transformação genética e suas aplicações em pesquisa...
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GaTE LabGenomics and Transposable Elements
Transformação genética e suas aplicações em pesquisa e
biotecnologia
Profa. Dra. Magdalena Rossi
Que é um organismo geneticamente modificado
(OGM)?
•São aqueles que recebem um ou mais genes de outro organismo e passam assim a expressar uma
nova característica de interesse.
•OGMs = melhoramento genético clássico.-cruzamentos naturais ou forçados com seleção humana
(milho/teosinte?)-introgressão de genes de espécies selvagens em S.
lycopersicum.
•OGMs= tão antigos quanto a agricultura (mas não são produzidos por
transformação).
DNAGenes de interesse:existem na natureza, não são
“inventados nem “sintetizados”.” Célula:animal, vegetal, bactéria, etc
Que é um transgênico?
Melhoramento genético:
Característica de interessePlanta de interesseEstabilidade da informação transferida
Gene de interessePlanta de interesseEstabilidade da informação transferida
Ambos dependem da seleção das cultivarespara uso comercial em etapas subsequentes.
“CLÁSSICO” “TRANSFORMAÇÃO DIRETA”
• Técnicas de transformação genética de plantas:
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
• Aplicações Biotecnológicas (produtostransgênicos)
• Técnicas de transformação genética de plantas:– Agrobacterium (método biológico)– Bombardeamento (método físico)– Eletroporação )método físico)
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada
• Aplicações Biotecnológicas (produtostransgênicos)
Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledôneas, mono) e Gimnospermas)
Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium)
A. tumefaciens(galha-da-coroa)
A. rhizogenes
A. tumefaciens
Histórico
• 1907; descreve-se a doença
• 1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium
• 1970; constata-se a correlação entre a doençae um plasmídeo
• 1979; transferência de um fragmento de DNA da bactéria para a célula vegetal
Agrobacterium
- Transfere um fragmento de DNA, o T-DNA, do
plasmídio Ti no genoma vegetal.
- Inserção em posição aleatória dentro do
genoma.
- Induz a proliferação celular originando
tumores ou raízes a partir da célula transformada.
- As células vegetais transformadas sintetizam
substâncias chamadas opinas que são a fonte de
C e N das bactérias.
Organização de pTi ou pRi
síntese de opinas e oncogenes (síntese de citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas)
(conjugação entre
agrobactériasdo solo)
(origem de replicação e região de
incompatibilidade)
(catabolismo de opinas)
(transferência do T-DNA: genes de
virulência)200Kb
Borda esquerda
Borda direita
Região transferida
PLANT CELL
AGROBACTERIUM
PhenolicsProduced by Wounded Plant cell
VirA VirG
Phenolicsdetected by the VirA/VirG two component sensor system.
VIP1 associates with the complex to target it to the nucleusVIP2 associates the complex to transcriptionallyactive DNAT-DNA integrates into plant DNA
and gall production is initiated.
Gall Formation!
Vir Gene expression induced
Bacterial Plasmid Formation of T-Pilus (VirB and VirD4
T-DNA
Vir D1 & D2 cut T-DNA at right and left borders and starts T-DNA synthesis (VirC)
VirD2 attaches to exposed 5I end
Formation of T-complex
VirE2
Transferência do T-DNA
Transformação via Agrobacterium
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção na bactéria.
-Introdução da construção na célula vegetal pela bactéria.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
Organização de pTi ou pRi
GENE DE INTERESSE + MARCADOR DE SELEÇÃO
(conjugação entre
agrobactériasdo solo)
(origem de replicação e região de
incompatibilidade)
(catabolismo de opinas)
(transferência do T-DNA: genes de
virulência)200Kb
Borda esquerda
Borda direita
Região transferida
Transformação de explantes
T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistência para seleção de transformantesSEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES
Células 3-4 dias em cultura liquido
4 ml
Bactérias de 1-2 dias em cultura
50 – 100 ul
3 dias de co-cultivo
ReplaqueamentoReplaqueamento ememmeiomeio seletivoseletivo
Meio + antibióticospara seleção
Após 7 dias
1 2
3 4 5 6
7 8 9 10
11 12
Transformação de células
ReplaqueamentoReplaqueamentoemem meiomeio seletivoseletivo
Meio MS30 sólido Carb + Vanc + Higro
1 2
3 4 5 6
7 8 9 10
11 12
U3A3MR::GUS U3A2MR::GUS Controle -
Transformação de células e seleção
Células crescendo emmeio seletivo
Células que não cresceramem meio seletivo
U3B::GUS
Transformação via bombardeamento (canhão gênico)
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção de interesse por um mecanismo físico.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de
tecidos).
Gene de interesseProm
VETOR
Bombardeador
Partículas de tungstêniocarregando DNA
Transformação genética de plantas: bombardeamento
Gene de interesse+
Gene de resistência para seleção de transformantes
Bombardment
Diferênça com vetor de Agro!
Transformação via eletroporação
-Obtenção da construção contendo o gene de interesse e um marcador de seleção.
-Introdução da construção de interesse por um método físico.
-Desenvolver a tecnologia para a regeneração da espécie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos).
D
E
F
Transformação genética de plantas: eletroporação
Gene de interesse+
Gene de resistência para seleção de transformantes
Gene de interesseProm
VETOR
E
• Técnicas de transformação genética de plantas:– Agrobacterium (método biológico)– Bombardeamento (método físico)– Eletroporação )método físico)
• Aplicações na pesquisa básica e aplicada– Conhecer o padrão temporal de expressão de um gene (?)– Conhecer o padrão espacial de expressão de um gene (?)– Conhecer a resposta de um gene a diferentes estímulos– Estudar os genes envolvidos nos diferentes processos
fisiológicos (ex. resistência a patógenos, floração, etc)
• Aplicações Biotecnológicas (produtos transgênicos)