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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD BIODEGRADADORA DE LAS CEPAS: Auricularia delicata y Pleurotus sajorcaju PARA DISMINUIR LOS PCB’s CONTENIDOS EN

ACEITES DIELÉCTRICOS

TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PARA

LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA QUÍMICA

AUTOR: BRENDA JADIRA ESTRELLA ANDRADE

TUTOR: BQ. MAGDALENA DE LOS ÁNGELES DÍAZ ALTAMIRANO

QUITO

2016

ii

© DERECHOS DE AUTOR

Yo, ESTRELLA ANDRADE BRENDA JADIRA, en calidad de autor del trabajo de

titulación, modalidad proyecto de investigación: EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD

BIODEGRADADORA DE PCB´S PROVENIENTES DE ACEITES DIELÉCTRICOS

MEDIANTE EL USO DE Auricularia delicata y Pleurotus sajorcaju, autorizo a la

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me

pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente

académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

Asimismo autorizó a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización

y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a

lo dispuesto en el Art, 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

En la ciudad de Quito, a los 22 días del mes Julio de 2016

_________________________

Estrella Andrade Brenda Jadira

CC: 1721635629

[email protected]

mailto:[email protected]

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, BQ Magdalena Díaz en calidad de tutora del trabajo de titulación, modalidad

proyecto de investigación: “EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD BIODEGRADADORA

DE PCB´S PROVENIENTES DE ACEITES DIELÉCTRICOS MEDIANTE EL USO DE

Auricularia delicata y Pleurotus sajorcaju”, elaborado por el estudiante Brenda Jadira

Estrella Andrade de la Carrera de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería Química

de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y

méritos necesarios en el ámbito metodológico y el campo epistemológico, para ser

sometido a la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que lo

APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea habilitado para continuar con el

proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito, a los 26 días del mes Julio de 2016

iv

A mis padres Vicente y Marisol y

a mis hermanos Rody y Karen,

con mucho cariño y respeto.

v

AGRADECIMIENTOS

El autor expresa sus agradecimientos a:

A la Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Ingeniería Química y a sus

profesores.

Al Dr. Ramiro Castro, jefe del laboratorio del Ministerio de Electricidad y Energías

Renovables por su orientación y valioso aporte para la realización del presente trabajo.

A la BQ. Magdalena Díaz, profesora de la Facultad de Ingeniería Química por su

respetable apoyo.

vi

CONTENIDO

pág.

LISTA DE TABLAS ....................................................................................................... x

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xii

LISTA DE ANEXOS .................................................................................................... xiii

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... xiv

RESUMEN .................................................................................................................. xv

ABSTRACT ................................................................................................................ xvi

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................... 3

1.1. Biorremediación .................................................................................................... 3

1.1.1. Definición. .......................................................................................................... 3

1.1.2. Contaminantes orgánicos persistentes .............................................................. 3

1.1.3. Bifenilos policlorados (PCB’s) ............................................................................ 3

1.1.4 Opciones tecnológicas para la destrucción de PCB’s.......................................... 3

1.1.5. Biodegradación por hongos. .............................................................................. 4

1.2. Hongos. ................................................................................................................ 4

1.2.1. Definición ........................................................................................................... 4

1.2.2. Hongos de la podredumbre blanca. ................................................................... 4

1.3. Enzimas. ............................................................................................................... 5

1.3.1. Definición. ........................................................................................................... 5

1.3.2. Mecanismos de reacción. ................................................................................... 5

1.4. Aceites dieléctricos. ............................................................................................... 5

1.4.1. Definición ........................................................................................................... 6

vii

1.4.2. Propiedades de los aceites dieléctricos............................................................... 6

1.4.3. Aplicaciones de los aceites dieléctricos .............................................................. 6

1.5. Bifenilos policlorados (PCB’s). .............................................................................. 6

1.5.1. Definición. ........................................................................................................... 6

1.5.2. Propiedades físico-químicas de los PCB’s. ......................................................... 7

1.5.3. Usos. .................................................................................................................. 8

1.5.4. Impacto ambiental. .............................................................................................. 8

1.5.5. Toxicidad. ........................................................................................................... 8

1.5.6. Desventajas de los PCB’s. .................................................................................. 8

1.6. Determinación de concentración de PCB’s en aceites dieléctricos......................... 9

1.6.1. Generalidades. ................................................................................................... 9

1.6.2. Pruebas para la determinación de presencia de PCB’s según el Manual de ........

Procedimientos para el Manejo de PCB’s en el Sector Eléctrico Ecuatoriano. .............. 9

1.6.1.1. Pruebas Cualitativas para determinar la presencia de PCB’s. ......................... 9

1.6.2.2. Pruebas Cuantitativas para determinar la presencia de PCB’s...................... 10

1.7. Crecimiento microbiano. ..................................................................................... 11

1.7.1. Definición. ......................................................................................................... 11

1.7.2. Cultivo de microorganismos. ............................................................................. 12

1.7.3. Medios de cultivo. ............................................................................................. 12

1.7.4. Agar papa-dextrosa (PDA). ............................................................................... 12

1.8. Polisorbato 20 ..................................................................................................... 12

1.8.1. Definición. ........................................................................................................ 12

2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ......................................................................... 13

2.1. Descripción del proceso. ..................................................................................... 13

2.2. Diseño experimental. .......................................................................................... 14

2.2.1. Codificación ...................................................................................................... 14

2.2.2. Diagramas de flujo. .......................................................................................... 15

2.3. Materiales y equipos. .......................................................................................... 17

viii

2.4. Sustancias y reactivos ........................................................................................ 18

2.5. Procedimiento. .................................................................................................... 18

2.5.1. Reproducción de las cepas puras. ................................................................... 18

2.5.2. Adaptación de las cepas fúngicas a dos concentraciones diferentes de .............

PCB’s ......................................................................................................................... 19


PCB’s con adición de tween 20. ................................................................................. 20


PCB’s con adición de tween 20 e inoculando una cepa adaptada al aceite ....................

previamente. ............................................................................................................... 21

2.5.5. Extracción de aceite dieléctrico del medio de cultivo sólido para análisis por ........

cromatografía de gases. ............................................................................................. 22

2.5.6. Preparación de la muestra para análisis por cromatografía de gases. .............. 22

2.5.7. Protocolo para muestreo de crecimiento de las cepas fúngicas en las ................

diferentes concentraciones y condiciones de siembra. ............................................... 23

2.6. Datos experimentales de áreas a través del tiempo ............................................ 23

2.6.1. Áreas a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s. ........... 23

2.6.2. Áreas a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s con .........

adición de tween 20. ................................................................................................... 24

2.6.3. Áreas a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s con .........

adición de tween 20 inoculando una cepa adaptada al aceite previamente. ............... 26

2.7. Datos experimentales de concentraciones de PCB’s iniciales y finales ................ 28

2.7.1. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Pleurotus sajorcaju ........... 28

2.7.2. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Auricularia delicata ........... 29

3. CÁLCULOS Y RESULTADOS ................................................................................ 30

3.1. Cálculos para la curva de cinética de crecimiento ............................................... 30

3.1.1. Cálculo del radio de crecimiento ...................................................................... 30

3.2. Cálculos para degradación de PCB’s .................................................................. 30

3.2.1. Cálculo de la cantidad inicial de PCB’s en masa .............................................. 30

ix

3.2.2. Cálculo de la cantidad final de PCB’s en masa ................................................ 31

3.2.3. Cálculo de la cantidad degradada en masa ..................................................... 31

3.2.4. Cálculo del porcentaje de degradación ............................................................ 31

3.3. Análisis estadístico ............................................................................................. 32

3.4. Resultados para la cinética de crecimiento ......................................................... 32

3.4.1. Radios a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s ........... 32

3.4.2. Radios a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s ...............

inoculando cepas adaptadas previamente al aceite. ................................................... 34

3.5. Resultados de la degradación de PCB’s ............................................................. 39

3.5.1. Porcentaje de degradación de PCB’s para Pleurotus sajorcaju ........................ 39

3.5.2. Porcentaje de degradación de PCB’s para Auricularia delicata ........................ 41

3.6. Resultados del análisis estadístico...................................................................... 43

3.6.1. Análisis de Normalidad .................................................................................... 46

3.6.2. Análisis de la igualdad de varianza .................................................................. 47

4. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 49

5. CONCLUSIONES ................................................................................................... 51

6. RECOMENDACIONES ........................................................................................... 53

CITAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................... 54

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 56

ANEXOS ..................................................................................................................... 57

x

LISTA DE TABLAS

pág

Tabla 1. Composición del medio de cultivo Agar papa-dextrosa (PDA) ..................... 12

Tabla 2. Codificación para Pleurotus sajorcaju ........................................................... 14

Tabla 3. Codificación para Auricularia delicata............................................................ 15

Tabla 4. Áreas a través del tiempo para Pleurotus sajorcaju ....................................... 25

Tabla 5. Áreas a través del tiempo para Auricularia delicata ....................................... 25

Tabla 6. Áreas a través del tiempo para Pleurotus sajorcaju inoculando una cepa .........

adaptada al aceite previamente. ................................................................................. 26

Tabla 7. Áreas a través del tiempo para Auricularia delicata inoculando una cepa ........

adaptada al aceite previamente. ................................................................................. 27

Tabla 8. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Pleurotus sajorcaju .............

concentración 1 .......................................................................................................... 28

Tabla 9. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Pleurotus sajorcaju .............

concentración 2 .......................................................................................................... 28

Tabla 10. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Auricularia delicata ...........

concentración 1 .......................................................................................................... 29

Tabla 11. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Auricularia delicata ...........

concentración 2 .......................................................................................................... 29

Tabla 12. Radios a través del tiempo para Pleurotus sajorcaju ................................... 33

Tabla 13. Radios a través del tiempo para Auricularia delicata ................................... 33

Tabla 14. Radios a través del tiempo para Pleurotus inoculando una cepa adaptada .....

al aceite previamente. ................................................................................................. 34

Tabla 15. Radios a través del tiempo para Auricularia delicata inoculando una ..............

cepa adaptada al aceite previamente. ....................................................................... 35

Tabla 16. Promedio de radios ..................................................................................... 36

Tabla 17. Porcentaje de degradación de PCB’s para Pleurotus sajorcaju ......................

concentración 1 .......................................................................................................... 40

Tabla 18. Porcentaje de degradación de PCB’s para Pleurotus sajorcaju ......................

concentración 2 .......................................................................................................... 40

xi

Tabla 19. Porcentaje de degradación de PCB’s para Auricularia delicata .....................

concentración 1 .......................................................................................................... 41

Tabla 20. Porcentaje de degradación de PCB’s para Auricularia delicata .......................

concentración 2 .......................................................................................................... 41

Tabla 21. Promedio de porcentajes de degradación ................................................... 42

Tabla 22. Análisis estadístico ...................................................................................... 43

Tabla 23. Análisis de normalidad ................................................................................ 46

xii

LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1. Estructura general de los PCB’s .................................................................... 7

Figura 2. Ejemplos de PCB’s ........................................................................................ 7

Figura 3. Esquema general de un cromatógrafo de gases .......................................... 10

Figura 4. Detector de captura de electrones ............................................................... 11

Figura 5. Curva de crecimiento de Hongos: tipos indefinido y definido ....................... 11

Figura 6. Diagrama de flujo con la descripción del proceso ........................................ 14

Figura 7. Adaptación de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y ...........

