TRAKYA NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS

YAPRAKLARI SALATA-BAHARAT

OLARAK TKETLEN BAZI BTKLERN ANTOKSDAN AKTVTELERNN

NCELENMES

Ar.Gr. ebnem SELEN BLR DOKTORA TEZ

Danman

Do. Dr. Ayten SAIROLU EDRNE-2008

TRAKYA NVERSTES

FEN BLMLER ENSTTS

YAPRAKLARI SALATA-BAHARAT OLARAK TKETLEN

BAZI BTKLERN ANTOKSDAN AKTVTELERNN

NCELENMES

Ar Gr. ebnem SELEN BLR

DOKTORA TEZ

KMYA ANABLM DALI

Danman

Do. Dr. Ayten SAIROLU

EDRNE-2008

i

ZET

Bu almada dereotu (Anethum graveolens L.), kuzukula (Rumex acetosella L.), gelincik (Papaver rhoeas L.), roka (Eruca sativa Mill.) ve tere (Lepidium sativum subsp. sativum) bitkilerinin antioksidan aktiviteleri eitli metodlarla incelenmitir. Bu amala bitkiler kurutulup tldkten sonra su, etanol ve aseton zcleri kullanlarak ekstraksiyonlar yapld. Herbir ekstraktn Folin-Ciocalteu ayrac ile toplam fenolik madde ierii, DPPH serbest radikali giderme aktivitesi, ferrik tiyosiyanat (FTC) metodu ile toplam antioksidan aktivitesi, metal iyonlarn elatlama kapasitesi, speroksit radikali giderme aktivitesi ve indirgeme kapasitesi tayin edilmitir. Elde edilen sonular -tokoferol, askorbik asit, BHT ve BHA standart maddeleriyle kyaslanarak deerlendirilmitir.

Su, etanol ve aseton zcleriyle gerekletirilen ekstraksiyonlar sonucunda, allan tm bitkilerin ekstrakte edilebilen madde miktarlar 21,66-488,35 mg/g kurutulmu bitki materyali arasnda bulundu. En yksek ekstraksiyon verimleri su ekstraktlarnda gzlendi.

Toplam fenolik madde tayini sonucu, ekstraktlarn toplam fenolik madde miktarlarnn gallik asit edeeri olarak 49,632,5-127,5514,48 mg/g aralnda; kateol edeeri olarak 24,081,67-76,039,66 mg/g aralnda deitii belirlendi. En yksek miktarlar kuzukula ve gelincik ekstraktlarnda tayin edildi.

Serbest radikal giderme aktivitesinden elde edilen verilere gre kuzukulann etanol ekstrakt, dereotu ve gelinciin etanol ve su ekstraktlar standart maddelerle karlatrlabilir dzeyde DPPH giderme aktivitesi gsterdi.

Bitki ekstraktlarnn toplam antioksidan aktivitesi linoleik asit emlsiyonunda deerlendirildi. Elde edilen sonulara gre dereotunun su ekstrakt, kuzukula, gelincik, roka ve terenin su ekstraktlarnn 100 g/mL konsantrasyonlar haricindeki tm ekstraktlar etkili ve yksek oranlarda antioksidan aktivite gsterdiler.

Metal elatlama aktivitesi tayininde Fe2+ zeltisi kullanld, sonular EDTA ile kyasland. Dereotu, gelincik ve terenin su ekstraktlar, kuzukula ve rokann etanol ekstrakt dier ekstraktlara gre yksek metal elatlama aktivitesi gsterdi.

Speroksit radikali giderme aktivitesinde PMS/NADH/O2 sisteminde O2- radikali oluturuldu ve ekstraktlarn bu radikali giderebilme kapasiteleri incelendi. allan ekstraktlardan sadece su ekstraktlarnda; kuzukula>gelincik>dereotu> roka>tere sralamasna gre aktivite gzlendi.

ii

H2O2 giderme aktivitesinde, ekstraktlarn 250 g/mL ve 400 g/mL konsantrasyonlarnda aktivite tayin edildi. En yksek H2O2 giderme oranlar kuzukula etanol, dereotu su ve roka aseton ekstraktlarnda belirlendi.

ndirgeme kapasitesi tayini ynnden; btn bitki ekstraktlarnn standartlarla kyaslandnda yksek aktiviteye sahip olmad gzlendi. ndirgeme kapasitesi yetenekleri gelincik>kuzukula>dereotu>roka>tere eklinde sralama gsterdi.

Anahtar kelimeler: Anethum graveolens L., Rumex acetosella L., Papaver rhoeas L., Eruca sativa Mill., Lepidium sativum subsp. sativum, antioksidan aktivite, DPPH, fenolik madde.

iii

ABSTRACT

In this study, the antioxidant activities of dill (Anethum graveolens L.), sorrel leaf (Rumex acetosella L.), corn poppy (Papaver rhoeas L.), rocket (Eruca sativa Mill.) and cress (Lepidium sativum subsp. sativum) were investigated by using different methods. For this purpose, after the plants were dried and ground to fine powder, their extractions were done by water, ethanol and acetone as solvent. The antioxidant activities of all extracts were assayed with the various methods including total phenolic compound contents by Folin-Ciocalteu reagent (FCR), DPPH free radical scavenging activity, total antioxidant activity by using ferric thiocyanate (FTC) method, metal chelating capacity, superoxide anion scavenging activity, and reducing power. The obtained results were compared by using -tocopherol, ascorbic acid, BHT and BHA as standard.

The extractable compound of all studied plants were found in the range of 21,66-488,35 mg/g dried plant at the and of the extractions carried out by water, ethanol and acetone as solvent. The best extraction yield was observed in water extracts.

In the total phenolic compound assay, total phenolic compound amounts of extracts were determined to be 49,632,5-127,5514,48 mg/g as gallic acid equivalent; 24,081,67-76,039,66 mg/g as catechol equivalent. The highest amounts were found in the sorrel leaf and corn poopy extracts.

According to obtained results from the assay of free radical scavenging activity, the ethanol extract of dill, the water and ethanol extracts of dill and corn poppy showed DPPH scavenging activity, which is comparable with standard compounds.

Total antioxidant activities of plant extracts were assayed by using linoleic acid emulsion. According to obtained results; all of extracts exhibited effective and high antioxidant activity except of the water extracts of dill, and the water extracts of corn poppy, sorrel leaf, rocket and cress at 100 g/mL concentration.

Metal chelating effect of samples were carried out by using Fe2+ solution, and the results were compared with EDTA. The water extracts of dill, corn poppy, and cress, the ethanol extracts of sorrel leaf and rocket showed the higher chelating activity Fe2+ ions than the other extracts.

For measurement of superoxide anion scavenging activity, O2- radical was generated by PMS/NADH/O2 system, and the abilities of all extracts to scavenge O2- activity were determined. It was observed the activity only in the water extracts. O2-

iv

radical scavenging activity of those samples followed the order: sorrel leaf>corn poppy >dill>rocket>cress.

In the H2O2 scavenging activity assay, the scavenging activities of extracts determined at concentrations of 250 g/mL and 400 g/mL. The high H2O2 scavenging effects were observed the ethanol extract of sorrel leaf, the water extract of dill and the acetone extract of rocket.

When the reductive capabilities of all samples were compared to reference compounds, it was observed they havent high activities. The reducing capacity of all extracts followed the order: corn poppy >sorrel leaf >dill>rocket>cress.

Key words: Anethum graveolens L., Rumex acetosella L., Papaver rhoeas L., Eruca sativa Mill., Lepidium sativum subsp. sativum, antioxidant activity, DPPH, phenolic compound.

v

TEEKKR

Doktora renimim sresinde, tezimin planlanmas ve yrtlmesinde her

zaman bilgi ve tecrbesini esirgemeyen Sayn Hocam Do. Dr. Ayten SAIROLUna

sonsuz teekkrlerimi sunarm.

Aratrmamn balangcndan bitimine kadar her aamada yakn ilgisini

grdm, almalarm boyunca katklarn ve yardmlarn esirgemeyen Sayn Yrd.

Do. Dr. Hlya YAARa, Blmmde grev yapan ve desteklerini grdm tm

arkadalarma, laboratuvar almalarm ve analizler srasnda yardmlarn esirgemeyen

Yksek Lisans rencimiz Glin AKAGNe, almada kullanlan bitkilerin tr

tanmlamalarn yapan T.. FenEdebiyat Fakltesi Biyoloji Blm retim Eleman

Ar. Gr. Dr. Necmettin GLERe ok teekkr ederim.

Beni her zaman itenlikle destekleyen aileme, sabrlar ve hogrleri iin eim

ve ocuklarma sonsuz teekkrler...

Bu alma T.. Bilimsel Aratrma Fonu tarafndan desteklenen Yapraklar

Salata-Baharat Olarak Tketilen Baz Bitkilerin Antioksidan Aktivitelerinin

ncelenmesi balkl TBAP-660 nolu proje kapsamnda gerekletirilmitir.

vi

NDEKLER

Sayfa No

ZET i

ABSTRACT.. iii

TEEKKR. v

NDEKLER vi

EKLLER DZN. ix

TABLOLAR DZN xi

KISALTMALAR.. xii

1. GR 1

2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARATIRMASI. 4

2.1. Serbest Radikaller... 4

2.1.1. Oksijen ve Reaktif Oksijen Trleri (ROT).

2.1.1.1. Speroksit radikali (O2-)

2.1.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2).

2.1.1.3. Hidroksil radikali (OH)..

2.1.1.4. Singlet oksijen (1O2)

2.1.1.5. Hipoklorik asit (HOCl)

2.1.1.6. Nitrik oksit (NO)

5

8

9

11

11

12

12

2.1.2. Hcredeki Reaktif Oksijen Trlerinin Kaynaklar.

2.1.2.1. Biyolojik kaynaklar

2.1.2.2. ntraselller kaynaklar

13

13

15

2.1.3. Serbest Radikallerin Etkileri...

2.1.3.1. Serbest radikallerin lipidlere etkileri...

2.1.3.2. Serbest radikallerin proteinlere etkileri...

2.1.3.3. Serbest radikallerin nkleikasitlere ve DNAya etkileri

2.1.3.4. Serbest radikallerin karbonhidratlara etkisi.

16

17

18

18

19

2.2. Antioksidanlar.

2.2.1. Antioksidanlarn snflandrlmas..

21

22

vii

2.2.1.1. Enzimler..

2.2.1.2. Yada ve suda znen radikal tutucular

2.2.1.3. Metal iyonlarn balayan proteinler...

2.2.2. Eksojen antioksidanlar

23

25

31

32

2.3. Gdalar ve Antioksidanlar.

2.3.1.Gdalarda doal olarak bulunan antioksidan maddeler...

2.3.2. Gdalara ilave edilen sentetik antioksidanlar.

32

32

34

2.4. Antioksidan Aktivite Tayin Metodlar..

2.4.1. HAT-temelli metodlar....

2.4.2. ET-temelli metodlar

2.4.3. Lipid oksidasyon markerlerini len metodlar...

2.4.4. Dier ROS giderici kapasiteleri len metodlar.

37

39

41

43

44

2.5. almada Kullanlan Bitkiler ve zellikleri

2.5.1. Dereotu (Anethum graveolens L)

2.5.2. Gelincik (Papaver rhoeas L.).

2.5.3. Kuzukula (Rumex acetosella L.).

2.5.4. Roka (Eruca sativa Mill.)..

2.5.5. Tere (Lepidium sativum subsp. sativum)

45

45

46

47

48

48

3. MATERYAL VE METOD... 50

3.1.Materyal 50

3.1.1. Bitki rnekleri 50

3.1.2. Kimyasal Maddeler ve Ekipmanlar 50

3.1.3. Kullanlan Kimyasal zeltiler.. 51

3.2. Metod ... 53

3.2.1. Ekstraktlarn Hazrlan. 53

3.2.2. Toplam Fenolik Madde (TPC) Tayini 54

3.2.3. DPPH Radikali Giderme Aktivitesinin Tayini... 55

3.2.4. Linoleik Asit Sisteminde Ferrik Tiyosiyanat (FTC) Metodu ile Toplam

Antioksidan Aktivite Tayini.

56

3.2.5. Demir (II) yonlarn elatlama Aktivitesinin Tayini. 57

3.2.6. Speroksit Radikali Giderme Aktivitesinin Tayini 57

viii

3.2.7. H2O2 Giderme Aktivitesinin Tayini 58

3.2.8. ndirgeme Kapasitesi Tayini... 59

3.2.9. Deerlendirme 59

4. ARATIRMA BULGULARI.. 60

4.1. FCR ile Toplam Fenolik Bileik Tayini

4.2. DPPH Radikali Giderme Aktivitesi...

60

63

4.3. Linoleik Asit Sisteminde Ferrik Tiyosiyanat Metodu ile Toplam Antioksidan

Aktivite Tayini.

