universidade estadual do cearÁ faculdade de … · prÓ-reitoria de pÓs-graduaÇÃo e pesquisa...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MARIA LIDUÍNA MAIA DE OLIVEIRA
MODULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE-INFLAMATÓRIA E CICATRICIAL EM
MODELOS EXPERIMENTAIS PROMOVIDA PELO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia
sidoides Cham., RICO EM TIMOL, E PELO ÓLEO FIXO DE Cucurbita pepo L. RICO
EM ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS -6 E -9
FORTALEZA – CEARÁ
2013
MARIA LIDUÍNA MAIA DE OLIVEIRA
MODULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE-INFLAMATÓRIA E CICATRICIAL EM
MODELOS EXPERIMENTAIS PROMOVIDA PELO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia
sidoides Cham., RICO EM TIMOL, E PELO ÓLEO FIXO DE Cucurbita pepo L. RICO EM
ÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS -6 E -9
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em
Ciências Veterinárias do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do título de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Diana Célia Sousa
Nunes Pinheiro.
FORTALEZA – CEARÁ
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecária Responsável –Thelma Marylanda Silva de Melo- CRB-3 / 623
O48m Oliveira, Maria Liduína Maia de
Modulação da resposta imune-inflamatória e cicatricial em modelos
experimentais promovida pelo óleo essencial de Lippia sidoides Cham., rico
em timol, e pelo óleo fixo de Cucurbita pepo L., rico em ácidos graxos
insaturados -6 e -9 / Maria Liduína Maia de Oliveira. -- 2013.
CD-ROM. 142 f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico,
acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de
Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Doutorado em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Prof.ª Dr.ª Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro.
1. Óleos vegetais. 2. Ácidos graxos insaturados. 3. Inflamação. 4.
Cicatrização. 5. Biomarcadores imunológicos. I. Título.
CDD: 574.192
À Deus-Pai Misericordioso;
Aos meus pais,
Francisco Gutemberg de Oliveira e
Hélia Maria Maia de Oliveira.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus, pai supremo e fidedigno, por sua infinita misericórdia e bondade, por ter me dado
forças diante das adversidades, permitindo eu concluir mais esta etapa da minha vida.
A todos os animais, especialmente àqueles utilizados em estudos científicos.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP)
pelo apoio financeiro concedido durante o Doutorado.
À Profa. Dra. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro, pelo seu entusiasmo com a pesquisa
científica, por sua inestimável orientação, colaboração, compreensão, incentivo, ensinamentos
e acima de tudo pela amizade e apoio nos momentos mais difíceis e ao longo de toda minha
vida acadêmica, meus eternos agradecimentos.
À Profa. Dra. Virgínia Cláudia Carneiro Girão pela colaboração junto ao Núcleo de Estudos
em Microscopia e Processamento de Imagens (NEMPI) do Departamento de Morfologia da
UFC, permitindo a realização de etapas fundamentais na execução deste trabalho; e pela
valiosa contribuição na correção dos artigos científicos.
À Profa. Dra. Adriana Rocha Tomé por estar sempre disposta a ajudar e pela importante
colaboração na etapa de finalização deste trabalho.
À Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo pela longa parceria e colaboração junto ao
Laboratório de Bioenergética da UFC.
À Profa. Dra. Érika Freitas Mota e à Profa Dra. Selene Maia de Morais por sempre estarem
disponíveis em ajudar por meio de sugestões, discussões e apoio técnico em seus laboratórios
de pesquisa.
À Neuza Félix Gomes Rochette pela ajuda, presteza e atenção e, sobretudo, pela amizade
compartilhada ao longo do período da pós-graduação.
A todos os colegas do Laboratório de Imunologia e Bioquímica de Animais (LIBA), em
especial à Belise Maria Oliveira Bezerra e Luana Oliveira Leite, pelo convívio harmonioso,
amizade e imensa colaboração na execução deste trabalho.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) da
UECE, pelos conhecimentos e experiências compartilhados, em especial em especial ao Prof.
Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha e ao Prof. Dr. Davide Rondina, que coordenaram o
Programa durante o período do Doutorado.
Aos funcionários do PPGCV e da Faculdade de Veterinária (FAVET), em especial à Adriana
Maria Sales, Joélia Carlota Amorim, Maria Eudócia Albano e Zirlene Nascimento Machado,
por estarem sempre dispostas a ajudar e fornecer palavras amigas durante todos esses anos de
convívio.
Aos meus pais, Francisco Gutemberg de Oliveira e Hélia Maria Maia de Oliveira, que são
meus pilares de sustentação e maiores incentivadores, por todo amor e dedicação, e por
estarem sempre ao meu lado, me apoiando em qualquer situação.
Aos meus irmãos, Arquimedes Maia de Oliveira, pela amizade e companheirismo, e Catarina
Áurea Maia de Oliveira (in memorian), que com certeza intercedeu por mim junto ao Pai nos
momentos de angústia e aflição.
Ao Carlos Alberto Carneiro, por todo amor, carinho, compreensão e atenção dedicados a
mim, sempre me incentivando em meu crescimento profissional.
Às minhas avós, Francisca Barreto de Oliveira e Salete Maria Maia, pelos exemplos de vida e
dedicação, que me dão forças para nunca desistir diante das dificuldades. A vocês, todo meu
amor e gratidão.
À minha amiga Walciany Barbosa Eleutério Andrade, por todos os momentos de
descontração e pelos laços de amizade e fraternidade indescritíveis.
Aos colegas da Agência de Defesa Agropecuária do Estado Ceará (ADAGRI), pela amizade,
apoio e incentivo necessários à conclusão deste trabalho.
Às demais pessoas que não foram aqui mencionadas, mas que contribuíram direta ou
indiretamente em mais uma etapa da minha realização profissional.
RESUMO
Diversas plantas medicinais são fontes de óleos essenciais, constituídos principalmente por
componentes voláteis, e óleos fixos, ricos em ácidos graxos insaturados (AGI). Estes óleos e
seus constituintes são relatados por atuar como importantes agentes moduladores da resposta
imunológica. Lippia sidoides apresenta propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias,
enquanto não foram descritas atividades biológicas sobre a resposta imune-inflamatória para
Cucurbita pepo. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do óleo essencial de L. sidoides
e óleo fixo de C. pepo sobre a inflamação tópica e a cicatrização cutânea em modelos
experimentais in vivo. Os óleos vegetais foram submetidos a análises químicas e utilizados para
elaboração de curvas dose-resposta. Testes de irritação à pele foram conduzidos para verificar a
segurança da aplicação tópica dos óleos vegetais sobre a pele em diferentes condições
fisiológicas. Os efeitos sobre a inflamação tópica foram avaliados em modelos de inflamação
aguda e crônica induzida por diferentes agentes flogísticos em camundongos, através de
análises morfométricas e histológicas, utilizando dexametasona e indometacina como drogas de
referência. Para avaliar os efeitos sobre a cicatrização, utilizou-se o modelo de feridas por
excisão cutânea em ratos e camundongos, as quais foram avaliadas através de análises
morfométricas, histológicas e imunohistoquímicas. O óleo essencial de L. sidoides, rico em
timol (71,0%), apresentou efeito irritativo sobre a pele, promovendo uma resposta inflamatória
cutânea. Entretanto, quando usado em concentrações adequadas, esse efeito pró-inflamatório
favoreceu o processo de cicatrização de feridas. Por outro lado, o óleo fixo de C. pepo foi capaz
de inibir a inflamação tópica induzida por xileno (69,6%), TPA (78,7%) e oxazolona (60,8%)
de maneira dose-dependente (p<0,05), e essa inibição foi similar a, no mínimo, uma droga de
referência (p>0,05). Esse óleo diminuiu os parâmetros inflamatórios, como o número de
mastócitos (p<0,05) no tecido inflamado. Além disso, o óleo fixo de C. pepo reduziu a
expressão da ciclooxigenase-2 (COX-2) e aumentou relativamente a expressão do fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) durante a cicatrização de feridas cutâneas. Esses efeitos
podem estar associados a proporção promissora de AGI presentes nesse óleo, especialmente -
6 (55,8%) e -9 (23,5%). Em conjunto, esses resultados permitem indicar o uso do óleo
essencial de L. sidoides e do óleo fixo de C. pepo como agentes terapêuticos alternativos para
tratamento tópico de lesões cutâneas em diferentes condições fisio-patológicas.
Palavras-chave: Óleos vegetais; Ácidos graxos insaturados; Inflamação; Cicatrização;
Biomarcadores imunológicos.
ABSTRACT
Several medicinal plants are sources of essential oils, which are constituted mainly of volatile
components; and fixed oils, which are rich in unsaturated fatty acids (UFAs). These oils and
their constituents are reported to act as important agents that modulate the immune-
inflammatory response. Lippia sidoides presented antimicrobial and anti-inflammatory
activities, while biological activities on the immune-inflammatory response were not
described for Cucurbita pepo. The aim of this study was to evaluate the effects of the essential
oil of L. sidoides and fixed oil of C. pepo on topical inflammation and skin wound healing in
experimental models in vivo. Vegetable oils were submitted to chemical analysis and used for
the preparation of dose-response curves. Skin irritation tests were conducted to verify the
topical safe use of vegetable oils on skin in different physiological conditions. The effects on
topical inflammation were assessed by morphometric and histological analyses in acute and
chronic inflammation models induced by different phlogistic agents in mice. Dexamethasone
and indomethacin were used as reference drugs. To evaluate the effects on wound healing, we
used the excision wound model in rats and mice skin, which were evaluated by morphometric,
histological and immunohistochemical analyses. The essential oil of L. sidoides, rich in
thymol (71.0%), presented an irritant response to skin by the mounting of local inflammatory
response. However, when this oil was used in adequate concentrations, the pro-inflammatory
effect was favorable to the wound healing. On the other hand, C. pepo fixed oil was able to
inhibit topical inflammation induced by xylene (69.6%) TPA (78.7%) and oxazolone (60.8%)
in a dose- dependent manner (p<0.05), and this inhibition was similar to, at least, one
reference drug (p>0.05). This oil reduced the inflammatory parameters of inflamed tissue, as
well as reduced the number of mastocytes in the inflammatory infiltration (p<0.05). In
addition, C. pepo fixed oil reduced the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and
relatively increased the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) during
cutaneous wound healing. These effects may be associated to promising proportion of UFAs
present in this oil, especially -6 (55.8%) and -9 (23.5%). Taken together, these results
indicated the use of essential oil of L. sidoides and fixed oil of C. pepo as alternative
therapeutic agents for the topical treatment of cutaneous lesions in different physiological and
pathological conditions.
Keywords: Vegetable oils; Unsaturated fatty acids; Inflammation; Wound healing;
Immunological biomarkers.
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1. Principais tipos celulares e mediadores envolvidos na cicatrização.................... 22
ARTIGO I
Table 1. Percentage composition of EOLS obtained by gas chromatography/mass
spectrometry.........................................................................................................
57
Table 2. Effects of essential oil of L. sidoides (EOLS) on wound contraction by
excision wound model.........................................................................................
58
ARTIGO II
Table 1. Fatty acids composition of PSO obtained by gas chromatography/mass
spectrometry.........................................................................................................
76
Table 2. Topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference
drugs in acute and chronic models of inflammation at the end of the
experimental period.............................................................................................
77
Table 3. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drug on absolute
number of mastocytes in acute and chronic models of inflammation.................
78
ARTIGO III
Table 1. Fatty acids composition of pumpkin seed oil (PSO) and reference oil obtained
by gas chromatography/mass spectrometry.........................................................
98
Table 2. Effect of pumpkin seed oil (PSO) on wound healing by excision wound model 99
Table 3. Histological evaluation of wound healing process in different groups of
treatment per biopsy day......................................................................................
100
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1. Estrutura molecular dos principais ácidos graxos encontrados em óleos
vegetais...........................................................................................................
32
Figura 2. Lippia sidoides Cham.............................................................................. 39
Figura 3. Curcubita pepo L. Aspecto geral da planta com ramas e do fruto.................... 40
ARTIGO I
Fig. 1. Effect of topical treatment with essential oil of L. sidoides (EOLS) at different
concentrations in skin irritation models: (A) one-dosage irritation to healthy
skin; (B) multiple-dosage irritation to healthy skin; (C) irritation to damaged
skin.........................................................................................................................
59
Fig. 2. Evaluation scores on the skin irritation response of Swiss mice to the
application of essential oil of L. sidoides (EOLS) at different concentrations in
three models: (I) one-dosage irritation to healthy skin; (II) multiple-dosage
irritation to healthy skin; (III) irritation to damaged skin. (A) edema and (B)
erythema scores were obtained on day 3 time course............................................
60
Fig. 3. Skin sections in the group treated with EOLS 100% (A, B and C) and EOLS
50% (D) on day 7 in different skin irritation models: (A) one-dosage irritation
to healthy skin; (B) multiple-dosage irritation to healthy skin; (C) and (D)
irritation to damaged skin. (a) epidermal discontinuity; (b) inflammatory cells
infiltration; (c) ulcer; (d) fibroblast proliferation; (e) epidermal thickening with
keratinocytes proliferation. Haematoxylin and eosin staining. Original
magnification: 200x. Scale bar: 100 μm................................................................
51
Fig. 4. Wound severity scores for lesions treated with essential oil of L. sidoides
(EOLS) ointments in excision wound model. (A) edema and (B) exudation
scores were assessed on days 1-3 and days 1-5, respectively................................