206 ppm...................................................................................................................... 15

Figura 8. Adaptación de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y ...........

206 ppm con tween 20 ................................................................................................ 16

Figura 9. Siembra de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206 ..........

ppm con tween 20 de cepas ya adaptadas previamente ............................................. 16

Figura 10. Curva de crecimiento de los dos hongos en medio de cultivo sólido a ..........

dos concentraciones con cepas sin adaptar ............................................................... 37

Figura 11. Curva de crecimiento de los dos hongos en medio de cultivo sólido a ..........

dos concentraciones con cepas adaptadas ................................................................ 37

Figura 12. Curva de crecimiento del hongo Pleurotus sajorcaju en medio de ................

cultivo sólido a dos concentraciones con cepas sin adaptar y adaptadas ................... 38

Figura 13. Curva de crecimiento del hongo Auricularia delicata en medio sólido ...........

a dos concentraciones con cepas sin adaptar y adaptadas ........................................ 38

Figura 14. Promedios de porcentaje de degradación para las dos cepas, a dos .............

condiciones y dos concentraciones diferentes ............................................................ 42

Figura 15. Influencia de cepas sin adaptar sobre la concentración inicial ................... 43

Figura 16. Influencia de cepas adaptadas sobre la concentración inicial .................... 44

Figura 17. Influencia de la concentración de 60 ppm sobre la condición ..................... 44

Figura 18. Influencia de la concentración de 206 ppm sobre la condición ................... 45

Figura 19. Influencia de Pleurotus sajorcaju sobre la condición .................................. 45

Figura 20. Influencia de Auricularia delicata sobre la condición .................................. 46

Figura 21. Gráfica de análisis de Normalidad ............................................................. 47

Figura 22. Gráfica análisis de Varianza ...................................................................... 48

xiii

LISTA DE ANEXOS

pág.

ANEXO A. Materiales usados para la reproducción de las cepas ............................... 58

ANEXO B. Materiales usados para la extracción de aceite dieléctrico del medio de .......

cultivo. ........................................................................................................................ 62

ANEXO C. Materiales usados en la preparación de las muestras para posterior ...........

análisis en C.G. .......................................................................................................... 65

ANEXO D. Cromatogramas de resultados .................................................................. 67

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

PCB’s Bifenilos Policlorados

CG Cromatografía de gases

COP Contaminantes orgánicos persistentes

PDA Agar papa dextrosa

ppm Partes por millón

UV Ultra violeta

COL. Colonizada

A Área

r Radio

m𝑖 Masa inicial

m𝑓 Masa final

V𝑖 Volumen inicial

𝑉𝑓 Volumen final

C𝑖 Concentración inicial

C𝑓 Concentración final

m𝑑 Masa degradada

Fs Estadístico para la distribución F

sa2 Varianza para la variable a

sb2 Varianza para la variable b

H0 Hipótesis nula

Ha Hipótesis alternativa

S Significación del análisis de varianza

RC Radio de colonia

t Tiempo

PSA Pleurotus sajorcaju sin adaptar

PA Pleurotus sajorcaju adaptado

ASA Auricularia delicata sin adaptar

AA Auricularia delicata adaptada

xv

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD BIODEGRADADORA DE LAS CEPAS: Auricularia

delicata y Pleurotus sajorcaju PARA DISMINUIR LOS PCB’s CONTENIDOS EN

ACEITES DIELÉCTRICOS.

RESUMEN

Se estudió la capacidad biodegradadora de las cepas Pleurotus sajorcaju y Auricularia

delicata para disminuir PCB’s contenidos en aceites dieléctricos.

Para ello se elaboraron dos medios de cultivos sólidos: a) Cepas inoculadas en agar

(sin adaptar) y b) Cepas inoculadas en agar más contaminante (adaptadas); las cuales

se inocularon a los aceites dieléctricos con concentraciones de 60 y 206 ppm de PCB’s,

y mediante cromatografía de gases con captura de electrones se cuantificaron los

porcentajes de degradación. Adicionalmente, se elaboraron las curvas de crecimiento

microbiano para cada experiencia, con los datos del registro fotográfico de las áreas de

crecimiento, las cuales facilitaron la determinación de los radios de colonia que se

graficaron en función del tiempo.

Los resultados evidenciaron que la mayor degradación de PCB’s fue del 89,83%, la cual

fue obtenida con la cepa adaptada Auricularia delicata, cuyo crecimiento en el

contaminante fue superior a la de la otra cepa. Los hongos tuvieron un mejor desarrollo

con una concentración de 206 ppm de PCB’s.

PALABRAS CLAVE: /BIODEGRADACIÓN/ BIFENILOS POLICLORADOS/ HONGOS/

PLEUROTUS SAJORCAJU/ AURICULARIA DELICATA/ CONTAMINANTES

ORGÁNICOS/ ACEITES DIELÉCTRICOS/

xvi

STUDY ABOUT THE BIODEGRADATION CAPACITY OF THE STRAINS: Auricularia

delicata and Pleurotus sajorcaju TO REDUCE THE POLYCHLORINATED

BIPHENYLS CONTAINED IN DIELECTRIC OILS.

ABSTRACT

The biodegradation capacity of the strains Pleurotus sajorcaju and Auricularia delicata

to reduce the polychlorinated biphenyls contained in dielectric oils was studied.

For this, two solid culture media were prepared: a) Strains inoculated in agar (unadapted)

and b) Strains inoculated in agar with the pollutant (adapted). The dielectric oils of 60

and 206 ppm of polychlorinated biphenyls were inoculated with the mentioned culture

media, and by gas chromatography with electron capture the degradation percentages

were quantified. In addition, microbial growth curves for each experiment were

developed, using the data of the photographic record of the growing areas. This

facilitated the determination of colony radii that were plotted as a function of time.

The results showed that the greatest degradation of polychlorinated biphenyls was of

89,83%, which was obtained with the Auricularia delicata adapted strain, whose growth

in the contaminant was greater than that of the other strain. Fungi had a better

development with a concentration of 206 ppm of polychlorinated biphenyls.

KEYWORDS: /BIODEGRADATION/ POLYCHLORINATED BIPHENYLS/ FUNGI/

PLEUROTUS SAJORCAJU/ AURICULARIA DELICATA/ ORGANIC POLLUTANTS/

DIELECTRIC OILS/

1

INTRODUCCIÓN

Las aplicaciones comerciales de los policlorobifenilos (PCBs) han sido muy diversas,

destacan como fluidos dieléctricos (transformadores), plastificantes (adhesivos,

pinturas, plásticos, entre otros.), sistemas de transferencia de calor (calefacciones) y

lubricantes; no obstante, la peligrosidad de estos compuestos para la salud humana y

el medio ambiente ha sido repetidamente demostrada hasta el punto que a nivel

internacional se han firmado acuerdos para disminuir su producción o eliminar los PCBs

existentes.

Los PCBs son productos sintetizados químicamente y se caracterizan por su gran

estabilidad en el medio ambiente y su larga persistencia, presentando la capacidad de

acumularse en la cadena alimentaria. Además estos compuestos no tienden a

disolverse en el agua y se evaporan con facilidad a partir del medio acuático. [1]

Los efectos en los seres humanos más destacados son: irritación cutánea, ocular y del

tracto respiratorio, trastornos del sistema inmunológico y hepáticos, posible

cancerígeno, desórdenes en la piel e hígado, problemas de reproducción y

anormalidades fetales, entre otros.

Los compuestos xenobióticos son creados por el hombre mediante síntesis química

que da como resultado estructuras que no se encuentran de forma original en la

naturaleza o que son muy raras de encontrarlas. Generalmente son átomos de carbono

unidos con enlaces covalentes a grupos electronegativos o deficientes de electrones

como son los halógenos, grupos nitro y amino. Los compuestos xenobióticos son

generalmente recalcitrantes, porque estos persisten en el medio ambiente debido a su

difícil biodegradación como es el caso de los PCB’s. [2]

En la actualidad la tecnología aprobada para la eliminación de estos compuestos se

desarrolla por incineración a temperaturas de 1200°C en condiciones estrictamente

controladas y seguida de un enfriamiento extremo constituye el método más seguro para

su destrucción, pero las desventajas que presenta dicho método son los altos costos de

transportación e incineración.

2

Sin embargo, la biorremediación es una alternativa sumamente atractiva para la

disposición de PCBs, pues la tecnología de biorremediación evita el tratamiento físico y

químico, mantiene la alteración del lugar contaminado al mínimo, se puede combinar

con otras tecnologías de tratamiento para desperdicios mixtos altamente complejos, no

genera desperdicios secundarios y sus costos son reducidos. [3]

En los últimos años se ha encontrado que más de 3.000 moléculas organocloradas se

producen naturalmente por organismos tales como bacterias, hongos, insectos

organismos marinos, plantas y mamíferos, así como también, mediante procesos

abióticos tales como actividad volcánica e incendios forestales. Debido a esto los

microorganismos han evolucionado y han diseñado varios mecanismos para lograr

degradar este tipo de compuestos organoclorados. Actualmente se considera que la

degradación microbiana de dichos compuestos es el mayor mecanismo que ayuda en

la prevención y su acumulación en el ambiente. [4]

Existen estudios con cepas fúngicas utilizadas para degradar PCB´s residuales

presentes en suelos contaminados, basándose en estas evidencias, el presente trabajo

está orientado a analizar la degradación de PCBs provenientes de aceites dieléctricos

mediante la evaluación de dos cepas fúngicas, por medio de la siembra y adaptación de

las mismas. [5]

3

1. MARCO TEÓRICO 1.1. Biorremediación

1.1.1. Definición. Es la actividad de un sistema biológico sobre un compuesto químico

peligroso, cuya consecuencia es la modificación de la estructura para la obtención de

compuestos menos peligrosos.

