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Universidade do Vale do Paraíba Faculdade de Educação e Artes

Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas

CATARINA DE SOUZA

EFEITO DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA NA REPRODUÇÃO DE Drosophila melanogaster

São José dos Campos – SP

2012


Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO


CATARINA DE SOUZA .

Orientadora: Prof.ª Dr ª Josane Mittmann


2012

Relatório Final apresentado como parte das exigências da disciplina Trabalho de Conclusão de Curso à Banca Examinadora da Faculdade de Educação e Artes da Universidade do Vale do Paraíba.


Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas Curso de Ciências Biológicas Da Faculdade de Educação e Artes

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

2012


Catarina de Souza

Orientadora: Prof.ª Dr ª Josane Mittmann

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Drauzio Eduardo Nareto Rangel (Univap) Profª Dra. Flavia Villaça Morais (Univap) Prof. Me. Antônio Carlos G.Prianti Júnior (Univap)

Nota do Trabalho...............................(................................)


DEDICATÓRIA

A toda minha família, principalmente a meus pais e minhas irmãs que foram

essenciais na minha formação, me dando apoio e me incentivando sempre.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida e por me permitir realizar meus sonhos.

A minha orientadora Drª Josane Mittmann por me aceitar como estagiária e dar

todo apoio na execução do trabalho.

Ao Dr. Drauzio E. N. Rangel por permitir que utilizasse em seu laboratório a

câmara UV e o microscópio estereoscópico para que os experimentos pudessem ser

feitos.

A todo pessoal do laboratório; Quênia Yoko, Luciana Cortez e Emanoel Pedro;

por me apoiarem e terem paciência em me ensinar procedimentos e técnicas.

A meus padrinhos Márcia e Sidney que me auxiliaram e me deram apoio em

todos os momentos.

A meus pais e minhas irmãs, pelo apoio, compreensão e paciência.

A minhas colegas de república, por aturarem minhas crises de estresse e pelas

experiências trocadas por todo esse tempo.

A meu namorado Renato que me auxilia em todos os momentos e sempre está do

meu lado e sua família que me acolheu desde o início como se eu fosse parte dela.

A minhas amigas de infância, que mesmo distantes foram essenciais em todos os

momentos de minha trajetória.

A todos que de alguma forma contribuíram para a minha formação durante a vida

acadêmica, seja professores, colegas e amigos da faculdade, principalmente minha

amiga Amanda Couto.

“A persistência é o menor caminho do êxito.”

Charles Chaplin

RESUMO: A Drosophila melanogaster é um modelo muito simples e importante no estudo de

agentes mutagênicos, sendo amplamente utilizada em diversas áreas. Estudos

sobre a influência da radiação UV-B nos organismos se mostram importantes uma

vez que os níveis que ultrapassam a camada de ozônio estão cada vez maiores e

podem causar danos que ainda são desconhecidos. Este trabalho analisou os

efeitos da radiação UV em Drosophila melanogaster como padrão de reprodução,

fecundidade e alterações morfológicas. Submeteu-se moscas adultas a radiação

UV-B com a intensidade de 828,13 mW / m² e irradiação de 2,98 kJ / m² por hora.

Adultos, machos e fêmeas foram irradiados durante 90 min. ou 180 min.

Cruzamentos foram feitos usando as combinações seguintes: controle (não

irradiado); irradiados (ambos os sexos irradiados); machos e fêmeas irradiados e

não irradiados. As observações foram feitas a cada dia. Adultos foram retirados após

o nascimento, contados e separados por sexo durante 20 dias. O teste ANOVA de

análise estatística foi realizada usando o programa GraphPad Prisma. A análise dos

resultados mostrou que nas condições experimentais a radiação UV não induziu

alterações fenotípicas em F1. Observou-se diferenças entre os sexos, o total de

fêmeas nascidas em todas as combinações foi maior após a irradiação com 180 min.

Moscas irradiadas durante 180 min. foram atrasados na eclosão das pupas quando

comparados com aqueles irradiados por 90 min.

Palavras-chave: radiação UV-B, Drosophila melanogaster

ABSTRACT: Drosophila melanogaster is a very simple and important and model in the studies of

mutagens, being widely used in many areas. Research about the influence of UV-B

radiation into de organisms are important because the levels of UV chat crossing the

ozone layer are increasing and may cause unknown damagen. This work analyzed

the UV radiation effects on Drosophila melanogaster reproduction pattern as

fecundity and morphological alterations. Submitted adults flies to UV-B radiation with

intensity of 828,13 mW/m² and irradiance of 2,98 kJ/m² per hour. Adults, females or

males were irradiated during 90 min. or 180 min. Crossings were made using the

followings combinations: Control (non-irradiated); irradiated (both sexes irradiated);

males irradiated and females irradiated. The observations were made every day.

Adults were removed after born, counted and separated by sex during 20 days.

ANOVA statistical analysis were performed using GraphPad Prisma program.

Results analysis showed that in the experimental conditions the UV radiation not

induced phenotypic alterations in F1. Observed differences between sexes, the total

of females born in all crossing combinations was higher after irradiation with 180 min.