68

4.4. Demir (II) yonlarn elatlama Aktivitesinin Tayini 80

4.5. Speroksit Radikali Giderme Aktivitesinin Tayini... 84

4.6. H2O2 Giderme Aktivitesinin Tayini.. 85

4.7. ndirgeme Kapasitesi Tayini.. 87

5. SONULAR ve TARTIMA.. 91

6. KAYNAKLAR. 105

ZGEM 117

ix

EKLLER DZN

Sayfa No

ekil 2.1 Oksijenin suya indirgenmesi ve dier oksijen trlerinin oluumu 6

ekil 2.2 Fagositik solunumsal patlamada oluan reaktif oksijen trleri 14

ekil 2.3 Serbest radikallerin hcresel hedefleri 16

ekil 2.4 Lipid peroksidasyonunun temel reaksiyonlar 18

ekil 2.5 Purin ve pirimidin bazlar zerine OH radikalinin etkisiyle oluan rnler 19

ekil 2.6 Oksidatif strese kar enzimatik savunma mekanizmalar 25

ekil 2.7. Gdalarda katk maddesi olarak kullanlan baz sentetik antioksidanlarn formlleri

34

ekil 2.8.

ekil 2.9.

ekil 2.10.

ekil 2.11.

ekil 2.12.

ekil 4.1

Dereotu bitkisi

Gelincik bitkisi

Kuzukula bitkisi

Roka bitkisi

Tere bitkisi

Gallik asit standart grafii

46

47

48

48

49

61

ekil 4.2 Kateol standart grafii 61

ekil 4.3 Bitki ekstraktlarnn gallik asit edeeri olan fenolik madde ierikleri 62

ekil 4.4 Bitki ekstraktlarnn kateol edeeri olan fenolik madde ierikleri 62

ekil 4.5 Dereotu ekstraktlarnn DPPH radikali giderme aktivitesi 63

ekil 4.6 Gelincik ekstraktlarnn DPPH radikali giderme aktivitesi 64

ekil 4.7 Kuzukula ekstraktlarnn DPPH radikali giderme aktivitesi 64

ekil 4.8 Roka ekstraktlarnn DPPH radikali giderme aktivitesi 65

ekil 4.9 Tere ekstraktlarnn DPPH radikali giderme aktivitesi 65

ekil 4.10 Linoleik asit peroksidasyonunda dereotu aseton (A), etanol (B), su (C) ekstraktlarnn etkisi

69

ekil 4.11 Linoleik asit peroksidasyonunda gelincik aseton (A), etanol (B), su (C) ekstraktlarnn etkisi

70

ekil 4.12 Linoleik asit peroksidasyonunda kuzukula aseton (A), etanol (B), su (C) ekstraktlarnn etkisi

71

ekil 4.13 Linoleik asit peroksidasyonunda roka aseton (A), etanol (B), su (C) ekstraktlarnn etkisi

72

ekil 4.14 Linoleik asit peroksidasyonunda tere aseton (A), etanol (B), su (C) ekstraktlarnn etkisi

73

ekil 4.15 Linoleik asit peroksidasyonunda sentetik antioksidan olan BHA (A) ve BHT (B)nin etkisi

75

x

ekil 4.16 Linoleik asit peroksidasyonunda E vitamini (A) ve C vitamini (B)nin etkisi

76

ekil 4.17 Dereotu ekstraktlarnn total antioksidan aktivitesi 78

ekil 4.18 Gelincik ekstraktlarnn total antioksidan aktivitesi 78

ekil 4.19 Kuzukula ekstraktlarnn total antioksidan aktivitesi 79

ekil 4.20 Roka ekstraktlarnn total antioksidan aktivitesi 79

ekil 4.21 Tere ekstraktlarnn total antioksidan aktivitesi 80

ekil 4.22 Dereotu ekstraktlarnn metal elatlama kapasitesi 81

ekil 4.23 Gelincik ekstraktlarnn metal elatlama kapasitesi 81

ekil 4.24 Kuzukula ekstraktlarnn metal elatlama kapasitesi 82

ekil 4.25 Roka ekstraktlarnn metal elatlama kapasitesi 82

ekil 4.26 Tere ekstraktlarnn metal elatlama kapasitesi 83

ekil 4.27 Bitki ekstraktlarnn EDTA edeeri olarak metal elatlama kapasiteleri 84

ekil 4.28 Su ekstraktlarnn speroksit radikalini giderme aktivitesi 85

ekil 4.29 Dereotu ekstraklarnn Fe+3 Fe+2ye indirgeme kapasitesi 87

ekil 4.30 Gelincik ekstraklarnn Fe+3 Fe+2ye indirgeme kapasitesi 88

ekil 4.21 Kuzukula ekstraklarnn Fe+3 Fe+2ye indirgeme kapasitesi 88

ekil 4.32 Roka ekstraktlarnn Fe+3 Fe+2ye indirgeme kapasitesi 89

ekil 4.33 Tere ekstraktlarnn Fe+3 Fe+2ye indirgeme kapasitesi 89

xi

TABLOLAR DZN

Sayfa No

Tablo 2.1. Baz serbest radikal trleri 7

Tablo 2.2. Organizmada bulunan temel antioksidan savunma sistemleri 22

Tablo 2.3. Gdalar korumada kullanlan baz sentetik antioksidanlar 36

Tablo 2.4. In vitro koullarda uygulanan antioksidan aktivite tayin metodlar 39

Tablo 2.5. Deneyde kullanlan bitkiler 45

Tablo 4.1. Kurutulmu bitkilerden ekstrakte edilen bileiklerin verimleri 60

Tablo 4.2 allan bitki ekstraktlarnn ve standartlarn DPPH radikali giderme aktivitesi sonularndan elde edilen EC50 deerleri

67

Tablo 4.3. Ekstraktlarn ve standartlarn lipid peroksidasyonunu inhibe etme oranlar

77

Tablo 4.4 Bitki ekstraktlar ve standartlarn H2O2 giderme aktiviteleri 86

xii

KISALTMALAR

ABTS 2,2'-Azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-slfonat)

BHA Btillendirilmi hidroksianisol

BHT Btillendirilmi hidroksitoluen

DA Dereotu aseton ekstrakt

DE Dereotu etanol ekstrakt

DPPH 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil

DS Dereotu su ekstrakt

FCR Folin-Ciocalteu reaktifi

FRAP Demir (III)iyonu indirgeme gc

FTC Ferrik tiyosiyanat

GA Gelincik aseton ekstrakt

GAE Gallik asit edeeri

GE Gelincik etanol ekstrakt

GS Gelincik su ekstrakt

G-SH Glutatyon

GSH-Px Glutatyon peroksidaz

GSH-Red Glutatyon redktaz

GST Glutatyon-S-transferaz

KA Kuzukula aseton ekstrakt

KE Kuzukula etanol ekstrakt

KS Kuzukula su ekstrakt

LDL Dk younluklu lipoprotein

MDA Malondialdehit

NADH Nikotinamidadenindinkleotid

NBT Nitroblue tetrazolyum

ORAC Oksijen radikalini absorblama kapasitesi

PG Propil gallat

PMS Fenazin metaslfat

RA Roka aseton ekstrakt

xiii

RE Roka etanol ekstrakt

ROT Reaktif oksijen trleri

RS Roka su ekstrakt

SOD Speroksit dismutaz

TA Tere aseton ekstrakt

TBHQ t-Btil hidroksikinon

TE Tere etanol ekstrakt

TEAC Trolox ekivalenti antioksidan kapasite

TPC Toplam fenolik madde

TRAP Toplam radikal tutma parametresi

TS Tere su ekstrakt

1

1. GR

Organizmada normal metabolik yollarn ileyii srasnda veya evresel ajanlar

(pestisidler, aromatik hidrokarbonlar, toksinler, zcler vb.), stres, radyasyon gibi

eitli d faktrlerin etkisiyle serbest radikaller meydana gelmektedir. Serbest radikaller

d orbitallerinde ortaklanmam elektron bulunduran, ksa mrl, reaktif

molekllerdir. Serbest radikallerin en nemlileri speroksit radikali (O2-), hidroksil

radikali (OH), singlet oksijen (1O2) ve radikalik olmayan hidrojen peroksit (H2O2) ve

peroksinitrit (ONOO-) olup reaktif oksijen trleri (ROT) olarak bilinirler. ROTlar

organizmada lipidler, nkleik asitler, proteinler ve karbonhidratlar gibi biyolojik

molekllerle kolayca reaksiyona girebilirler. Bu yzden yalanma, kanser,

kardiyovaskler hastalklar, immn sistem hastalklar, katarakt, diyabet, bbrek ve

karacier hastalklar gibi pekok hastalktan sorumlu tutulurlar (Halliwell ve

Gutteridge, 1990).

Endstri ve gda teknolojisi asndan bakldnda; zellikle birden fazla

doymam ba ieren ya asitleri ve yaca zengin rnler oksidasyona olduka aktr.

Bu yzden gdalarn korunmas ve depolanmas srasnda meydana gelen en byk

problemlerden biri lipid peroksidasyonudur. Lipid peroksidasyonu sv ve kat yalarda

aclamaya (ransidleme), ya ieren dier gdalarda ise renk, tat, aroma, tekstr ve

kvamda bozulmalara ve besinsel kalitenin azalmasna neden olmaktadr (enkyl,

2001). Bu nedenle oksidasyon kararlln arttrmak iin yalarda uzun sredir

btillendirilmi hidroksianisol (BHA), btillendirilmi hidroksitoluen (BHT), t-btil

hidrokinon (TBHQ) ve propil gallat (PG) gibi sentetik antioksidanlar gda katk maddesi

olarak kullanlmaktadr.

Antioksidanlar serbest radikallerin etkilerini yokedici sistemlerdir. Vcutta

ROTlarn oluumunu ve bunlarn meydana getirdii hasar nlemek zere enzimatik

veya enzimatik olmayan birok endojen antioksidan savunma mekanizmas

bulunmaktadr. Bunun yannda baz ilalar, vitaminler ve sentetik gda antioksidanlar

2

da eksojen antioksidanlar olarak deerlendirilebilir. Serbest radikal oluumunu

geciktiren veya tamamen durduran koruyucu antioksidanlar (enzimler, metal elatrleri)

veya lipid peroksidasyonunun ilerlemesini engelleyen zincir krc antioksidanlar

(askorbik asit, -tokoferol, flavonoidler) olarak etki gsterirler.

nsan vcudunu serbest oksijen radikallerine kar korumada doal ve fenolik

bileiklerce zengin meyve ve sebzelerin yararl olduu bilinmektedir. Yaplan

epidemiyolojik almalarla reaktif oksijen trlerine kar bitkisel kaynaklardaki

fitonutrientlerin yararl olduu; meyve ve sebzelerin koruyucu etkilerinin ierdikleri

askorbik asit (C vitamini), -tokoferol (E vitamini), karotenoidler, glutatyon,

flavonoidler ve fenolik asitler gibi doal bileiklerden dolay olduu bildirilmitir

(Halvorsen vd., 2002). Vcudun endojen savunma sisteminin dzenli ve dengeli bir

diyetle alnacak antioksidan bileikler ile desteklenmesi gerekmektedir. Bu yzden

diyetle antioksidan almnda artma veya antioksidanlarla zenginletirilmi gdalar

giderek nem kazanmaktadr.

Gda sanayinde yalarn ve ya ieren dier rnlerin korunmas ve raf mrnn

uzatlmas iin genellikle btillendirilmi hidroksitoluen (BHT) ve btillendirilmi

hidroksianisol (BHA) kullanlmaktadr. Ancak yaplan aratrmalar bu bileiklerin

toksiditesinden bahsederek, onlarn karsinojenik olma riskini ortaya koyar niteliktedir

(Ito vd., 1986). Bu sebeple, tketiciler tercihlerini doal tarmsal rnlere yneltmi ve

ilenmi gdalarda da salk, kalite ve gvenlik araylarn n plana karmtr. Doal

biyoaktif bileiklerle ilgilenen zellikle farmastik ve gda endstrilerinden gelen talep

zerine, doal bileiklerin antioksidan aktiviteleri aratrmaclar tarafndan youn

ekilde allmaktadr. Geni bir eitlilik ve dalm gsteren bitkisel kaynaklar hem

vcutta, hem de ilenmi gdalarda meydana gelen oksidatif hasara kar koruma

salayabilecek daha gvenilir ve daha salkl antioksidanlar sunabilir. Bu yzden de

aratrmaclar doal kaynaklardan elde edilebilen yksek antioksidan aktiviteli

ekstraktlar sentetik antioksidanlarn yerine kullanmay hedeflemektedirler.