La biodegradación es uno de los tratamientos que se utilizan para reducir la presencia

de los PCBs en el ambiente. La transformación de PCBs se realiza por dos procesos:

aerobio y anaerobio. Los aerobios atacan oxidativamente, rompiendo el anillo y

destruyendo los compuestos, mientras que los anaerobios remueven los cloros del anillo

bifenílico sin afectar la estructura del bifenilo (decloración). [6]

Por otro lado, la biorremediación es una técnica que permite degradar totalmente los

PCBs por medio de microorganismos tales como hongos y bacterias, mostrando una

alternativa interesante de degradar estos compuestos. [7]

1.1.2. Contaminantes orgánicos persistentes. Son sustancias químicas orgánicas

que en su estructura contienen carbono, hidrógeno y cloro. Han sido clasificadas por el

Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo (PNUD), como las de mayor

toxicidad, causantes de efectos negativos sobre los seres humanos y los animales. [8]

1.1.3. Bifenilos policlorados (PCB’s). Conocidos así por sus siglas en inglés, son

compuestos químicos orgánicos clorados, muy estables y de difícil degradabilidad. El

número y posición de átomos de cloro pueden variar en la estructura dando lugar a 209

moléculas diferentes. [9]

1.1.4 Opciones tecnológicas para la destrucción de PCB’s. Las posibilidades de

eliminación de PCB’s dependerán de la concentración de este producto en el material

que se trate. Algunos países industrializados basan su eliminación mediante procesos

de incineración a altas temperaturas.

Existen otras tecnologías para la eliminación de PCBs las cuales se muestran a

continuación y que ya se están aplicando a una serie de materiales y equipos que los

4

contengan, en particular transformadores, capacitores y aceites.

Incineración

Procesos de decloración

Sistemas de arco plasmático

Reducción química en fase gaseosa

Degradación biológica

Oxidación con agua supercrítica [10]

1.1.5. Biodegradación por hongos. En la micorremediación se emplean hongos con

el fin de degradar componentes que llegan a ser contaminantes para el ambiente. Esto

gracias a la capacidad que tienen ciertos hongos de degradar moléculas orgánicas. [11]

Los hongos ligninolíticos son los más promisorios microorganismos para la degradación

de contaminantes ambientales.

Las mismas enzimas involucradas en la degradación de lignina se sugiere que son las

responsables del ataque a los PCB’s por la producción de radicales hidroxilo.

Se ha encontrado que los hongos, al igual que las bacterias, degradan preferentemente

bifenilos menos clorados. [12]

1.2. Hongos.

1.2.1. Definición. Los hongos son un grupo de organismos eucariotas en los cuales

se encuentran mohos, levaduras y setas. Se encuentran divididas en un reino distinto al

del resto, principalmente por la constitución de su pared celular que a diferencia del reino

vegetal en lugar de celulosa contiene quitina. Los hongos son un grupo muy numeroso

de organismos. Aproximadamente se han descrito taxonómicamente 500.000, pero

existe la estimación que podrían existir entre 1 y 1.5 millones de especies. [13]

1.2.2. Hongos de la podredumbre blanca. Son aquellos hongos que poseen enzimas

lignolíticas, las cuales degradan una gran cantidad de polímeros orgánicos

complejos y algunos contaminantes ambientales con una estructura similar a la lignina.

Numerosos estudios han demostrado que los hongos de la pudrición blanca son

capaces de remover significativamente bifenilos policlorados. Los hongos del género

5

Pleurotus son capaces de transformar y mineralizar compuestos aromáticos utilizando

glucosa como fuente de carbono, secretando durante el proceso de transformación

enzimas lignolíticas y en menor medida son capaces de llevar a cabo la transformación

y mineralización del benzopiropeno. [14]

La razón por la que se eligió el género pleurotus para este trabajo es porque forma parte

de los hongos de la pudrición blanca; mientras que el género auricularia delicata se lo

tomó en cuenta debido a la existencia de un estudio en proceso, el cual se enfocaba en

la degradación de TPH (Hidrocarburos totales en el petróleo) y estos al contener

aromáticos se estarían pareciendo a los PCBs por lo que al observar un crecimiento

satisfactorio en el crudo se decidió probar en bifenilos policlorados.

1.3. Enzimas.

1.3.1. Definición. Las enzimas son moléculas proteicas que tienen la propiedad de

actuar como catalizadores biológicos; proporcionan los medios suficientes para realizar

funciones complejas tales como la síntesis y descomposición de compuestos.

Las enzimas son cadenas de aminoácidos unidos en una secuencia definida, que tienen

en su estructura un centro activo, formado por una pequeña cantidad de aminoácidos

que son los responsables directos de la unión con el sustrato y son los que catalizan la

reacción particular de cada enzima. [15]

1.3.2. Mecanismos de reacción. Se sabe que las enzimas actúan como todos los

catalizadores reduciendo la energía de activación (EA) de una reacción. Las enzimas

reducen la energía de activación mediante la creación de un ambiente en el que el

estado de transición es estabilizado, se dice que la enzima mediante atracción de cargas

cambia la conformación del sustrato, llevándolo al estado de transición pero de tal

manera que la energía necesaria para llegar a dicho estado, disminuye. Esto brinda una

ruta alternativa para que la reacción ocurra con menor EA, cosa que no ocurre sin la

presencia de la enzima. La ruta alternativa sucede mediante la creación de una reacción

intermedia denominada complejo Enzima-Sustrato. [16]

1.4. Aceites dieléctricos.

6

1.4.1. Definición. Son aceites de origen mineral, vegetal o sintético, extremadamente

limpios y estables, con excepcionales propiedades dieléctricas, alta estabilidad térmica

y elevada resistencia a la oxidación. Son materiales que se usan como aislante eléctrico

debido a que son malos conductores de electricidad [17]

1.4.2. Propiedades de los aceites dieléctricos. Alta resistencia a la oxidación, lo que

le permite funcionar por largos períodos, tanto en transformadores de potencia y de

distribución como en interruptores. Poseen una alta estabilidad química y buenas

propiedades refrigerantes debido a su baja viscosidad, lo cual facilita la transferencia de

calor generado en el transformador. [18]

1.4.3. Aplicaciones de los aceites dieléctricos. Se pueden utilizar en:

Transformadores de potencia y distribución.

Interruptores de potencia en baños de aceite.

Condensadores.

Como medio aislante en las bobinas de arranque de automóviles.

Como aceite dieléctrico en general. [19]

1.5. Bifenilos policlorados (PCB’s).

1.5.1. Definición. Los bifenilos policlorados conocidos como PCB’s por sus siglas en

inglés son compuestos químicos orgánicos constituidos por átomos de carbono,

hidrógeno y cloro, muy estables y de difícil degradabilidad. La fórmula química es

C12H(10-n)Cln en donde n es el número de átomos de cloro. [20]

Los PCBs forman un grupo de 209 congéneres, dependiendo de las sustituciones de

cloro que tenga su estructura química, las cuales pueden variar entre 1 a 10 átomos de

cloro, de los cuales 130 pueden encontrarse en productos comerciales. Los PCBs

pueden tener sustituciones de cloro en la posición para, meta y orto, pueden

presentarse de diferentes formas que van desde líquidos grasos hasta sólidos cerosos.

[21]

7

Figura 1. Estructura general de los PCB’s

Figura 2. Ejemplos de PCB’s

1.5.2. Propiedades físico-químicas de los PCB’s. Las propiedades de los PCB’s

varían de acuerdo al contenido de cloro, siendo más persistentes y más peligrosos al

ser más clorados. En general las características de estos son las siguientes:

Son líquidos de viscosidad variable, aumentando cuando se incrementa el contenido

de cloro

Son más pesados que el agua, pues su densidad varía entre 1,182 y 1,56 g/ml. La

densidad es más elevada cuando el contenido de cloro es mayor.

Los PCB’s comerciales (mezcla de congéneres) son de color amarillo claro u oscuro.

Los congéneres individuales son incoloros.

Baja solubilidad en agua y alta en aceites y solventes orgánicos.

Alta resistencia al envejecimiento, no se deterioran con el uso.

Alta estabilidad frente al calor y solamente se descomponen a muy altas

temperaturas (1000°C).

Alto punto de inflamación (entre 170°C y 380°C), no explosivos.

Alta estabilidad química bajo condiciones normales, son resistentes a la oxidación,

ácidos, bases y otros agentes químicos.

8

Baja presión de vapor (semivolátiles), forman vapores más pesados que el aire, pero

no forman mezclas explosivas con el aire.

Excelentes aislantes eléctricos, pues tienen alta constante dieléctrica y baja

conductividad eléctrica. [22]

1.5.3. Usos. Los bifenilos policlorados han sido ampliamente utilizados principalmente

en aceites de transformadores y condensadores debido a su baja presión de vapor, baja

inflamabilidad, estabilidad térmica y química, aislantes eléctricos, conductores de calor,

entre otras. Sin embargo, estos compuestos son altamente tóxicos, se acumulan en

tejidos adiposos y se adhieren fuertemente a matrices orgánicas tales como el suelo,

producto de su hidrofobicidad. [23]

1.5.4. Impacto ambiental. Los PCB’s se convierten en un problema al ser liberados al

ambiente debido a que cuando se producen derrames de PCB’s estos pueden migrar al

suelo, al agua subterránea y al aire y pueden abarcar grandes distancias, contaminando

tanto el medio ambiente local, como el global. Los peces, animales y cultivos en áreas

contaminadas de PCB’s pueden no ser aptas para el consumo. [24]

1.5.5. Toxicidad. Cuando los PCB’s entran al cuerpo humano y al de los animales se

resisten a la descomposición y no son expulsados mediante la excreción y secreción,

sino que, por el contrario, se quedan y se conservan en los tejidos grasos y en los

órganos del cuerpo. Por lo tanto las personas y los animales que entran en contacto

(respiración, contacto con la piel, bebidas o alimentos) con los PCB’s pueden, con el

tiempo, acumular mas y mas concentraciones de PCB’s. Este efecto de concentración

de los PCB’s en el organismo es llamado bioacumulación. [25]

1.5.6. Desventajas de los PCB’s. Hoy en día las desventajas se consideran

significativas por tener las siguientes propiedades:

No son biodegradables.