Flies irradiated during 180 min. were delayed in the pupae hatching when compared

with those irradiated for 90min.

Keywords: UV-B radiation, Drosophila melanogaster

LISTA DE FIGURAS E TABELAS: Figura 1: Ciclo de Vida da Drosophila melanogaster............................................13

Figura 2: Espectro Eletromagnético......................................................................15

Tabela 1 – Ingredientes utilizados para preparação do meio...............................18

Figura 3: Frascos de cultura prontos para uso......................................................19

Figura 4: Saccharomyces cerevisiae utilizada na alimentação.............................19

Figura 5: Representação esquemática de D. melanogaster macho e fêmea.......20

Figura 6: Indivíduos adultos de D. melanogaster indicando o pente sexual e o

abdômen mais escuro do macho...........................................................................21

Figura 7: Frascos de cultura com machos e fêmeas separados...........................22

Figura 8: Indivíduos no último estágio de pupa ....................................................23

Figura 9: A- Placa de Petri e pincel utilizados. B- Placa com papel filtro umedecido

e agulha para perfurar o filme PVC.......................................................................24

Figura 10: Câmara UV...........................................................................................24

Figura 11: Total de indivíduos nascidos após cada tratamento.............................26

Figura 12: Total de indivíduos nascidos em relação ao tempo..............................28

Figura 13: Total de indivíduos nascidos após cada tratamento, separados por

sexo........................................................................................................................29

Tabela 2: Total de indivíduos nascidos e razão sexual..........................................30

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 11

1.1 OBJETIVOS ..................................................................................................... 11

1.1.1 Geral ........................................................................................................... 11

1.1.2 Específicos ................................................................................................. 11

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 12

2.1 Drosophila melanogaster .................................................................................. 12

2.2 Radiação UV-B ................................................................................................. 15

3. METODOLOGIA ................................................................................................... 18

3.1 Local de estudo ................................................................................................ 18

3.2 Meio de cultura e manutenção das moscas de D. melanogaster ..................... 18

3.3. Separação dos machos e fêmeas ................................................................... 20

3.4 Bioensaios ........................................................................................................ 22

4.1 Efeitos da radiação UV-B na morfologia........................................................... 26

4.2 Efeito da radiação UV-B na fecundidade e tempo de eclosão ......................... 26

5. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 31

6. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 34

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 35

11

1. INTRODUÇÃO

As diferentes espécies do gênero Drosophila têm sido utilizadas como

organismos modelo em diversas áreas de estudo pelas inúmeras vantagens que

possuem (SOUZA, 2009) para a análise genética, quer à nível da investigação de

ponta, quer como modelo para ensinar os princípios básicos da hereditariedade

(GOMES,2001).

Segundo Dallas (2002), com o recente declínio da camada de ozônio devido a

compostos clorofluorcarbono, há uma crescente quantidade de radiação ultravioleta

(UV) que atinge a superfície da Terra, o que iniciou nova investigação para

determinar os efeitos que o aumento na radiação terá sobre os seres vivos.

Pesquisas anteriores mostraram os efeitos das radiações diversas em drosófila.

Tem sido relatado, que vários tipos de radiação podem vir a mudar não só a

fertilidade, mas também podem induzir mutações genéticas, o que sugere que a

drosófila está seriamente vulnerável a diferentes tipos de radiação UV (ZHEPENG,

2008).

São vários os trabalhos demonstrando que a radiação UV provoca

preferencialmente danos ao nível citoplasmático celular e pouco a nível nuclear; ao

contrário das radiações UV-B e UV-C, as quais provocam danos nucleares

(Kochevar 1990, Beer et al. 1993) citado por HOLLMANN (2007).

Sendo assim a drosófila é um modelo simples, cujos resultados podem ser

importantes para compreender qual o papel da radiação ultravioleta em insetos.

1.1 OBJETIVOS

Em vista das questões expostas anteriormente, este trabalho tem como objetivos:

1.1.1 Geral

Analisar o efeito da radiação ultravioleta na reprodução de Drosophila

melanogaster.

1.1.2 Específicos

Verificar por microscopia óptica possíveis alterações morfológicas induzidas

pela radiação UV.

Avaliar a fecundidade após exposição a diferentes tempos de radiação UV;

12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Drosophila melanogaster

A Drosophila melanogaster apresenta o corpo dividido em cabeça, tórax e

abdómen. Na cabeça, distinguem-se as antenas, os olhos e as peças bucais; no

tórax, que é constituído por 3 segmentos, apresenta 3 pares de patas; no abdômen,

possui uma nítida segmentação e é este que constitui o centro de nutrição

(PEREIRA et al. 2008).