62
ARTIGO II
Figure 1. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and
dexamethasone (Dexa) on xylene (Xyl)-induced ear edema in mice. Ear
edema was measured at 1 h after induction of inflammation in both ear
thickness (A) and tissue weight (B). The positive control only received
acetone topically after the challenge with xylene.............................................
79
Figure 2. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and
dexamethasone (Dexa) on TPA-induced ear edema in mice. Ear edema was
measured at 4 h after induction of inflammation in both ear thickness (A)
and tissue weight (B). The positive control only received acetone topically
after the challenge with TPA.............................................................................
80
Figure 3. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone (Dexa) on
oxazolone (Oxa)-induced chronic dermatitis in mice. The responsiveness of
treatments was measured in ear thickness (A) at 24, 48, 72, 96 and 102 h
after challenge and just before drug application as well as in tissue weight
(B) at 102 h post-challenge. The positive control only received acetone
topically after the challenge with oxazolone.............................................
81
Figure 4. Histological analysis of topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil
(PSO) and dexamethasone on acute ear edema induced by xylene (A, B, C)
and TPA (D, E, F) and chronic dermatitis induced by oxazolone multiple
applications (G, H, I). Photomicrograph of transverse sections from ears
collected in the last day of experiments. Generally, inflamed ears (A, D, G)
showed dermal edema, congestion, inflammatory cell infiltration with the
presence of mononuclear and polymorphonuclear cells. Treatment with in
nature PSO (B, E, H) or dexamethasone (C, F, I) reduced these
inflammatory parameters. A minimum of two section from five animals for
each treatment were analyzed. HE staining. Original magnification: 100x.
Scale bar: 200 μm..............................................................................................
82
Figure 5. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone on mastocytes
infiltration in acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E,
F) and chronic dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H,
I). Photomicrograph of transverse sections from ears collected in the last day
of experiments. In chronic model, the treatment with in nature PSO (B, E,
H) and dexamethasone (C, F, I) reduced the number of mastocytes in
inflammatory cell infiltration when compared to respective positive control
(A, D, G). A minimum of two section from five animals for each treatment
were analyzed. Toluidine-blue staining. Original magnification: 100x. Scale
bar: 200 μm.......................................................................................................
83
ARTIGO III
Figure 1. Macroscopic wound closure on days 0, 3, 7 and 10 post-surgery. The in
natura PSO treated group shown an enhanced wound closure when
compared to other treatment groups, except to reference group on day 7........
101
Figure 2. Histological progression of the wound healing in PSO (in nature) treated
group, reference and saline 0.9% control groups (top to bottom, respectively)
on days 3 (left column) and 7 (right column). On day 3, a single cells layer
in re-epithelized epidermis could be observed in group treated with in natura
PSO, while ulcer areas could still be verified in the other groups. Wound
healing was characterized by a complete re-epithelization and higher
proliferation of fibroblasts and neovascularization in PSO (in nature) treated
group on day 7. Haematoxylin and eosin staining. Original magnification:
100x. Scale bar: 200 μm....................................................................................
102
Figure 3. Immunohistochemical staining for COX-2 and VEGF on days 3 and 7,
respectively. In natura PSO treated lesions decreased COX-2 expression on
day 3 and increased relatively VEGF expression as compared to saline 0.9%
control group on day 7. Similar results was found in reference group.
Sections were scored as +, slight positive staining, up to 15% positive cells;
++, moderate positive staining, from 15% to 30% positive cells; +++, strong
positive staining with more than 30% positive cells. Original magnification:
400x. Scale bar: 50 μm......................................................................................
103
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA Ácido araquidônico
AGI Ácidos graxos insaturados
AG Ácidos graxos
ALA Ácido α-linolênico
ANOVA Análise de variância
AOCS American Oil Chemists’ Society
ºC Graus Celsius
CD Grupamento de diferenciação (cluster of differentiation)
CEUA Comitê de Ética para Uso de Animais
COX Ciclooxigenases
COX-1 Ciclooxigenase-1
COX-2 Ciclooxigenase-2
DAB Diaminobenzidine
Dexa Dexamethasone
DHA Ácido docosahexaenóico
EGF Fator de crescimento epidérmico
Ed Edema
EOLS Essential oil of Lippia sidoides
EPA Ácido eicosapentaenóico
FP Fibroblast proliferation
eV Elétron-volt
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
FUNCAP Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
h/min Hora/Minuto
He/HE Gás hélio/Hematoxilin-eosin
HGF Fator de crescimento dos hepatócitos
HLE Human leukocyte elastase
HRP Horseradish peroxidase
ICAM Molécula de adesão intercelular
IFN-γ Interferon gama
IL-1 Interleucina-1
IL-2 Interleucina-2
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
Indo Indomethacin
Ka/Wa Known area/ Wound area
Kg/g/mg/ µg Quilograma/Grama/Miligrama/Micrograma
L/mL/µL Litro/Mililitro/Microlitro
LA Ácido linoléico
LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais
LIBA Laboratório de Imunologia e Bioquímica de Animais
LOX Lipoxigenase
LT Leucotrienos
LTB4 Leucotrieno B4
LTC4 Leucotrieno C4
LTD4 Leucotrieno D4
LTE4 Leucotrieno E4
m/cm/mm Metro/Centímetro/Milímetro
Mac-1 Receptor para integrinas CD11a/CD18 e CD11bCD18
MCP Proteína quimioatraente de macrófagos
MEC Matriz extracelular
MIP Proteína inflamatória para macrófagos
MNC Mononuclear cells
MMP Metaloproteinases da matriz
Nk Number of pixels inside know area
Nw Number of pixels inside wound area
NF-κB Fator de transcrição nuclear kappa-B
NO Óxido nítrico
NV Neovascularization
NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs
OA Ácido oléico
Oxa Oxazolone
PADETEC Parque de Desenvolvimento Tecnológico
PAF Fator de agregação plaquetária
PBS Phosphate-buffered saline
PDGF Fator de crescimento derivado das plaquetas
PG Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandina E2
PGE3 Prostaglandina E3
PGF2 Prostaglandina F2
PGI2 Prostaglandina I2
pH Potencial hidrogeniônico
PK Proteína quinase
PMN Polymorphonuclear cells
PPAR Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
PSO Pumpkin seed oil
PT Pre-treatment
RANTES Ligante de quimiocina tipo 5
RE Re-epithelialization
ROS Espécies reativas de oxigênio
SD Standard deviation
SNK Student-Newman-Keuls
TB Toluidine blue
TIMP Inibidores teciduais das metaloproteinases
TGF Fator de crescimento transformante
Th Célula T auxiliar (T helper)
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TPA 13-acetato de 12-O-tetradecanoil-forbol
TX Tromboxanos
TXA2 Tromboxano A2
UECE Universidade Estadual do Ceará
UFA Unsaturated fatty acids
UFC Universidade Federal do Ceará
VCAM Molécula de adesão à célula vascular
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VR1 Receptor vanilóide tipo 1
Xyl Xylene
-3 Ômega-3
-6 Ômega-6
-9 Ômega-9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 18
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 20
2.1 Resposta inflamatória............................................................................................ 20
2.2 Resposta cicatricial................................................................................................. 21
2.2.1 Fase inflamatória.................................................................................................... 22
2.2.2 Fase proliferativa.................................................................................................... 23
2.2.2 Fase de remodelagem............................................................................................. 25
2.3 Óleos de origem vegetal......................................................................................... 26
2.3.1 Óleos essenciais........................................................................................................ 26
2.3.2 Óleos fixos............................................................................................................... 27
2.4 Óleos de origem vegetal e suas atividades em processos inflamatórios e
cicatriciais...............................................................................................................
28
2.4.1 Óleos essenciais........................................................................................................ 29
2.4.2 Óleos fixos................................................................................................................ 31
2.4.2.1 Ácidos graxos........................................................................................................... 32
2.4.2.2 Influência dos AGI na resposta inflamatória........................................................... 33
2.4.2.3 Influência dos AGI na resposta cicatricial............................................................... 36
2.5 Plantas medicinais fornecedoras de óleos vegetais objetos do estudo............... 39
2.5.1 Lippia sidoides Cham.............................................................................................. 39
2.5.2 Curcubita pepo L..................................................................................................... 40
3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 42
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA..................................................................................... 43
5 OBJETIVOS.......................................................................................................... 44
5.1 Geral....................................................................................................................... 44
5.2 Específicos.............................................................................................................. 44
6 ARTIGO I – O USO TÓPICO CONTÍNUO DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Lippia sidoides Cham. INDUZ RESPOSTA INFLAMATÓRIA CUTÂNEA,
MAS NÃO RETARDA O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO.....................
45
7 ARTIGO II – POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO TÓPICO DO ÓLEO
DE SEMENTE DE ABÓBORA (Cucurbita pepo L.) SOBRE A
INFLAMAÇÃO CUTÂNEA AGUDA E CRÔNICA EM CAMUNDONGOS.
63
8 ARTIGO III – ÓLEO DE SEMENTE DE ABÓBORA REDUZ A
EXPRESSÃO DE CICLOOXIGENASE-2 (COX-2) E MELHORA A
EXPRESSÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL
VASCULAR (VEGF) NA CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA.................................
84
9 CONCLUSÕES.................................................................................................... 104
10 PERSPECTIVAS............................................................................................... 105
REFERÊNCIAS..................................................................................................... 106
APÊNDICES..................................................................................................... 121
Apêndice A – Artigo publicado na Acta Veterinaria Brasilica, v. 7, n. 2,
2013..........................................................................................................................
122
Apêndice B – Artigo publicado na Acta Scientiae Veterinariae, v. 41, n.
1168, 2013................................................................................................................
134
18
1 INTRODUÇÃO
A inflamação é uma resposta inata desencadeada por estímulos e condições nocivas,
tais como infecções e lesões nos tecidos (MEDZHITOV, 2008). A cicatrização, por sua vez,
compreende uma série de mecanismos complexos ativados após injúria tecidual, que inclui a
resposta inflamatória e visa manter a homeostase tecidual (VELNAR et al., 2009). Estes
processos envolvem a interação entre muitos tipos celulares e mediadores solúveis bioativos, os
quais tem um importante papel na defesa do hospedeiro. Os mediadores químicos podem incluir
moléculas de natureza lipídica, peptídica, aminas vasoativas, enzimas, moléculas de adesão,
espécies reativas de oxigênio, dentre outras, dependendo da população celular envolvida e da
natureza do agente injuriante. Em geral, a reposta inflamatória, quando controlada, é benéfica e
culmina com a eliminação do agente agressor e reparo do dano tecidual. Entretanto, se essa
reação for desregulada pode haver dano aos tecidos do hospedeiro, levando ao desenvolvimento
de doenças inflamatórias (CALDER, 2013).
Na busca por novas substâncias com potencial anti-inflamatório e cicatrizante, as
plantas medicinais têm sido utilizadas como fontes de matérias-primas para aliviar, prevenir,
curar ou alterar estes processos fisiológicos e patológicos tanto no homem quanto nos animais
(RATES, 2001). Dentre essas plantas, algumas são fontes de óleos vegetais, os quais podem
ser classificados como óleos essenciais constituídos por componentes voláteis de baixo peso
molecular (MATOS, 2007), e óleos fixos, ricos em ácidos graxos, constituintes de alto peso
molecular (REDA; CARNEIRO, 2007).
Com o avanço da ciência, óleos vegetais têm sido cada vez mais utilizados como
recursos promissores no desenvolvimento de formulações cosméticas, e na farmacologia
como agentes terapêuticos alternativos para o tratamento de processos inflamatórios
associados ou não a cicatrização de feridas. Óleos essenciais e seus constituintes, quando
utilizados em concentrações apropriadas, apresentam propriedades anti-inflamatórias e
cicatrizantes comprovadas (MONTEIRO et al., 2007; RIELLA et al., 2012; VERAS et al.,
2013). Entretanto, o uso inadequado desses óleos pode ser irritante aos tecidos do hospedeiro
e interferir com o processo de cicatrização (KERR, 2002; VIGAN, 2010). Em contrapartida,
AGI presentes em óleos vegetais são relatados como importantes agentes moduladores das
respostas imune-inflamatórias (PEREIRA et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2010; CARDOSO
et al., 2011) com indicação terapêutica no reparo de feridas cutâneas (DECLAIR, 1997;
PIEPER; CALIRI, 2003; FERREIRA et al., 2012). Entretanto, diversos óleos vegetais ricos
19
em AGI ainda necessitam de investigação científica para validação destas propriedades
farmacológicas.
Tendo em vista o uso popular associado ao importante papel que os óleos vegetais
e seus constituintes exercem sobre o sistema imune, torna-se cada vez mais necessário o
entendimento dos eventos celulares e moleculares envolvidos nas respostas inflamatória e
cicatricial moduladas por esses produtos naturais. Neste cenário, o óleo essencial de Lippia
sidoides (alecrim-pimenta) e o óleo fixo de Cucurbita pepo (abóbora) destacam-se como
objetos de estudo.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Resposta inflamatória
A inflamação consiste de um mecanismo de defesa inato, sendo definida como
uma resposta biológica complexa dos tecidos vascularizados a diferentes estímulos, que auxilia
na eliminação de agentes estranhos e dá início ao processo de reparo tecidual (SHERWOOD;
TOLIVER-KINSKY, 2004; GRIVENNIKOV et al., 2010). Os tecidos podem responder a
estímulos nocivos, tais como patógenos, células lesionadas e injúrias químicas, térmicas ou
mecânicas, através da interação com receptores que desencadeiam a produção de diferentes
mediadores bioativos, os quais amplificam os eventos celulares e moleculares envolvidos no
processo inflamatório (SETHI et al., 2012; CALDER, 2013). A resposta inflamatória quando
controlada é benéfica, pois auxilia na eliminação do agente agressor, protegendo contra
infecções, mas pode tornar-se prejudicial se desregulada, levando ao desenvolvimento de
doenças. Assim, o estado patológico inflamatório é assumido como uma contrapartida
fisiológica (MEDZHITOV, 2008).