Son persistentes en el medio ambiente.

Son bioacumulativos.

No metabolizantes.

Pueden acumularse en los tejidos adiposos del cuerpo.

Los efectos en los seres humanos más destacados son: irritación cutánea, ocular y

del tracto respiratorio, trastornos del sistema inmunológico y hepáticos, posible

9

cancerígeno, desórdenes en la piel e hígado, problemas de reproducción y

anormalidades fetales, entre otros. [26]

1.6. Determinación de concentración de PCB’s en aceites dieléctricos.

1.6.1. Generalidades. Los contenidos o concentraciones de PCB’s se determinan en

partes por millón (ppm), en miligramos por kilogramo (mg/Kg) o en porcentaje en peso

(%). Tomando como referencia la norma EPA de los Estados Unidos (Environmental

Protection Agency), la que establece lo siguiente:

Mayor a 500 ppm: Sustancia pura de PCB’s

Mayor a 50 a 500 ppm: Sustancia contaminada con PCB’s

De 5 a 50 ppm: Sustancia no contaminada con PCB’s

Menor a 5 ppm: Sin PCB’s [27]

1.6.2. Pruebas para la determinación de presencia de PCB’s según el Manual de

Procedimientos para el Manejo de PCB’s en el Sector Eléctrico Ecuatoriano.

1.6.1.1. Pruebas Cualitativas para determinar la presencia de PCB’s.

Prueba de densidad. Los aceites que contienen PCB’s son mas pesados que el agua

por contener átomos de cloro, pudiendo llegar su densidad a 1,56 g/ml, en tanto que

los aceites minerales generalmente son inferiores a 1 g/ml. En base a este principio

un método práctico consiste en agregar unas gotas de aceite en un recipiente con

agua y si el aceite se va al fondo tiene la posibilidad de contener PCB’s.

Prueba del cloro. Si se enciende un compuesto que contiene cloro en presencia de

cobre, se producirá una llama verde, ya que se forman pequeñas cantidades de

cloruro de cobre en la superficie del cobre y esta sustancia al volatilizarse produce

una llama verde.

Utilización de kits de prueba rápida. Consiste en el uso de un kit de ensayo

colorimétrico (Colorimetric Test Kit), denominado Clor-N-Oil de la fábrica Dexsil

Corporation, trabaja por el principio de determinación de cloro, con el que se puede

identificar PCB’s en los aceites dieléctricos.

10

Debido a que la prueba trabaja con el principio de detección de cloro, la contaminación

con cloruro de sodio, agua de mar, sudor, entre otras, podría dar como resultado un

falso positivo y serán necesarias pruebas de laboratorio adicionales. [28]

1.6.2.2. Pruebas Cuantitativas para determinar la presencia de PCB’s.

Análisis con equipo L2000DX ANALYZER. Este equipo es portátil y puede ser

utilizado en el campo o en el laboratorio y es efectivo en un rango de 5 a 5000 ppm

de PCB’s. Su funcionamiento se basa en el principio electroquímico de ión cloro.

Análisis por cromatografía. La cromatografía de gases (CG) es una técnica en la que

la elución de la muestra se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A

diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las

moléculas del analito (en este caso moléculas de PCB’s); su única función es la de

transportar el analito a través de la columna.

La CG se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases como muestra la figura 2. Este

consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyección de

muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

Figura 3. Esquema general de un cromatógrafo de gases

Durante el desarrollo de la cromatografía de gases se han utilizado diferentes

detectores en el análisis de trazas de policloruros de bifenilo. El detector de captura

de electrones (ECD, electron capture detector) es muy sensible a los compuestos

que contienen grupos funcionales electronegativos como halógenos, en este caso los

cloros de bifenilo. [29]

11

Figura 4. Detector de captura de electrones

1.7. Crecimiento microbiano.

1.7.1. Definición. La curva de crecimiento microbiano representa la evolución del

número de células viables presentes en un cultivo microbiano a lo largo del tiempo de

estudio. En la curva de crecimiento se diferencian cuatro fases, la fase de retraso (a

veces llamada fase de latencia), la fase de crecimiento exponencial o logarítmico, la fase

estacionaria y la fase de muerte celular.

De las cuatro fases de la curva de crecimiento, habitualmente la fase de crecimiento

exponencial o logarítmica es la que presenta mayor interés por ser la fase en la cual el

incremento del número de microorganismos es máximo. Durante esta fase el tiempo de

generación de los microorganismos (el tiempo que la población de microorganismo

necesita para duplicar su número) se mantiene constante. [30]

Figura 5. Curva de crecimiento de Hongos: tipos indefinido y definido

12

1.7.2. Cultivo de microorganismos. Consiste en proporcionarles a las cepas las

condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de

forma controlada. En general, se pueden distinguir cultivos líquidos y sólidos en función

de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la

disponibilidad de nutrientes en el medio. [31]

1.7.3. Medios de cultivo. Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le

aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares.

Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden

clasificar en autótrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y

heterótrofos si utilizan carbono orgánico. [32]

1.7.4. Agar papa-dextrosa (PDA). Es un medio sólido complejo de uso general para el

cultivo de hongos. [33]

Tabla 1. Composición del medio de cultivo Agar papa-dextrosa (PDA)

Ingredientes g/L

Glucosa 20,0

Extracto de papa 4,0

Agar 15,0

pH 5,6

1.8. Polisorbato 20

1.8.1. Definición. El polisorbato 20 o también llamado tween 20 se deriva de un

ingrediente natural llamado sorbitol, sin embargo este producto no es un ingrediente

natural, de hecho es carcinógeno debido a que es tratado con 20 partes de óxido de

etileno. En el mercado existen grados mayores de polisorbato, tales como el 40 y 80,

este número indica las partes de óxido de etileno que han sido utilizadas en su

tratamiento. Se usan como surfactantes en sprays insecticidas y pesticidas, así como

emulgentes en cremas cosméticas e industria alimentaria. [34]

13

2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

2.1. Descripción del proceso.

Para llevar a cabo el proceso investigativo de evaluación de la capacidad

biodegradadora de PCB’s provenientes de aceites dieléctricos mediante dos cepas

fúngicas se llevó a cabo el proceso que se describe a continuación:

Se seleccionaron las posibles cepas biodegradadoras de PCB’s investigadas

anteriormente en la literatura. Posterior a esto se obtuvieron dichas cepas para llevarlas

a reproducción en un medio de cultivo sólido (Agar Papa Dextrosa). Cuando ya se

obtuvo una cantidad considerable de cepas puras, se procedió a inocular con los aceites

contaminados y Agar Papa Dextrosa en proporciones que se detallarán mas adelante.

Estos medios de cultivo fueron incubados a 28⁰C durante 45 días. Luego de esto se

realizó la extracción de aceite del medio sólido y seguidamente se realizó el análisis por

cromatografía de gases para de esta forma poder cuantificar el porcentaje de

degradación de PCB’s.

Cabe recalcar que previo a la inoculación de los aceites con las cepas y el agar, dichos

aceites fueron analizados por cromatografía de gases para verificar la presencia de

PCB’s y cuantificación de los mismos.

14

Figura 6. Diagrama de flujo con la descripción del proceso

2.2. Diseño experimental.

2.2.1. Codificación

Tabla 2. Codificación para Pleurotus sajorcaju

Cepa Concentración Adaptación

de cepas fúngicas

Adaptación de cepas

fúngicas con tween 20

Adaptación de cepas fúngicas con tween 20 y previa adaptación de las

cepas al aceite

Pleurotus Sajorcaju (Cepa 1)

60 ppm

1 1 1

2 2 2

3 3 3

206ppm

1 1 1

2 2 2

3 3 3

15

Tabla 3. Codificación para Auricularia delicata

Cepa Concentración Adaptación

de cepas fúngicas

Adaptación de cepas

fúngicas con tween 20

Adaptación de cepas fúngicas con tween 20 y previa adaptación de las

cepas al aceite

Auricularia delicata (Cepa 2)

60 ppm

1 1 1

2 2 2

3 3 3

206ppm

1 1 1

2 2 2

3 3 3

2.2.2. Diagramas de flujo.

a) Adaptación de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206 ppm

Figura 7. Adaptación de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206

ppm

16

b) Adaptación de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206 ppm

con tween 20

Figura 8. Adaptación de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206

ppm con tween 20

c) Siembra de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206 ppm con

tween 20 de cepas ya adaptadas previamente.

Figura 9. Siembra de las cepas fúngicas a las concentraciones de 60 ppm y 206

ppm con tween 20 de cepas ya adaptadas previamente

17

2.3. Materiales y equipos.

Reverbero

Malla metálica

Vasos de precipitación V= 200 ml; Ap: ± 20 ml

Autoclave TUTINAUER 3870M

Balanza analítica R: 1000 g; Ap: ± 0,0001 g

Varilla de agitación

Cajas Petri de vidrio

Cámara de Flujo Laminar BBS-DDC

Parafilm

Plástico de cocina

Mechero de Bunsen

Estufa MEMMERT

Micropipeta Glassco V= 200 μl; Ap: ± 1 μl

Bisturí

Cuchara metálica

Probeta V= 20 ml; Ap: ± 1 ml

Fundas autoclavables

Frascos ámbar V= 200 ml; Ap: ± 20 ml

Pinza de laboratorio

Jeringa V= 5 ml; Ap: ± 1 ml

Mufla IVYMEN SISTEM OPTIC SNOL 8.2/1100

Equipo de filtración al vacío

Matraces Erlenmeyer V= 100 ml; Ap: ± 20 ml

Rotavapor HAHN SHIN 3001

Baño ultrasónico OVAN

Micropipetas V= 1 ml; Ap: ± 0,1 ml

Viales V= 2 ml; Ap: ± 0,5 ml

Pipetas pasteur

Lana de vidrio

Vortex de laboratorio

18

2.4. Sustancias y reactivos

Agar papa dextrosa

Agua destilada H2O (l)

Alcohol C2H60 (ac)

Tween 20 C58H114O26 (ac)

Aceite dieléctrico con 60 ppm de PCB’s (Aroclor 1242)

Aceite dieléctrico con 200 ppm de PCB’s (Aroclor 1242)

Isooctano C8H18 (ac)

Sulfato de sodio Na2SO4 (sol)

Metanol CH3OH (ac)

Florisil MgSiO3 (sol)

2.5. Procedimiento.

2.5.1. Reproducción de las cepas puras.

a) Pesar en la balanza analítica 7,8 g de agar papa dextrosa.

b) Medir en una probeta 200 ml de agua destilada.

c) Mezclar el agar papa dextrosa con el agua destilada, someterla a calentamiento en

el reverbero con agitación hasta que se disuelva todo el agar; aproximadamente

hasta llegar a la ebullición.

d) Colocar la solución en un frasco ámbar y autoclavar junto con los demás materiales

de siembra durante 30 minutos con el fin de esterilizarlo todo.

e) Encender la lámpara UV de la cámara de flujo laminar durante 15 minutos para

esterilizar el área de trabajo y posterior a esto el ventilador a alta potencia durante 10

minutos para la dispersión de posibles radicales libres formados.

f) Encender el mechero dentro de la cámara de flujo laminar y en presencia de este

colocar 20 ml de medio de cultivo en cada caja Petri.

g) Esperar hasta que se solidifique.

h) Encender nuevamente la lámpara UV con los materiales y las cajas Petri durante 10

minutos y esperar 10 minutos adicionales.

i) Encender el mechero y colocar el bisturí en la llama hasta que esté incandescente,

inmediatamente enfriarlo en alcohol.