Segundo Pereira (2008), a classificação da espécie considerada atualmente mais

correta é a seguinte:

Filo: Arthropoda

Classe: Insecta

Subclasse: Pterygota

Ordem: Diptera

Subordem: Cyclorrapha

Família: Drosophilidae

Gênero: Drosophila

Espécie: Drosophila melanogaster

No decurso do seu ciclo de vida (Fig. 1) a drosófila passa por uma fase de ovo

(0,5 mm.), decorrendo a embriogênese em cerca de 24 horas. Eclode então uma 1ª

forma larval que, ao fim de um dia, muda de cutícula e se transforma numa larva de

2ª fase. Decorrido mais um dia a larva muda novamente de cutícula e transforma-se

numa 3ª fase larval que aumenta significativamente de tamanho ao longo de três

dias (4 mm). Nesta altura, a larva deixa de escavar galerias no meio de cultura semi

sólido e tem tendência a fugir da humidade, deslocando-se para zonas mais secas.

Nesta fase, começa a ficar imóvel, segrega uma cutícula espessa e forma uma

espécie de casulo denominada pupa (3 mm). Durante a fase de pupa, que demora

cerca de cinco dias, ocorre metamorfose, a qual envolve a degradação de

praticamente todos os tecidos larvares e a proliferação significativa dos discos

imaginais. Estes são pequenos grupos de células, até então indiferenciados, que

irão originar as estruturas do adulto (também conhecido por imago). Da pupa eclode

o indivíduo adulto (2 mm), que atinge a maturidade sexual ao fim de 12 horas e que

tem uma expectativa média de vida de 60 dias. Apenas ao fim de uma hora de

13

eclosão da pupa é que as asas do adulto ficam completamente distendidas. Os

adultos eclodem pouco pigmentados, e só ao fim de algumas horas é que se tornam

óbvias a coloração acastanhada do corpo e o padrão de listas escuras dos

segmentos abdominais (Gomes, 2001).

Figura 1: Ciclo de Vida da Drosophila melanogaster

Disponível em: www.asmitocondrias.blogspot.com (Acesso em 06 set. 2012)

As diversas espécies do gênero Drosophila têm sido utilizadas como organismos

modelo em várias áreas de estudo pelas inúmeras vantagens que possuem, desde a

fácil manutenção em laboratório, suscetibilidade de suas populações às alterações

ambientais, a sua genética bem conhecida e, além disto, muitas espécies já

possuem seus genomas completamente sequenciados (SOUZA, 2009). Além disso,

elas são tão férteis, e o tempo entre a fecundação e o nascimento é tão curto que os

cientistas podem acompanhar a evolução da vida como que num filme em ritmo

acelerado. Numa temperatura amena, entre 22 e 25 graus, as moscas se

reproduzem em apenas duas semanas. No fim da vida, uma fêmea de drosófila terá

14

gerado uma prole com algo em torno de 1.000 insetos. Isso significa que, num único

ano, pode-se analisar 25 gerações (GOMES, 2001).

A drosófila apresenta várias vantagens para a análise genética, quer ao nível da

investigação de ponta, quer como modelo para ensinar os princípios básicos da

hereditariedade sendo um excelente modelo biológico. Cruzando indivíduos que

diferem em características facilmente visíveis (como sejam o tamanho das asas e a

cor dos olhos ou do corpo) e estendendo esta análise até aos seus netos (F2), é

possível determinar, ao fim de um mês, quantos genes estão envolvidos, quais os

alelos dominantes e os recessivos e se o padrão de herança está, ou não, ligado ao

sexo (GOMES, 2001).

A drosófila é a sucessora direta das ervilhas que Gregor Mendel estudou na

segunda metade do século XIX para estabelecer a ideia básica da genética

moderna: a de que as características de cada indivíduo são transmitidas de pais

para filhos por "fatores", como os batizou - os atuais genes. Os pesquisadores

calculam que, em um século de dinastia, as drosófilas tenham dado motivos para

que se escrevessem mais de 100.000 artigos científicos (VENTUROLI, 2005).

Em espécies de drosófila, assim como em qualquer outro organismo, o

aparecimento de novos mutantes é um evento extremamente raro. Drosófilas com

olhos brancos ou asas vestigiais só foram encontradas após a análise minuciosa de

milhares de indivíduos. Em 1914, Morgan escreveu: “Na realidade, nossa

experiência com Drosophila nos dá a impressão que as mutações são eventos raros,

embora o número de mutações obtidas por nós até o momento tenha sido muito

grande.” Existem duas razões principais para a raridade das mutações. Uma delas é

a baixa frequência com que um determinado gene sofre mutação; a outra é a

recessividade da maioria dos alelos mutantes. Como consequência dessa última

situação, a quase totalidade dos alelos mutantes encontra-se no estado

heterozigótico, mascarados pelo alelo dominante selvagem (adaptado de Moore,

1986).

Durante as primeiras décadas do século XX, os organismos foram submetidos a

diversos tratamentos visando o aumento da taxa de mutação. Na esperança de

obter novos mutantes, Morgan injetou várias substâncias químicas em diferentes

espécies de insetos. Posteriormente, ele expôs drosófilas à radiação, ideia que deve

ter vindo de seu colega da Columbia University, James Howard McGregor, que foi

um dos primeiros a testar o efeito da radiação por rádio em organismos vivos (ele

15

usou gametas e embriões de rãs). O fato de algumas das linhagens de D.

melanogaster de Morgan terem sido submetidas à radiação traz a remota

possibilidade de que alguns dos primeiros mutantes descobertos possam ter sido

induzidos por ela (adaptado de Moore, 1986).