Fisiologicamente, a inflamação caracteriza-se por eventos vasculares e celulares, e
pode ser classificada em aguda ou crônica, dependendo da persistência da lesão e severidade
dos sinais clínicos (MEDZHITOV, 2008). A reação inflamatória aguda é caracterizada pela
curta duração, aumento da permeabilidade vascular, exsudação de fluidos e proteínas
plasmáticas e migração de leucócitos, principalmente neutrófilos (BAUHMANN; GAUDIE,
1994; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Em geral, essa reação é autolimitante e sofre
resolução, envolvendo remoção de células mortas, depuração das células de resposta aguda e
regeneração da matriz extracelular. A resposta inflamatória crônica depende ou não da
resolução do processo de fase aguda e, geralmente, possui longa duração. Caracteriza-se pela
persistência de macrófagos e linfócitos, além de angiogênese, proliferação de tecido
conjuntivo e dano tissular frequentemente resultando em reparo excessivo (GRIVENNIKOV
et al., 2010; WIDGEROW, 2011; FREIRE; VAN-DYKE, 2013).
Os eventos vasculares da resposta inflamatória ocorrem na microcirculação
(BAUHMANN; GAUDIE, 1994). As alterações vasculares consistem em vasoconstrição
arteriolar inicial, seguida por vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular,
principalmente venular, as quais são induzidas por diversos mediadores, tais como histamina,
serotonina, bradicinina e prostaglandinas (PG) (MEDZHITOV, 2008; FREIRE; VAN-DYKE,
21
2013). Com o aumento do fluxo sanguíneo local, são observados os sinais clínicos calor e
eritema. Paralelamente, ocorre a saída de íons e moléculas, como água e proteínas para o meio
extravascular, resultando no aumento da pressão hidrostática local e formação de edema. O
exsudato contém uma variedade de substâncias e mediadores, o qual é drenado pelos vasos
linfáticos até os linfonodos regionais, onde os produtos dos micro-organismos invasores
podem iniciar uma resposta imune (BAUHMANN; GAUDIE, 1994; SHERWOOD;
TOLIVER-KINSKY, 2004; ROCK et al., 2010).
Os eventos celulares, por sua vez, caracterizam-se pelo acúmulo de leucócitos,
particularmente polimorfo e mononucleares, nos tecidos afetados (ROCK et al., 2010). Essas
células são recrutadas do sangue para os locais de infecção por intermédio de citocinas e
quimiocinas, as quais favorecem a ligação destas células ao endotélio mediada por moléculas
de adesão, favorecendo a migração transendotelial e seu deslocamento até o local da infecção
(FUHLBRIGGE; WEISHAUPT, 2007; SCHMIDT et al., 2013). Os neutrófilos e macrófagos
fagocitam agentes nocivos, destroem bactérias e outros patógenos, degradam o tecido
necrótico, antígenos estranhos e células apoptóticas, levando à liberação de enzimas,
mediadores químicos e espécies reativas de oxigênio (ROS), que contribuem para o dano
tecidual e, posteriormente, para o retorno à homeostase através do processo de cicatrização
(MURRAY; WYNN, 2010; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
2.2 Resposta cicatricial
A cicatrização cutânea é um processo complexo, que envolve uma série de
eventos celulares e moleculares desencadeados a partir de uma lesão na pele. Esses eventos
são inter-relacionados entre si e englobam diferentes tipos celulares, proteínas da matriz
extracelular, fatores de crescimento, citocinas e outros mediadores, que regulam e modulam a
resposta reparativa para restabelecer a homeostase do tecido lesionado (VELNAR et al.,
2009; GANTWERKER; HOM, 2012). Os principais tipos celulares e mediadores envolvidos
no processo cicatricial estão indicados na Tabela 1. Classicamente, este processo pode ser
dividido em três fases que se sobrepõem de forma contínua e temporal: inflamatória,
proliferativa e de remodelagem (TELLER; WHITE, 2011).
22
Tabela 1. Principais tipos celulares e mediadores envolvidos na cicatrização
Tipos celulares
presentes no ferimento
Principais mediadores
liberados
Principais efeitos
desencadeados
Plaquetas
TGF-β, PDGF (PDGF-AA, PDGF-AB,
PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD), PAF,
fibrinogênio, fibronectina, tromboplastina
Formação de trombo plaquetário
que tampona a lesão e
recrutamento de
neutrófilos/monócitos
Neutrófilos IL-6, IL-8, IL-1, TNF-α, TGF-β, HGF,
MIP, HLE
Recrutamento de
monócitos/macrófagos
Monócitos/
Macrófagos
TGF-α, TGF-β, VEGF-A, IL-6, IL-8, IL-1,
TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MCP-
1, HB-EGF, HGF, MIP
Quimiotaxia de monócitos e
fibroblastos, proliferação de
fibroblastos, angiogênese e
síntese de colágeno
Células residentes
(a) Fibroblastos
(b) Queratinócitos
(c) Células endoteliais
(a) FGF1, FGF2, FGF4, FGF7, FGF-10,
IP-10, IL-8, eotaxina, TGF-β (b) MCP-1,
FGF1, FGF2, TGF-β, MIP-2; (c) MCP-1
Maturação e remodelamento da
matriz extracelular e
angiogênese
Fontes: Werner e Grose (2003), Hatanaka e Curi (2007) e Behm et al. (2012).
2.2.1 Fase inflamatória
Na fase inflamatória, predominam eventos relacionados com a hemostasia e a
inflamação (BAUM; ARPEY, 2005). A hemostasia se caracteriza pela vasoconstrição,
agregação plaquetária e ativação dos sistemas de coagulação sanguínea. Estes eventos geram
um tampão, rico em fibrina, que forma uma barreira contra a invasão de micro-organismos e
organiza uma matriz provisória necessária para a migração celular. As plaquetas, além de sua
função hemostática, são importantes por atuarem como moduladoras do reparo tecidual, sendo
as primeiras células a produzirem e liberarem citocinas e fatores de crescimento, que
estimulam a proliferação celular e a produção de proteínas específicas que irão atuar durante
as fases seguintes do processo cicatricial (EMING et al., 2007; VELNAR et al., 2009). Dentre
esses mediadores, o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) apresenta
propriedades quimiotáticas sobre neutrófilos, macrófagos e fibroblastos, assim como as
moléculas da superfamília do fator de crescimento transformante- β (TGF-β) (WERNER;
GROSE, 2003; BEHM et al., 2012).
Durante a ruptura da barreira epidérmica, ocorre ativação de fatores de transcrição
nas células sentinelas, como o fator de transcrição nuclear kappa-B (NF-κB), o qual está
envolvido na ativação de genes específicos (SIGAL, 2006). Isso resulta no aumento da
produção de citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose tumoral-α (TNF-α),
interleucina-1 (IL-1), as quais exercem papéis importantes na ativação de células endoteliais e
23
aumento da expressão de moléculas de adesão, favorecendo à migração do neutrófilo
(BARRIENTOS et al., 2008; BEHM et al., 2012).
Após atingirem o sítio lesionado, os neutrófilos predominam na região entre o
primeiro e segundo dia (HATANAKA; CURI, 2007). Os macrófagos, por sua vez, são as
próximas células a chegarem na área da lesão, por volta do segundo ao quinto dia, e ao
contrário do papel desempenhado pelos neutrófilos, são considerados os elementos mais
críticos na indução do processo de reparo (PARK; BARBUL, 2004). Além de auxiliar os
neutrófilos na eliminação de micro-organismos pela fagocitose, essas células atuam na
limpeza da ferida, degradando e eliminando componentes do tecido conjuntivo necrosado, e
modulando a cicatrização através da secreção de proteases, citocinas, fatores de crescimento e
substâncias vasoativas. Estes mediadores são fundamentais para a formação do tecido de
granulação na fase subsequente do processo cicatricial (MURRAY; WYNN, 2010; NOVAK;
KOH, 2013). Por outro lado, embora a participação dos linfócitos também tenha sido
demonstrada, os mecanismos através dos quais estas células contribuem para a cicatrização
tecidual ainda necessitam de maiores esclarecimentos (OLIVEIRA; POPI et al., 2010). A fase
inflamatória tem duração de 48 a 72 horas (HATANAKA; CURI, 2007).
2.2.2 Fase proliferativa
A fase proliferativa caracteriza-se pelos processos de angiogênese, formação do
tecido de granulação, deposição de matriz extracelular (MEC) e re-epitelização (SCHREML
et al., 2010). Nesta fase, a sinalização celular é feita por um número maior de mediadores, que
envolvem ativação, migração e proliferação celular, principalmente de fibroblastos e
queratinócitos (PARK; BARBUL, 2004).
Inicialmente, a migração e ativação de fibroblastos são intensificadas em
decorrência da liberação de mediadores produzidos principalmente por macrófagos,
destacando-se os fatores de crescimento como PDGF, TGF-β e fator de crescimento endotelial
vascular-VEGF (WERNER; GROSE, 2003; BARRIENTOS et al., 2008). Os fibroblastos são
os principais componentes celulares do tecido de granulação, os quais são ativados por fatores
de crescimento derivados dos macrófagos, migrando das bordas para o centro da ferida. Isto
ocorre através da matriz provisória formada e de um gradiente químico de substâncias
quimioatraentes (VELNAR et al., 2009; TELLER; WHITE, 2011). Os fibroblastos ativados
iniciam a produção de colágeno no local e a nova matriz extracelular começa a ser substituída
24
por um tecido conjuntivo mais denso e elástico, embora desorganizado. Esse processo
denominado de fibroplasia é dependente da formação paralela de novos vasos sanguíneos na
região (GREAVES et al., 2013).
A angiogênese ocorre pela ação direta de fatores de crescimento sobre as células
endoteliais e, em parte, pela baixa tensão de oxigênio no centro da ferida, elevados níveis de
ácido láctico e aminas vasoativas. Esse evento é essencial porque permite a troca de gases e a
nutrição de células metabolicamente ativas no tecido neoformado (BROWN et al., 2002;
VELNAR et al., 2009; GREAVES et al., 2013). Dentre os fatores de crescimento, VEGF é
descrito como principal regulador da angiogênese durante o desenvolvimento do tecido
cicatricial (HOWDIESHELL et al., 2001; BAO et al., 2009).
Com a fibroplasia e a angiogênese, inicia-se a formação do tecido de granulação
por volta do quarto dia. Esse tecido é constituído por macrófagos, fibroblastos, células
inflamatórias e componentes neovasculares, os quais são sustentados por uma matriz frouxa
de fibronectina, ácido hialurônico, glicosaminoglicanos e colágenos. O tecido neoformado é
edematoso e caracteriza-se pela presença de muitos espaços vazios, devido à imaturidade dos
vasos, os quais são exsudativos e sangram com facilidade (BAUM; ARPEY, 2005;
HATANAKA; CURI, 2007; KLINGBERG et al., 2013). Durante a maturação fenotípico dos
fibroblastos em células produtoras de colágeno, o processo de contração da ferida alcança sua
eficiência máxima. Isto ocorre devido à diferenciação de alguns fibroblastos das margens das
feridas para miofibroblastos, células contráteis especializadas, as quais promovem o
fechamento da ferida (KLINGBERG et al., 2013; VELNAR et al., 2009).
Em resposta aos diversos estímulos recebidos, os queratinócitos hiperproliferam e
migram a partir das bordas da ferida, produzindo e secretando componentes da MEC e
polipeptídeos sinalizadores, ao mesmo tempo em que seu citoesqueleto é alterado para a
produção de queratina (FREEDBERG et al., 2001; SANTORO; GAUDINO, 2005;
SCHREML et al., 2010). A re-epitelização inicia-se imediatamente após a lesão, porém nas
etapas iniciais esse processo é ineficiente devido à inexistência de substrato adequado na área
da ferida, o qual somente é fornecido quando o tecido de granulação alcança o nível da
epiderme. Além disso, a superfície úmida e oxigenada da ferida também acelera o processo de
migração dos queratinócitos (BALBINO et al., 2005; VELNAR et al., 2009).
Ao final desta etapa, o leito da ferida está totalmente preenchido pelo tecido de
granulação, a circulação é restabelecida pela neovascularização e a rede linfática passa por
regeneração. Lentamente, o tecido de granulação é enriquecido com mais fibras colágenas,
25
que começam a ser reorganizadas, dando à região lesada a aparência de cicatriz devido ao
acúmulo de massa fibrosa. A fase proliferativa tem duração de 12 a 14 dias (HATANAKA;
CURI, 2007; GANTWERKER; HOM, 2012).
