Transzláció prokariótákban

A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek

30S 30S*

30S* + mRNA PKk1

k-1

PKk2

k-2

IK

IK TKk3

( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNSMet)

( preiniciációs komplex)

( iniciációs komplex)

( transzlációs komplex)

K1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős.

k2 a SD és a transzlációs start kodon közti távolság,

és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.

A transzláció hatékonyságát meghatározó elemektechnikai megközelítés

Shine - Dalgarno szekvencia

GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez,

pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon) 10 x növekedés a termék mennyiségében

a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációtHasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja.

Transzlációs start kodon

kodon gyakoriság

AUG 91 %

GUG 8 %

UUG 1 %

Az AUG előtti szekvenciák

20x-os különbség

UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet)

G-k kerülendők

Az AUG utáni szekvenciák

30x -oskülönbségek lehetnek

AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)...

A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala)

transzlációs szabályozás a 2. kodonnal

+10 régió AT gazdag

Távolság a start kodon és a SD között

- meglehetősen érzékeny, általban 4 - 13 bázispár megengedett.

- Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat.

A köztes szekvencia összetétele

“A” jó, ha van (2x-es stimulus), “C” mindegy

“U” a "-4"-es pozícióban hatékony “G” gátol (3x-os

gátlás)Upstream nemtranszlálódó szekvencia

Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac).

Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.

Kodon felhasználási preferencia

Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak,

a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják

az azonos aminosavakat kódoló tripleteket.

Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata

nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént

a gazda sejt preferenciájának megfelelően.

Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása,

ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével

[gbbct]: 50 CDS's (13879 codons)

Sphingomonas paucimobilis

AmAcid Codon Number /1000 Fraction Gly GGG 208.00 14.99 0.17 Gly GGA 70.00 5.04 0.06 Gly GGT 117.00 8.43 0.10 Gly GGC 827.00 59.59 0.68 Glu GAG 476.00 34.30 0.60 Glu GAA 318.00 22.91 0.40 Asp GAT 297.00 21.40 0.35 Asp GAC 558.00 40.20 0.65 Val GTG 386.00 2 7.81 0.43 Val GTA 40.00 2.88 0.04 Val GTT 65.00 4.68 0.07 Val GTC 412.00 29.69 0.46 Ala GCG 630.00 45.39 0.40 Ala GCA 142.00 10.23 0.09 Ala GCT 108.00 7.78 0.07 Ala GCC 687.00 49.50 0.44 Arg AGG 35.00 2.52 0.04 Arg AGA 12.00 0.86 0.01 Ser AGT 24.00 1.73 0.04 Ser AGC 232.00 16.72 0.3 Lys AAG 465.00 33.50 0.86 Lys AAA 76.00 5.48 0.14 Asn AAT 151.00 10.88 0.37 Asn AAC 252.00 18.16 0.63

Met ATG 376.00 27.09 1.00 Ile ATA 19.00 1.37 0.03 Ile ATT 117.00 8.43 0.17 Ile ATC 570.00 41.07 0.81 Thr ACG 228.00 16.43 0.33 Thr ACA 29.00 2.09 0.04 Thr ACT 41.00 2.95 0.06 Thr A CC 383.00 27.60 0.56 Trp TGG 250.00 18.01 1.00 End TGA 37.00 2.67 0.74 Cys TGT 21.00 1.51 0.11 Cys TGC 167.00 12.03 0.89 End TAG 5.00 0.36 0.10 End TAA 8.00 0.58 0.16 Tyr TAT 213.00 15.35 0.56 Tyr TAC 170.00 12.25 0.44 Leu TTG 71.00 5.12 0.06 Leu TTA 4.00 0.29 0.00 Phe TTT 8 6.00 6.20 0.14 Phe TTC 542.00 39.05 0.86 Ser TCG 204.00 14.70 0.31

Kodon felhasználási preferencia – táblázat

egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban,vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.