Endstriyel uygulamalarda kullanlmak zere; meyve, sebze, aromatik bitki ve

zellikle eitli baharatlarn tohum, meyve, yaprak, kk, kabuk gibi ksmlar

3

kullanlarak antioksidanca zengin ekstraktlar tanmlamak zere yaplm ok sayda

alma vardr (Karpinska vd., 2001, Tepe vd., 2006, Chen vd., 2007). Ancak yaplan

literatr taramasnda dereotu, gelincik, kuzukula, roka ve tere bitkilerinin antioksidan

aktivitelerinin tayinine ynelik ok az sayda aratrmaya rastlanmtr.

almamzda gnlk beslenmede sklkla yer alan ve yapraklar salata-baharat

olarak tketilen dereotu, gelincik, kuzukula, roka ve tere bitkilerinin eitli metodlarla

antioksidan aktiviteleri ve bu bitki ekstraktlarnn sentetik antioksidanlara alternatif

olabilecek doal antioksidan kayna olarak incelenmesi amalanmtr. Bitkilerin

etanol, su ve aseton ekstraktlar alnarak, her bir ekstraktn toplam fenolik madde

miktar, metal iyonlarn elatlama kapasitesi, FTC metodu ile toplam antioksidan

aktivitesi, indirgeme kapasitesi, DPPH serbest radikali giderme aktivitesi, speroksit

radikali giderme aktivitesi ve H2O2 giderme aktivitesi tayin edilmitir. Sonular -

tokoferol, askorbik asit, BHT ve BHA gibi eitli standart maddeler ile kyaslanarak

deerlendirilmitir.

4

2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARATIRMASI

2.1. Serbest Radikaller

Atom veya molekllerdeki elektronlar ekirdein etrafnda orbital olarak

tanmlanan blgelerde hareket ederler. Her yrngede birbirine zt ynde hareket eden

en fazla iki elektron bulunur. Bir atom veya molekl d orbitallerinde bir veya daha

fazla ortaklanmam (elememi) elektron bulunduruyorsa serbest radikal (SR)

olarak tanmlanr. Bu tip molekller, ortaklanmam elektronlarndan dolay olduka

reaktiftirler (Halliwell ve Gutteridge, 1990). En basit serbest radikal bir elektron ve bir

protonu olan hidrojen atomudur. Serbest radikallerde elememi elektron, atom veya

molekln st ksmna konulan bir nokta ile belirtilir.

eitli fiziksel etkenler ve kimyasal olaylar nedeniyle evrede ve hcresel

koullarda devaml bir radikal yapm vardr. Serbest radikaller temel yolla oluur

(Akku, 1995, Onat vd., 2002):

a) Kovalent balarn homolitik krlmas ile: Kovalent ban kopmas srasnda ba

yapsndaki iki elektronun her biri ayr ayr atomlar zerinde kalr.

b) Normal bir molekln elektron kaybetmesi ile: Radikal zellii bulunmayan bir

moleklden elektron kayb srasnda d orbitalinde elememi elektron kalyorsa

radikal formu oluur. rnein, askorbik asit ve tokoferol gibi hcresel antioksidanlar,

radikal trlere tek elektron verip radikalleri indirgerken, kendilerinin radikal formu

oluur.

c) Normal bir molekle tek bir elektron transferi ile: Radikal zellii tamayan bir

molekle tek elektron transferi ile d orbitalinde elememi elektron oluuyorsa bu tr

5

indirgenme radikal oluumuna sebep olabilir. rnein, molekler oksijenin tek elektron

ile indirgenmesi, radikal formu olan speroksidi oluturur.

Biyolojik sistemlerde serbest radikaller en fazla elektron transferi sonucu

oluurlar. Serbest radikaller pozitif ykl, negatif ykl veya ntral olabilirler.

Biyolojik sistemlerde en nemli radikaller, serbest oksijen radikalleri (SOR) olmakla

beraber; C, N, S trevi olan radikaller ve inorganik molekller de vardr. Cu2+, Fe3+,

Mn2+, Mo5+ gibi gei metallerinin de ortaklanmam elektronlar olduu halde serbest

radikal olarak kabul edilmezler. Fakat bu iyonlar reaksiyonlar katalizlediklerinden

dolay serbest radikal oluumunda nemli rol oynarlar (Akku, 1995).

2.1.1. Oksijen ve Reaktif Oksijen Trleri (ROT)

Molekler oksijen (O2), iki kovalent ba yapmasna ramen, molekln

paramanyetik zellikte olmas elememi elektron ierdiini gsterir. D orbitallerinde

bulunan iki elektron, spinleri ayn ynde ve farkl orbitallerde iken molekl minimum

enerji seviyesindedir (Lee, 1991). Serbest radikal tanmna gre oksijen bir diradikal

olarak deerlendirilir. Diradikal oksijen, spin kstlanmasndan dolay radikal olmayan

maddelerle yava reaksiyona girdii halde, dier serbest radikaller ile kolayca

reaksiyona girer (Akku, 1995, http://www.mustafaaltinisik.org).

Organizmada, pek ok oksidaz ve oksijenazn aktif merkezlerinde bulunan gei

metalleri (Cu2+, Fe3+ gibi) vastasyla molekler oksijene tek elektron transferi suretiyle

oksijenin spin kstlamas alabilir.

6

O2nin reaktivitesini arttrmak iin spin kstlamasn amann dier bir yolu,

enerji absorbsiyonu ile oksijenin uyarlm hale gemesidir (Halliwell ve Gutteridge,

1990). Bunun sonucu singlet oksijen oluur.

Oksijen bulunan bir ortamda fiziksel ve kimyasal etkenlerle, zorunlu metabolik

reaksiyonlar sonucu oksijen radikalleri retilir. Oksijen radikalleri biyolojik sistemlerde

bulunan en nemli serbest radikallerdir. Bunlar arasnda speroksit radikali (O2-),

hidroksil radikali (OH) ve radikal olmayan hidrojen peroksitin (H2O2) zel yerleri

vardr ve reaktif oksijen trleri (ROT) olarak bilinirler.

O2 O O

O OO O O2

HO2 O2

H2O2

OH

H2O

O OH O O

O OH H

O H

O HH

e-

e-

e-

e-

O2

ekil 2.1. Oksijenin suya indirgenmesi ve dier oksijen trlerinin oluumu

7

Reaktif oksijen trleri, eitli serbest radikallerin olutuu serbest radikal zincir

reaksiyonlarn balatabilirler ve hcrede karbon merkezli organik radikaller (R),

peroksil (peroksi) radikalleri (ROO), alkoksil (alkoksi) radikalleri (RO), tiyil

radikalleri (RS) gibi nemli serbest radikallerin oluumuna neden olurlar. Tiyil

radikalleri oksijenle tekrar reaksiyona girip slfenil (RSO) veya tiyil peroksil (RSO2)

gibi radikalleri de meydana getirebilirler (Akku, 1995,

http://www.mustafaaltinisik.org).

Tablo 2.1. Baz serbest radikal trleri (Halliwell, 1994)

Ad Forml Tanm

Hidrojen atomu H En basit serbest radikal

Speroksit O2- Oksijen merkezli radikal, seimli reaktif

Hidroksil OH En fazla reaktif oksijen radikali. nsan vcudundaki

tm molekllere saldrr.

Triklorometil CCl3 C merkezli radikal, CCl4 metabolizmas sonucu

retilir ve genellikle O2 ile hzla reaksiyona girer.

Tiyil RS Kkrt zerinde elememi elektron bulunduran

trlerin genel ad

Peroksil, Alkoksil RO2, RO Organik peroksitlerin ykm srasnda oluan oksijen

merkezli radikaller.

Nitrik oksit NO L-arginin amino asidinden in vivo koullarda retilir.

Azotdioksit NO2 NOnun O2 ile reaksiyonunda oluur. Kirli hava,

sigara dumannda vb. bulunur.

Hidrojen peroksit H2O2 Reaktivitesi en dk, molekler hasar yetenei

dk.

Singlet oksijen 1O2 Oksijenin gl oksidatif formu

Reaktivite radikale ve ortamda bulunan molekle baldr. ki serbest radikal

karlatnda elememi elektronlar kovalent ba yaparak birleir. Ancak bunun

sonucunda oluan trler de reaktif olabilir. Buna rnek NO ve O2-in ok hzl

reaksiyonu ile bir nonradikal rn olan peroksinitritin oluumu verilebilir:

8

Bununla birlikte bir serbest radikal, radikal olmayan bir madde ile reaksiyona girerek

yeni bir radikal oluturabilir. Biyolojik molekllerin byk bir ksm radikal olmad

iin, in vivo artlarda reaktif bir radikalin oluumu, genellikle zincir reaksiyonunun

balamasna yol aabilir (Nehir El vd., 1999).

2.1.1.1. Speroksit radikali (O2-)

Hemen tm aerobik hcrelerde oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi sonucu

speroksit radikali oluur. Balca u yollarla retilmektedir (Halliwell ve Gutteridge,

1990, Halliwell, 1994):

1. Katekolaminler, hidrokinonlar, redkte flavinler, tiyoller, tetrahidrofolatlar

gibi biyolojik molekllerin aerobik ortamda otooksidasyonu sonucu speroksit oluur.

2. Aktive olmu fagositik hcreler (ntrofiller, monositler, makrofajlar,

eozinofiller), virs veya bakteriyi inaktive etmek iin bol miktarda speroksit retirler.

3. Mitokondriyal enerji metabolizmas srasnda oluan elektron sznts sonucu

kullanlan oksijenin %1-3 speroksit radikali yapm ile sonlanr.

4. ndirgenmi gei metallerinin otooksidasyonu speroksidi meydana

getirebilir.

Speroksit radikalinin nemi H2O2 kayna olmas ve gei metal iyonlarnn

indirgeyicisi olmasdr. Ayrca hcresel koullarda retilen speroksit hem oksitleyici

9

hem de indirgeyici olarak davranabilir. rnein; ferrisitokrom c ile reaksiyonunda

indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve oksijene dnr. Epinefrin

oksidasyonunda ise oksidan olarak davranarak bir elektron alr ve H2O2ye indirgenir

(Akku 1995). Speroksit radikali dk pH deerlerinde daha reaktiftir ve oksidan olan

perhidroksil radikalini (HO2) oluturmak zere protonlanr. Speroksit radikali ve

perhidroksi radikali birbiriyle reaksiyona girince biri ykseltgenir, dieri indirgenir. Bu

dismutasyon reaksiyonu sonucu H2O2 oluur.

Speroksidin fizyolojik bir serbest radikal olan NO ile birlemesi sonucu reaktif

bir oksijen trevi olan peroksinitrit meydana gelir. Bu ekilde NO normal etkisini

inhibe eder, ayrca peroksinitritler direkt proteinlere etki ederler.

O2 + NO ONOO-

2.1.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2)

Molekler oksijenin evresindeki molekllerden iki elektron almas veya

speroksidin bir elektron almas sonucu H2O2 oluur.

O2 + e- + 2 H+ H2O2

O2 + 2 e- + 2 H+ H2O2

Yapsnda elememi elektron iermedii iin radikal deildir, ancak biyolojik

membranlar geerek hcrelerin arasna veya iine kolayca difze olabilir ve uzun

mrl bir oksidandr (Halliwell ve Gutteridge, 1990, Halliwell, 1994).

Biyolojik sistemlerde H2O2nin asl retimi speroksidin nonenzimatik veya

SOD katalizli dismutasyon reaksiyonu ile H2O2ye dnmesiyle olur.

10

Ayrca, aminoasit oksidaz, ksantin oksidaz (XO) gibi baz oksidaz enzimlerinin

faaliyeti sonucunda in vivo olarak H2O2 retilir (Murray vd., 1996).

H2O2 bir radikal olmad halde, ROT iine girer ve serbest radikal

biyokimyasnda nemli rol oynar. nk gei metal iyonlar varlnda Fenton

reaksiyonu sonucu; speroksit radikali varlnda Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en

reaktif ve daha ok hasar verici olan hidroksil radikaline dnr (Halliwell vd., 2000).

Haber-Weiss reaksiyonu speroksidin direkt olarak H2O2 ile reaksiyonudur,

katalizrsz reaksiyon olduka yava ilerler. Demirle katalizlenen ikinci ekli ise ok

hzldr. Bu reaksiyonda nce ferri demir (Fe3+) speroksit tarafndan ferro demire

(Fe2+) indirgenir. Sonra Fenton reaksiyonu ile H2O2den OH ve -OH retilir. Reaksiyon

mekanizmas aadaki ekildedir:

Speroksit radikalinin lipidte znrl snrl olduu halde, H2O2 lipitte

znebilir. Bu yzden H2O2 kendisinin olutuu yerden uzakta olan ve Fe2+ ieren

membranlarda hasar oluturabilir.

11

2.1.1.3. Hidroksil radikali (OH)

Hidroksil radikali gei metalleri varlnda H2O2nin indirgenmesiyle (Fenton

reaksiyonu) oluur. Suyun yksek enerjili iyonlatrc radyasyona maruz kalmas

sonucu da oluur.

Biyolojik sistemlerdeki en reaktif ve hasar verici radikal trdr. Yarlanma

mr ok ksa olmasna ramen ortamda rastlad her biyomoleklle tepkimeye girer

ve olutuu yerde byk hasara sebep olur (Akku, 1995, Halliwell ve Gutteridge,

1990). Tiyoller ve ya asitleri gibi moleklerden bir proton kopararak tiyil radikalleri

(RS), C merkezli organik radikaller (R), organik peroksitler (RCOO) gibi yeni

radikallerin olumasna sebep olur.