2.2 Radiação UV-B

A radiação UV é uma radiação não ionizante e compreende ondas

eletromagnéticas entre 100 e 400 nm (OKUNO, 2005).

Conforme citado por Pinheiro (2010) o UV é o espectro da radiação solar mais

fotoquimicamente reativo e tem uma ampla gama de efeitos genéticos e citotóxicos

(VICENT; NEALE, 2000). É comumente dividido em três faixas (fig. 2): UV-C (100-

280 nm), UV-B (280-315 nm) e UV-A (320-400 nm) (ROSENTHAL et al., 1986;

PAUL, 2000; WHITE; JAHNKE, 2004). Dentre estas, a radiação UV-B pode causar

inúmeros efeitos negativos nos organismos em diferentes níveis, tanto molecular

quanto celular (VICENT; NEALE, 2000).

Figura 2: Espectro Eletromagnético

Fonte: Corrêa (2003)

No nível molecular a radiação UV-B pode causar danos ao DNA, RNA, proteínas

e em muitos outros constituintes celulares, pois é absorvida diretamente por

diferentes macromoléculas, causando fotodanos e mutagêneses no DNA, sendo os

16

dímeros de pirimidina os danos mais prevalentes causados pela radiação, assim, o

DNA é a molécula mais sensível à radiação UV-B na maioria dos sistemas que

foram estudados (QUAITE et al., 1992; 1994; ROUSSEAUX et al., 1999; ROZEMA et

al., 2002). Citado por Pinheiro (2010).

Os raios UV dissipam sua energia para os átomos que eles encontram, elevando

os elétrons de orbitais exteriores para níveis de alta energia, um estado referido

como excitação. As moléculas contendo átomos na forma iônica ou no estado

excitado são quimicamente mais reativas do que as que contêm átomos em seu

estado estável normal. A reatividade aumentada dos átomos presentes nas

moléculas de DNA é a base dos efeitos mutagênicos da luz UV e da radiação

ionizante (ZAHA, 1996).

Segundo Nascimento (2009), a radiação UV-B também é fortemente absorvido

por aminoácidos aromáticos, como a tirosina, o triptofano e a fenilalanina. As formas

reativas dos resíduos desses aminoácidos podem sofrer autólise ou reagir com

outras moléculas. Em ambos os casos, podem ocorrer desnaturação e a perda da

função biológica de enzimas e de proteínas (GERHARDT et al.; 1999; HOLLOSY,

2002). O fato de o DNA estar intimamente associado à proteína torna comum a

ocorrência de ligações cruzadas entre essas moléculas após as exposições a

radiação UVB (GRIFFITHS et al., 1998). Além disso, o aumento de UV-B pode

alterar não só o organismo, mas a estrutura de comunidades, atividade de

microrganismos terrestres e a biomassa (JOHNSON, 2003).

A camada de ozônio é responsável pela forte atenuação da radiação UV,

principalmente nas bandas C e B (OKUNO, 2005), no entanto, com seu recente

declínio devido a compostos clorofluorcarbono, há uma crescente quantidade de

radiação UV que atinge a superfície da Terra, o que iniciou nova investigação para

determinar os efeitos que o aumento na radiação terá sobre os seres vivos

(DALLAS, 2002), como o fato de ter o UV como um responsável pela diminuição de

espécies onde o habitat não é obviamente afetado por outras causas de mortalidade

(LICHT & GRANT, 1997).

A relação entre a taxa de mutação e a dose de UV é muito variável, dependendo

do tipo de mutação do organismo e das condições empregadas (ZAHA, 1996). Os

efeitos da radiação são facilmente verificáveis em organismos que, naturalmente são

mais suscetíveis a mutações. São vários os trabalhos demonstrando que a radiação

UV-A provoca preferencialmente danos ao nível citoplasmático e pouco a nível

17

nuclear; ao contrário das radiações UVB e UVC, as quais provocam principalmente

danos nucleares (KOCHEVAR 1990, BEER et al. 1993). Citado por HOLLMANN

(2007).

O ultravioleta é, portanto, muito adequado em estudos que abordam a natureza

íntima de processos mutagênicos.

Considerando o crescente interesse em estudar os efeitos da radiação UV sobre

os organismos e sendo a D. melanogaster um modelo muito utilizado para ensaios

biológicos optou-se neste projeto por utilizar este inseto como modelo para estudos

dos efeitos da radiação UV-B na fecundidade.

18

3. METODOLOGIA

3.1 Local de estudo

O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Parasitologia e Biotecnologia em

parceria com o laboratório de Microbiologia Ambiental no Instituto de Pesquisa &

Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba, em São José dos

Campos - SP.

3.2 Meio de cultura e manutenção das moscas de D. melanogaster

As moscas D. melanogaster, usadas para a realização dos bioensaios, foram

mantidas em ambiente com temperatura de 25 ± 2 °C, no Laboratório de

Parasitologia e Biotecnologia do IP&D, dentro de frascos de vidro transparentes

previamente limpos, com aproximadamente 50 ml de meio de cultura. Estas foram

cedidas pelo Laboratório de Drosofilídeos – Prof Paulo Roberto Petersen Hofmann

da Universidade Federal de Santa Catarina, em 2008, e são mantidas desde então.