STOP kodonSTOP kodon

UAA

UGA

UAG

kötődő faktor

RF1, RF2

RF1

RF2

UAA >> UGA, UAG

Az esetek 80 %-ában:UAAU

KÉT CISZTRONOS EXPRESSZIÓS RENDSZER

1 Cisztronos rendszer

ATG struktúrgén

5’ 3’

SD

mRNS

2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje

2. STOP

1. STOP

ATG 1. cisztron5’ 3’

1. SD

ATG 2. cisztron

2. SDmRNS

STOP

Az 1. cisztron tetszőlegesen tervezhetú, de:- ne legyen túl hosszú, hogy ne terhelje feleslegesen a sejtet (felesleges műtermék) néhány aminosav- AT gazdag legyen a másodlagos struktúrák elkerülése végett.

1 Cisztronos rendszer

ATG struktúrgén

5’ 3’

SD

mRNS

2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje

2. STOP

1. STOP

ATG 1. cisztron5’ 3’

1. SD

ATG 2. cisztron

2. SDmRNS

STOP

Az 1. cisztron STOP kodon pozíciója a 2. cisztron Shine-Dalgarno szekvenciájához

képest meghatározó a transzláció hatékonysága szempontjából.

PÉLDA bGH (marha növekedési hormon)Egy cisztronos rendszerben < 0.4 % fehérjeKét cisztronos rendszerben 1. cisztron ...GGAGGAATAACATATG...2. cisztron.elrendeződésben 24 % fehérje termeltethető

Kifordított – antiriboszómális kötőhelyen alapuló - rendszer

PROTEOLÍZIS

Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa

E. coli-ban

Abnormális fehérjék,sejten belüli

aggregátumok ATP függő endoproteázok

polipeptidek< 1500 Da

endoproteázok

peptidek aminosavak

oldékony mono-, di- és tripeptidázok

La (Lon) a fő ATP függő proteáz

87 kDa egységekből felépülő homotetramer,

ATP és Mg2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés

felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell,

in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb.

hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj

mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív

abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása)

szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít

alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja,

a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll:

32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke

inaktív proteáz(4 ADP)

proteinszubsztrát

4 ADP

4 ATP - Mg2+

alloszterikus aktiválásaktív proteáz

(4 ATP)

4 PO43-

4 Mg 2+

Proteolitikus ciklus

Genetikai vonatkozások

léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok

A lon- mutáció másodlagos hatásai Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34oC)Megoldás:

37oC-on növeszteni galE struktúrgének inaktiválása cps (capsule) struktúrgének inaktiválása rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok

A lon mutánsok UV érzékenyek

DNS sérülés filamentációGazdag médiumon akár letális is lehetok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA.

Megoldás:- ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont- sulA mutánsok

Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz

81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer,ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű

ATP és Mg2+ faktorok szükségesekhidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól

az alegységek külön multimerizálódnak

HtpR szabályozás alatt áll

Tulajdonság Ti (Clp) proteáz ClpP ClpA

aktivitás fehérje degradációATP hidrolízis mellett

peptidázATP független

ATP-ázfehérje aktivált

Kofaktor Mg2+ - Mg2+

Inhibítor MalNEt, iPr2P-F iPr2P-F MalNEt

Stabilizálás ATP, glicerin hőstabil ATP, glicerin

natív méret 700 kDa 260 kDa 160 kDa

alegységek 6 ClpA + 12 ClpP 21 kDa 81 kDa

Genetikai vonatkozások

Rendelkezésre állnak clp mutánsok

a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt hatékony

Egyéb proteázok

OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz

DegP periplazmatikus proteáz T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket

pin gén terméke: La inhibitor

E. coli törzs genotípus Kiindulási törzs Megjegyzés

lon mutánsok

SG1117 gal lac lon-146::Tn10 leu

sup+ rec+ HB101 Tetraciklin

rezisztens, jól transzformálható

SG12041 gal, lon-510 sulA recA C600 nincs filamentációRec-

lon htpR mutánsok

SG21163 lon-510 supFts htpRam165 MC4100 hőmérséklet érzékeny

lon clp mutánsok SG12044 gal lon-510 sulA

clpA319::kan C600 kanamycin

rezisztens

lon clp htpR mutánsok

SG21173 lon-510 supFts htpRam165 clpA319::kan lac

MC4100 kanamycin rezisztens,

hőmérséklet érzékeny

Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre

FÚZIÓS FEHÉRJÉK

A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit

a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze,

hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen.

Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást

követő régiókként helyezkednek el.

ELŐNYEI

1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet 2. Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok 3. szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált) 4. Az in vitro hasítás sokszor pontosabb,

intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez

Oldhatatlan 

"iclusion bodies"trpEII, vagy cII,

nincs proteolízis, differenciális centrifugálással az "inclusion body" könnyen tisztítható,

probléma: nem aktív fehérjepl sometostatin, inzulin A, B,

ellenanyag termelés

Oldható forma

biológiailag aktív fehérje,

affinitás oszlopon való tisztítás

problémák a stabilitással,

kevésbé jósolható

Fúziós fehérjék oldhatósága

Egyéb hasznosítási lehetőségek

1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később)

a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet,diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF

A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűenkevesebb proteáz,könnyebb tisztítás

2. A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható

3. funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználásalkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra.

4. megfelelő hasítás után az intakt fehérje tetszőleges biokémiai, biofizikai vizsgálata

A fúziós fehérjék tisztításának elve

I. 1. affinitás kromatográfia

II. hasítás III. 2. affinitás kromatográfia

tiszta fehérje

fúziós partner

célfehérje

A fúziós fehérjék típusai I.

I. Szekréció

S XTP

Megjegyzés

pl. humán növekedési hormonalkalikus foszfatáz szignál

szekvenciával

II. Polimerizáció

X X

TP fehérje-élettartam növekedés,pl. proinzulin 1-2 percről 60 perc,

IGF 200x-os növekedés

III. C-terminális fúzió

A X

TP a fúziós partner intakt szabályozó régiója használható, pontosabb proteolitikus hasítás

IV. N-terminális fúzió

X BTP amino terminális szekvenciák

meghatározása, a proteolititkus hasítás csonkot hagyhat a “B” N-terminálisán

A fúziós fehérjék típusai II.

V. A szekréció és a C-terminális fúzió kombinációja

A XS

TPa termék folyamatosan kinyerhető

affinitáskromatográfiával

VI. Kettős fúzió

A X B

TP

A XB

TP

X A B

TP

nagy tisztaságú, nagy stabilitású termék,

hátrány: két tisztítás, hasítás

szükséges

VII. Szekréció-inszerció

X IS

TPmembrán fehérjék

termeltetése a membránban

Fehérje Származási hely molekulasúly (kDa)

szekréció

ligand

-galaktozidáz

Escherichia coli 116 - TPEG, APTG

Protein A Staphylococcus aureus

31 + IgG

Z szintetikus 7 + IgG

CAT Escherichia coli 24 + klóramfenikol

sztreptavidin Streptomyces 13 + biotin

PhoS Escherichia coli 36 + hidroxilapatit

Protein G Streptococci 28 + albumin

MBP Escherichia coli 40 + keményítô

GST Escherichia coli 26 - glutation

poliarginin szintetikus 1-3 - ioncsere

poliglutamát szintetikus 1-2 - ioncsere

polihisztidin szintetikus 1-7 + Ni2+, Zn2+, Cu2+

Fúziós partnerfehérjék

CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje; PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz;

TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.

FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I.

KÉMIAIhasító ágens

hasítási hely

brómcián - Met

hangyasav - Asp Pro -

hidroxilamin - Asn Gly -

ENZIMATIKUS

aminopeptidázok 1 - 3 aminosavat hasítanak az N-terminálisról

karboxipeptidázok1 - 2 aminosavat hasítanak a C-terminálisról

FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II.