Her tr biyolojik moleklle reaksiyona girse de zellikle elektronca zengin

bileikler tercihli hedefleridir, nkleik asitler (prin ve pirimidin bazlar) ve proteinler

(aromatik amino asitler) ile eitli radikalik tepkimeler verir.

2.1.1.4. Singlet oksijen (1O2)

Molekler oksijenin elektronlarndan birinin enerji alarak kendi spininin ters

ynnde olan baka bir orbitale yer deitirmesiyle singlet oksijen oluur. Singlet

oksijen ortaklanmam elektronu olmad iin radikal deildir. Oksijenin

ortaklanmam elektronlar paralel spinli olduundan oksijendeki spin kstlamas

singlet oksijende yoktur ve olduka reaktif bir oksijen bileiidir (Akku, 1995,

12

http://www.mustafaaltinisik.org). Delta ve sigma olmak zere iki ekli vardr. Delta

ekli daha dk enerjili (92 kj) olduundan sigma ekline (155 kj) gre daha uzun

yarmrldr (Cotton ve Wilkinson, 1988).

Vcutta, pigmentlerin (flavin ieren nkleotidler, retinal, bilirubin) oksijenli

ortamda absorblamasyla, O2-nin dismutasyon tepkimesi srasnda, porfirya gibi

porfirin metabolizmas hastalklarnda oluabilir (Halliwell ve Gutteridge, 1990).

2.1.1.5. Hipoklorik asit (HOCl)

Doku makrofajlar gibi fagositik hcreler, ntrofil, eozinofil gibi granlositler

mikroorganizmalar ldrmek iin klorlanm oksidanlar retebilir (Murray vd., 1996,

Meram ve Aktaran, 2002). HOCl miyeloperoksidaz enzimi tarafndan H2O2 ve Cl-

iyonunun birlemesi sonucu oluur. Dokularda hasar oluturan gl bir oksidandr.

2.1.1.6. Nitrik oksit (NO)

NO hem fizyolojik hem patofizyolojik srelerde nemli bir role sahip serbest

radikaldir. Nitrik oksit eitli reseptrlerin aktivasyonu sonucu L-arginin ve oksijenden

nitrik oksit sentaz (NOS) etkisiyle sentezlenir. Vaskler endoteliyal hcrelerde

oluturulan nemli bir vazodilatrdr, nemli bir nrotransmitterdir, inflamasyon ve

13

enfeksiyon durumlarnda sitokinler ve endotoksinler tarafndan indklenerek bol

miktarda retilir ve parazitlerin ldrlmesinde rol oynar (Halliwell, 1994, Murray,

1996).

NO insan metabolizmasnda yararldr, fakat fazlas sitotoksik olabilir. Nitrik

oksidin speroksit radikaliyle etkilemesi sonucu oluan peroksinitrit (ONOO-), nitrik

oksitin toksisitesinden sorumlu balca bileiktir. Proteinlerdeki SH gruplarn

oksitleyerek direkt zarar verebilir. Ayrca fizyolojik pHda protonlanabilir ve gl bir

lipid peroksidasyon balatcs olan azotdioksiti (NO2), hidroksil radikalini (OH),

fenilalanin, tirozin gibi aromatik halkalar nitrolama ajan olan nitronyum iyonunu

(NO2+) oluturabilir (Halliwell, 1994, Murray, 1996).

2.1.2. Hcredeki Reaktif Oksijen Trlerinin Kaynaklar

Serbest radikaller ve dier reaktif oksijen trleri organizmada zel metabolik

olaylar iin veya kazara retilirler.

2.1.2.1. Biyolojik kaynaklar

a) Solunumsal Patlama: Aktive olmu makrofajlar, ntrofiller, eozinofiller ve

fagositik lkositler eitli biyolojik hedeflerin paralanmasn salayan ve enfeksiyona

kar vcudun hcresel cevabn balatan hcrelerdir. Fagositik solunumsal patlama

srasnda eitli serbest oksijen radikalleri (speroksit anyonu, H2O2, hidroksil radikali

ve hipoklorik asit) oluur. Fagosite edilmi mikroorganizma, bakteri bu rnlerin

etkisiyle ldrlr. Ancak bu oksidan rnler hcrelerin antioksidan savunma glerini

atnda normal konak hcrelerine zarar verirler ve eitli hastalklarn patogenezinde

rol oynarlar. rnein romatoit artritli (RA) hastalarn diz eklemlerinde fazla miktarda

ntrofil birikir ve bunlardan ortalama salnan serbest radikaller eklem hasarn

hzlandrr.

14

ekil 2.2. Fagositik solunumsal patlamada oluan reaktif oksijen trleri

(http://www.mustafaaltinisik.org)

b) Radyasyon ve evresel ajanlar (hava kirlilii, pestisidler, sigara duman,

zcler, anestezikler, aromatik hidrokarbonlar) serbest radikal oluumuna neden

olmaktadr.

c) Antineoplastik ajanlar (nitrofurantoin, bleomisin, doxorubicin, adrioxmicine):

Antikarsinojen bir ajan olan doxorubicin hcrenin DNA replikasyonu inhibe eder. Bu

srada H2O2 ve O2- oluumuna ve sonuta lipid peroksidasyonunun balamasna yol

aar (Winterbourn vd., 1985, Weijl vd., 1997).

d) Stres: Sinirsel uyarlar katekolaminlerin sentezinde art yapar (Murray vd.,

1996). Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikal kaynadr. Bu olay stresin

hastalklarn patogenezindeki rolnn serbest radikal retimiyle ilgili olabileceini

gstermesi bakmndan nemlidir (Akku, 1995).

15

2.1.2.2. ntraselller kaynaklar

a) Normalde hcrelerde en byk serbest oksijen radikali kayna mitokondriyal

elektron tama zincirinden szntdr. Hcrelerde kullanlan oksijen byk bir ksm

(yaklak % 95) mitokondri i zarnda yerlemi oksidatif fosforilasyon zinciri ile drt

elektron alarak suya indirgenir. Bu sistemde olan elektron sznts sonucu oksijenin %

1-3 speroksit radikalini retebilir (Halliwell, 1994).

b) Endoplazmik retikulum ve nkleer membranlarda serbest radikal retimi,

membrana bal sitokromlarn oksidasyonundan kaynaklanr.

c) Kk molekllerin otooksidasyonu: Tiyoller, katekolaminler,

tetrahidrofolatlar, flavinler gibi baz bileiklerin otooksidasyonu da speroksit radikali

kaynadr.

d) Birok enzimin (ksantin oksidaz, aldehit oksidaz, flavoprotein dehidrogenaz,

aminoasit oksidaz, triptofon dioksijenaz gibi) katalitik dngs srasnda H2O2 ve O2-

ortaya kar (Murray vd., 1996)

e) zellikle demir ve bakr gibi gei metalleri, fizyolojik artlarda

oksidoredksiyon reaksiyonlarnda yer alrlar. Bu zelliklerinden dolay serbest radikal

reaksiyonlarn hzlandran katalizrler olarak i grrler. Demir ve bakr zellikle

tiyollerden tiyil sentezini, H2O2 ve O2-den OH sentezini katalizler

(http://www.mustafaaltinisik.org).

f) Toksik maddeler eitli etkilerle hcrede serbest radikal retimini arttrrlar;

toksinin kendisi bir serbest radikaldir, toksin bir serbest radikale metabolize olabilir

veya toksinin metabolizmas sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir.

g) Araidonik asit metabolizmas da reaktif oksijen metabolitlerinin nemli bir

kaynadr. Araidonik asit, membran yapsnda bulunan, nemli fizyolojik

fonksiyonlar olan eikazonoidler ailesinin sentezinde balang maddesi olan 20

16

karbonlu oklu doymam bir ya asididir. Fagositik hcrelerin uyarlmas sonucu

plazma membranndaki araidonik asit serbestleir ve enzimatik oksidasyonla eitli

serbest radikal ana rnleri meydana gelir (Akku, 1995).

2.1.3. Serbest Radikallerin Etkileri

Gl reaktif zellie sahip olan serbest radikaller tm hcre bileenleriyle

kolayca etkileebilirler. Hcrenin savunma mekanizmalar ile ortadan kaldrlmazlarsa,

biyolojik molekllerle reaksiyona girerek yeni serbest radikallerin olutuu zincirleme

bir reaksiyon balatr.

ekil 2.3. Serbest radikallerin hcresel hedefleri (Onat vd., 2002)

17

2.1.3.1. Serbest radikallerin lipidlere etkileri

Lipidler serbest radikallerin etkilerine kar en hassas olan biyomolekllerdir.

Hcre membranlarndaki ve gdalardaki kolesterol ve ya asitleri serbest radikallerle

kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon rnleri olutururlar. oklu doymam ya

asitlerinin serbest radikaller etkisi ile oksidatif ykm nonenzimatik lipid

peroksidasyonu olarak bilinir ve zincir reaksiyonu eklinde ilerler.

Lipid peroksidasyonu organizmada oluan serbest radikallerin zellikle OHin,

membran yapsnda bulunan oklu doymam ya asitlerindeki (PUFA) konjuge ift

balardan bir H atomu karmasyla balar (radikalik reaksiyonun balama aamas).

Bunun sonucunda ya asidi zinciri bir lipid radikali (L) nitelii kazanr. Molekl ii bir

dzenlenme ile daha kararl olan konjuge dienler oluur. Aerobik artlarda, konjuge

dienin molekler oksijenle birlemesi sonucu lipid peroksil radikalleri (LOO) oluur.

LOO oluumu nemlidir, nk membran yapsndaki dier oklu doymam ya

asitlerini etkileyerek, yeni lipid radikallerinin (L) oluumuna yol aar. Kendisi de aa

kan hidrojen atomlarn alarak lipid peroksitlere (LOOH) dnr. Ayrca membran

proteinlerine de saldrabilir. Bylece reaksiyon otokatalitik olarak devam eder. Bu lipid

peroksidasyonunun ilerleme aamasdr (Halliwell ve Gutteridge, 1990).

Lipid peroksidasyonu lipid peroksidlerinin aldehit ve dier karbonil bileiklerine

yklmas ile sona erer (sonlanma basama). Ykldklarnda, ou biyolojik olarak aktif

olan aldehitler oluur. Bu bileikler ya hcre dzeyinde metobolize edilir veya ilk atak

blgesinden hcreye difze olup hcrenin dier blmlerine hasar yayarlar. veya

daha fazla ift ba ieren ya asitlerinin peroksidasyonu sonucu; lipid peroksidasyon

seviyesinin indikatr olarak kabul edilen malondialdehit (MDA) oluur. Lipid

peroksidasyonu, membran yapsna direk ve oluturduu reaktif aldehitlerle dier hcre

bileenlerine indirek olarak zarar veren geri dnmsz bir olaydr (Onat vd., 2002).

18

LH + R L + RH

L + O2 LOO (lipid peroksit radikali)

LOO + LH LOOH + L

LOOH LOO ; LO ; aldehitler ekil 2.4. Lipid peroksidasyonunun temel reaksiyonlar

Hcre membranndaki ve intraselller membranlardaki lipid peroksidasyonu

serbest radikallerin hepsiyle uyarlabilir ve redoks katalisti olarak grev yapan gei

metallerinin varlnda artar.

2.1.3.2. Serbest radikallerin proteinlere etkileri

Proteinler serbest radikallere kar oklu doymam ya asitlerinden daha az

hassastr, ancak proteinin aminoasit ieriine gre radikalik hasardan etkilenme derecesi

deiir. Triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin gibi doymam ba ieren ve metiyonin,

sistein gibi kkrt bulunduran aminoasitlere sahip proteinler serbest radikallerden

kolaylkla etkilenir (Van Der Vliet vd., 1994). Bunun sonucunda karbon merkezli

organik radikaller ve slfr radikalleri oluur. Bu reaksiyonlar sonucu albmin ve

immunoglobin G (IgG) gibi fazla sayda dislfit ba bulunduran proteinlerin tersiyer

yaps bozulur. Hemoglobinin ferro demiri (Fe+2) speroksit ve dier oksitleyici

ajanlarla oksitlenmeye duyarl olup, bunun sonucunda oksijen tamayan

methemoglobin oluur (Murray vd., 1996).

2.1.3.3. Serbest radikallerin nkleik asitlere ve DNAya etkileri

DNA serbest radikallerden kolay etkilenen bir hedeftir. yonize edici

radyasyonla oluan radikaller, DNAy etkileyerek hcre mutasyonuna ve lmne yol

19

aabilirler. Aktive olmu ntrofillerden salnan H2O2 membranlardan kolayca

geebildii iin hcre ekirdeine kadar ular burada oluan hidroksil radikali drt

DNA bazyla kolayca reaksiyona girerek baz modifikasyonlarna yol aar (Halliwell,

1994). DNA hasar onarlmazsa hcre disfonksiyonuna ve hatta hcre lmne yol

aabilir.