Para a preparação do meio os ingredientes (Tabela 1) secos foram pesados em

uma balança de precisão e colocados em um Becker. O Nipagim foi reservado, pois

este deve ser misturado somente após o meio estar pronto. Após esse processo,

juntou-se a água e a mistura foi levada ao micro-ondas em potencia alta por 4

minutos, sendo que a cada 1 minuto o meio foi misturado, para que não houvesse a

formação de grumos. Feito estes procedimentos, juntou-se ao meio o Nipagim e

misturou-se bem.

Tabela 1 – Ingredientes utilizados para preparação do meio

Ingrediente Quantidade

Farinha de milho 58,34 g

Farinha de soja 2,92 g

Farinha de centeio 7,50 g

Açúcar 45,84 g

Sal 0,45 g

Fungicida (Nipagin) 1,60 g

Água 417,00 ml

19

Os frascos de vidro foram lavados e colocados em estufa para secagem, numa

temperatura de 60 ± 2 °C. Após estarem totalmente secos, o meio de cultura é

colocado e o vidro é tampado com uma rolha de espuma poliuretano. Estes são auto

clavados em temperatura ideal de 121 °C a 1 atm. por 30 minutos e armazenados

até o momento do uso em um local seco, porém onde não receba luz solar para que

não haja ressecamento. As moscas são mantidas no mesmo frasco por

aproximadamente 15 dias e, após este período, uma porcentagem é descartada e

outra é transferida para os frascos anteriormente preparados. Nestes frascos é

introduzida ao meio uma fita de papel filtro (Fig. 3), a fim de absorver a umidade

excessiva. O frasco do qual foi eliminado as moscas é mantido fechado para que as

larvas já existentes empem e sejam utilizadas posteriormente. Após, no máximo 30

dias, o meio é removido e o frasco é higienizado para uso.

Durante todo o período de manutenção, as drosófilas são alimentadas com

Saccharomyces cerevisiae (Fig. 4) duas vezes por semana.

Figura 3: Frascos de cultura prontos para uso

Figura 4: Saccharomyces cerevisiae utilizada na alimentação. A- forma granulada para facilitar a

conservação. B- dissolvido em água no momento do uso

A B

20

3.3. Separação dos machos e fêmeas

A realização dos cruzamentos implica numa identificação correta dos machos e

das fêmeas. Na realidade existe um dimorfismo sexual bem acentuado no abdômen

do adulto. Enquanto as fêmeas apresentam uma alternância típica de listas claras e

escuras nos segmentos abdominais, os machos apresentam a extremidade do

abdômen negra devida à fusão (coalescência) dos segmentos terminais (Fig. 5).

Porém, estas diferenças não são óbvias nos indivíduos recentemente eclodidos da

pupa devido à sua fraca pigmentação. A observação da zona genital masculina e

feminina também não permite uma distinção perfeita. O critério verdadeiramente

objetivo para distinguir o sexo mesmo na pupa baseia-se na observação de uma

estrutura pilosa, denominada pente sexual, que os machos possuem na base do

metatarso do par de patas anterior, ou seja, no primeiro par de patas junto à cabeça

(Fig. 6). As fêmeas não possuem esta estrutura em nenhum dos seus três pares de

patas, e os machos também não apresentam pente sexual no segundo e no terceiro

pares de patas (GOMES, 2001).

Figura 5: Representação esquemática de D. melanogaster macho e fêmea

Fonte: Gomes (2001)

21

Figura 6: Indivíduos adultos de D. melanogaster indicando o pente sexual e o abdômen mais

escuro do macho

22

3.4 Bioensaios

Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, os espécimes foram separados

de acordo com o sexo na fase de pupa e colocados em frascos previamente

preparados com meio de cultura para que pudessem eclodir (Fig. 7).

Para que seja possível essa distinção, observa-se na presença ou não de dois

pontos negros na parte anterior da pupa. Esses pontos se caracterizam pelo pente

sexual do macho, que é nitidamente visualizado (Fig. 8).

Figura 7: Frascos de cultura com machos e fêmeas separados

23

Figura 8: Indivíduos no último estágio de pupa A- Macho com indicação do pente sexual

B- Fêmea

24

As pupas são colocadas numa placa de petri forrada com papel filtro umedecido

e com o auxílio de um pincel macio elas são manipuladas para visualização correta

no microscópio (Fig. 9 A).

Após a eclosão, os frascos com os indivíduos foram colocados na geladeira por

aproximadamente 1 minuto a fim de ficarem imóveis e facilitar o manuseio. Feito isto

os indivíduos foram colocados placas de petri de 4 cm de diâmetro forradas com

papel filtro umedecido e tampadas com filme PVC. Com auxílio de uma agulha de

insulina foram feitos pequenos furos no filme PVC para que o ar pudesse circular no

interior na placa (Fig. 9 B). Após estes procedimentos os indivíduos foram colocados

em uma câmara UV-B (Fig. 10) com 2 lâmpadas fluorescentes TL 20W 12 RS,

potência de 828,13 mW/m² a uma irradiância de 2,98 kJ/m² por hora e submetidos à

radiação por 90 min. ou 180 min. consecutivos. Após este período os indivíduos

foram colocados nos frascos contendo meio de cultura na proporção de 5 machos

para 5 fêmeas para realizar cruzamentos.