Endopeptidázok

ENZIMATIKUS

ENZIM HASÍTÁSI HELY

kollagenáz - Pro - Val Gly - Pro -

enterokináz - Asp - Asp - Asp - Lys

Xa faktor - Ile - Glu - Gly - Arg

trombin - Gly - Pro - Arg

tripszin - Arg, Lys

klosztripain - Arg

Ala64-szubtilizin - Gly - Ala - His - Arg

Nómenklatúra:szekréció: az extracelluláris térbeexport: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe

A fehérje szekréció

Előnyei

A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet

Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb, korrektebb protein folding

  A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan

stabilabb termékek

Baktériumok membránszerkezete

SZEKRÉCIÓ E. coli-ban

nem hatékony vagy nem teljes transzport a membránon keresztül  alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, idő előtti fehérjedegradáció

ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs módosítása szükséges,akkor ennek hiánya

kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak jó eredmények nagy molekulák esetén problémák lehetnek,

pl az ER hiánya (módosítások színhelye) vannak fehérjék, amelyek nem szekretálhatóak,

esetleg letális, pl -galaktozidáz fúziós fehérjék exportja

Fő protein transzport mechanizmusok bacteriumokban

Sec útvonal: egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre

Tat útvonal: több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is tartalmaz(hat)naktranszport: a fehérje összeszerelődése után

SRP, signal recognition particle, és receptoraE. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY

Poszttranszlációs transzport

Kotranszlációs transzport

 - szignál szekvencia,  - szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep), Ala-X-Ala felismerőhely - szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák eltávolítása lipoproteinekrôl  - sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok felhalmozódásához vezet, Némi átfedés van közöttük.

 - Régebben prl nómenklatúra is volt  - SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belső membránkötött, ATP-áz aktivitás, kölcsönhatás a szállítandó fehérjével

 - SecB szekréció kompetens konformációért felelős

- SecYEFG a csatorna kialakításáért felelős

- SecD a periplazmatikus térbe való “leválásért”

Sec útvonal E. coli-ban

SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.

Standard szignál peptid

COOH

“N” “H” “C”

1K vagy R

hidrofób hélix, sok A és L,nem lehet P, K, R, D, E, H, R

fordulatPG

hasítóhely

AGS

-1 +1

AX

semleges vagynegatív

fM Gfordulat

AVS

-3

Lipoprotein szignál peptid

“C”

COOH

“N” “H”

1K vagy R

hidrofób hélix, sok A és L,nem lehet P, K, R, D, E, H, R

hasítóhely

AG

-1 +1

Dlipoprotein kiválasztó

szignál

semleges vagynegatív

fM

L

Gram-pozítív baktériumok

a szignál peptid szignifikánsan hosszabb kiterjedtebb “H” régió

a “H” régióban a Leu dominál

nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály

a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav

SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II.

Eukarióták

az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli export mechanizmusafelismer(het)i, illetve fordítva

A Sec függő fehérje transzlokáció modellje

E. coli-ban

ATP

ADP+Pi

SPáz Y E G

A

B

Y E G

A

ATP

ADP+Pi

Y E G

A

D

H+

H+

periplazma

citoplazma

INICIÁCIÓ TRANSZLOKÁCIÓ KISZABADULÁS

N+ C+

C N

citoplazma

Átjutás a C-terminális véggel,

ez az áltatános

Átjutás az N-terminális véggel,

inszerció

A Sec útvonal - másképpen

A Sec útvonal - másképpen

A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusokösszehasonlítása

Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal

A Sec és az SRP közötti választás: “trigger” faktor

membrán fehérjékre jellemző

Twin-arginine szignál peptid

n-régió c-régióh-régió

N

+moderáltanhidrofóbS/T-R-R-x-F-L-K

n-region c-region

Sec szignál peptid

h-region

Nerősen

hidrofób

+

Signal sequences for targeting

SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le

A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise citoplazmatikus összeszerelődési modell

Periplazma

Citoplazma

csatorna

Holoenzim

kofaktor(ok)prekurzor

szignál peptid

citoplazma

membrán

periplazma

N NN

N

C

C

CC

TatATatE

TatB

TatC

The twin-arginine translocase (Tat) proteins

cciitoplatoplazmazma

TatCTatB TatA

membrmembráánn

aktív formát felvettaktív formát felvett enzimenzim

A TAT modell