HN

N NH

N

O

OHH2N

8-hidroksi guanin

N

NH

OHH

OHH

NH2

O

sitozin glikol

N

NH

NH2

O

OH

H

5-hidroksi sitozin

HN

NH

OHCH3

OHH

O

O

timin glikol

N

N NH

N

NH2

OH

8-hidroksi adenin ekil 2.5. Prin ve pirimidin bazlar zerine OH radikalinin etkisiyle oluan

rnler

2.1.3.4. Serbest radikallerin karbonhidratlara etkisi

Serbest radikallerin karbonhidratlar zerinde polisakkarit depolimerizasyonu ve

zellikle monosakkarit otooksidasyonu gibi etkileri vardr. Monosakkaritlerin

otooksidasyonu sonucu meydana gelen speroksitler ve okzalaldehitler diyabet ve

sigara iimi ile ilgili patolojik olaylarda rol oynar. Okzaldehitler ayrca DNA, RNA ve

proteinlere balanabilme zelliklerinden dolay antimitotik etki gsterirler. Bylece

kanser ve yalanma olaylarnda da rol oynarlar

Ba dokunun nemli bir mukopolisakkaridi olan hiyalronik asit sinoviyal

svda bol miktarda bulunmaktadr. Romatoit artrit gibi enflamatuar eklem

20

hastalklarnda hiyalronik asidin oluan serbest radikal tarafndan paraland

gsterilmitir (Hawkins ve Davies, 1998, McNeil vd., 1985).

Organizmada normal metabolizma srasnda ve patolojik proseslerde serbest

radikaller retilir. Bu serbest radikaller hcresel savunma mekanizmalar ile ortadan

kaldrld iin, ROT retimi antioksidan savunma sistemleri tarafndan

dengelenmektedir. Ancak bazen serbest radikallere metabolize olan toksinler, ar

oksijen konsantrasyonuna maruz kalma, fagositik aktivasyondaki dzensizlikler,

malntrisyon sonucu diyetle antioksidan etkili bileiklerin yetersiz alm gibi sebeplerle

hcrede daha fazla reaktif oksijen trleri oluabilir. Hcresel savunma mekanizmalar

vastasyla ortadan kaldrlandan daha fazla ROT olutuunda oksidatif stres durumu

ortaya kar. Oksidatif stres oksidanlar ve antioksidanlar arasndaki dengenin

oksidanlar ynne kaymas ve hcre hasarna yol amas olarak tanmlanr (Halliwell,

1994). Oksidatif stresin, ROTlarn neden olduu hcre hasarlar sonucu birok

hastala katkda bulunduu dnlmektedir. Yaplan pek ok almada lseratif kolit

(Dal vd., 1997), iskemi/reperfzyon hasar (Cruthirds vd., 2003, Ta vd., 1995),

ateroskleroz (Halliwell ve Gutteridge, 1990), yalanma (Hipkiss, 2007), diabetes

mellitus (Akku, 1995), Alzheimer hastal; Parkinson hastal (Dauer ve Przedborski,

2003, Mosley vd., 2006), sigara kullanm (Zalata vd., 2007, Ksecik vd., 2005) ve hava

kirliliinin (Tao vd., 2003) neden olduu rahatszlklar ve KOAH (Bowler vd., 2004)

gibi akcier hastalklar; eitli kanser trleri; fel; hipertansiyon; romatoit artrit ve

multiple sklerosis gibi otoimmn hastalklar; alerji; astm; septik ok; inflamasyon; akut

pankreatit; yalanmaya bal makler hastalklar ve katarakt (Anderson, 2007,

Halliwell, 1994, Halliwell ve Gutteridge, 1990) gibi klinik durumlara serbest oksijen

radikallerinin katld belirtilmitir. Ancak serbest radikallerin hastalklar zerindeki

nemi ve rol incelenirken, serbest radikal oluumunun hastaln nedeni mi, yoksa

sonucu mu olduunun ayrmna varlmasnn nemi vurgulanmaktadr.

21

2.2. Antioksidanlar

ROT oluumu ve bunlarn meydana getirdii hasar nlemek iin vcutta birok

savunma mekanizmalar vardr. Bu mekanizmalar antioksidan savunma sistemleri

veya ksaca antioksidanlar olarak bilinirler. Antioksidanlar serbest radikalleri

ntralize etmek iin karlkl etkileim halinde olan endergonik ve ekzergonik kaynakl,

ok eitli bileiklerdir. Bu bileikler gda kkenli antioksidanlar (C vitamini, E

vitamini, karotenoidler, lipoik asit gibi), antioksidan enzimler (SOD, glutatyon

peroksidaz, glutatyon redktaz gibi), metal balayc proteinler (ferritin, albmin,

laktoferrin, seruloplasmin gibi) ve bitkilerde yaygn ekilde bulunan eitli antioksidan

fitonutrientlerdir.

Antioksidan terimi uluslararas kabul edilmi herhangi bir tanm ile

snrlandrlmamtr. Gdalardaki antioksidanlar yalar gibi kolaylkla okside olabilen

materyallerin oksidasyonunu nleyebilen veya geciktirebilen kk miktardaki

maddeler olarak tanmlanmtr. Lipidlerin yan sra protein, DNA ve karbonhidrat gibi

okside olabilen dier tm bileikleri de ieren dier bir tanm okside olabilen

substratlara kyasla dk konsantrasyonlarda bulunan ve substratlarn oksidasyonunu

nleyen veya geciktiren maddeler eklindedir (Becker E.M. 2004). Antioksidanlarn

oksidatif reaksiyonlara etkisi farkl ekillerde olabilir (Rice-Evans, 1999, Seven ve

Candan, 1996):

a) ROT olumasn engelleyen sistemler: Demir ve bakr iyonlarn balayan metal

elatrleri, mitokondride doal olarak oluan ROTlar indirgeyen mitokondriyal

sitokrom oksidaz gibi.

b) ROTlar yakalayp ntralize eden antioksidanlar: Flavonoidler, -tokoferol, askorbik

asit, metiyonin, rik asit, -karoten, indirgenmi glutatyon, mukus gibi. Bu tr

antioksidanlar radikalik zincir reaksiyonunun balamasn inhibe eder veya zincir

reaksiyonunun ilerlemesine engel olarak radikalik reaksiyonu sona erdirirler.

22

c) Oluan radikalleri detoksifiye eden sistemleri: ROTlar daha az toksik rnlere

dntren enzim sistemleridir. Speroksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz,

glutatyon redktaz, glutatyon-S-transferaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz.

2.2.1. Antioksidanlarn snflandrlmas

Antioksidanlarn snflandrlmas eitlilik gstermektedir. Doal (endojen

kaynakl) ve eksojen kaynakl antioksidanlar olarak snflandrlabildii (Akku, 1995)

gibi enzim ve enzim olmayan antioksidanlar (Seven ve Candan, 1996) eklinde

snflandrmalar da mevcuttur. Vcudumuzdaki antioksidan savunma sisteminde yer

alan balca elemanlar ise; enzimler, metal iyonlarn balayan proteinler ve suda ve

yada znen radikal tutuculardr (Percival, 1998, Halliwell, 1994).

Tablo 2.2. Organizmada bulunan temel antioksidan savunma sistemleri

Enzimler

Radikal

Yada znenler

Tutucular

Suda znenler

Metal iyonlarn

balayan

proteinler

Speroksit dismutaz E vitamini C vitamini Ferritin (Fe)

Katalaz - karoten Glutatyon Transferrin (Fe)

Glutatyon peroksidaz Bilirubin rikasit Laktoferrin (Fe)

Glutatyon redktaz Ubikinon Sistein Albmin (Cu)

Glutatson S transferaz Flavonoidler Mannitol Seruloplazmin (Cu)

Glukoz-6-fosfat

dehidrogenaz

Melatonin Miyoglobin (Fe)

Lipoik asit

23

2.2.1.1. Enzimler

Speroksit dismutaz (SOD): Serbest radikallere kar organizmadaki ilk

savunma SOD enzimiyle gerekleir. Enzimin fizyolojik fonksiyonu, oksijeni

metabolize eden hcreleri speroksit serbest radikalinin zararl etkilerine kar

korumaktadr. Speroksidin daha az toksik olan H2O2ye dnmn katalizler.

SOD enzimi H2O2 rettii iin H2O2 uzaklatrc enzimlerle ibirlii iinde

alr. karyotik hcrelerde SODun 3 izoformu bulunmaktadr: Sitozolde bulunan

dimerik, Cu ve Zn ieren CuZnSOD, mitokondride bulunan tetramerik, Mn ieren

MnSOD ve hcred svlarda bulunan Cu ve Zn ieren ECSOD. SODun ektraselller

aktivitesi ok dktr (Seven ve Candan, 1996, Akku, 1995, Halliwell, 1994).

Katalaz: Tm hcre tiplerinde deiik konsantrasyonlarda bulunan, zellikle

peroksizomlarda lokalize drt alt birimden oluan bir hemprotendir. H2O2nin

yklmasn salar. H2O2 oluum hznn yksek olduu durumlarda indirgeyici aktivite

gsterir.

H2O2 oluum hznn dk olduu veya yksek konsantrasyonlarda elektron

vericisi bulunduu durumlarda peroksitatif aktivite gsterir (Murray vd., 1996, Onat

vd., 2002).

24

Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px): Normal koullarda katalaz ve glutatyon

peroksidaz hcrenin farkl yerlerinde yerlemi olmalarndan dolay, karacierde

endojen oluan H2O2 seviyesini dzenlemede birlikte etkinlik gsterirler.

Hcrede bulunan H2O2in detoksifikasyonundan esas olarak GSH-Px

sorumludur. Lipid peroksidasyonunun balamasn ve gelimesini engelleyici zellikte

olan bir enzimdir. Sitozolde bulunur. Selenyuma baml ve bamsz olan iki tipi

vardr. Selenyuma baml olan; hem H2O2, hem lipid hidroperoksitlerini, selenyumdan

bamsz olan; sadece lipid hidroperoksitlerini metabolize edebilmektedir.

Hcrelerde ayrca sitozolik olan fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz

(PLGSH-Px) enzimi de vardr. Membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere

indirger.

Reaksiyonlar sonucunda oksitlenmi glutatyon GSSG oluur. Antioksidan

savunmann etkinliini srdrebilmesi iin oksitlenmi glutatyonun tekrar indirgenmi

ekle (G-SH) dnmesi gerekir. GSSG konsantrasyonundaki art oksidatif stresin bir

gstergesidir (Seven ve Candan, 1996).

Glutatyon Redktaz (GSH-Red): GSH-Red prostetik grubu flavin adenin

dinkleotid (FAD) olan, dimerik yapda sitozol ve mitokodride bulunan bir enzimdir

(Halliwell, 1994). NADPH varlnda oksitlenmi glutatyonun indirgenme

reaksiyonunu katalizler.

Glutatyon-S-Transferazlar (GST): GST her biri iki alt birimden olumu bir

enzim ailesidir. Katalitik ve katalitik olmayan ok sayda fonksiyona sahiptirler.

25

Antioksidan savunma mekanizmas asndan nemleri ksenobiyotiklerin (yabanc

maddeler) biyotransformasyonu ve detoksifikasyonunda nemli rol almalar ve bata

araidonik asit ve linoleat hidroperoksitleri olmak zere lipid peroksitlere kar

selenyumdan bamsz GSH-Px aktivitesi gstermeleridir

(http://www.mustafaaltinisik.org, Akku, 1995).

ekil 2.6. Oksidatif strese kar enzimatik savunma mekanizmalar

(http://www.mustafaaltinisik.org)

2.2.1.2. Yada ve suda znen radikal tutucular

Organizmadaki enzimatik savunma sistemlerine ek olarak, endojen olarak oluan

veya gdalarla alnan antioksidan zellii olan molekller de vardr. Bu antioksidanlar

ROTlar dorudan ntralize edebilirler.

C Vitamini (Askorbik asit): C vitamini suda znen bir vitamindir.

Organizmada bir ok bileik iin indirgeyici ajan olarak grev yapar. Gl indirgeyici

aktivitesinden dolay ayn zamanda gl bir antioksidandr.

26

Askorbat etkili olarak H2O2, hipoklorit, speroksit, hidroksil ve peroksil

radikallerini ve singlet oksijeni tutar. Sv fazdaki tm peroksil radikallerini plazma

lipidlerine difze olmadan tutar ve bu ekilde lipid peroksidasyonunun balamasn

engeller. Membranlarda oluan -tokoferol radikali ile reaksiyona girerek -tokoferoln

rejenerasyonunu salar (Akku, 1995, Halliwell, 1994). C vitamininin fagositoz iin de

nemli olduu gsterilmitir; aktive ntrofillerin sebep olduu peroksidasyona kar

plazma lipidlerini korur ve gl bir hipoklorat gidericisidir (Seven ve Candan, 1996).

Sigara dumannda bulunan reaktif oksijen trlerine kar koruma salar, sigara ienlerde

ve pasif iicilerde plazma C vitamini dzeyleri sigara imeyenlere gre dk

bulunmutur. Yaplan eitli almalarda baz gdalarda ve sigara dumannda bulunan

nitrozaminleri inaktive ederek, antitumrjenik rol olduu gsterilmitir (Block, 1999,

Anderson, 2007).