Figura 9: A- Placa de Petri e pincel utilizados.

B- Placa com papel filtro umedecido e agulha para perfurar o filme PVC

Figura 10: Câmara UV

A B

25

Os cruzamentos foram divididos em frascos de cultura da seguinte maneira:

- Cruzamento 1→ fêmeas não irradiadas + machos não irradiados

- Cruzamento 2 → fêmeas irradiadas + machos irradiados

- Cruzamento 3 → fêmeas não irradiadas + machos irradiados

- Cruzamento 4 → fêmeas irradiadas + machos não irradiados

Os frascos foram datados e identificados e os espécimes foram alimentados com

levedura. Após 48 horas da junção dos casais, estes foram retirados dos frascos e

descartados. Foram feitas 3 repetições de cada tempo de irradiação

O experimento decorreu por até 20 dias. A medida que os pupas eclodiram os

indivíduos foram retirados, eterizados e reservados para análises posteriores e

estatísticas, que foram feitas a partir de todos os indivíduos que nasceram neste

período.

Os dados foram analisados através do software GraphPad Prism ®, e as médias

entre os tratamentos foram comparadas através da análise de ANOVA.

26

4. RESULTADOS

4.1 Efeitos da radiação UV-B na morfologia

Os indivíduos obtidos na geração F1 foram observados minuciosamente em

microscópio estereoscópico e não foi encontrada nenhuma alteração fenotípica.

4.2 Efeito da radiação UV-B na fecundidade e tempo de eclosão

Nos tratamentos feitos por 90 min. de irradiação observou-se que o controle

obteve o maior número de nascimentos que os irradiados (Fig.11), entretanto a

análise estatística mostrou que estas diferenças não foram significativas. Nos

tratamentos feitos por 180 min. de irradiação observou-se que no tratamento 4

(fêmeas irradiadas) as pupas eclodiram primeiro e ao final obteve-se um total maior

de indivíduos que o controle (Fig. 11 e 12), porém sem diferenças significativas.

Figura 11: Total de indivíduos nascidos após cada tratamento. 1 – controle; 2 – machos e fêmeas irradiados; 3 – machos irradiados; 4 – fêmeas irradiadas.

90 min.

180 min.

27

A formação de pupas e a velocidade do ciclo de vida também tiveram alterações.

Enquanto o controle teve formação de pupas já no 9º dia após o cruzamento, os

tratamentos irradiados tiveram o ciclo mais lento, tendo a formação de pupas

somente após o 11º dia, sendo que o cruzamento 2 (machos e fêmeas irradiados)

teve formação de pupas no primeiro experimento, mas cerca de 80 % não eclodiu.

Os primeiros nascimentos do controle ocorreram a partir do 14º dia após

cruzamento e mantiveram-se até o 20º dia, tendo um aumento significativo na

quantidade de nascidos com o tempo. Já o cruzamento 3 (machos irradiados) teve o

primeiro nascimento no 13º dia e aumentou gradativamente até o 20º dia, no

entanto, com menos indivíduos que o controle. Os cruzamentos 2 (machos e fêmeas

irradiados) e 4 (fêmeas irradiadas) também obtiveram nascimentos a partir do 14º

dia, no entanto a quantidade de indivíduos até o 20º dia também foi menor que o

controle (Fig. 12).

O cruzamento 2 (machos e fêmeas irradiados) teve o primeiro nascimento após

16 dias da junção dos casais, já o cruzamento 3 (machos irradiados), após 17 dias,

o que não interferiu para que este tivesse mais nascimentos que os outros até o 20º

dia (Fig. 12).

Comparando os dados com a análise de ANOVA (Tukey's multiple comparisons

test) verificou-se que existem diferenças estatísticas significativas quando tratamos

do total de indivíduos por tempo. Após as análises observou-se que os resultados

são estatisticamente diferentes no tempo de 20 dias após irradiação, exceto para o

cruzamento em que os machos que foram irradiados por 90 min., onde parece que

os nascimentos foram constantes ao longo do tempo. O nascimento dos indivíduos

do cruzamento em que os machos foram irradiados por 180 min. nasceram mais

lentamente sendo que o maior número de eclosão das pupas aconteceu próximo ao

20º dia (Fig 12).

Quando comparadas as médias +/- o desvio padrão dos nascimentos de machos

e fêmeas separadamente, observou-se quando os indivíduos foram irradiados por 90

min. a quantidade de machos nascidos foi maior do que o de fêmeas, em todos os

cruzamentos. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Já nos

ensaios de 180 min. de irradiação, nasceram mais fêmeas em todos os cruzamentos

do que machos (Fig. 13).