19

j) Hacer cortes cuadrados del mismo tamaño aproximadamente en la caja que contiene

la cepa pura.

k) Con ayuda de la pinza tomar uno de los pedazos y trasladarlo a una de las cajas que

contiene el agar papa dextrosa solidificado.

l) Sellar las cajas con parafilm y plástico para cocina.

m) Etiquetar.

n) Regular la temperatura de la estufa a 28⁰C y llevar las cajas para su incubación.

o) Repetir este proceso para la otra cepa.

2.5.2. Adaptación de las cepas fúngicas a dos concentraciones diferentes de

PCB’s

2.5.2.1. Para aceite con 60 ppm de PCB’s



c) Mezclar el agar papa dextrosa, el agua destilada y el aceite dieléctrico, someterla a

calentamiento en el reverbero y con agitación hasta que se disuelva todo el agar.

d) Colocar la solución en un frasco ámbar y autoclavar junto con los demás materiales


e) Encender la lámpara UV de la cámara de flujo laminar durante 15 minutos para



f) Encender el mechero dentro de la cámara de flujo laminar y en presencia de este

colocar 19 ml de medio de cultivo y 1 ml de aceite dieléctrico de 60 ppm en cada caja

Petri.

g) Esperar hasta que se solidifique.

h) Encender nuevamente la lámpara UV con los materiales y las cajas Petri durante 10


i) Encender el mechero y colocar el bisturí en la llama hasta que esté incandescente,


j) Hacer cortes cuadrados del mismo tamaño aproximadamente en la caja que contiene

la cepa pura.

k) Con ayuda de la pinza tomar uno de los pedazos y trasladarlo a una de las cajas que

contiene el medio de cultivo solidificado.

l) Sellar las cajas con parafilm y plástico para cocina.

m) Etiquetar.

20

n) Regular la temperatura de la estufa a 28⁰C y llevar las cajas para su incubación.

o) Repetir este proceso para la otra cepa.

2.5.2.2. Para aceite con 206 ppm de PCB’s.

a) Repetir el proceso anterior variando el aceite a agregar.


PCB’s con adición de tween 20. Estas cepas serán denominadas en lo que

continúa del documento como cepas sin adaptar.




c) Con ayuda de una jeringa medir 0,6 ml de tween 20 y 3 ml de aceite dieléctrico con

concentración de 60 ppm de PCB’s.

d) Mezclar el agar papa dextrosa, el agua destilada, el tween 20 y el aceite dieléctrico,

someterla a calentamiento en el reverbero y con agitación hasta tener una mezcla

homogénea.

e) Colocar la solución en un frasco ámbar y autoclavar junto con los demás materiales


f) Encender la lámpara UV de la cámara de flujo laminar durante 15 minutos para



g) Encender el mechero dentro de la cámara de flujo laminar y en presencia de este


h) Esperar hasta que se solidifique.

i) Encender nuevamente la lámpara UV con los materiales y las cajas Petri durante 10


j) Encender el mechero y colocar el bisturí en la llama hasta que esté incandescente,


k) Hacer cortes cuadrados del mismo tamaño aproximadamente en la caja que contiene

la cepa pura.

l) Con ayuda de la pinza tomar uno de los pedazos y trasladarlo a una de las cajas que


m) Sellar las cajas con parafilm y plástico para cocina.

21

n) Etiquetar.

o) Regular la temperatura de la estufa a 28⁰C y llevar las cajas para su incubación.

p) Repetir este proceso para la otra cepa.




PCB’s con adición de tween 20 e inoculando una cepa adaptada al aceite

previamente. Estas cepas serán denominadas en lo que continúa del documento

como cepas adaptadas.




c) Con ayuda de una jeringa medir 0,6 ml de tween 20 y 3 ml de aceite dieléctrico con

concentración de 60 ppm de PCB’s.

d) Mezclar el agar papa dextrosa, el agua destilada, el tween 20 y el aceite dieléctrico,

someterla a calentamiento en el reverbero y con agitación hasta tener una mezcla

homogénea.

e) Colocar la solución en un frasco ámbar y autoclavar junto con los demás materiales


f) Encender la lámpara UV de la cámara de flujo laminar durante 15 minutos para



g) Encender el mechero dentro de la cámara de flujo laminar y en presencia de este


h) Esperar hasta que se solidifique.

i) Encender nuevamente la lámpara UV con los materiales y las cajas Petri durante 10


j) Encender el mechero y colocar el bisturí en la llama hasta que esté incandescente,


k) Hacer cortes cuadrados del mismo tamaño aproximadamente en la caja que contiene

la cepa previamente adaptada al aceite dieléctrico.

22

l) Con ayuda de la pinza tomar uno de los pedazos y trasladarlo a una de las cajas que


m) Sellar las cajas con parafilm y plástico para cocina.

n) Etiquetar.

o) Regular la temperatura de la estufa a 28⁰C y llevar las cajas para su incubación.

p) Repetir este proceso para la otra cepa.



2.5.5. Extracción de aceite dieléctrico del medio de cultivo sólido para análisis por

cromatografía de gases.

a) Pesar 720 g de sulfato de sodio y colocarlos en la mufla durante 8 horas y a 400⁰C

con la finalidad de eliminar la humedad.

b) Tomar una caja petri y proceder a trocear el agar, vaciar en un Erlenmeyer y a este

agregarle 30 g de sulfato de sodio. Tapar con parafilm y dejar reposar durante 2

horas. Repetir este proceso para cada caja petri.

c) A cada Erlenmeyer agregar 45 ml de isooctano y cubrir con parafilm.

d) Llevar las muestras al baño ultrasónico y dejarlas ahí durante 30 minutos a 20⁰C.

e) Filtrar a vacío cada muestra.

f) Concentrar cada una de las muestras en el rotavapor a una temperatura de 55⁰C en

baño maría, a 90 rpm (revoluciones por minuto) y generando vacío con ayuda de la

bomba.

g) Recolectar cada concentrado en un vial y almacenar en refrigeración.

Por razones de salud realizar la este proceso en una campana de extracción. Véase

anexo B2.

2.5.6. Preparación de la muestra para análisis por cromatografía de gases.

a) Pesar aproximadamente 100 g de florisil y colocarlos en la mufla durante 8 horas a

135⁰C con el fin de eliminar la humedad.

b) Tomar las pipetas pasteur y medir 35 mm desde la base.

23

c) Colocar en las pipetas pasteur lana de vidrio y a continuación de esta colocar el florisil

hasta la señal marcada anteriormente, agregar 5 mm aproximadamente de sulfato de

sodio.

d) Colocar las columnas en el horno a 135⁰C durante 6 horas para activar el florisil.

e) Lavar las columnas de florisil con 3 ml de isooctano e inmediatamente tomar 100 μl

del extracto obtenido en el punto 2.5.5., hacer pasar por la columna y eluirlas con 6

ml de isooctano.

f) Recolectar la muestra eluida, agitar en vortex, colocarla en los viales correspondientes

y llevarla a su respectivo análisis en un cromatógrafo de gases con captura de

electrones.

2.5.7. Protocolo para muestreo de crecimiento de las cepas fúngicas en las

diferentes concentraciones y condiciones de siembra.

a) A las muestras colocadas en la estufa para incubación tomarles fotografías cada día

durante 8 a 10 días o hasta que copen toda la caja Petri.

b) En el programa photoshop cargar una a una las imágenes e ir seleccionando el área

sombreada.

c) Registrar los valores obtenidos en una tabla para su posterior análisis.

2.6. Datos experimentales de áreas a través del tiempo

En las tablas que se muestran a continuación se encuentran los valores de las áreas

obtenidas a través del tiempo para cada caja Petri mediante el uso del programa

Photoshop.

2.6.1. Áreas a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s. Las

tablas de las áreas del primer lote correspondientes a la inoculación de las dos cepas

en el agar con aceite dieléctrico, y este a su vez con PCB’s, no se muestran debido a

que como no se usó un tensoactivo, el aceite no logró emulsionarse con el agar, y a

pesar de que el hongo creció, no se pudo apreciar el crecimiento circular, el cual es

típico del mismo, llevándonos a la invalidación de este lote porque no se pudo medir las

áreas de crecimiento a través del tiempo mismas que eran necesarias para determinar

los radios de crecimiento y poder graficar el radio de colonia vs el tiempo. Ver Anexo A,

Figura A8.

24

2.6.2. Áreas a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s con

adición de tween 20. Se muestran los valores de las áreas en el tiempo para las cepas

Pleurotus sajorcaju y Auricularia delicata con adición de tween 20 y a dos diferentes

concentraciones de PCB’s.