2.2.2 Fase de remodelagem
A fase de remodelagem é marcada por maturação dos elementos e alterações na
matriz extracelular, ocorrendo aumento na deposição e reorganização do colágeno e aumento
da força de tensão da cicatriz (VELNAR et al., 2009). A resistência do tecido cicatricial é
dada pela quantidade de colágeno depositada e pela forma com que as fibras estão
organizadas. Esse remodelamento envolve etapas sucessivas de produção, digestão e
orientação das fibrilas de colágeno até o restabelecimento basal do tecido (BALBINO et al.,
2005; TELLER; WHITE, 2011).
A degradação do colágeno e de outras proteínas da MEC é efetuada por uma
família de metaloproteinases da matriz (MMP) que dependem de íons zinco para sua
atividade (GILL; PARKS, 2008). MMP consiste em colagenases intersticiais, gelatinases e
metaloproteinases da matriz ligadas à membrana. Essas enzimas são produzidas por vários
tipos celulares, como macrófagos, neutrófilos, fibroblastos e queratinócitos, e sua secreção é
induzida por determinados estímulos, incluindo fatores de crescimento, como PDGF e fator
de crescimento fibroblástico (FGF), e citocinas, como IL-1 e TNF-α. Por outro lado, a
produção de MMP é inibida pelo TGF-β (GILL; PARKS, 2008; TELLER; WHITE, 2011;
KHOKHA et al., 2013). Uma vez expressas e ativadas, MMP induz a liberação de fatores de
crescimento ligados à MEC, permitindo um estímulo constante à proliferação e migração
dos queratinócitos, acelerando o processo de re-epitelização (BAUM; ARPEY, 2005; GILL;
PARKS, 2008; SCHREML et al., 2010). Por outro lado, MMP ativadas são rapidamente
inibidas por uma família de inibidores teciduais específicos das metaloproteinases (TIMP)
que são produzidos pela maioria das células mesenquimatosas, impedindo, assim, a ação
descontrolada dessas proteinases (GILL; PARKS, 2008; KHOKHA et al., 2013).
Ao final desta etapa, os anexos da pele, como folículos pilosos e glândulas sofrem
regeneração limitada e a coloração da cicatriz permanece pálida, pois a regeneração dos
melanócitos é deficiente e as cicatrizes são hipovascularizadas devido ao desaparecimento dos
neocapilares. Esta fase ocorre lentamente, podendo durar de meses a anos e, mesmo assim,
uma cicatriz cutânea completamente madura possui apenas 70% da resistência da pele normal
(BALBINO et al., 2005; HATANAKA; CURI, 2007; VELNAR et al., 2009).
26
2.3 Óleos de origem vegetal
O uso de produtos naturais como matéria-prima para a síntese de compostos
químicos com atividade biológica tem sido amplamente relatado ao longo dos anos. A grande
biodiversidade vegetal presente no Brasil é considerada uma fonte potencial de substâncias
biologicamente ativas. Assim, sua preservação e estudo são fundamentais para descoberta de
novas substâncias com ação farmacológica (ALBUQUERQUE et al., 2007).
A maioria dos fármacos em uso clínico ou são de origem natural ou foram
desenvolvidos por síntese química planejada a partir de produtos naturais (BARREIRO;
BOLZANI, 2009). Nas plantas medicinais, podem ser encontradas várias substâncias
importantes com diferentes aplicações farmacológicas, sintetizadas a partir do metabolismo
celular vegetal (RATES, 2001). Dentre esses produtos naturais, destacam-se dois tipos de
óleos vegetais: óleos essenciais constituídos por componentes voláteis de baixo peso
molecular (MATOS, 2007) e óleos fixos, ricos em ácidos graxos, constituintes de alto peso
molecular (REDA; CARNEIRO, 2007).
2.3.1 Óleos essenciais
Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas,
geralmente odoríferas e líquidas e, na maioria das vezes, extraídos de plantas aromáticas
como metabólitos secundários por meio de destilação por arraste com vapor d’água ou hidro-
destilação (BAKALLI et al., 2008). Eles podem ser obtidos a partir de todas as partes da
planta, incluindo folhas, flores, frutos, raízes etc. (SIMÕES et al., 2010). Entretanto, o
produto extraído pode sofrer variações na qualidade, quantidade e composição química
devido ao material genético, idade e estágio vegetativo da planta, das condições ambientais,
como clima e tipo de solo, assim como da colheita e o processamento pós-colheita, tais como
a parte da planta utilizada para extração, horário e época do ano (TAYLOR et al., 2001;
ANGIONI et al., 2006). Esses óleos essenciais também são chamados de óleos etéreos ou
essências devido a algumas de suas características físico-químicas, como a de serem
geralmente líquidos com aspecto oleoso à temperatura ambiente (GIORDANI et al., 2008).
Os óleos essenciais têm sido largamente utilizados em virtude de apresentar
importantes atividades biológicas na natureza, tais como efeitos antibacteriano (ROSATO et
al., 2007), antifúngico (SEGVIC-KLARIC et al., 2007) e inseticidas (PAVELA, 2005). Estes
27
produtos naturais são comercialmente importantes para as indústrias farmacêutica,
agronômica, alimentícia, e principalmente para fabricação de cosméticos e perfumes
(BAKALLI et al., 2008). Compostos vegetais bioativos ricos em óleos essenciais são
empregados in natura para a preparação de infusões ou sob a forma de outras preparações
simples. Tais óleos podem ser utilizados na indústria farmacêutica para síntese de vitaminas,
hormônios, antibióticos e antissépticos (BRUNETON, 1995). Além disso, alguns óleos
essenciais apresentam diferentes propriedades medicinais, sendo indicados como agentes
terapêuticos para tratar diversas enfermidades (PERRY et al., 2003; SILVA et al., 2003;
CAVALCANTI et al., 2012).
Quimicamente, os óleos essenciais podem conter cerca de 20 a 60 constituintes
em diferentes concentrações, sendo caracterizados por um ou dois constituintes majoritários,
existindo outros em menores concentrações e alguns em baixíssimas quantidades (BAKALLI
et al., 2008; SIMÕES et al., 2010). Os constituintes químicos dos óleos essenciais variam
desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis,
ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até
compostos com enxofre, todos caracterizados por apresentar baixo peso molecular (SIMÕES
et al., 2010). Geralmente, o constituinte majoritário determina as propriedades biológicas do
óleo essencial (PICHERSKY et al., 2006), incluindo atividades anti-inflamatórias
(MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al., 2013) e cicatriciais (CAVALCANTI et al., 2012).
2.3.2 Óleos fixos
Óleos fixos, conhecidos genericamente por óleos vegetais, são gorduras obtidas
das plantas, quase exclusivamente de grãos e sementes conhecidas como oleaginosas, apesar
de outras partes da planta poderem ser utilizadas na extração destas substâncias, como casca
do caule e polpa de frutos (SIMÕES et al., 2010; PAULA et al., 2012). Segundo definição da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária-ANVISA (2005), são produtos obtidos de espécies
vegetais compostos principalmente por glicerídeos de ácidos graxos, podendo conter baixas
quantidades de fosfolipídios, constituintes insaponificáveis e ácidos graxos livres. São
substâncias hidrofóbicas e lipofílicas, formadas predominantemente por triglicerídeos ou
triacilgliceróis (moléculas que provêm do metabolismo primário, formadas por três ácidos
graxos esterificados com glicerol e que pelo menos um deles seja insaturado), que se
apresentam em estado líquido e viscoso nas condições normais de temperatura e pressão,
devido ao baixo ponto de fusão (MORETTO; FETT, 1998).
28
É importante destacar que os óleos fixos são quimicamente diferentes dos óleos
essenciais. Além dos triacilgliceróis, os óleos fixos podem apresentar outros constituintes
químicos em menor quantidade. Dentre estes, os carotenoides (β-caroteno) dão a coloração
amarelada ou avermelhada característica dos óleos. Os tocoferóis agem como antioxidantes,
impedindo a rancidez oxidativa. As lactonas e metilcetonas conferem odor ao óleo. Já os
esteróis, os cerídeos e os hidrocarbonetos incolores não influenciam as propriedades
organolépticas dos óleos fixos (MORETTO; FETT, 1998).
Os óleos fixos são fontes de energia de grande importância para a indústria
alimentícia, na produção de ácidos graxos, glicerina, lubrificantes, biodiesel, além de
inúmeras outras aplicações (REDA; CARNEIRO, 2007). A obtenção do óleo vegetal bruto é
feita por meio de métodos físicos e químicos sobre as sementes oleaginosas, utilizando
solventes como extrator e prensagem (MORETTO et al., 2002; REDA; CARNEIRO, 2007).
Os óleos fixos destinados ao consumo humano ou à formulação de rações animais são
submetidos a um processo de refinamento para remoção de alguns componentes como ácidos
graxos livres, proteínas, corantes naturais, umidade e compostos voláteis e inorgânicos
(MORETTO et al., 2002).
A utilização de fontes de ácidos graxos proveniente de óleos vegetais,
principalmente ácidos graxos insaturados, na dieta humana e animal ou em formulações
concentradas, como cápsulas, emulsões e azeites vegetais, tem sido cada vez mais
recomendada por especialistas da área de saúde para prevenção de várias doenças. Essas
macromoléculas são bem relatados por apresentarem diversas propriedades biológicas no
organismo, incluindo importantes atividades anti-inflamatórias (CALDER et al., 2013) e
cicatrizantes (CARDOSO et al., 2004; CARDOSO et al., 2011).
2.4 Óleos de origem vegetal e suas atividades em processos inflamatórios e cicatriciais
Os avanços científicos para o entendimento dos aspectos celulares e moleculares
envolvidos na inflamação e cicatrização de feridas permitiram o estabelecimento de novas
metodologias/sistemas para identificação de substâncias de origem vegetal efetoras, como os
óleos vegetais e seus constituintes (CARVALHO, 2004). A investigação desses produtos com
propriedades anti-inflamatórias e cicatrizantes tem sido possível graças ao uso de técnicas in
vitro, tais como cultura de células, dosagem e identificação de biomarcadores, inibição de
enzimas e outros mediadores; além de técnicas in vivo, como indução de inflamação tópica
29
por agentes flogísticos, e indução de feridas cutâneas para avaliar atividade cicatrizante em
diferentes modelos animais, os quais são amplamente utilizados na pesquisa pré-clínica.
Neste contexto, óleos vegetais (essenciais e fixos) tradicionalmente utilizados no
tratamento da inflamação e/ou cicatrização são indicadores da presença de compostos ativos
que possuem atividades biológicas sobre estes processos, e por isso devem ser investigados
para comprovação de sua eficácia.
2.4.1 Óleos essenciais
Diversas plantas fornecedoras de óleos essenciais utilizadas na medicina popular
têm demonstrado amplo potencial anti-inflamatório tópico e cicatrizante in vivo. Dentre essas
plantas, destacam-se aquelas pertencentes ao gênero Lippia (Verbenaceae) tradicionalmente
usadas em países da América Central, América do Sul e África Tropical. Muitas espécies de
Lippia contém monoterpenos como constituintes majoritários dos óleos essenciais, sendo o
timol, carvacrol, citral e p-cimeno os compostos mais frequentemente encontrados e
responsáveis pelas atividades biológicas observadas (PASCUAL et al., 2001).
Do ponto de vista farmacológico, o óleo essencial de Lippia alba é provavelmente
o mais estudado, o qual tem sido relatado por apresentar atividades analgésicas e anti-
inflamatórias (HENNEBELLE et al., 2008). Por outro lado, embora o óleo essencial de
Lippia multiflora tenha demonstrado propriedades analgésicas e antipiréticas, esta mistura não
foi efetiva em inibir o processo inflamatório através da formação de granuloma induzido in
vivo (ABENA et al., 2003). Estes efeitos foram atribuídos a mono e sesquiterpenos presentes
nestes óleos essenciais (ABENA et al., 2003; HENNEBELLE et al., 2008).
A avaliação do potencial anti-inflamatório, bem como o mecanismo de ação do óleo
essencial de Lippia gracilis tem sido mais recentemente investigados. Esta mistura de terpenos,
cujos constituintes majoritários foram timol e p-cimeno, reduziu a formação do edema de pata e
a migração de leucócitos na cavidade peritoneal em modelos murinos (MENDES et al., 2010),
através da inibição de mediadores inflamatórios como óxido nítrico (NO), PGE2, TNF-α e
interferon-γ (IFN-γ), sugerindo que este óleo essencial afeta seletivamente as células
inflamatórias (GUILHON et al., 2011). Adicionalmente, o timol presente no óleo essencial de
L. gracilis apresentou potencial anti-inflamatório e cicatrizante ao reduzir o edema e o infiltrado
inflamatório na área da lesão, com redução da atividade enzimática da mieloperoxidase. Além
disso, feridas tratadas com esse monoterpeno, demonstraram maiores taxas de contração da
30
ferida, com maior densidade e organização das fibras de colágeno no tecido de granulação
durante o processo cicatricial (RIELLA et al., 2012).
Ainda relativo ao gênero Lippia, o óleo essencial de Lippia sidoides também
mostrou potentes atividades anti-inflamatórias tópicas quando usado em diferentes
concentrações em modelos de inflamação aguda (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al.,
2013). Tal efeito provavelmente foi devido às suas propriedades antioxidantes (MONTEIRO
et al., 2007) e à redução da produção de mediadores pró-inflamatório, sobretudo aqueles
envolvidos com a via de sinalização mediada pela ciclooxigenase-COX (VERAS et al., 2013).