28

Figura 12: Total de indivíduos nascidos em relação ao tempo. A- Irradiação por 90 min.(4,47 KJ/m²). Pode-se observar que os nascimentos mantiveram-se constantes até o 14º dia, após este período, o controle obteve o maior número de nascimentos no decorrer dos dias, sendo que nos dias 19 e 20 os experimentos tiveram um crescimento proporcional. B- Irradiação por 180 min. (8,94 KJ/m²). Pode-se observar que os nascimentos mantiveram-se constantes até o 15º dia, após este período, o tratamento 4 obteve o maior número de nascimentos, no entanto todos os tratamentos tiveram o mesmo comportamento, bem como o controle.

Tempo (dias)

Tempo (dias)

29

Figura 13: Total de indivíduos nascidos após cada tratamento, separados por sexo. 1 – controle; 2 – machos e fêmeas irradiados; 3 – machos irradiados; 4 – fêmeas irradiadas. A- Tratamento de 90 min. O nascimento de machos no controle foi maior do que os outros tratamentos. B- tratamento de 180 min. O número de fêmeas foi maior nos tratamentos 1 e 4.

30

A razão sexual foi calculada dividindo-se o número de machos pelo número de

fêmeas, sendo encontradas proporções próximas das esperadas de 1:1 indivíduos

de cada sexo quando os indivíduos foram irradiados por 90 min., bem como para

seu respectivo controle. Nos tratamentos de 180 min. de irradiação observamos uma

maior proporção de fêmeas em relação ao número de machos, ou seja,

praticamente duas fêmeas para cada macho, mesmo no controle, sendo estas

diferenças significativas estatisticamente. Na análise de ANOVA utilizando teste

Tukey, as comparações feitas entre todos os resultados dos dois tempos para o total

de indivíduos demostra que a porcentagem de variação entre a quantidade de

machos e fêmeas é estatisticamente diferente para p< 0,001, sendo que a

quantidade de fêmeas nascidas no controle de 180 min. difere estatisticamente de

todos os outros tratamentos. (Tabela 2)

Tabela 2: Total de indivíduos nascidos e razão sexual

31

5. DISCUSSÃO

Em nossos experimentos não foi possível observar alterações morfológicas nos

indivíduos nascidos após a irradiação. Devemos considerar que foram irradiados

indivíduos adultos que possuem uma cutícula que pode impedir que a radiação

alcance as células germinativas, o que seria necessário para que possíveis

alterações morfológicas aparecessem já na primeira geração. A irradiação dos ovos

poderia levar a essas alterações, pois em trabalho realizado por Bownes (1973), ao

qual foram estabelecidas irradiação dos ovos em 245, 265, 285, ou 305 nm de

comprimento de onda, a frequência de defeitos embrionários aumentou com o

aumento das doses de UV, enquanto que as doses mais baixas obtiveram

resultados indiferentes em relação ao controle. A radiação de 285 nm foi mais eficaz

na produção de defeitos embrionários em ovos irradiados durante a multiplicação

nuclear. Os ovos nos experimentos conduzidos por Bownes (1973) foram irradiados

sem córion, pois o mesmo interfere na penetração da radiação.

A correlação entre a irradiação do ovo e dos defeitos embrionários resultantes

também foi encontrado por Hathaway & Selman (1961), onde diferentes áreas do

ovo, nas mesmas fases que os utilizados por Bownes (1973), foram irradiadas e os

resultados foram semelhantes após a irradiação em duas fases, com exceção que

eles encontraram uma sensibilidade maior dos ovos durante a multiplicação nuclear,

após a formação da blastoderme. No entanto, estes resultados foram interpretados

assumindo que (1) os defeitos embrionários não distinguiram no procedimento de

marcação que são produzidos por danos UV aos diferentes tipos de moléculas, (2) a

capacidade do embrião para reparar ou compensar os danos do raio UV a estas

moléculas logo diminui nas fases posteriores, e que (3) a diminuição da capacidade

para a reparação ou a compensação ocorre com diferentes tipos de moléculas.

Conforme citado por BOWNES (1973) a radiação UV induziu padrões aberrantes

no segmento corporal em ovos de mosquitos da família Chironomidae, como

descrito por Yajima(1964), Kalthoff & Sander (1968),e Kalthoff (1971a, 1973b). Em

particular, o abdômen aberrante foi causado por irradiação do pólo anterior do ovo

de Smittia. O embrião, em seguida, desenvolveu um segundo abdômen, em simetria

com o primeiro, no lugar da cabeça normal, tórax e segmentos abdominais

anteriores. Da mesma forma, o mutante bicaudal de Drosophila melanogaster

32

produziu uma anormalidade embrionária que se assemelha ao do abdômen de

Smittia, induzida por radiação UV (Bull,1966).