25

Tabla 4. Áreas a través del tiempo para Pleurotus sajorcaju

Área de la caja Petri= 63,61 𝐜𝐦𝟐

Concentración Caja Área día: 𝐜𝐦𝟐

0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

60 ppm

1 0,78 0,95 1,27 1,77 2,54 3,14 3,46 4,15 4,52 5,31 5,73

2 0,78 0,83 1,00 1,42 1,77 2,27 3,14 3,80 4,52 5,31 6,61

3 0,78 0,89 1,13 1,60 2,16 2,71 3,30 3,98 5,52 5,31 6,17

206 ppm

1 0,78 0,80 0,87 0,95 1,77 4,15 4,91 5,73 8,55 10,18 13,20

2 0,78 0,80 0,82 0,95 2,01 7,07 10,75 14,52 17,35 20,43 23,76

3 0,78 0,80 0,84 0,95 1,89 5,61 7,83 10,12 12,95 15,30 18,48

Tabla 5. Áreas a través del tiempo para Auricularia delicata



0 1 2 3 4 7 8 9

60 ppm

1 0,78 2,32 16,99 35,58 38,60 42,98 53,29 63,61

2 0,78 8,87 25,52 32,49 36,80 39,50 42,13 44,76

3 0,78 5,59 21,25 34,04 37,70 41,24 47,71 54,19

206 ppm

1 0,78 15,98 37,99 44,18 55,01 63,61 COL. COL.

2 0,78 10,87 15,56 29,27 38,01 51,67 57,64 63,61

3 0,78 13,42 26,78 36,72 46,51 57,64 59,98 63,61

26

2.6.3. Áreas a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s con adición de tween 20 inoculando una cepa

adaptada al aceite previamente.

Se muestran los valores de las áreas en el tiempo para las cepas Pleurotus sajorcaju y Auricularia delicata con adición de tween 20

inoculando cepas adaptadas previamente al aceite dieléctrico con dos diferentes concentraciones de PCB’s.

Tabla 6. Áreas a través del tiempo para Pleurotus sajorcaju inoculando una cepa adaptada al aceite previamente.


Concentración Caja Área: día 𝐜𝐦𝟐

0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

60 ppm

1 0,78 1,10 1,43 1,99 3,14 5,31 5,31 5,73 8,04 10,18 12,57

2 0,78 1,19 1,60 2,44 3,14 8,04 8,04 8,55 9,08 11,95 12,57

3 0,78 1,15 1,51 2,22 3,14 6,68 6,68 7,14 8,56 11,06 12,57

200 ppm

1 0,78 2,01 2,42 3,14 3,80 4,91 5,73 6,61 15,90 18,86 33,18

2 0,78 2,38 3,99 5,73 7,07 21,24 24,63 28,27 33,18 43,01 50,27

3 0,78 2,20 3,21 4,43 5,43 13,07 15,18 17,44 24,54 30,93 41,72

27

Tabla 7. Áreas a través del tiempo para Auricularia delicata inoculando una cepa adaptada al aceite previamente.



0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

60 ppm

1 0,78 7,96 22,15 27,78 31,61 39,30 44,13 48,95 53,99 58,98 62,68

2 0,78 10,36 16,53 17,53 18,15 19,67 20,00 21,45 22,90 27,81 33,18

3 0,78 9,16 19,34 22,65 24,88 29,48 32,06 35,20 38,44 43,39 47,93

200 ppm

1 0,78 11,96 27,11 29,67 36,26 63,61 COL. COL. COL. COL. COL.



28

2.7. Datos experimentales de concentraciones de PCB’s iniciales y finales

En las tablas que se muestran a continuación se incluyen los valores iniciales y finales

de concentración en ppm de PCB’s contenidos en aceites dieléctricos a dos

concentraciones y con adición de tween 20 para las dos cepas utilizadas.

Los datos tabulados fueron obtenidos luego de realizar un análisis cromatográfico con

captura de electrones.

2.7.1. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Pleurotus sajorcaju

Se muestran los valores de las concentraciones iniciales y finales para Pleurotus

sajorcaju con adición de tween 20, a las condiciones sin adaptar y adaptadas y a dos

diferentes concentraciones de PCB’s.

Tabla 8. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Pleurotus sajorcaju

concentración 1

Pleurotus sajorcaju

Condiciones Caja Concentración inicial [ng/μl]

Concentración final [ng/μl]

Sin adaptar

1

60

0,227165

2 0,295182

3 0,280674

Adaptadas

1 0,124938

2 0,217840

3 0,190389

Tabla 9. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Pleurotus sajorcaju

concentración 2

Pleurotus sajorcaju



Sin adaptar

1

206

0,547576

2 0,378652

3 0,459453

Adaptadas

1 0,103344

2 0,527996

3 0,415405

29

2.7.2. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Auricularia delicata

Se muestran los valores de las concentraciones iniciales y finales para Auricularia

delicata con adición de tween 20, a las condiciones sin adaptar y adaptadas y a dos

diferentes concentraciones de PCB’s.

Tabla 10. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Auricularia delicata

concentración 1

Auricularia delicata



Sin adaptar

1

60

0,165966

2 0,000011

3 0,078299

Adaptadas

1 0,092955

2 0,054436

3 0,0789152

Tabla 11. Concentraciones de PCB’s iniciales y finales para Auricularia delicata

concentración 2




Sin adaptar

1

206

0,504590

2 0,279456

3 0,395691

Adaptadas

1 0,645435

2 0,501648

3 0,577727

30

3. CÁLCULOS Y RESULTADOS

3.1. Cálculos para la curva de cinética de crecimiento

Para construir la curva de crecimiento de hongos en medio sólido es necesario tener los

valores del radio de colonia y el tiempo de crecimiento, por lo tanto se presenta a

continuación el cálculo modelo para hallar el radio mediante los datos de las áreas

obtenidas en photoshop.

3.1.1. Cálculo del radio de crecimiento

A = π ∗ r2 (1)

𝒓 = (𝑨

𝛑) ^0,5

(2)

𝒓 = (0,78

3,14159) ^0,5 = 0,4994 𝑐𝑚

3.2. Cálculos para degradación de PCB’s

El valor obtenido en los resultados del cromatograma tiene que ser evaluado para poder

obtener el valor mas aproximado a la realidad de contenido de PCB’s en la muestra

concentrada de aceite luego de haber sido extraída del medio de cultivo para poder

hacer las relaciones convenientes.

3.2.1. Cálculo de la cantidad inicial de PCB’s en masa. Cálculo modelo para deducir

la masa inicial de PCB’s contenidos en los aceites dieléctricos.

mi = Vi ∗ Ci (3)

mi = 100 μl ∗60 ng

1 μl= 6000 ng

31

Siendo:

mi = masa inicial

Vi = volumen inicial

Ci = concentración inicial

3.2.2. Cálculo de la cantidad final de PCB’s en masa. Cálculo modelo para deducir

la masa final de PCB’s contenidos en los aceites dieléctricos a partir de los resultados

del cromatograma con un porcentaje de recuperación del 75% luego de hacer pasar por

la columna de florisil.

mf = Vf ∗ Cf (4)

mf = 6100 μl ∗(0,227165 ng)/0,75

1 μl= 1847,6087 ng

Siendo:

mf = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

V𝑓 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

Cf = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

3.2.3. Cálculo de la cantidad degradada en masa. Cálculo modelo para determinar

la masa degradada.

md = 𝑚i − mf (5)

md = 6000 ng − 1847,6087 ng = 4152,3913 ng

Siendo:

md = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑑𝑎

m𝑖 = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

mf = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

3.2.4. Cálculo del porcentaje de degradación. Cálculo modelo para determinar el

porcentaje de degradación en cada muestra.

32

% degradado =𝑚𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑑𝑎

𝑚𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100 (6)

% degradado =4152,3913 ng

6000 ng∗ 100 = 69,2065 %

3.3. Análisis estadístico. El análisis estadístico se efectuó mediante el programa

estadístico SPSS, en el cual se realizó el análisis de la varianza con un factor (ANOVA),

el mismo que se basa en las siguientes expresiones lógicas.

Fs = T′

E (7)

H0: sa2 = sb

2 Ha: sa2 ≠ sb

2 (8)

Si S > 0.05 se acepta H0 ; Si S ≤ 0.05 se acepta Ha (9)

Siendo:

Fs = Estadístico para la distribución F

sa2 = Varianza para la variable a

sb2 = Varianza para la variable b

H0 = Hipótesis nula

Ha = Hipótesis alternativa

S = Significación del análisis de varianza.

3.4. Resultados para la cinética de crecimiento

En las tablas que se muestran a continuación están los valores necesarios para construir

la curva de crecimiento microbiana para las dos cepas utilizadas.

3.4.1. Radios a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s. En

las tablas se muestran los valores de los radios en el tiempo para las cepas Pleurotus

sajorcaju y Auricularia delicata con adición de tween 20 y a dos diferentes

concentraciones de PCB’s.

33

Tabla 12. Radios a través del tiempo para Pleurotus sajorcaju

Radio de la caja Petri= 4,499 cm

Concentración Caja Radios día: cm

0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

60 ppm

1 0,50 0,55 0,63 0,75 0,90 1,00 1,05 1,15 1,20 1,30 1,35

2 0,50 0,51 0,56 0,67 0,75 0,85 1,00 1,10 1,20 1,30 1,45

3 0,50 0,53 0,60 0,71 0,83 0,93 1,03 1,13 1,33 1,30 1,40

206 ppm

1 0,50 0,50 0,53 0,55 0,75 1,15 1,25 1,35 1,65 1,80 2,05

2 0,50 0,50 0,51 0,55 0,80 1,50 1,85 2,15 2,35 2,55 2,75

3 0,50 0,50 0,52 0,55 0,78 1,34 1,58 1,80 2,03 2,21 2,43

Tabla 13. Radios a través del tiempo para Auricularia delicata



0 1 2 3 4 7 8 9

60 ppm

1 0,50 0,86 2,33 3,37 3,51 3,70 4,12 4,50

2 0,50 1,68 2,85 3,22 3,42 3,55 3,66 3,77

3 0,50 1,33 2,60 3,29 3,46 3,62 3,90 4,15

206 ppm

1 0,50 2,26 3,48 3,75 4,18 4,50 COL. COL.

2 0,50 1,86 2,23 3,05 3,48 4,06 4,28 4,50

3 0,50 2,07 2,92 3,42 3,85 4,28 4,37 4,50

34

3.4.2. Radios a través del tiempo a dos concentraciones diferentes de PCB’s inoculando cepas adaptadas previamente al aceite.