Entretanto, o tratamento tópico repetido com o óleo essencial de L. sidoides ou timol
promoveu um aumento da resposta inflamatória, limitando seu uso em tratamentos crônicos
(VERAS et al., 2013). Este efeito pode ser devido a uma atividade aumentada da enzima
lipoxigenase (LOX), a qual gera mediadores com propriedades quimioatraentes para células
inflamatórias, induzindo a formação excessiva de ROS, responsável pelo dano tecidual
(VERAS et al., 2013). Entretanto, os efeitos do óleo essencial de L. sidoides sobre a
cicatrização de feridas não foi encontrado na literatura.
Acredita-se que o monoterpeno timol seja o responsável pelas atividades anti-
inflamatórias tópicas atribuídas a L. sidoides (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et al., 2013) e
cicatrizantes verificadas para L. gracilis (RIELLA et al., 2012). Entretanto, em um estudo
realizado com o óleo essencial de Thymus vulgaris foi demonstrado que o efeito anti-
inflamatório observado para este óleo essencial foi antagônico àquele verificado para timol, seu
constituinte majoritário. Nesse mesmo estudo, timol exerceu um potente efeito quimioatraente,
mas não reduziu a formação de edema e, mais que isso, apresentou uma resposta irritante,
provavelmente dependente da liberação de histamina, eicosanóides e outros mediadores
inflamatórios, a qual foi similar ao efeito observado com óleo de cróton, um potente agente
flogístico (FACHINI-QUEIROZ et al., 2012).
Além disso, deve-se considerar que constituintes presentes em menores
quantidades nos óleos essenciais possam contribuir para seus efeitos biológicos. Isto foi
observado para o óleo essencial de Cordia verbenaceae, cuja atividade anti-inflamatória é
devido ao α-humuleno, presente na mistura volátil em torno de 4,64% (FERNANDES et al.,
2007), o qual parece interferir com a produção de TNF-α (PASSOS et al., 2007).
Outros gêneros de plantas aromáticas utilizadas na medicina tradicional também
têm sido amplamente estudadas como fonte de substâncias voláteis com atividades anti-
inflamatória e cicatrizante. Os efeitos anti-inflamatórios de óleos essenciais de Eucalyptus
31
foram demonstrados através da inibição de parâmetros como edema, migração neutrofílica e
permeabilidade vascular (SILVA et al., 2003). Esses mesmos parâmetros também estavam
reduzidos em processos inflamatórios agudos tratados com óleo essencial de Peperomia
serpens, o qual inibiu a produção de mediadores inflamatórios e a expressão de moléculas de
adesão (PINHEIRO et al., 2011). Adicionalmente, atividades anti-inflamatórias associadas à
propriedades cicatrizantes têm sido relatadas para óleos essenciais de plantas da família
Pinaceae (TUMEN et al., 2011), sobretudo do gênero Pinus (SUNTAR et al., 2012), as quais
podem estar associadas aos seus potentes efeitos antimicrobianos.
Dentre as espécies nativas do Nordeste do Brasil, o óleo essencial de Croton
zehntneri e seu constituinte majoritário, trans-anetol, têm sido relatados por apresentar
potencial terapêutico significativo sobre a cicatrização de feridas cutâneas. Ambos
tratamentos aceleraram o fechamento das feridas com aumento da atividade de fibroblastos e
deposição de fibras colágenas no tecido neoformado, embora não tenham sido observadas
alterações no infiltrado inflamatório e angiogênese. Além disso, o óleo essencial reduziu o
edema e exsudato na área das lesões semelhante à droga de referência padrão
(CAVALCANTI et al., 2012).
Óleos essenciais também têm sido efetivos no tratamento de lesões, em que há
retardo do processo de cicatrização. O óleo essencial de Rosmarinus officinalis tem sido
efetivo na cicatrização de feridas em modelos experimentais de diabetes, o qual reduziu a
resposta inflamatória e melhorou a contração das feridas e outros parâmetros como re-
epitelização, formação do tecido de granulação, angiogênese e deposição de colágeno (ABU-
AL-BASAL, 2010).
Os resultados promissores encontrados nesses estudos demonstram possibilidades da
utilização de óleos essenciais como agentes anti-inflamatórios tópicos e cicatrizantes.
2.4.2 Óleos fixos
Existe grande diversidade de espécies vegetais oleaginosas das quais se podem
extrair óleos fixos. Estes produtos apresentam variações nas proporções dos diferentes ácidos
graxos (AG), os quais podem apresentar respostas fisiológicas distintas quando fornecidos em
dietas nutracêuticas (SALMERON, 2008; PAULA et al., 2012) ou quando utilizados como
agentes terapêuticos alternativos para tratamento tópico de processos inflamatórios e lesões
32
cutâneas (OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO et al., 2010; VALACCHI et al., 2011; FRANCO
et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2013).
2.4.2.1 Ácidos graxos
Os óleos vegetais contêm alta proporção de ácidos graxos insaturados (AGI) em
relação aos saturados (PAULA et al., 2012). Dentre estes constituintes, os mais comuns entre
os saturados são os ácidos palmítico (C16:0) e o esteárico (C18:0), e entre os insaturados,
destacam-se os ácidos oléico (C18:1, -9, OA), linoléico (C18:2, -6, LA) e α-linolênico
(C18:3, -3, ALA) (Figura 1).
Dentre os AGI, ALA (-3) e LA (-6) são considerados os únicos AG essenciais,
uma vez que outros AG podem ser sintetizados a partir desses dois precursores. ALA (-3) e
LA (-6) são nutrientes essenciais para o funcionamento do organismo e devem ser
adquiridos através de fontes alimentares, uma vez que os mamíferos não podem sintetizá-los.
Dentre os AGI produzidos a partir desses AG essenciais, os ácidos araquidônico (-6, AA),
docosahexaenoico (-3, DHA) e eicosapentaenoico (-3, EPA) são os mais relevantes
fisiologicamente (LE et al., 2009).
Figura 1. Estrutura molecular dos principais ácidos graxos encontrados em óleos vegetais
ALA (-3) e LA (-6) estão presentes tanto em espécies vegetais como animais
empregados na alimentação. As principais fontes de AGI -3, incluindo ALA, DHA e EPA
33
são os pescados, moluscos, algas e crustáceos. Dentre os peixes, aqueles de origem marinha,
como sardinha, salmão e cavala, geralmente apresentam maiores quantidades de EPA e DHA
que os peixes oriundos de águas continentais. Outras fontes de AGI -3 e -6 são alguns
cereais, leguminosas, sementes e frutos oleaginosos (VIANI; BRAZ-FILHO, 1996; MARTIN
et al., 2006). AA (-6) pode ser obtido diretamente dessas fontes vegetais ou indiretamente
formado a partir do LA (-6), que é um componentes encontrados em óleos vegetais, como os
de milho, girassol, açafrão e soja. Nos óleos vegetais, a maior concentração do ALA (-3)
ocorre no óleo de linhaça, sendo que os óleos de canola e soja também apresentam
concentrações significativas desse AGI (DUBOIS et al., 2007; MARTINS et al., 2008).
Ao contrário dos AG essenciais, OA (-9), um AG monoinsaturado não-essencial
pode ser sintetizado pelos mamíferos a partir de precursores carbônicos simples (VIANI;
BRAZ-FILHO, 1996; YAQOOB, 2002), sendo considerado o principal constituinte de muitos
óleos vegetais, incluindo azeite de oliva, óleos da noz de macadâmia e abacate (DUBOIS et
al., 2007).
As propriedades biológicas dos AGI oriundos de óleos vegetais no organismo são
amplas e têm sido bem descritas na literatura (RICHARD et al., 2009; RISERUS et al., 2009;
HURST et al., 2010; KELLER et al., 2013; KRÁLOVÁ-LESNÁ et al., 2013; LAVIANO et
al., 2013). Dentre seus inúmeros efeitos benéficos, destaca-se o importante papel dessas
moléculas bioativas como agentes moduladores da resposta imunológica, participando nas
interações célula-célula e sinalização intracelular nos processos inflamatórios e cicatriciais
(OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO, 2013).
2.4.2.2 Influência dos AGI na resposta inflamatória
A relação entre resposta inflamatória e AGI tem sido bastante investigada nos
últimos anos. O interesse das pesquisas nesta área deve-se ao fato de que AGI com 20 átomos
de carbono, especialmente AA (-6) e EPA (-3), são precursores dos eicosanóides,
metabólitos biologicamente ativos que modulam inúmeros processos fisiológicos e
bioquímicos e possuem importantes propriedades imunorregulatórias (LE et al., 2009;
KENDALL; NICOLAOU, 2013). AGI -9 produzidos endogenamente parecem não possuir
papel expressivo na resposta inflamatória (CLIFTON, 2009), embora apresentem efeitos
moduladores sobre outras funções imune-fisiológicas (SALES-CAMPOS et al., 2013).
34
Em resposta a uma variedade de estímulos de ativação inespecíficos, AA é
mobilizado a partir da bicamada de fosfolipídios de membrana das células inflamatórias pela
ação da fosfolipase A2. AA é o principal substrato para as enzimas COX e LOX, originando
mediadores que contribuem para o processo inflamatório: prostaglandinas (PG) e
tromboxanos (TX) da série 2 (PGE2, PGF2, PGI2, TXA2) ou leucotrienos (LT) da série 4
(LTB4, LTC4, LTD4, LTE4), respectivamente. Esses mediadores têm papéis bem conhecidos
na imunidade e inflamação (ROCCA; FITZGERALD, 2002; CALDER, 2009; CALDER,
2013; KENDALL; NICOLAOU, 2013).
PGE2 induz febre, aumenta a permeabilidade vascular e está envolvida com a
sensação de dor associada a processos inflamatórios (CALDER, 2010). Já LTB4 aumenta a
permeabilidade vascular, é um potente quimioatraente para leucócitos, induz liberação de
enzimas lisossômicas e ROS pelos neutrófilos, bem como a produção de TNF-α, IL-1β e IL-6
(CALDER, 2010). LTB4 juntamente com TXA2 promovem vasoconstrição. Em reações
inflamatórias nas quais ocorre produção de LTC4, LTD4 e LTE4 por mastócitos, basófilos e
eosinófilos, esses mediadores têm atividades biológicas similares àquelas da histamina,
promovendo vasodilatação. Ademais, atuam como potentes estimuladores da permeabilidade
vascular nas reações de hipersensibilidade imediata (PETERS-GOLDEN et al., 2005,
CALDER, 2006; VOEHRINGER, 2013). PGE2 atua suprimindo a imunidade celular através
da inibição da proliferação de linfócitos T (CALDER et al., 1992) e da produção de citocinas
Th1: IL-2 e IFN-γ (BETZ; FOX, 1991). Assim, é possível que um suprimento excessivo de
AG -6 poderia agir para promover ou exacerbar estados de inflamação e imunossupressão
(CALDER, 2010).
Apesar da contínua ênfase dada aos efeitos pró-inflamatórios dos eicosanóides
derivados do AA, propriedades anti-inflamatórias desses mediadores também tem sido
relatadas (CALDER, 2009). PGE2 é uma potente inibidora da produção de duas citocinas pró-
inflamatórias clássicas, IL-1 e TNF-α, por monócitos e macrófagos (MILES et al., 2002).
Além disso, esse mediador inibe a 5-LOX, diminuindo a produção de LT da série 4, e induz a
15-LOX promovendo a formação de lipoxinas (LEVY et al., 2001), as quais tem sido
relatadas por seus efeitos anti-inflamatórios, atuando na resolução da resposta inflamatória
(SERHAN et al., 2008).
EPA (-3) e DHA (-3) inibem o metabolismo do AA (-6), e a produção dos
eicosanóides derivados do AA é diminuída por esses AG -3 de maneira dose-dependente
(CALDER, 2009). EPA também atua como substrato para as enzimas COX e LOX, sendo
35
convertido em PG e TX da série 3 e LT da série 5, respectivamente. Esses eicosanóides, por
sua vez, apresentam ação anti-inflamatória no organismo (WANTEN; CALDER, 2007).
Outros mediadores derivados do EPA e DHA são as resolvinas, enquanto DHA também
produz protectinas (WEYLANDT et al., 2012). Estas moléculas são produzidas através de uma
série de reações envolvendo as enzimas COX-2 e LOX e exercem potentes efeitos anti-
inflamatórios sobre neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células T (SERHAN et al.,
2008; WEYLANDT et al., 2012).
Apesar dos eicosanóides gerados a partir de EPA e DHA serem descritos por
apresentar menor potência biológica do que aqueles formados a partir do AA, tem sido
relatado que nem sempre isso é verdadeiro (CALDER, 2009). PGE2 e PGE3 mostraram ter
efeitos inibitórios equivalentes sobre a produção de TNF-α e IL-1β por células mononucleares
humanas estimuladas com lipopolissacarídeo (MILES et al., 2002).
AGI -3 podem, ainda, originar AG eletrofílicos através de um mecanismo
catalisado por COX-2, especificamente em macrófagos ativados. Essas moléculas podem
modular a inflamação, funcionando como mediadores anti-inflamatórios por inibir a produção
de citocinas pró-inflamatórias e NO. Dessa forma, os AG eletrofílicos podem estar envolvidos
nos efeitos anti-inflamatórios sistêmicos associados a dietas ricas em AGI -3 (GROEGER et
al. 2010).