Como visto por Faruki (2007), a irradiação de diferentes estágios larvais também

induz alterações. Os primeiros estágios larvais se mostraram mais sensíveis à

radiação UV do que os últimos, o que se confirma com as descobertas de Qureshi et

al. que relataram que a sensibilidade larval dependia do estágio em tratamento, ou

seja, larvas em últimos estágios eram menos sensíveis do que as mais jovens. No

ensaio realizado por Faruki, a mortalidade das larvas que foram irradiadas foi

diretamente proporcional à dose de radiação, ou seja, é aumentada gradualmente

com o aumento das doses. Além dessa suscetibilidade das larvas, a radiação UV

inibiu o desenvolvimento de pupas e adultos e produziu deformidades em diferentes

fases de desenvolvimento. Fecundidade e fertilidade dos ovos também foram

notavelmente reduzidas.

Não observamos diferenças estatisticamente significativas entre o número total

de indivíduos nascidos quando comparamos o controle e os tempos de irradiação,

apenas quando comparamos os tempos de irradiação entre si. Deve-se considerar

que os desvios padrão encontrados para as médias foram altos o que sugere que o

tamanho da amostra foi pequeno, portanto é possível que em novos ensaios com

número maior de repetições, diferenças significativas poderão ser encontradas.

O fato de encontramos o dobro de fêmeas quando calculamos a razão sexual

não pode ser explicada apenas pela irradiação, pois mesmo o controle não irradiado

este resultado também foi observado. Deve-se levar em consideração que a razão

sexual trata de números absolutos.

Os dados de TAKINAMI et al (2000) sugerem que comprimentos de onda da luz

solar em torno de 310 e 340 nm causa mutações somáticas pela formação de

dímeros de timidina como principal formador das lesões. Observaram que irradiação

UV-B com pico de luz fluorescente de 310 nm também causa mutação somática em

larvas de drosófila a irradiação a 260 nm foi tóxica, mas não mutagênica.

Considerando-se que utilizamos radiação UV-B cujos comprimentos de onda

variam entre 290-320 nm, poderia se esperar algum tipo de alteração nos padrões

normais reprodutivos. FAKURI et al (2005) investigaram o efeito da radiação em

diferentes tempos de exposição em larva de coleoptera, observaram mortalidade

das larvas, formação da pupa, emergência de adultos e deformidades, crescimento

das larvas adultos e pupas e potencial reprodutivo da progênie. Os estágios iniciais

33

das larvas foram mais susceptíveis com alta mortalidade. Raios UV inibiram

significativamente o desenvolvimento da pupa e adultos, crescimento da larva,

pupas e adultos. Observaram deformidades provocadas pela irradiação em

diferentes estágios de desenvolvimento. A fecundidade e a fertilidade dos ovos

foram reduzidas após a irradiação com lâmpada germicida de 15 W e comprimento

de onda de 245 nm.

Uma das possíveis explicações para os resultados obtidos pode ser o fato de

termos irradiados indivíduos adultos MOSSE et al (1994) citado por WANG et al

(2008) sugere que a melanina na cutícula dos insetos tem um papel indispensável

na proteção contra UV, pois a energia UV pode ser absorvida e convertida em calor

pela melanina, devido possivelmente as ligações C=O em sua estrutura.

WANG et al (2008) investigaram a tolerância a UV entre mutantes de cor do

corpo em D. melanogaster. Para tal utilizaram lâmpada ultravioleta germicida com

comprimento de onda de 253.7 nm e intensidade de 500 μW/cm2.

Investigando esta tolerância em mutantes yellow e ebony e comparando com

moscas selvagens, observaram que as drosófilas selvagens tem tempo médio de

vida e fertilidade mais altas do que os mutantes. Sendo que ebony teve resultados

melhores do que yellow . Os pesquisadores sugerem que além da melanina outros

fatores podem estar associados a está menor sensibilidade, como maiores níveis de

superóxido dismutase (SOD) uma das enzimas do sistema de defesa antioxidante.

Níveis mais altos foram encontrados em drosófilas selvagens quando comparados

aos mutantes yellow e ebony. Desta forma radicais livres formados pela radiação

absorvida pela cutícula das moscas seriam convertidos em peróxido de hidrogênio

pela SOD em seguida os peróxidos convertidos em oxigênio molecular e água pela

catalase. Portanto, está habilidade das moscas selvagens de destoxificar as ROS e

reduzir o dano oxidativo as macromoléculas pode ser uma das explicações de não

termos observado alterações significativas neste trabalho.

Como perspectivas futuras podemos sugerir a realização de novos ensaios com

maior número de repetições, bem como irradiação de larvas em diferentes estágios

e comparar se as mesmas são mais susceptíveis. Além disso, poderiam ser testados

novos tempos de irradiação e ainda observarmos a F2, realizando o cruzamento dos

indivíduos nascidos na F1 e observar se mudanças podem acontecer nas gerações

sucessivas.

34

6. CONCLUSÃO

Os ensaios nas condições experimentais deste trabalho sugerem que:

1. Os tempos de irradiação e o comprimento de onda utilizado não foram

suficientes para induzir alterações morfológicas.

2. Foi possível observar variações na quantidade de fêmeas e machos

nascidos entre os diferentes tempos testados.

3. Drosófilas irradiadas por 180 min. demoraram mais para começar a formar

pupas e, portanto o tempo para o início da eclosão foi posterior ao

observado para as moscas irradiadas por 90 min.

35

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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