En las tablas se muestran los valores de los radios en el tiempo para las cepas Pleurotus sajorcaju y Auricularia delicata con adición de

tween 20 inoculando cepas adaptadas previamente al aceite dieléctrico con dos diferentes concentraciones de PCB’s.

Tabla 14. Radios a través del tiempo para Pleurotus inoculando una cepa adaptada al aceite previamente.



0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

60 ppm

1 0,50 0,59 0,67 0,80 1,00 1,30 1,30 1,35 1,60 1,80 2,00

2 0,50 0,62 0,71 0,88 1,00 1,60 1,60 1,65 1,70 1,95 2,00

3 0,50 0,60 0,69 0,84 1,00 1,46 1,46 1,51 1,65 1,88 2,00

206 ppm

1 0,50 0,80 0,88 1,00 1,10 1,25 1,35 1,45 2,25 2,45 3,25

2 0,50 0,87 1,13 1,35 1,50 2,60 2,80 3,00 3,25 3,70 4,00

3 0,50 0,84 1,01 1,19 1,32 2,04 2,20 2,36 2,80 3,14 3,64

35

Tabla 15. Radios a través del tiempo para Auricularia delicata inoculando una cepa adaptada al aceite previamente.



0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

60 ppm

1 0,50 1,59 2,66 2,97 3,17 3,54 3,75 3,95 4,15 4,33 4,47

2 0,50 1,82 2,29 2,36 2,40 2,50 2,52 2,61 2,70 2,98 3,25

3 0,50 1,71 2,48 2,69 2,81 3,06 3,19 3,35 3,50 3,72 3,91

206 ppm




36

En la siguiente tabla se muestran los promedios de radios de colonia de las tres cajas para cada concentración, a dos diferentes condiciones

y para cada cepa. Esto se realizó con el fin de poder comparar de mejor manera el comportamiento del crecimiento de cada hongo con las

variables mencionadas anteriormente.

Tabla 16. Promedio de radios


Hongo Concentración Radios días: cm

0 1 2 3 4 7 8 9 10 11 14

Pleurotus sin adaptar

60 0,50 0,53 0,60 0,71 0,83 0,93 1,03 1,13 1,24 1,30 1,40

206 0,50 0,50 0,52 0,55 0,78 1,33 1,56 1,77 2,01 2,19 2,41

Auricularia sin adaptar

60 0,50 1,29 2,59 3,29 3,46 3,62 3,89 4,14 4,14 4,14 4,14

206 0,50 2,06 2,87 3,41 3,84 4,28 4,38 4,50 4,50 4,50 4,50

Pleurotus adaptada

60 0,50 0,60 0,69 0,84 1,00 1,45 1,45 1,50 1,65 1,88 2,00

206 0,50 0,84 1,01 1,18 1,31 1,96 2,12 2,27 2,77 3,10 3,63

Auricularia adaptada

60 0,50 1,71 2,48 2,67 2,80 3,03 3,16 3,30 3,45 3,67 3,87

206 0,50 2,07 2,78 3,39 3,63 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50

37

Figura 10. Curva de crecimiento de los dos hongos en medio de cultivo sólido a

dos concentraciones con cepas sin adaptar

Figura 11. Curva de crecimiento de los dos hongos en medio de cultivo sólido a

dos concentraciones con cepas adaptadas

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 3 6 9 12 15

Rad

io d

e c

olo

nia

, cm

Tiempo, días

RC= f(t)

PSA.60

PSA.206

ASA.60

ASA.206

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 3 6 9 12 15

Rad

io d

e c

olo

nia

, cm

Tiempo, días

RC= f(t)

PA.60

PA.206

AA.60

AA.206

38

Figura 12. Curva de crecimiento del hongo Pleurotus sajorcaju en medio de cultivo

sólido a dos concentraciones con cepas sin adaptar y adaptadas

Figura 13. Curva de crecimiento del hongo Auricularia delicata en medio sólido a

dos concentraciones con cepas sin adaptar y adaptadas

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

0 3 6 9 12 15

Rad

io d

e c

olo

nia

, cm

Tiempo, días

RC= f(t)

PSA.60

PSA.206

PA.60

PA.206

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

0 5 10 15

Rad

io d

e c

olo

nia

, cm

Tiempo, días

RC= f(t)

ASA.60

ASA.206

AA.60

AA.206

39

3.5. Resultados de la degradación de PCB’s

3.5.1. Porcentaje de degradación de PCB’s para Pleurotus sajorcaju. En las

siguientes tablas (tablas 17 y 18) se muestran los valores de los porcentajes de

degradación para Pleurotus sajorcaju, con adición de tween 20, a dos concentraciones

diferentes de PCB’s y con cepas sin adaptar y adaptas previamente al aceite dieléctrico.

40

Tabla 17. Porcentaje de degradación de PCB’s para Pleurotus sajorcaju concentración 1

Pleurotus sajorcaju


Cantidad inicial [ng]


Cantidad final [ng]

Cantidad degradada [ng]

Porcentaje de degradación

Sin adaptar

1

60 6000

0,30 1847,61 4152,39 69,21

2 0,39 2400,81 3599,19 59,99

3 0,35 2124,21 3875,79 64,60

Adaptadas

1 0,17 1016,16 4983,84 83,06

2 0,29 1771,77 4228,23 70,47

3 0,25 1509,86 4490,14 74,84

Tabla 18. Porcentaje de degradación de PCB’s para Pleurotus sajorcaju concentración 2

Pleurotus sajorcaju




Cantidad final [ng]



Sin adaptar

1

206 20600

0,73 4453,62 16146,38 78,38

2 0,50 3079,70 17520,30 85,05

3 0,61 3744,33 16855,67 81,82

Adaptadas

1 0,14 840,53 19759,47 95,92

2 0,70 4294,37 16305,63 79,15

3 0,52 3175,83 17424,17 84,58

41

3.5.2. Porcentaje de degradación de PCB’s para Auricularia delicata. En las siguientes tablas (tablas 19 y 29) se muestran los valores

de los porcentajes de degradación para Auricularia delicata, con adición de tween 20, a dos concentraciones diferentes de PCB’s y con

cepas sin adaptar y adaptadas previamente al aceite dieléctrico.

Tabla 19. Porcentaje de degradación de PCB’s para Auricularia delicata concentración 1





Cantidad final [ng]



Sin adaptar

1

60 6000

0,22 1349,86 4650,14 77,50

2 0,19 1183,86 4816,14 80,27

3 0,20 1246,44 4753,56 79,23

Adaptadas

1 0,12 756,03 5243,97 87,40

2 0,07 442,75 5557,25 92,62

3 0,10 631,23 5368,77 89,48

Tabla 20. Porcentaje de degradación de PCB’s para Auricularia delicata concentración 2





Cantidad final [ng]



Sin adaptar

1

206 20600

0,67 4104,00 16496,00 80,08

2 0,37 2272,91 18327,09 88,97

3 0,53 3210,83 17389,17 84,41

Adaptadas

1 0,86 5249,54 15350,46 74,52

2 0,67 4080,07 16519,93 80,19

3 0,77 4690,33 15909,67 77,23

42

En la siguiente tabla se muestran los promedios de los porcentajes de degradación de

las tres cajas para cada concentración, a dos diferentes condiciones y para cada cepa.

Esto se realizó con el fin de poder comparar de mejor manera la degradación de cada

hongo con las variables mencionadas anteriormente.

Tabla 21. Promedio de porcentajes de degradación

Condiciones Concentración

inicial [ng/μl]

Porcentaje de

degradación

Pleurotus sin adaptar

60 64,60

206 81,75

Auricularia sin adaptar

60 79,00

206 84,49

Pleurotus adaptada 60 76,12

206 86,55

Auricularia adaptada 60 89,83

206 77,31

Figura 14. Promedios de porcentaje de degradación para las dos cepas, a dos

condiciones y dos concentraciones diferentes

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 2

Po

rce

nta

jes

Cepas a diferentes condiciones


PSA.60-PSA.206

ASA.60-ASA.206

PA.60-PA.206

AA.60-AA.206

43

3.6. Resultados del análisis estadístico

La siguiente tabla muestra los resultados obtenidos del análisis estadístico, haciendo

alusión a diferentes combinaciones de variables y enfocada a los porcentajes de

degradación.

La tabla presenta la suma de cuadrados, los grados de libertad (gl), la media cuadrática,

el factor de Fisher (F) y la significancia (Sig).

Tabla 22. Análisis estadístico

ANOVA Suma de

cuadrados gl

Media cuadrática

F Sig.

Hongo 175,102 1 175,102 7,649 0,014

Concentración inicial 158,383 1 158,383 6,919 0,018

Condición 149,851 1 149,851 6,546 0,021

Hongo - Concentración inicial 449,355 1 449,355 19,630 0,000

Hongo – Condición 60,155 1 60,155 2,628 0,125

Concentración inicial – Condición 229,379 1 229,379 10,020 0,006

Hongo - Concentración inicial -Condición

47,714 1 47,714 2,084 0,168

Figura 15. Influencia de cepas sin adaptar sobre la concentración inicial

44

Figura 16. Influencia de cepas adaptadas sobre la concentración inicial

Figura 17. Influencia de la concentración de 60 ppm sobre la condición

45

Figura 18. Influencia de la concentración de 206 ppm sobre la condición

Figura 19. Influencia de Pleurotus sajorcaju sobre la condición

46

Figura 20. Influencia de Auricularia delicata sobre la condición

Para verificar que el método estadístico ANOVA es aplicable a este caso, se debe

verificar que los datos cumplan con normalidad e igualdad de varianza.

3.6.1. Análisis de Normalidad. El coeficiente de Shapiro Wilk debe ser mayor que

0,05 para que esta cumpla una distribución normal y se pueda aplicar ANOVA. La tabla

que se muestra a continuación muestra claramente que los valores de significancia son

mayores a 0,05 por lo que si cumple con la condición.

Tabla 23. Análisis de normalidad

Variable Estadística Número de casos

Sig.

Hongo Pleurotus 0,977 12 0,971

Auricularia 0,928 12 0,363

Concentración inicial

60 ppm 0,979 12 0,978

206 ppm 0,930 12 0,385

Condición Sin adaptar 0,902 12 0,171

Adaptadas 0,976 12 0,960

47

La siguiente figura de lo observado vs lo esperado confirma la normalidad de datos: la

línea recta representa lo esperado, mientras que los puntos lo observado. Al tener una

tendencia definida, muestra la normalidad de los datos.