AGI também podem regular a expressão de moléculas de adesão, tais como
integrinas e selectinas, nos leucócitos e células endoteliais. Esse tipo de regulação é importante
para migração transendotelial dos leucócitos (CALDER, 2013). AGI -3 reduz a expressão de
ICAM-1, VCAM-1 e selectina-E nas células endoteliais, enquanto AGI -6 aumenta a
expressão de ICAM-1 e VCAM-1. AGI -9, por sua vez, é capaz de aumentar o estado de
afinidade da molécula de adesão Mac-1, permitindo maior adesão dos leucócitos às células
endoteliais (POMPÉIA et al., 2000; CALDER, 2006).
Um dos principais fatores de transcrição envolvido na produção de mediadores
inflamatórios é o NF-κB, cuja expressão pode ser modulada por AGI (CALDER, 2013).
Estudos utilizando cultura de células endoteliais têm sugerido que o LA (-6) pode
desempenhar um importante papel na inflamação através da ativação do NF-κB com aumento
na produção de TNF-α, IL-6 e outros mediadores inflamatórios (HENNIG et al., 1996), bem
como da molécula de adesão VCAM-1 (DICHTL et al., 2002). Existem evidências que o AA
(-6) também pode ativar o NF-κB (CAMANDOLA et al., 1996) e induzir a produção de
TNF-α, IL-1α e IL-1β (PRIANTE et al., 2002). A expressão de COX-2 também tem sido
36
regulada pelo NF-κB em resposta a diferentes estímulos pró-inflamatórios, como
lipopolissacarídeo, TNF- α e IL-1, em diferentes tipos celulares (TAK; FIRESTEIN, 2001).
EPA (-3), por sua vez, é relatado por diminuir ativação do NF-κB em cultura de monócitos,
sugerindo um efeito direto dos AGI -3 sobre a inibição da expressão de genes que codificam
citocinas pró-inflamatórias (NOVAK et al., 2003). Entretanto, recentemente um estudo
demonstrou que os AGI, independente da família a que pertencem, podem suprimir a
atividade do NF-κB e dos mediadores envolvidos nessa via de sinalização, indicando, assim,
um novo mecanismo através dos qual os AGI exercem seus efeitos anti-inflamatórios
(SCHUMANN; FUHRMANN, 2010).
Estudos recentes utilizando modelos experimentais têm explorado importantes
efeitos anti-inflamatórios tópicos para os AGI presentes em óleos vegetais. O óleo da semente
de pequi, rico em OA (AGI -9), foi capaz de inibir a inflamação tópica induzida por xileno
de maneira dose-dependente (OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO et al., 2010). Esse óleo
também apresentou efeito anti-edematogênico em modelos de inflamação tópica induzida por
óleo de cróton, AA e fenol, sem antagonizar o edema causado pela histamina e capsaicina,
sugerindo uma atividade anti-inflamatória tópica similar àquela de drogas clássicas que
modulam a produção de metabólitos do AA (SARAIVA et al., 2011). Ensaios preliminares
também mostram que os óleos de abóbora (OLIVEIRA et al., 2011), sucupira e andiroba, os
quais apresentam diferentes proporções de AGI -6 e -9, mostraram resultados similares na
inibição do processo inflamatório tópico, enquanto o óleo de linhaça (AGI -3) apresentou a
menor resposta no modelo utilizado (OLIVEIRA; BEZERRA et al., 2010).
Dessa forma, AGI de diferentes classes podem atuar como agentes pró ou anti-
inflamatórios quando administrados por via tópica ou oral. Isso pode ser verificado através de
modificações nos biomarcadores celulares e moleculares, sobretudo no perfil de mediadores
lipídicos e peptídicos gerados. Assim, alterações na composição lipídica da dieta ou de
formulações tópicas, sobretudo na proporção de AGI -3, -6 e -9 podem estar associadas à
regulação de diferentes processos inflamatórios.
2.4.2.3 Influência dos AGI na resposta cicatricial
A presença de AGI na pele é fundamental para manutenção da homeostase,
hidratação e barreira cutâneas. Quando há rompimento dessa barreira mecânica, os AGI são
mobilizados para restabelecer a continuidade da epiderme através do processo de cicatrização
37
cutânea (McCUSKER; GRANT-KELS, 2010; KENDALL; NICOLAOU, 2013). No entanto,
essas funções tornam-se reduzidas quando há deficiências nutricionais dos AG essenciais
(BROWN; PHILLIPS, 2010).
Os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo (PPAR) são fatores de
transcrição pertencentes à família de receptores nucleares que regulam a homeostase da
glicose e do metabolismo dos lipídios (DESVERGNE; WAHLI, 1999). Estes receptores são
expressos em diferentes tecidos, incluindo a pele, já tendo sido identificados em
queratinócitos, células de Langerhans e melanócitos da epiderme (MICHALIK; WAHLI,
2007). AGI -3 são ligantes agonistas dos PPAR, ativando-os. A ativação dos PPAR-β
promove a sobrevivência das células por reduzir a apoptose. Isso é importante para o processo
de reparo cutâneo, uma vez que PPAR-β é expresso nos queratinócitos das bordas da ferida
durante todo o processo de cicatrização (McCUSKER; GRANT-KELS, 2010). Além disso,
AGI -3 parece aumentar a atividade dos PPAR-γ, resultando em efeitos anti-inflamatórios
por interferir na ativação do NF-κB durante a fase inflamatória do processo cicatricial (VAN-
DEN-BERGHE et al., 2003; CALDER, 2013).
Os benefícios do tratamento de feridas cutâneas com formulações contendo AG
essenciais têm sido verificados na literatura (DE NARDI et al., 2004; MANHEZI et al., 2008;
OLIVEIRA; NUNES-PINHEIRO et al., 2010; FERREIRA et al., 2012). Em modelos
experimentais, a suplementação dietética com óleos de linhaça (AGI -3) e girassol (AGI -6
e -9) retardou o fechamento de feridas cutâneas, bem como afetou o infiltrado inflamatório e
a deposição de colágeno nas lesões (OTRANTO et al., 2010). Por outro lado, a aplicação
tópica do óleo de pequi (-9) acelerou o processo de reparo cutâneo (OLIVEIRA; NUNES-
PINHEIRO et al., 2010), assim como o óleo de gergelim (AGI -6 e -9), o qual também
promoveu aumento da expressão do VEGF e maior nível de angiogênese (VALACCHI et al.,
2011). Entretanto, o efeito da associação do AG essencial LA (-6) com triglicerídeos de
cadeia média (ácidos caprílico, cáprico, capróico e láurico), lecitina de soja e vitaminas A e E,
aplicado por via tópica em úlceras cutâneas induzidas experimentalmente, não acelerou o
processo de reparo tecidual por segunda intenção (MAGALHÃES et al., 2008).
Um papel relevante da administração tópica isolada de AGI -3, -6 e -9 sobre a
cicatrização de feridas cutâneas também foi descrito. Esses AGI alteraram a deposição de
fibras do tecido conjuntivo no sítio da ferida, sendo que o tratamento com AGI -9 induziu
uma menor resposta inflamatória local e fechamento mais rápido da ferida quando comparado
a AGI -3 e -6. Além disso, AGI -9 foi capaz de inibir a produção de NO nas primeiras
38
horas, enquanto AGI -3 retardou o fechamento da lesão, induziu pico de NO e intensa
deposição de matriz extracelular (CARDOSO et al., 2004).
AGI -3 é capaz de aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias no sítio de
feridas, as quais são responsáveis pela ativação de macrófagos, estimulando as fases seguintes
do processo cicatricial (McDANIEL et al., 2008). AGI -6 e -9 estimularam uma elevação
dose-dependente dos níveis de IL-1β e VEGF, enquanto AGI n-9 também estimulou a
produção de uma citocina quimioatraente para neutrófilos. Além disso, AGI -6 e -9
aumentaram a massa do tecido cicatrizado e não afetaram a permeabilidade vascular durante a
fase inflamatória do reparo cutâneo. Juntos, esses efeitos pró-inflamatórios podem acelerar o
processo de cicatrização (PEREIRA et al., 2008).
Ensaios in vitro mostram que os AGI -6 e -9 agem sobre neutrófilos
aumentando a liberação de ROS. Essas moléculas são importantes sinalizadores durante o
processo de reparo tecidual, e estão envolvidas na sinalização para migração e diferenciação
celular e liberação de citocinas (HATANAKA; CURI, 2007).
No processo cicatricial, a produção excessiva de citocinas por neutrófilos pode
levar à injúria tecidual e a morte celular. Por outro lado, a não produção de citocinas por
neutrófilos pode afetar a migração de outros tipos celulares para o local da lesão. Sendo
assim, a hiper ou hipo-responsividade encontrada em células tratadas com AGI pode
desencadear efeitos inapropriados, aumentando a susceptibilidade do organismo à infecção
por patógenos invasores (HATANAKA; CURI, 2007).
AGI também podem modificar o reparo tecidual por alterar o equilíbrio das MMP e
seus inibidores (TIMP), moléculas chaves na fase de remodelagem do processo cicatricial
(ARMSTRONG; JUDE, 2002). Feridas cutâneas induzidas experimentalmente e tratadas com
AGI -9 apresentaram maior expressão de MMP e TIMP, sugerindo uma elevada remodelagem
tecidual (CARDOSO et al., 2011). Nesse mesmo estudo, AGI -9 diminuiu a expressão de
COX-2 e aumentou a expressão de colágeno III quando comparado a AGI -3, e reduziu o
infiltrado inflamatório nas lesões cutâneas sem induzir morte celular (CARDOSO et al., 2011).
Esses resultados sugerem novos mecanismos para a modulação da resposta imunológica pelo
AGI -9 na cicatrização (CARDOSO et al., 2011; SALES-CAMPOS et al., 2013).
As diferentes fases do processo cicatricial podem ser moduladas por AGI. Essas
moléculas regulam positiva ou negativamente a ativação de diferentes tipos celulares e a
secreção de seus produtos, bem como a expressão de biomarcadores moleculares envolvidos
no restabelecimento da homeostase tecidual.
39
2.5 Plantas medicinais fornecedoras de óleos vegetais objetos do estudo
2.5.1 Lippia sidoides Cham.
Lippia sidoides Cham. é um arbusto aromático, caducifólio, ereto, muito
ramificado, próprio da vegetação do semiárido nordestino, comum na caatinga entre Mossoró-
RN e Tabuleiro do Norte-CE. Esta planta pertence à família Verbenaceae, sendo conhecida
popularmente como alecrim-pimenta e estrepa-cavalo (Figura 2) (LORENZI; MATOS, 2002;
MATOS, 2002).
Figura 2. Lippia sidoides Cham.
Fonte: http://cerradoinvitro.net/files/lippia_sidoides.pdf
O óleo essencial obtido de suas folhas apresenta alto teor de timol, além de outros
constituintes minoritários como α-felandreno, β-cariofileno, p-cimeno, mirceno e carvacrol,
dentre outros (MATOS et al., 2004). As múltiplas propriedades biológicas verificadas para o
óleo essencial de L. sidoides, e que apoiam seu uso popular, tem sido atribuídas ao seu
constituinte majoritário, timol. Dentre estas, destacam-se as atividades antimicrobiana
(BERTINI et al., 2005; FONTENELLE et al., 2007; VERAS et al., 2012), anti-helmíntica
(CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2008), antiprotozoária (MEDEIROS et al., 2011),
antioxidante, gastroprotetora e anti-inflamatória tópica (MONTEIRO et al., 2007; VERAS et
al., 2013) e antisséptica oral (GIRÃO et al., 2003; BOTELHO et al., 2009). Recentemente, um
efeito inflamatório crônico para este óleo essencial também foi relatado (VERAS et al., 2013).
40
L. sidoides é uma das plantas selecionadas pelo projeto de Fitoterapia Social da
Universidade Federal do Ceará denominado “Farmácias Vivas”, utilizada para tratar feridas e
infecções superficiais cutâneas em pessoas carentes (MATOS, 2002). Isto torna a pele um alvo
comum para as ações farmacológicas desta planta. A despeito de sua propriedade anti-
inflamatória tópica e de seu amplo uso popular, não foram verificados na literatura relatos
sobre a segurança do uso do óleo essencial de L. sidoides sobre a pele, bem como seus efeitos
sobre a cicatrização de feridas cutâneas.
2.5.2 Curcubita pepo L.
Cucurbita pepo L. é uma planta herbácea pertencente à família Cucurbitaceae, a
qual produz ramas rasteiras que podem chegar a 6 m de comprimento. Por ser uma espécie de
polinização cruzada, há grande variedade de formas, cores e textura dos frutos, os quais são
conhecidos popularmente como abóbora, moranga ou jerimum (Figura 3) (HEIDEN et al.,
2007). A abóbora tem sido cultivada em todas as regiões brasileiras, incluindo o Nordeste
(RAMOS et al., 2010). Esse fruto é amplamente utilizado na alimentação humana, sobretudo
no preparo de vários pratos da culinária, e na ornamentação de ambientes (HEIDEN et al.,
2007). Suas sementes são consideradas uma fonte valiosa de proteína e gordura vegetal, a
qual fornece cerca de 400 a 540 g/Kg de óleo fixo (PROCIDA et al., 2013).
Figura 3. Curcubita pepo L. Aspecto geral da planta com ramas e do fruto
Fontes: Heiden et al. (2007) e Ramos et al. (2010).