Askorbik asidin yksek konsantrasyonlarda antioksidan aktivitesinin yannda,

dk konsantrasyonlarda prooksidan aktivite gsterdii bildirilmitir. Gei metalleri

varlnda demiri indirgeyerek Fenton reaksiyonu ile OH radikali oluumuna katk

salar. Salkl organizmada gei metal iyonlar proteinlere bal bulunduklarndan, bu

durum in vivo koullarda ok snrldr ve askorbik asidin antioksidan zellii

prooksidan zelliinden daha baskndr (Halliwell, 1994).

-tokoferol: Doada yaygn olarak bulunan E vitamini ailesinin ana bileenidir.

Antioksidan aktivitesi yapsndaki fenolik hidroksil grubuna sahip aromatik halkadan

kaynaklanr (Akku, 1995). Lipofilik zelliinden dolay lipid peroksidasyonuna kar

hcre membranlarnn ve plazma lipoproteinlerinin en nemli zincir krc

antioksidandr. Peroksil radikallerini gidererek lipid peroksidasyonunu inhibe eder.

27

O

CH3HO

H3CCH3

CH3CH2CH2CH2CH

CH3CH3

3

-tokoferol

-tokoferol radikali (T) nispeten stabil ve reaktivitesi az olan bir radikaldir.

Glukuronikasit ile konjugasyona urayp safra ile atlabilir. Okside olduktan sonra veya

atlmadan nce askorbik asit ve glutatyon tarafndan yeniden indirgenebilir. Bylece

rejenere edilmi olur.

In vivo ve in vitro almalar -tokoferol ile glutatyon peroksidazn serbest

radikallere kar birbirini tamamlayc etkisi olduunu gstermitir. GSH-Px olumu

peroksitleri ortadan kaldrrken, -tokoferol peroksitlerin oluumunu engeller (Seven ve

Candan, 1996, Akku, 1995).

Son yllarda aterosklerozun geliiminde lipid peroksidasyonunun zellikle de

LDL peroksidasyonunun etkili ve kritik bir rol oynad bildirilmektedir. -tokoferol

tarafndan lipid peroksidasyonu yaylma basamanda engellenir. -tokoferol almyla

koroner kalp hastalklar riskinin azald deneysel olarak gsterilmitir (Anderson,

2007).

-tokoferol nitritlerin nitrozaminlere dnmn engelleyerek, antikarsinojen

etki gsterir, iskemi/reperfzyon ile ilikili peroksidatif hasar nlemede etkilidir,

immniteyi arttrr, eritrosit membrannn stabilitesi iin esansiyeldir. -tokoferol

selenyumun organizmadan kaybn nleyerek ve onu aktif halde tutarak selenyum

metabolizmasnda da nemli rol oynar (Seven ve Candan, 1996, Anderson, 2007).

Karotenoidler: Bitkilerde yaygn ekilde bulunan doal renk pigmentleridir.

Fotooksidatif proseslere kar bitkileri korur. En bilineni A vitamini ncs olan -

karotendir.

28

Karotenoidler zellikle singlet oksijeni (1O2) ve peroksil radikallerini gideren

etkili antioksidanlardr. Karotenoidler arasnda en etkin 1O2 tutucu; -karotenin ak

zincirli analou olan likopendir (Stahl ve Sies, 1999). LDLyi oksidatif hasara kar

koruyarak ateroskleroz ve dier koroner hastalklarn gelimesini de engeller (Seven ve

Candan,1996).

Likopen

Fotooksidatif proses gz ve deri gibi a maruz kalan dokularda baz

hastalklara neden olan bir olaydr ve ROT oluumuna yol aar. Krle neden olan

yaa baml makler hasarda, singlet oksijenden koruyucu pigmentler zellikle lutein

ve zeaksantindir. Gne yanklarnda grlen eriteme kar koruyucu ve fotooksidatif

hasar nleyici pigment -karotendir. Lipofilik zelliklerinden dolay, oksidatif hasara

kar hcresel mebranlar ve lipoproteinleri korumada nemli rol oynarlar. -karoten

reaktif azot trlerini gidermede C ve E vitaminleri ile sinerjik etki gsterir (Stahl ve

Sies, 2003, Stahl ve Sies, 1999).

Flavonoidler: Bitkilerin sekonder metabolitleri olan polifenolik bileiklerdir.

Gnmzde bitkilerden izole edilen 4000den fazla flavonoid bilinmektedir. Halka

yaplarna gre flavonoller, flavonlar, flavanonlar, antosiyaninler, kateinler ve

izoflavonoidler olarak snflandrlr (Bilalolu ve Harmandar). Flavonoidler ve dier

bitki fenoliklerinin O2-, lipid alkoksil (RO), lipid peroksil (ROO) ve NO radikallerini

temizleme, Fe ve Cu elatlama, -tokoferol rejenerasyonu gibi fonksiyonlara katld

29

da bildirilmitir (Miller ve Ruiz-Larrea, 2002, Ross ve Kasum, 2002, Rice-Evans,

1999).

Flavonoid ve fenolik antioksidanlar anomerik hidroksil grubundan lipid

radikallerine bir hidrojen atomu vererek lipid oksidasyonunu engeller. Bileiin yaps

ile antioksidan kapasitesi ilikilidir, fenolik bileiklerde OH grubu says,

flavonoidlerde B halkasnn 5-OH, 3-OH ve 4-OH gruplar olmas antioksidan aktivite

zerinde etkilidir (Cotella vd., 1996, imen, 1999).

Glutatyon (G-SH): Organizmann tm hcrelerinde bulunan glutamikasit-

sisteinglisinden oluan bir tripeptidtir. Aminoasitlerin hcre iine tanmas grevinden

baka, eitli metabolik fonksiyonlar vardr (Onat vd., 2002). Suda znen nemli bir

antioksidandr. H2O2, dislfitler, askorbat ve serbest radikalleri indirgeyebilir ve

bylece hcreleri oksidatif hasara kar korur. zellikle eritrosit membrann H2O2den,

lkositleri fagositozda retilen oksidan maddelerden ve lens proteinlerini oksidatif

hasardan korur. Glutatyon eritrositlerde hemoglobinin ve dier proteinlerin tiyol

gruplarn (-SH) indirgenmi halde tutarak onlar oksidasyona kar korur. Bylece

hemoglobinin methemoglobine dnmn, fonksiyonel protein ve enzimlerin de

inaktivasyonunu engeller.

30

rik asit: Purin metabolizmasnn son rn olan rat plazmada bulunan ve

suda znen bir maddedir. Normal plazma konsantrasyonlarnda bulunan rat (160-

450 M/L) hidroksil, speroksit, peroksit radikalleri ve singlet oksijeni giderir. Fakat

lipid radikalleri zerinde etkisizdir (Akku, 1995).

rik asidin plazmada askorbik asidi stabilize etme fonksiyonu direk antioksidan

aktivitesinden daha nemli bulunmaktadr (Keaney ve Frei, 1994).

Bilirubin: HEM metabolizmasnn memelilerdeki son rnlerinden biri olan

bilirubin rat ve askorbat ile birlikte plazmann temel antioksidanndan biridir

(Stryer, 1995, Seven ve Candan, 1996). Suda znen peroksitlere kar koruma

salamada askorbat kadar etkilidir. In vitro koullarda dk konsantrasyonlarda lipid

peroksidasyonunu inhibe ettii gsterilmitir (Yeilkaya vd., 1998).

Melatonin: Melatonin immnite, uyku, reme ve sirkadien ritmin (yaz-k, uzun

gn-ksa gn, aydnlk-karanlk dngsnn) dzenlenmesi gibi birok biyolojik

fonksiyonda rol oynayan bir hormondur (Reiter, 1998). Literatrde ilk kez antioksidan

etkili olarak 1991de yer alm ve daha sonra in vitro ve in vivo almalarla

desteklenmitir. OH, H2O2, 1O2, HOCl, NO,ONOO- gibi serbest radikalleri detoksifiye

ettii bilinmektedir. Hem suda hem lipid fazda znebildiinden, geni bir alanda

antioksidan aktivite gsteren gl bir antioksidandr (Yazc ve Kse, 2004).

31

NH

H2C

CH2

HN

CCH3

O

H3CO

Melatonin -Lipoik Asit: Kkrt ieren, endojen bir antioksidandr. OH radikali ve H2O2i

ntralize eder. Hem lipid hem sulu fazda serbest radikalleri giderir. Prooksidan metalleri

elatlayarak da antioksidan etki gsterebilir (Percival, 1998, Packer vd., 1995, Scott vd.,

1994).

2.2.1.3. Metal iyonlarn balayan proteinler

Gei metallerinin nemi; oksidan hasarn dolayl yoldan hzlandrmalardr.

Demir ve bakr iyonlar in vivo koullarda baz az reaktif bileiklerin ok ksa srede

daha reaktif ekillerine dnmelerini salayabilirler. Bu yzden organizmada tayc

protein ve depo proteinlerine bal halde tutulurlar (Halliwell, 1994, Onat vd., 2002).

Vcuttaki demirin 2/3 hemoglobinde, az bir ksm miyoglobinde, eitli

enzimlerde, demir tayc protein transferrinde ve kalan ksm da ferritindedir. Ferritin

dokulardaki demiri balayp depolar. Laktoferrin ve transferrin dolamdaki serbest

demiri balarlar. Albmin miyoloperoksidaz kataliziyle oluan HOClnin

giderilmesinde etkilidir, ayrca bakr da balar (Halliwell ve Gutteridge, 1990).

Seruloplazmin plazmadaki bakr balayan bir proteindir ve ekstraselller antioksidan

savunmaya katk salar. Seruloplazmin enzimatik tarz bir mekanizma ile Fe2+y

Fe3+ya ykseltgeyerek Fenton reaksiyonunu ve dolaysyla OH oluumunu inhibe eder

(Gutteridge vd., 1980).

32

2.2.2. Eksojen antioksidanlar

Eksojen antioksidanlar vitaminler, ilalar ve gda antioksidanlar olarak

snflandrlabilir. -tokoferol (E vitamini), -karoten, askorbik asit (C vitamini), folik

asit vitamin olan eksojen antioksidanlardr.

la olarak kullanlan eksojen antioksidanlar unlardr; ksantin oksidaz

inhibitrleri (alloprinol, oksiprinol, folikasit), NADPH oksidaz inhibitrleri

(adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, non-steroid antiinflamatuvar

ilalar), rekombinant SOD, Trolox C (E vitamini analou), endojen antioksidan

aktiviteyi arttranlar (GSH-Px aktivitesini arttran ebselen ve asetilsistein), nonenzimatik

radikal toplayclar (mannitol, albumin), sitokinler (TNF, IL-1), demir elatrleri, demir

redoks dngs inhibitrleri (desferroksamin, seruloplazmin) (Onat vd., 2002).

2.3. Gdalar ve Antioksidanlar

Organizmamzda doal olarak bulunmalarnn yannda antioksidan bileiklerle

gnlk hayatmzda da srekli etkileim halindeyiz. Beslenmemizin byk ksmn

oluturan meyve ve sebzeler ile doal antioksidan etkili bileikleri aldmz gibi,

ilenmi gdalar ve market rnlerinin tketimiyle de bu gdalara katk maddesi olarak

eklenen sentetik antioksidanlar almaktayz.

2.3.1. Gdalarda doal olarak bulunan antioksidan maddeler

Diyetle alnan taze meyve ve sebzelerin eitli hastalklara kar koruyucu etki

gsterdii bilinmektedir. Bu koruyucu etkinin besinlerde bulunan askorbik asit, -

tokoferol, -karotenoidler, glutatyon, fitosteroller, flavonoidler, kumarinler, fenolik

asitler, selenyum ve izotiyosiyanatlar gibi antioksidan zellikli bileiklerden

kaynakland dnlmektedir. Bu bileikler detoksifikasyon enzimlerini indklemek,

33

nitrozamin oluumunu inhibe etmek, karsinojenleri balamak gibi eitli

mekanizmalarla antioksidan aktive gsterirler (Pokorny, 1991, Steinmetz ve Potter,

1996, Vecchia vd., 2001). Yaplan epidiyomolojik almalarla meyve ve sebzelerin

ierdii fitonutrientlerin diyabet, obesite, katarakt ve kardiovaskler hastalklarn ve

zellikle baz kanser trlerinin oluma riskini azaltt gsterilmitir (Schrder, 2007,

Tavani vd., 1996, Giugliano vd., 2006).

Sebze ve meyve tketimi ile kanser riski arasndaki ilikiyle ilgili pek ok

aratrma yaplmaktadr. Bu bilimsel almalardan 206 adet insan epidemiyolojik

almas ve 22 adet hayvan denemesine ait bilimsel makale derlendiinde; mide,

yemek borusu, grtlak, yutak, akcier, pankreas, kolon ve endometrium kanserinde

meyve ve sebze tketiminin koruyucu etkisi olduu kantlanmtr. Kansere kar

koruyucu etkisi olan sebze ve meyve eitleri genellikle i sebzeler, allium sebzeleri

(soan, sarmsak, prasa), havu, yeil sebzeler, turpgiller (brokoli, Brksel lahanas,

lahana, karnabahar gibi) ve domatestir (Steinmetz ve Potter, 1996).