Figura 21. Análisis de Normalidad

3.6.2. Análisis de la igualdad de varianza. Cuando la figura de valores predichos vs

residuales no tiene tendencia definida entonces hay igualdad de varianza y se puede

aplicar ANOVA.

48

Figura 22. Análisis de Varianza

49

4. DISCUSIÓN

No se pudo determinar la cinética de crecimiento de las cepas fúngicas en el agar

para el primer lote debido a que estas fueron inoculadas en el medio de cultivo sólido

y por falta de la presencia de un surfactante el aceite dieléctrico no logró

emulsionarse en el agar. Como consecuencia se obtuvo un crecimiento del hongo de

manera irregular por toda la caja Petri (ver Anexo A- Figura A8) , obviando las partes

donde el aceite se encontraba en mayor concentración y dificultando así la medida

del área de crecimiento para posteriores cálculos.

La presencia de tween 20 pudo haber sido un factor de estimulación de la actividad

enzimática en las cepas fúngicas, pues este al ser un surfactante mejora

notablemente la solubilidad del aceite en el medio de cultivo sólido, haciéndolo

biodisponible y obteniendo como consecuencia mejores resultados de degradación.

El tween 20 al ser un producto biodegradable pudo actuar también como sustrato

para los hongos.

Las cepas que fueron adaptadas previamente al contaminante pudieron obtener

mejores porcentajes de degradación, debido a que al haber sido inoculadas un

tiempo con el aceite evolucionaron varios mecanismos para la degradación de

compuestos organoclorados, convirtiéndolos en organismos más fuertes, por lo que

al realizar la siembra final para llevar a cabo el proceso de biorremediación estos se

adaptaron de mejor manera al medio haciendo el proceso más eficiente.

El tiempo de incubación de las cajas es primordial en este trabajo, pues no basta con

que la caja esté colonizada por completo, hay que esperar más días para asegurar

que la biodegradación se esté produciendo. Mientras haya sustrato los hongos van

poder seguir viviendo y por lo tanto degradando mayor cantidad de PCB’s.

En el caso de que la de la cepa muriera durante el proceso, el porcentaje de

degradación en la experiencia disminuiría, debido a que bajaría la producción

enzimática de los organismos vivos.

50

Para ambas cepas se puede evidenciar en sus figuras (Véase figuras 10-13) que la

fase de adaptación es casi nula. Esto pudo deberse a que los hongos estaban

inoculados anteriormente en el mismo medio de cultivo, es decir PDA, razón por la

cual se vuelven a adaptar rápidamente, trayendo como consecuencia la desaparición

de dicha fase o la aparición de esta únicamente por un tiempo muy limitado.

Los porcentajes de degradación son bastante buenos, esto se debe a que los aceites

que se utilizaron en el proyecto contenían únicamente un patrón, el de AROCLOR

1242, mismo que contiene las estructuras de PCB’s más livianas. Esto favorece a la

investigación, de manera que hace que sus estructuras sean más fáciles de romper,

haciendo el proceso eficiente.

El análisis estadístico muestra para la combinación Hongo-Condición una

significancia de 0,125, misma que no entra en el rango permitido; razón por la cual la

combinación de estas dos variables no sería relevante en el proceso. . (Véase tabla

22).

Al combinar las tres variables (Hongo-Concentración inicial-Condición), la

significancia arroja un valor de 0,168, la cual muestra que la influencia de estas tres

variables en la degradación de PCB’s no es significativa. (Véase tabla 22).

51

5. CONCLUSIONES

La mejor eficiencia de crecimiento en la caja Petri es la de la cepa Auricularia delicata

a la concentración de 206 ppm, tanto para cepas sin adaptar como para cepas

adaptadas; seguidas de la misma cepa a la menor concentración. Por esta razón se

concluye que esta cepa crece de mejor manera en el contaminante. (Véase tabla 16).

Se puede observar claramente en la figura 10 que la cepa de Auricularia delicata sin

adaptar se reproduce de mejor manera tanto a una concentración de 60 ppm como

a una de 206 ppm en relación a la cepa de Pleurotus sajorcaju.

Al comparar la cepa Pleurotus sajorcaju a las condiciones de hongo inoculado sin

adaptar y adaptado, se puede evidenciar que para la cepa adaptada a mayor

concentración, es decir 206 ppm tuvo un mejor ajuste, por lo que su radio de

crecimiento a los mismos tiempos fue mayor que el de cepas sin adaptar e incluso

que una cepa ya adaptada pero a menor concentración de PCB’s (Véase figura 12).

Para la cepa Auricularia delicata se observa que para ambas condiciones (sin adaptar

y adaptadas) a 206 ppm tuvieron una mejor adaptación al medio, pues

aproximadamente en 7 días alcanzaron la colonización total de la caja Petri. (Véase

tabla 16).

Los microorganismos se ajustan de mejor manera a las condiciones de mayor

concentración de contaminante. (Véase tabla 16).

El mayor porcentaje de degradación se obtuvo para la cepa de Auricularia delicata a

la condición de cepa adaptada y a la menor concentración, seguida por la cepa de

Pleurotus sajorcaju a la misma condición (cepa adaptada) pero con mayor

concentración de contaminante. (Véase tabla 21 y figura 14).

La adaptación previa del hongo es un factor importante para la degradación de este

compuesto, pues la cepa Pleurotus sajorcaju a la condición de cepa sin adaptar a la

52

menor concentración obtuvo el menor porcentaje de reducción de contaminante

respecto a todas las demás. (Véase tabla 21 y figura 15).

Al analizar variable por variable estadísticamente se puede concluir que tanto la

elección del hongo, la concentración inicial y la condición (sin adaptar y adaptada)

influyen directamente en la degradación de PCB’s, pues su significancia es menor a

0,05 para los tres casos y el método ANOVA hace análisis de varianzas en valores

menores a este. (Véase tabla 22)

Al analizar combinaciones de variables, tales como: Hongo-Concentración inicial y

Concentración inicial-Condición también se puede demostrar que son variables que

afectan a la biodegradación, pues sus valores de significancia son de 0,000 y 0,006

respectivamente.

53

6. RECOMENDACIONES

La adición de un surfactante al medio de cultivo puede influenciar en la actividad

enzimática, pues una cantidad excesiva podría inhibir la producción de enzimas,

desfavoreciendo por completo la degradación de PCB’s. Es por esto que se

recomienda utilizar entre el 1-15 % de surfactante.

Para futuros trabajos de investigación que involucren PCB’s, se sugiere investigar

congéneres por separado o a su vez AROCLORES por separado tal como se hizo

en esta experiencia, con el fin de obtener mejores resultados de biodegradación.

Se recomienda realizar las experiencias en medios de cultivo líquido para medir

absorbancias en un espectrofotómetro y conocer a que tiempo se da la mayor

producción de actividad enzimática de los hongos.

En trabajos de investigación que involucren actividad enzimática, se recomienda

adicionar sustratos ricos en glucosa para mejorar las condiciones de crecimiento y

producción de enzimas biodegradadoras.

54

CITAS BIBLIOGRÁFICAS

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[9] Ibíd., p.19

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[11] CHANG, Boris et al. Chemosphere. 2000. p. 79

[12] Biorremediación. Op. Cit. p. 4

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partir del micelio de hongos agaricoides. Trabajo de Grado. Ingeniero Químico.

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[18] Loc. Cit

[19] Loc. Cit

[20] MORENO, Op. Cit., p. 19

[21] GUTIÉRREZ, Jennifer y GONZÁLEZ, Maricela. Tendencia en el manejo y análisis

de policloruros de bifenilo. Trabajo de grado. Ingeniero Industrial. Universidad

Tecnológica de Pereira. Escuela de Tecnología Química. Pereira. 2012. p. 21

[22] MORENO, Op. Cit., pp. 94,95

[23] Quiminet, Op. Cit.

[24] GUTIÉRREZ, Op. Cit., pp. 30,31

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[30] FRENCH, Eduardo y HEBERT, Teddy. Métodos de investigación fitopatológica.

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[31] AQUIAHUATL, Maggy et al. Manual de prácticas de laboratorio de microbiología

general. Editorial Printed in México, Iztapalapa, 2012. p. 48

[32] Ibíd., p. 49

[33] Ibíd., p. 50

[34] ACOFARMA. Fichas de información técnica [en línea]. [Fecha de consulta: 14 Julio

2016]. Disponible en:

http://www.acofarma.com/admin/uploads/descarga/408613a7fe07629597df9e0d23

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56

BIBLIOGRAFÍA

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characterisation of polychlorinated biphenyl (PCB) degrading fungi from a historically

contaminated soil. Departament of Plant Biology, University of Turin. Turin, Italy.

2009.

57

ANEXOS

58

ANEXO A. Materiales usados para la reproducción de las cepas

Figura A1. Balanza analítica

Figura A2. Medio de cultivo

59

Figura A3. Autoclave

Figura A4. Cámara de flujo laminar

60

Figura A5. Incubadora

Figura A6. Vista del hongo Pleurotus sajorcaju inoculado y crecido

61

Figura A7. Vista del hongo Auricularia delicata inoculado y crecido

Figura A8. Vista del hongo Auricularia delicata sin presencia de tensoactivo

inoculado y crecido

62

ANEXO B. Materiales usados para la extracción de aceite dieléctrico del medio de cultivo.

Figura B1. Horno Mufla

Figura B2. Campana de extracción

63

Figura B3. Baño ultrasónico

Figura B4. Equipo de filtración a vacío

64

Figura B5. Rotavapor

65

ANEXO C. Materiales usados en la preparación de las muestras para posterior análisis en C.G.

Figura C1. Recolección de la muestra pasada a través de la columna de florisil

Figura C2. Vórtex de laboratorio

66

Figura C3. Cromatógrafo de gases

67

ANEXO D. Cromatogramas de resultados

Figura D 1. Cromatograma obtenido para una muestra de Pleurotus sajorcaju sin

adaptar a 60 ppm

68

Figura D 2. Cromatograma obtenido para una muestra de Pleurotus sajorcaju

adaptada a2 206 ppm

69

Figura D 3 Cromatograma obtenido para una muestra de Auricularia delicata sin

adaptar a 60 ppm

70

Figura D 4. Cromatograma obtenido para una muestra de Auricularia delicata

adaptada a2 206 ppm

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