41
O óleo das sementes de abóbora é extraordinariamente rico em AGI, os quais
representam cerca de 84% do total de ácidos graxos, incluindo LA (-6) e OA (-9), e os
saturados palmítico e esteárico (PROCIDA et al., 2013). Além disso, também é rico em
minerais, vitaminas lipossolúveis, particularmente α- e γ-tocoferol, carotenoides, e outros
componentes como fitoesterois (NAWIRSKA-OLSZANSKA et al., 2013; PROCIDA et al.,
2013). Este óleo é utilizado pelas indústrias alimentícia e farmacêuticas, bem como na
medicina tradicional de muitos países (CAILI et al., 2006).
Por muitos anos, as sementes de abóbora foram utilizadas na medicina
complementar principalmente como vermífugo (NAWIRSKA-OLSZANSKA et al., 2013).
Com o avanço das pesquisas, evidências demonstraram que o óleo destas sementes foi efetivo
contra o desenvolvimento de patologias prostáticas (HONG et al., 2009), incluindo o câncer
de próstata (ANDERSON, 2005), por reduzir a inflamação deste tecido; e doenças
cardiovasculares como a hipertensão (EL-MOSALLAMY et al., 2012). Além disso, também
foram verificados efeitos benéficos em mulheres na menopausa devido à sua rica composição
em fitoestrógenos (GOSSELL-WILLIAMS et al., 2011). Entretanto, a despeito da sua
composição rica em AGI, não foram encontrados na literatura relatos de seus efeitos
terapêuticos sobre a inflamação e a cicatrização cutâneas.
42
3 JUSTIFICATIVA
Muitas plantas medicinais são fontes de óleos vegetais, os quais atuam como
importantes agentes terapêuticos na modulação da resposta imunológica. Estudos prévios
apontam para atividades anti-inflamatória e/ou cicatrizante de óleos essenciais e AGI presentes
em óleos fixos. L. sidoides apresenta diversas propriedades biológicas, destacando-se seu
potencial antimicrobiano e anti-inflamatório tópico, enquanto as atividades biológicas de C.
pepo sobre as respostas imune-inflamatórias ainda não foram descritas. Assim, os efeitos do
óleo essencial de L. sidoides e do óleo fixo de C. pepo sobre o processo inflamatório e
cicatricial cutâneo, incluindo seu uso seguro sobre a pele em diferentes condições fisiológicas, o
envolvimento de componentes celulares e moleculares, bem como os mecanismos através dos
quais estes eventos se estabelecem, necessitam de esclarecimentos para comprovação de suas
atividades. Portanto, torna-se necessário aprofundar os estudos pré-clínicos através de
avaliações morfológica e detecção de biomarcadores no tecido afetado.
A descoberta de novas atividades biológicas para esses óleos vegetais poderá
favorecer o desenvolvimento de fitoterápicos que agreguem múltiplas potencialidades
biológicas em um único produto, como é o caso do óleo essencial de L. sidoides. Somado a
isso, haverá, ainda, benefícios para pessoas carentes por reduzir custos com diferentes
tratamentos convencionais, bem como a viabilização de opções terapêuticas alternativas na
prática clínica veterinária, sobretudo para animais que sofrem de afecções múltiplas de pele.
43
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O óleo essencial de L. sidoides Cham. e o óleo fixo de C. pepo L. modulam as
respostas imune-inflamatória e cicatricial cutânea.
44
5 OBJETIVOS
5.1 Geral
Avaliar os efeitos do óleo essencial de L. sidoides e do óleo fixo de C. pepo sobre
a inflamação tópica e cicatrização cutânea em modelos experimentais in vivo.
5.2 Específicos
a) Verificar, in vivo, os efeitos do óleo essencial de L. sidoides sobre a pele em
modelos de irritação tópica e cicatrização por excisão cutânea, através da
avaliação de parâmetros morfométricos e histológicos;
b) Avaliar, in vivo, os efeitos do óleo fixo de C. pepo em modelos de inflamação
aguda e crônica induzida por diferentes agentes flogísticos, através de análises
morfométricas e histológicas;
c) Avaliar, in vivo, os efeitos do óleo fixo de C. pepo em modelo de cicatrização
por excisão cutânea, através de análises morfométricas, histológicas e
imunohistoquímica para COX-2 e VEGF.
45
6 ARTIGO I – O USO TÓPICO CONTÍNUO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia
sidoides Cham. INDUZ RESPOSTA INFLAMATÓRIA CUTÂNEA, MAS NÃO
RETARDA O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
Topical continuous use of Lippia sidoides Cham. essential oil induces cutaneous
inflammatory response, but does not delay wound healing process
(O uso tópico contínuo do óleo essencial de Lippia sidoides Cham. induz resposta
inflamatória cutânea, mas não retarda o processo de cicatrização)
Artigo submetido ao periódico Journal of Ethnopharmacology
Maria Liduína Maia de Oliveiraa, Belise Maria Oliveira Bezerra
a, Luana Oliveira Leite
a,
Virgínia Cláudia Carneiro Girãob, Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro
a,*
aPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade
Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
bDepartamento de Morfologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil
*Corresponding author: Tel: +55 85 32270804; Fax: + 55 85 31019840.
E-mail address: [email protected] (D.C.S. Nunes-Pinheiro)
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Topical continuous use of Lippia sidoides Cham. essential oil induces cutaneous
inflammatory response, but does not delay wound healing process
Graphical abstract
Abstract
Ethnopharmacological relevance: The essential oil of Lippia sidoides (EOLS) has been used
in Brazilian folk medicine as a topical antiseptic agent in skin for treatment of wounds and
superficial infections of the body. The aim of this study was to investigate the effects of EOLS
on intact and damaged skin, including its action on healing full-thickness cutaneous lesions in
vivo.
Material and methods: EOLS was analyzed chemically and used at different concentrations
to dose-response experiments in skin mice. Skin irritation tests by one-dosage and multiple-
47
dosages and irritation to damaged skin were assessed by macroscopy, morphometry and
histological analysis. To evaluate the effects of EOLS on wound healing, excision wounds
were surgically created on the dorsum of rats, and the ointments at 6% and 12% were applied
daily to the wound area. Cutaneous lesions were assessed by planimetric (wound contraction)
and macroscopic parameters.
Results: Skin irritation tests showed that topical application of EOLS promoted cutaneous
inflammation in a concentration-dependent manner, which was demonstrated by increase of
skin thickness and formation of cutaneous edema and erythema. Topical administration of
EOLS in high concentrations presented an irritant response to skin, but this irritation is lighter
when low concentrations this oil were used. Histological evaluation supported the outcome of
these models, which revealed accentuated presence of inflammatory cells infiltration. In
wound healing process, the lesions treated with EOLS showed intense edema and exsudation
up to day 5, but there were not significant differences in the wound contraction on days 14
and 21.
Conclusion: The continuous application of EOLS in adequate concentrations on cutaneous
wounds increases inflammatory response without delay the lesions closure. The association of
these results with antimicrobial action previously related to EOLS allows its indication as an
alternative therapeutic modality for topical treatment of infected cutaneous wound.
Keywords: Lippia sidoides; Verbenaceae; essential oil; inflammation; wound healing; skin
1 Introduction
As the primary interface between the body and the environment, the skin provides a
first line of defense against infection, trauma, or injury. Upon skin injury, a series of events
take place aiming at the reconstruction of the wounded and cutaneous homeostasis
maintenance (Bangert et al., 2011). Wound repair is a natural process of regenerating tissue
with multiple pathways, which are immediately activated after an injurious stimulus and can
be divided into three overlapping phases: inflammation, proliferation or granulation tissue
formation, and tissue remodeling (Velnar et al., 2009). During the inflammatory phase,
leukocyte cells play a key role in protecting the tissue against infections through
phagocytosis, the antibacterial effects of oxygen radicals, and the activation of complement
(Rock et al., 2010). In general, this response is a beneficial event that leads to removal of the
48
offending factor, repair the damage, and then the recruited cells need to be removed
themselves with resolution of inflammation (Widgerow, 2011).
In inflammatory and wound healing processes, several medicinal plants and their
diverse biological compounds such as terpenes, phenols, lignols and essential oils have been
traditionally used to inhibit or accelerate these events, respectively (Monteiro et al., 2007;
Cavalcanti et al., 2012; Riella et al., 2012; Veras et al., 2013). Lippia sidoides Cham.
(Verbenaceae) is a native aromatic bush from semiarid areas of the northeast Brazil, popularly
known as “alecrim-pimenta” (Matos, 2007). Essential oil obtained from its leaves presented
high concentration of thymol and exhibits multiple biological activities, including
antimicrobial (Bertini et al., 2005; Fontenelle et al., 2007; Veras et al., 2012), antioxidant,
gastroprotective and topical anti-inflammatory (Monteiro et al., 2007; Veras et al., 2013), and
oral antiseptic (Girão et al., 2003; Botelho et al., 2009). In northeastern Brazil, pharmaceutical
formulations from the essential oil of L. sidoides (EOLS) have been available by programs of
herbal medicine in primary health care to treat cutaneous wounds and superficial infections in
people served at regional hospitals (Matos, 2002), which make the skin a common target to
pharmacologic actions of this plant.
Despite topical acute anti-inflammatory (Monteiro et al., 2007; Veras et al., 2013)
and chronic inflammatory effects recently attributed to OELS (Veras et al., 2013), its safe and
continuous use on skin in different physiologic conditions, including the use in open
cutaneous wound was not reported. Thus, the aim of this work was to evaluate the effects of
topical application of EOLS on intact and damaged skin, including its action on wound
healing process in experimental models.
2 Material and methods
2.1 Plant material and chemical analysis
EOLS was purchased commercially from Technological Development Center
(PADETEC) of the Federal University of Ceará. The chemical composition of EOLS was
determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry, using a Shimadzu 5050
GCMS-QP instrument under the following conditions-column: W Scientific DB-5MS fused
silica capillary column (50 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 mL/min); injector temperature: 250
°C; detector temperature: 200 °C; column temperature: 35-180 °C at 4 °C/min and then 250
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°C/15 min; mass spectrum: electronic impact 70 eV. The identification of the constituents was
performed by a computer-based library search, retention indices and visual interpretation of the
mass spectra (Alencar et al., 1984; Adam, 1989).
2.2 Experimental animals
Male Swiss albino mice (25-30 g) and male Wistar rats (150-180 g) were used in the
study. Animals were individually housed in polypropylene cages under standard experimental
conditions of humidity (40-45%), temperature (23-25 °C), 12 h light/dark cycle and fed on
normal pellet diet and water ad libitum. All experimental protocols were approved by Ethics
Committee for Use of Animals of the State University of Ceará (protocol n° 10340180-6/2010).
2.3 Skin irritation tests
Skin irritation tests were performed as previously described procedure (Jia et al.,
2008) with some modifications. Swiss mice were shaved on the dorsal surface of the body,
and then were left under close observation for 24 h in order to ascertain no abnormal skin
responses. The shaved animals were randomly allocated into fifteen groups (n=6/group), that
received EOLS (10 L) at 100% (in nature EOLS), 50%, 25% and 12% (v/v) in mineral oil
(control group), applied topically in skin nude area of about 1 cm2, as following:
2.3.1. One-dosage irritation to healthy skin. Mice were treated with EOLS at
different concentrations in a single dose.
2.3.2. Multiple-dosages irritation to healthy skin. Mice were repeatedly treated with
EOLS at different concentrations, once per day, for consecutive 7 days.
2.3.3. Irritation to damaged skin. Mice skin abrasion was made using a scalpel blade
until the presence of the noticeable tissue fluid, but not blood. The animals were treated with
EOLS in a dose (10 L) fractionated three times a day for one day.
Dermal reactions to the skin challenge, including edema and erythema, were
evaluated by macroscopic examination daily for 7 consecutive days. Scoring method for skin
irritation was performed as follows: 1-absent; 2-light; 3-moderate; 4-intense. Skin thicknesses
were measured before and after application of treatments, every 24 h, using a micrometer
(MMD IP54). On day 7, the animals were euthanized and skin samples were removed for
histological evaluation.
50
2.4 Histological analysis
Skin sample were fixed in 10% neutral buffered formalin and were embedded in
paraffin wax by usual histological processing. Five-micrometer sections were cut and stained
with hematoxylin-eosin. A representative area was selected for descriptive light microscopic
analysis (Nikon, Tokyo, Japan) at 400x magnification.
2.5 Wound healing evaluation
Excision wound model was used to evaluate the effects of EOLS on wound healing.
Wistar rats were anesthetized with an intraperitoneal injection of xylazine (5 mg/kg) and
ketamine (80 mg/kg) (Sadigh-Eteghad et al., 2013). The dorsal surface of each animal was
shaved and area was disinfected with povidone-iodine. Then, an area approximately 4 cm2
was delimited on the dorsal medial line, and one full-thickness wound was created with sterile
surgical blade and scissors as previously described (Magalhães et al., 2008).
The animals were randomly divided into five groups (n=6/group). Test group was
treated with EOLS ointment 6% and 12% (v/w). Control groups received ointment vehicle
(vaseline and lanolin-1:2) or 0.9% saline. Reference group was treated with 5% clostebol
acetate and neomycin sulphate cream. The treatments were applied topically once a day, starting
from the wound induction until complete healing in enough quantity to cover all wounds. The
wounds were left undressed to the open environment and observed daily (Oliveira et al., 2010).