Benzer bir alma 1983-1999 yllar arasnda talyann kuzey blgesinde

yaplm olup sebze tketiminin eitli kanser trlerinde gl koruyucu etkisi olduu

gzlenmitir. Ayrca; Akdeniz diyetinde ok tketilen ve likopen ierii yksek olan

domatesin, -karoten, E vitamini gibi antioksidanlarn kanserle ilikisi incelenmitir

(Vecchia vd., 2001).

Gnlk beslenmemizde en az bir kan tkettiimiz zm, nar, elma, zms

meyveler, adaay, biberiye, kekik, brokoli, domates, soan, sarmsak, havu, spanak,

karnabahar, lahana, kereviz, ay, yeilay, arap, siyah zm suyu (Prior, 1998, Nehir

El vd., 1999, Frankel, 1999, Halvorsen, 2002, Opara ve Rockway, 2006, Orak, 2006,

zcan vd., 2007) gibi eitli meyve, sebze ve ieceklerle yaplan aratrmalarda,

zellikle flavonoid arlkl olmak zere, ierdikleri fitorutrientlerin yksek antioksidan

aktiviteler gsterdii bildirilmektedir. Bu nedenle vcudun endojen savunma sisteminin

diyetle alnacak antioksidan bileikler ile desteklenmesi gerektii bildirilmektedir.

34

2.3.2. Gdalara ilave edilen sentetik antioksidanlar

Gdalarn korunmas ve depolanmas srasnda meydana gelen en byk

problemlerden biri lipid oksidasyonu olup; yalarda aclamaya (ransidleme), ya

ieren dier gdalarda ise renk, tat, aroma, tekstr ve kvamda bozulmalara ve besinsel

kalitenin azalmasna neden olmaktadr. Gda endstrisinde lipid oksidasyonu

engellemek veya azaltmak, toksik oksidasyon rnlerinin olumasn engellemek,

besinsel kaliteyi srdrmek ve gdann raf mrn uzatmak amacyla antioksidan

kullanm gereklidir (Finley ve Given, 1986). Trk Gda Kodeksi Ynetmeliine gre

de antioksidanlar yalarn aclamas ve renk deiiklii gibi oksidasyonun neden

olduu bozulmalar nleyerek, gdalarn raf mrlerinin uzatlmasn salayan maddeler

olarak tanmlanmaktadr (http://www.kkgm.gov.tr).

Bu amala gda endstrisinde yalarda ve yaca zengin dier gdalarda

btillendirilmi hidroksitoluen (BHT), btillendirilmi hidroksianisol (BHA), propil

gallatlar (PG), tert-btil hidroksikinon (TBHQ) gibi sentetik antioksidanlar gda katk

maddesi olarak yllardan beri kullanlmaktadr. Aada ekil.2.7de bu maddelerin

formlleri verilmitir.

ekil 2.7. Gdalarda katk maddesi olarak kullanlan baz sentetik

antioksidanlarn formlleri

35

Son yllarda yaplan almalar bu bileiklerin toksiditesini ve karsinojenik

zelliklerini ortaya koyar niteliktedir. Ayrca gnmz toplumunda gelir dzeyi

ykseldike ve beslenme konusundaki bilin arttka sentetik rnlere kar duyulan

kuku artm ve doal rnlere ynelme balamtr. Fare, hamster ve sanlarla yaplan

in vivo almalarda, sentetik antioksidanlardan zellikle BHAnn bu kemirgenlerde

mide ve mesane tmr oluumuna yol at ve karsinojen olduklar gsterilmitir (Ito

vd., 1985, Ito vd., 1986, Hirose vd., 1997). Buna karlk kemirgenlerde BHAnn

karsinojenik olmadn gsteren almalar da vardr (Conning ve Phillips, 1986). FDA

(Amerikan Gda ve la Dairesi) normalde vcuda alnan dk BHA dzeyinin insanlar

iin risk oluturmadn belirtmektedir (Blumenthal vd., 1986).

Sentetik antioksidanlarn insan sal asndan potansiyel toksik olabileceinin

ne srlmesi, zellikle gnmzde tketici tercihlerini doal tarmsal rnlere

yneltmi ve ilenmi gdalarda da salk, kalite ve gvenlik araylarn n plana

karmtr. Aratrmaclar ve gda bilimcileri sentetik antioksidanlarn yerine

geebilecek doal antioksidanlar aratrma gayreti iine girmilerdir. Bu amala

yeryznde geni dalm gsteren bitkisel kaynaklara ynelinmekte ve bu

kaynaklardan elde edilecek doal antioksidanlarn gdalarn ilenmesi srasnda sentetik

antioksidanlar yerine gdalara ilave edilmesi hedeflenmektedir. zellikle kanser ve diyet

arasndaki ilikinin nemi dnldnde antioksidan aktiviteye sahip bitkisel

kaynaklarn direk tketimi veya bu materyallerden elde edilecek ekstraktlarn yemeklik

yalarda ve dier gda maddelerinde koruyucu olarak kullanm giderek nem

tamaktadr.

36

Tablo 2.3. Gdalar korumada kullanlan baz sentetik antioksidanlar *

Antioksidan Kodu Kullanld Gdalar

Askorbik asit tuzlar

E300-302

Bebek mamas; emlsifiye hayvansal-

bitkisel yalar; reel, jle ,marmelat; arap,

st-sttozu; ilenmi, dondurulmu veya

konserve rnler; ekmek, makarna; kyma-

dan hazrlanan et karmlar; meyve-sebze

sular.

Sentetik tokoferoller

(alfa-, beta-, gama-)

E307-309

Bebek mamas; emlsifiye hayvansal-

bitkisel yalar; reel, jle, marmelat; arap,

st-sttozu; ilenmi, dondurulmu veya

konserve rnler; ekmek, makarna;

kymadan hazrlanan et karmlar; rafine

zeytinya; ya ieren tahl, biskvi, gevrek.

Propil gallat

BHA

BHT

TBHQ

E310

E320

E321

E319

Isl ilem grm gdalardaki kat-sv

yalar; Kat-sv kzartma yalar;

Balk, sr, koyun, kanatl yalar;

Sakz; tahl bazl erez; hazr kek karm;

kurutulmu patates ve et; sttozu (otomatik

makine iin); toz orba ve soslar; eni

verici maddeler; eitli gda takviyeleri;

ilenmi sert kabuklu meyveler.

*Trk Gda Kodeksinin konuyla ilgili ksmndan yararlanlarak hazrlanmtr.

zellikle baharatlar doal antioksidan kayna olarak kabul grm ve bir

ounun antioksidatif bileikleri de izole edilmitir (Madsen ve Bertelsen, 1995, Ho vd,

2000, Juliani ve Simon, 2002, Miyajima vd., 2004, Masuda vd., 2004). Biberiye,

adaay, kekik, mercankk, zencefil ekstraktlarnn msr, balk, zeytin, fndk,

ayiei, soya yalar zerindeki oksidasyon stabilitesi incelenmi ve etkili sonular

bulunmutur (Yanishlieva ve Marinova, 2001). Biberiye, adaay, kekik ve sarmsak ile

yaplan bir baka almada ise, bu baharatlarn etin zgarada piirilmesi srasnda

37

oluan karsinojenik etkili heterosiklik aminlerin oluumunu % 60 orannda azaltt

bildirilmitir (Murkovic vd., 1998). Yksek antioksidan aktivitesinden dolay biberiye

ekstrakt ticari olarak gda stabilizasyonu ve et rnlerinde kullanlmaktadr (Vazgeer

vd., 2005).

Doal ve bitkisel kaynaklardan yeni antioksidan aray artarak devam ederken

bu kaynaklarn ucuz, yenilebilir ve bol bulunur olmas da nemli bir konudur. Dk

maliyetlerinden dolay tarmsal ve endstriyel atklarn doal antioksidan kayna

olarak kullanm zellikle ilgi ekicidir. Patates kabuu atklar, zm kabuu ve

ekirdei, zeytin kspesi, havu pulpu at, yal ay yapraklar, soya fasulyesi melas,

narenciye ekirdei ve kabuklar ucuz antioksidan kayna olarak allm ve

bazlarnn polifenolik bileikleri tanmlanmtr (Muare vd., 2001, Jayaprakasha vd.,

2003, Nandita ve Rajini, 2004,).

Bu tez kapsamnda da yapraklar salata ve baharat olarak tketilen dereotu,

gelincik, kuzukula, roka ve tere gibi bitkilerin in vitro koullarda antioksidan

aktiviteleri eitli metodlarla belirlenmitir. Yksek antioksidan aktivite gsteren bitki

ve ekstraktlarnn doal antioksidan olarak bu alanda deerlendirilmesi

dnlmektedir.

2.4. Antioksidan Aktivite Tayin Metodlar

Diyet antioksidanlarnn oksidatif stresle ilgili hastalklarn nlenmesindeki

pozitif etkilerinden dolay, antioksidanlar son yllarda artan bir ilgi konusu haline

gelmitir. Antioksidanlar ve oksidatif stresle ilgili makale says geen on ylda

(1993ten 2003e kadar) 4 katna kmtr. Bu art tketilen gdalarn antioksidan

kapasitesini ve bileiklerini renmek iin beslenme, salk ve gda bilimi uzmanlarnn

ve zellikle halkn artan ilgisinden dolaydr.

38

Gda bileiminin kompleksliinden gdadaki antioksidan bileiklerin

multifonksiyonel olmas ve sinerjistik etkileimlerinden dolay, gdadaki her bir

antioksidan bileiin zel olarak ayrlmas ve allmas pahal ve zordur. Antioksidan

alannn kompleks bir konu olmasndan dolay aratrmaclar arasnda antioksidanlar

deerlendirmede kullanlan metodlara ait fikir uyumazlklar da bulunmaktadr. Bunu

minimize etmek iin standardize edilmi testlere byk ihtiya vardr. Bu yzden

aratrmaclar antioksidan etkinliin hzl, gvenilir biimde ve bir kimyasal reaksiyon

ile llmesini salayabilecek metod gelitirme arzusundadrlar. Buna ramen in vitro

koullarda antioksidan kapasiteyi lmeyi amalayan ok sayda metod mevcuttur.

Ancak her bir deerlendirme farkl oksidasyon artlar altnda ve farkl

oksidasyon rnlerini lmek iin birka metod kullanarak yaplmaldr (Frankel ve

Meyer, 2000). Son zamanlarda toplam antioksidan kapasite veya toplam antioksidan

aktiviteyi lmek iin birka metod gelitirilmitir. Trolox ekivalenti antioksidan

kapasite (TEAC), toplam radikal tutma parametresi (TRAP), demir (III) iyonu

indirgeme gc (FRAP) ve oksijen radikalini absorblama kapasitesi (ORAC) bunlardan

bazlardr.

Bu metodlar substrat, prob, reaksiyon artlar ve antioksidan etkinin hesaplanma

ekline gre birbirinden farkldr. Bu yzden farkl metodlardan alnan sonular

karlatrmak son derece zordur (Frankel ve Meyer, 2000).

Bu metodlar kimyasal reaksiyonlarna gre balca iki gruba ayrlrlar:

Hidrojen atomu transferine (HAT) dayanan metodlar ve bir tek elektron

transferine (ET) dayanan metodlar. HAT- ve ET-temelli metodlar rnein koruyucu

antioksidan kapasitesi yerine radikal veya oksidan giderici kapasitesini lmeyi

hedefler. Basit lipidsiz sistemlerde; antioksidandan serbest radikal moleklne

elektron transferi veya H+ verilmesinin direk lm yaplr. Bu metodlar ticari kit

halinde de olup, yaygn ekilde kullanlrlar.

39

Tablo 2.4. In vitro koullarda uygulanan antioksidan aktivite tayin metodlar

HAT-temelli metodlar

Oksijen radikalini absorblama kapasitesi

(ORAC)

Linoleik asit oksidasyonunun inhibisyonu

(TRAP)

LDL oksidasyonunun inhibisyonu (TRAP)

Crocin aartma metodu

ET-temelli metodlar

Trolox ekivalenti antioksidan kapasite (TEAC)

Fe(III) iyonu indirgeme gc (FRAP)

DPPH radikali giderme aktivitesi

FCR ile toplam fenolik bileik tayini

Dier metodlar

Tiyobarbitrikasit ile oksidasyon rnlerinin

tayini (TBARS)

Peroksit deeri (POV)

Ransimat metodu

eitli serbest radikalleri yakalama metodlar

2.4.1. HAT-temelli metodlar

ORAC, TRAP gibi HAT-temelli metodlarda peroksil radikali (ROO) retmek

zere bir radikal balatc kullanlr. Eklenen antioksidan radikaller iin ortamdaki

substrat ile yarr. ROO tercihen antioksidandan bir hidrojen atomu alr. Sonuta

ROO ve hedef molekl arasndaki reaksiyon inhibe edilir veya geciktirilir (Ou vd.,

2002, Huang vd., 2005).

ORAC (Oksijen Radikalini Absorblama Kapasitesi) metodu: eitli ekstraktlar

ve fitokimyasallarn antioksidan aktivitesini lmek iin kullanlr. Metodun ilk halinde

prob olarak fluoresan bir protein olan -fikoeritrin (-PE) ile ve peroksil radikal

balatcs olarak AAPH (2,2'-azobis(2-amidinopropan)dihidroklorit) bileii ile

allmtr. Ancak -PEnin fotostabil olmamas, polifenolik maddelerle etkileimi ve

40

radikal balatc eklenmediinde bile fluoresansnn azalmas dezavantajlaryla

karlalm ve sonralar ORAC metodu, prob olarak -PE yerine floressein

kullanlarak gelitirilmitir. Floressein (FL, 3',6'-dihidroksispiro [izobenzofuran-1[3H],

9'[9H]-ksanten]-3-on) protein olmayan sentetik bir probdur (Becker vd., 2004).

Bu metotta radikal balatc olan AAPH, floressein veya -PEnin fluoresansnda

azalmaya neden olur. Reaksiyon ilerledike fluoressein veya -PE tketilir. Antioksidan

varlnda AAPH radikalleri giderilir ve fluoresans azalmas inhibe edilir (Tomer vd.,

2007).

TRAP (Toplam Radikal Tuzaklayc Antioksidan Parametre) metodu: Plazma

ve serumun total antioksidan kapasitesini lmek iin gelitirilmitir. Bu metod

plazma antioksidanlarn okside etmek iin ABAP (2,2'-azobis(2-amidinopropan)

hidroklorit) radikal balatcs tarafndan peroksil radikallerinin retilmesi ve meydana

gelen oksidasyon srasnda tketilen oksijenin llerek izlenmesine dayanr. Daha

sonra metod, oksitlenebilir bir lipid substrat olan linoleik asidin eklenmesiyle modifiye

edilmitir (Frankel ve Meyer, 2000). Modifiye metotta Cu2+ ya da bir azo balatcs ile

linoleik asit oksidasyonu yapay olarak indklenir, otooksidasyonun ilerleyii linoleik

asit oksidasyonundan oluan konjuge dienperoksitlerin absorbansnn takibi ile izlenir

(Huang vd., 2005).

Crocin aartma metodu: Crocin doal bir karotenoid trevidir. Metod serbest

radikal balatc AAPH (2,2'-azobis(2-amidinopropan)dihidroklorit) tarafndan, crocinin

aarmasn nlemede antioksidanlarn inhibisyon kapasitesini ler. Crosin safrandan

elde edilen doal pigmentler karm olduu iin ok fazla eitlilie sahiptir ve

karotenoidler gibi dier gda pigmentleri ayn dalga boyunda (=450 nm) k absorblar.

Bu da crocinin endstriyel uygulamasn snrlar (Huang vd., 2005).

41

2.4.2. ET-temelli metodlar

Antioksidann, Fe3+, ABTS+ gibi bir oksidan tarafndan ykseltgenmesi

sonucunda bir elektron antioksidandan oksidana transfer edilir, bu da oksidann renk

deiimine neden olur. UV/VIS ile absorbans deiimi llr. Bu absorbans

deiiminin derecesi antioksidan konsantrasyonuyla orantl olduundan, antioksidann

indirgeyici kapasitesi tayininde kullanlr. FCR ile toplam fenolik bileik tayini, Cu2+

indirgeme kapasitesi, TEAC ve FRAP metodlar bu snfa girer.

FCR ile toplam fenolik bileik tayini: Metod balangta proteinlerde fenol

grubu ieren tirozin kalnts ile Folin-Ciocalteu ayracnn (FCR) etkileiminden dolay

protein analizi iin dnlmtr. Daha sonralar daha geniletilerek toplam fenol

metodu olarak kullanm artmtr. FCR Cu+, C vitamini gibi fenolik olmayan bileikler

tarafndan da indirgenebildii iin fenolik bileiklere spesifik deildir. Ancak fenolik

bileikler sadece bazik artlar altnda (metotta pH10 iin karbonat zeltisi kullanlr)

FCR ile reaksiyon verir. Fenolik antioksidanlarn varlnda ayrataki Mo(VI)nn

indirgenmesiyle renk sardan maviye dner ve 760 nmde absorbans llr.

FCR rnein indirgeyici kapasitesini len bir metod olduu iin antioksidan

kapasite ve FCR ile toplam fenol metodu arasnda korelasyon bulunur. Basit ve

tekrarlanabilir bir metod olduundan, fenolik antioksidan almalarnda rutin olarak

kullanlmaktadr (Huang vd., 2005).

TEAC (Trolox Ekivalenti Antioksidan Kapasite) metodu: lk kez 1993 ylnda

bildirilen metod daha sonralar gelitirilmitir. Bu metotta metmiyoglobin/H2O2

sisteminin oluturduu ferrilmiyoglobin radikali ABTS (2,2'-azinobis(3-

etilbenzothiazolin-6-slfonat)) ile etkileerek ABTS+ katyonik radikalini retir. Oluan

ABTS+ radikalinin antioksidan tarafndan giderilmesi 734 nmde absorbansn

azalmasyla takip edilir (Frankel ve Meyer, 2000). Modifiye metotta ise ABTS+

radikali, ABTSnin potasyum perslfat oksidasyonuyla direk retilir. Antioksidan

kapasite suda znen E vitamini analou olan trolox konsantrasyonu (mM) olarak

tayin edilir. TEAC, 1 mM troloxunkiyle ayn aktiviteyi gstermek iin gerekli olan

42

antioksidan konsantrasyonunu ifede eder. Artan kullanmna ramen baz snrlamalar

vardr, en byk dezavantaj sentetik ABTS+ radikalinin biyolojik sistemlerde

bulunmamasdr (Becker vd., 2004, Huang vd., 2005).

FRAP (Fe(III) yonu ndirgeme Gc) metodu: Bu metotta dk pHda ferrik

tripiridiltriazin kompleksi (Fe3+-TPTZ) antioksidanlarn etkisiyle ferrz kompleksine

(Fe2+-TPTZ) indirgenir. Oluan kompleksin 593 nmde absorbans llr. Bylece

elektron vermenin antioksidanlarn toplam indirgeme kapasitesiyle lineer olduu

varsaylr. Bu yaklamn ana dezavantaj, metod okside olabilen bir substrat

iermediinden antioksidanlarn koruyucu zellikleri hakknda bilgi salamamasdr

(Benzie ve Strain, 1996, Huang vd., 2005).

DPPH radikali giderme metodu: 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) radikali

ticari olarak mevcut, stabil radikallerden biridir. Fenolik antioksidanlarn aktiviteleri

zerinde yap etkisini almak iin kullanlan ilk sentetik antioksidanlardan biridir.

Etanoldeki zeltisi mor renklidir ve 515 nmde maksimum absorbans verir.

Antioksidan tarafndan indirgenince rengi solduu iin reaksiyonun ilerleyii

spektrofotometre ile izlenir. DPPHin renginin solmas antioksidan konsantrasyonu ile

orantldr. Balangtaki ilk DPPH konsantrasyonunu % 50 azaltmak iin gerekli

antioksidan miktar antiradikal etkinliki ifade eder ve EC50 (mg/ml) olarak

isimlendirilir (Frankel ve Meyer, 2000). EC50 deeri antioksidan aktiviteyi lmek iin

daha yaygn olarak kullanlan bir parametredir.

N N

O2N

O2N

NO2

DPPH

Oksidan olarak Cu2+ kullanan toplam antioksidan potansiyel metodu: Bu

metoda dair az sayda yaynlanm bilgi vardr. rnekte bulunan indirgenler

(antioksidanlar) tarafndan Cu2+ Cu+e indirgenir. Cu+ kromojenik bir reaktif olan

43

batokupronin (2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10-fenantrolin) ile kompleks oluturur. 490

nmde maksimum absorbans llr (Huang vd., 2005).

2.4.3. Lipid oksidasyon markerlerini len metodlar

Lipid model sistemlerinde reaktanlarn kayb (oksijen, ya asitleri), serbest

radikal oluumu ve primer ve sekonder oksidasyon rnlerinin (hidroperoksitler,

aldehitler, ketonlar, asitler) oluumunun tayin edilmesi lipid oksidasyonunda en yaygn

kullanlan indikatrlerdir. Peroksit deeri (POV), tiyobarbtirik asit reaktif trlerin

(TBARS) tayini ve ksa zincirli ya asitlerinden kaynaklanan iletkenliin (Ransimat

metodu) lm lipid oksidasyonunun tayininde en sk kullanlan metodlardr.

POV tayininde iki farkl metodla lipid peroksitlerin oluumu izlenir.

Metodlardan biri olan iyodometrik yntem; oluan peroksitlerin iyodr (I-) ile

reaksiyona girerek iyot (I2) oluturmas ve oluan iyodun titrimetrik yntemle tayin

edilmesi esasna dayanr. Ferrik tiyosiyanat metodunun esas ise, oluan peroksitlerin

Fe2+ iyonlarn Fe3+e ykseltgemesi ve ortama eklenen tiyosiyanat ile oluturulan

kompleksin spektrofotometrik olarak tayinine dayanr (Pan vd., 2007).

TBARS tayini ile aldehitler, ketonlar, asitler ve hidrokarbonlar gibi sekonder

oksidasyon rnlerinin oluumu tayin edilir. Sadece lipit peroksidayonunun son rn

olan malondialdehite (MDA) spesifik olmayp, dier okso bileiklerini de ler (Becker

vd., 2004).

Ransimat ynteminde antioksidan aktivite yalarda bulunan doymam ya

asitlerinin yksek scaklkta peroksidasyonu sonucu oluan bozunma rnlerinin su

iine absorbe edilerek, Ransimat cihaz ile suyun iletkenlii tayin edilir (Barrera-

Arellano ve Esteves, 1992).

44

2.4.4. Dier ROS giderici kapasiteleri len metodlar

nsan vcudunda oksidatif hasara neden olabilen O2-, H2O2, OH, 1O2 ve

ONOO- gibi reaktif oksijen trleri olduu bilinmektedir. O2- SOD enzimi ve H2O2

katalaz enzimi ile zararsz trlere evrilebilirken OH, 1O2 ve ONOO-i gidermek iin

enzimatik faaliyet bilinmemektedir. Bu yzden rneklerin oksidan giderici kapasiteleri

deerlendirilirken, metotlar bu reaktif oksijen trlerini de ierecek ekilde

dzenlenmelidir. In vitro koullarda eitli radikal retici sistemler kullanlarak

antioksidanlarn serbest radikal tuzaklama yeteneklerinin lm iin baz metdlar

kullanlmaktadr.

O2-radikali giderme kapasitesi tayini: NADH/PMS/O2 sistemi ile (Franke vd.,

2004, Glin vd., 2003) ve riboflavin/metiyonin sisteminde flavinin fotokimyasal

indirgenmesi ile non-enzimatik olarak (Dasgupta ve De, 2007) veya hipoksantin/ksantin

oksidaz sistemi ile enzimatik olarak (Wood vd., 2003) speroksit radikali retilir.

Radikal giderme aktivitesi substrat olarak kullanlan NBTnin indirgenmesiyle tayin

edilir. Bu metotta oluturulan O2- radikalleri sar renkli NBT2+yi mavi renkli formazan

trevine indirger. Ortamda antioksidan bileik varsa mavi-mor NBT oluumu inhibe

edilir. Ancak NBTnin direk antioksidan tarafndan indirgenmesi de szkonusudur.

OH radikali giderme kapasitesi tayini: Biyolojik olarak OH radikali byk

lde Fenton reaksiyonu ile olutuu iin in vitro koullarda da Fe2+/H2O2 sistemiyle

retilir ve antioksidann OH radikalini giderebilme gc llr. Ancak pek ok

antioksidan ayn zamanda metal elatr olduu iin Fe2+nin aktivitesini deitirebilir.

Bu yzden deerlendirilen antioksidann iyi bir metal elatlayc m veya OH radikali

giderici mi olduunun kesin anlalamamas metodun dezavantajdr (Becker vd., 2004).

Peroksinitrit (ONOO-) giderici kapasitenin tayini: ONOO- gl bir antioksidan deildir, ancak fizyolojik pHda protonlanm hali olan peroksinitrz asit

(ONOOH) ok gl bir oksidandr. zellikle protein hasarndan sorumlu olduu

dnlr. ONOO- giderici lmler genellikle ONOO- tarafndan tirozinin

45

nitrolanmasnn inhibisyonuna dayanr. Nitrozaminlerin HPLC ile ayrmna dayanan ve

uzun sren bir metottur (Becker vd., 2004).

2.5. almada Kullanlan Bitkiler ve zellikleri

Bitkiler insan beslenmesinde ve yaamnda nemli rol oynar. zellikle

yapraklar veya eitli ksmlar sebze olarak tketilen pek ok bitki, ayn zamanda halk

arasnda tedavi edici amalarla da kullanlmaktadr. almamzda kullanlan dereotu

(Anethum graveolens L), gelincik (Papaver rhoeas L.),