Inflammatory parameters, edema and exudation, were monitored by macroscopic examination
and graded on a four-point scale: 1-absent; 2-light; 3-moderate; 4-intense.
Planimetrical analysis was performed on days 0, 3, 7, 14 and 21 on anesthetized
animals. The contraction rate was assessed by tracing the raw wound on each evaluation day
using transparency paper and a permanent marker. The wound area and one piece of
millimeter paper with known area (1 cm2) were digitalized using a scanner (Hewlett-Packard,
Palo Alto, CA, USA). The measuring wound area was obtained with images analyses as
previously described (Oliveira et al., 2010). Thus, the unhealed wound area and the
percentage of wound contraction were calculated as reduction of initial wound size and used
for statistical analysis.
51
2.6 Statistical analysis
Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5.0 software (San Diego,
CA, USA). The comparison between groups was carried out by ANOVA followed by
Student-Newman-Keuls test. The analysis of the inflammatory parameters was performed by
Kruskal-Wallis test, followed by Dunn test. Results were expressed as mean±standard
deviation (SD) and values of p<0.05 were considered as statistically significant
3 Results
The chemical analysis of EOLS is displayed in Table 1. The main constituent was
thymol, but other minor constituents were also identified.
The results of skin irritation tests showed that topical application of EOLS promoted
cutaneous inflammation in a concentration-dependent manner (Fig. 1).
In one-dosage irritation to healthy skin model, EOLS 100% increased skin thickness
(p<0.05) throughout the study (Fig. 1A). Cutaneous edema and erythema were more intense
in mice treated with EOLS 100% in comparison to the control group on day 3 (Fig. 2). On day
7, it was observed epidermal discontinuity and moderate polymorphonuclear cells infiltration
(Fig. 3A).
In multiple-dosages irritation to healthy skin model, EOLS 100% treated group
revealed intense inflammatory parameters in cutaneous tissue on day 3 (Fig. 2). From day 5,
this group showed diminished skin thickness when compared to EOLS 50% treated group
(p<0.05), which induced higher skin thickness on day 7 (p<0.05) (Fig. 1B). In histological
evaluation, it was verified the presence of ulcer and moderate inflammatory cells infiltration
in EOLS 100% treated group (Fig. 3B).
In irritation to damaged skin model, the cutaneous thickness was higher in EOLS
25% and 12% treated groups in relation to the other groups up to day 4 (p<0.05) (Fig. 1C). On
day 3, skin erythema and edema were more intense in EOLS 50% and 25% treated groups,
respectively, as compared to control group (Fig. 2). On the other hand, the skin peeling was
more intense from day 3 post-treatment with EOLS 100%, which increased progressively
during the study. On day 7, it was verified intense inflammatory cells infiltration and
fibroblast proliferation in EOLS 100% treated group (Fig. 3C), while the group that received
EOLS 50% presented intense epidermal thickening with keratinocytes proliferation (Fig. 3D),
52
which can have contributed to higher skin thickness observed in this group at the end of
experiment (Fig. 1C).
When the wounds were induced experimentally, the lesions appeared clean and free
of exudate throughout the study in all groups, except in groups treated with EOLS. In these
groups, it was observed intense edema and exudation on wounds up to day 5. Despite the
presence of edema in all groups on day 3, except in saline 0.9% control group, this
inflammatory parameter was more intense and noticeable in animals treated with EOLS (Fig.
4); however, EOLS ointments promoted healing. Table 2 shows the reduction in wound area
in the different groups over the 21-day study period. The wound areas decreased in all groups
compared with the initial wound size, but no significant differences were verified in the wound
contraction on days 14 and 21 (p>0.05).
4 Discussion
In folk medicine of northeast Brazil, EOLS has been used as antiseptic agent for local
use in skin (Matos, 2002). This oil presents thymol and others phenolic compounds, which are
effective biological molecules when used in appropriate manner. Although the bioactive
constituents of EOLS substantiate their use as the wound healing agent (Cavalcanti et al.,
2012; Riella et al., 2012), they are nonselective in their action and can cause damage to host
cells. Consequently, inadequate use might cause skin damage and interfere with or prevent
healing (Chang et al., 2000). In the present study, we investigated the effects of continuous
topical administration of EOLS on intact and damaged skin, in order to evaluate safety of
EOLS on cutaneous tissues.
Data present here indicate that OELS in high concentrations, mainly when it was used
in nature, showed irritant effects on mice skin, which were demonstrated by increase cutaneous
thickness, edema and erythema formation, loss of skin hydration and elasticity. On the other
hand, in low concentrations (12%), irritant effects of EOLS on the mice skin, after seven days
of treatment, were limited to discrete erythema and edema, and the skin response was estimated
as light irritation. Although not indicated using pure essential oils on the skin, it must be
considered that there may be improper use (Vigan, 2010). However, essential oils are used in a
12% concentration to treat skin wounds, excoriations and infections (Kerr, 2002). The skin is an
immune-competent organ capable of rapid response to chemical and physical injuries by
mounting an inflammatory response that prevents damage and restore tissue function (Bangert
53
et al., 2011). In this context, the results of the current study show that an increased cellular
infiltration was observed on histological analysis in EOLS treated skin, which may be due to
increased induction of chemotactic molecules, which might have attracted inflammatory cells
towards the wound site and intensified the inflammatory response.
Considering that relative skin irritancy in response to the topical treatment may play
a role to delay or impair the wound healing (Jia et al., 2008), an issue addressed in this study
was determining the effect of EOLS ointments on excision wound healing and evaluating
their therapeutic action for topical application. Wound repair is a dynamic and complex
process that requires inflammatory reaction and formation of new tissue to heal the lesion. In
inflammatory phase, soluble mediators increase vascular permeability, leading to fluid
extravasations that result in edema, and attract inflammatory cells, facilitating the adhesion to
the endothelium and transmigration, which result in tissue exudation (Velnar et al., 2009). A
successful inflammatory response is characterized by clearance of injurious stimuli and
restoration of tissue normal physiology with resolution of process. However, when this event
is not controlled, the exaggerated inflammation is a common factor that contributes to matrix
destruction, cellular senescence, and tissue nonhealing (Rajakariar et al., 2006; Widgerow,
2011). In our study, we found that EOLS at 6% and 12% accentuated the inflammatory
response by edema and exudation formation, but does not delay wound closure and promoted
healing in rat skin. Despite topical anti-inflammatory activity of EOLS in acute edema model,
the repeated use of both EOLS and its major constituent, thymol, induced pro-inflammatory
effect and cutaneous damage, suggesting that the use this oil must be limited mainly in
chronic treatment (Veras et al., 2013). On the other hand, thymol has been related as a
promising compound to be used in treatment of inflammatory processes as well as wound
healing, once it reduced the edema and diminished the influx of leukocytes to the injured area
(Riella et al., 2012).
We and other researchers believed that the anti-inflammation is the first step in the
wound healing and this effect can play a direct role in facilitating the fast healing (Jia et al.,
2008; Oliveira et al., 2010; Riella et al., 2012). However, a prolonged inflammatory response
can be beneficial when it does not cause tissues damage and there is the need to eliminate
excessive potential pathogens (Rock et al., 2010; Widgerow, 2011). In other words, the
remarkable inflammatory response and normal wound closure promoted by OELS in this
study associated with its previous potential antimicrobial activity (Bertini et al., 2005;
Fontenelle et al., 2007; Veras et al., 2012) can be responsible for the inhibition of superficial
54
infections of the damaged skin. Moreover, considering that wound infection is likely the most
common cause for deficient wound healing, the efficiency of EOLS in eradiation of the
potential pathogenic microorganisms after injury can played an essential role in controlling
the morbidity in patients suffering from skin wounds, such as diabetic foot ulcers in humans
and traumatic ulcers in domestic animals.
5 Conclusion
In summary, we provided evidence that adequate use of EOLS has positive effects on
dermal irritation response and wound healing. EOLS revealed an irritant response to skin
when applied topically in high concentrations; however this irritation was light when OELS
was used in low concentrations, suggesting that the dose of EOLS should be controlled for
external use. In relation to wound repair process, continuous use of EOLS in adjusted
concentrations amplifies the inflammatory response, but does not delay the cutaneous lesions
closure. Take together, the antimicrobial action previously related and exacerbation of
inflammatory response during wound healing verified in our study, we suggest that the EOLS
in adequate concentrations can be used topically as an alternative therapeutic modality for
treatment of infected cutaneous wound. However, further cellular and molecular studies of
tissue response to OELS should be carried out before to obtain conclusions more accurate
regarding these heath benefits.
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57
Table 1. Percentage composition of EOLS obtained by gas chromatography/mass
spectrometry.
Constituents Yield (%)
Myrcene 2.12
α-Terpinene 0.50
p-Cymene 7.51
γ-Terpinene 0.80
Thymol methyl ether 1.45
Thymol 70.97
Carvacrol 0.30
Eugenol 0.11
Caryophyllene 8.30
Caryophyllene oxide 1.59
Others constituents 6.35
58
Table 2. Effects of essential oil of L. sidoides (EOLS) on wound contraction by excision
wound model.
Day Unhealed wound area (mm
2) and wound contraction (%)
EOLS 6% EOLS 12% Vehicle Reference Saline 0.9%
0 432.95±39.53a 488.38±52.91
a 422.08±76.47
a 464.08±53.10
a 449.15±67.23
a
3 503.90±58.39a
539.90±52.26a 456.08±68.45
ab 511.93±42.48
a 406.20±69.05
b
7 308.52±44.40
ab
(28.50±9.75)AB
386.90±41.55a
(20.36±8.83)A
237.70±46.84b
(43.12±10.53)B
310.63±65.86ab
(33.02±13.75)AB
269.48±60.62b
(39.44±13.61)AB
14 72.47±8.73
ab
(82.99±3.81)A
89.14±26.24a
(81.42±6.12)A
58.38±16.03b
(85.62±5.04)A
86.02±19.30ab
(81.45±3.65)A
58.52±12.30b
(86.95±2.09)A
21 24.67±5.75
a
(94.18±1.97)A
30.26±19.69a
(93.88±3.89)A
9.84±13.95a
(97.29±4.11)A
28.33±16.15a
(93.84±3.48)A
17.10±8.50a
(96.17±1.82)A
Results are expressed as means±S.D. (n=6).
Different small letters within the same line indicate significant difference of unhealed wound
area among groups (p<0.05). Different capital letters within the same line indicate significant
difference of wound contraction among groups (p<0.05).
59
(A)
a
a
ab
a
a
ab c
a
b
c
a
c
b
b
a
b
b b
a
b
b
b
a
b
b
b b
b b
c c
c b
b b
(B)
b
a
c
bc
bc
a
a
a
b
b
a
b
a
b
b
a
d
ab
b
c
a
c
a a
b
ab
c
b
a
ab
b
c
a a
ab
(C)
b
ab
a ab
ab
b
b
b
c
a
a
a
b
a
a
a
a
ab
c
ab
a
b
a
a a
a
b
ab
c
ab
b
c
a
a
a
Fig. 1. Effect of topical
treatment with essential oil
of L. sidoides (EOLS) at
different concentrations in
skin irritation models: (A)
one-dosage irritation to
healthy skin; (B) multiple-
dosage irritation to healthy
skin; (C) irritation to
damaged skin. Different
small letters on the same
day indicate significant
differences of skin
thickness among groups
(p<0.05). Results are
expressed as means±S.D.
(n=6).
60
Fig. 2. Evaluation scores on the skin irritation response of Swiss mice to the application of
essential oil of L. sidoides (EOLS) at different concentrations in three models: (I) one-dosage
irritation to healthy skin; (II) multiple-dosage irritation to healthy skin; (III) irritation to
damaged skin. (A) edema and (B) erythema scores were obtained on day 3 time course.
Different small letters indicate significant difference of inflammatory parameters among
groups per skin irritation model (p<0.05). Results are expressed as means±S.D. (n=6).
a
ab
ab
ab
b
a ab
ab ab
b
ab ab
a ab
b
a
ab
ab ab
b
a
ab ab
ab
b
a
ab
ab
b
ab
(A) (B)
61
Fig. 3. Skin sections in the group treated with EOLS 100% (A, B and C) and EOLS 50% (D)
on day 7 in different skin irritation models: (A) one-dosage irritation to healthy skin; (B)
multiple-dosage irritation to healthy skin; (C) and (D) irritation to damaged skin. (a)
epidermal discontinuity; (b) inflammatory cells infiltration; (c) ulcer; (d) fibroblast
proliferation; (e) epidermal thickening with keratinocytes proliferation. Haematoxylin and
eosin staining. Original magnification: 200x. Scale bar: 100 μm.
62
Fig. 4. Wound severity scores for lesions treated with essential oil of L. sidoides (EOLS)
ointments in excision wound model. (A) edema and (B) exudation scores were assessed on
days 1-3 and days 1-5, respectively. Different small letters indicate significant difference of
inflammatory parameters among groups per evaluation day (p<0.05). Results are expressed as
means±S.D. (n=6).
(A) (B)
ab
a
ab
b b
a
a
ab
b
b
a
a
b b b
b b
b
a
a
63
7 ARTIGO II – POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO TÓPICO DO ÓLEO DE
SEMENTE DE ABÓBORA (Cucurbita pepo L.) SOBRE A INFLAMAÇÃO CUTÂNEA
AGUDA E CRÔNICA EM CAMUNDONGOS
Topical anti-inflammatory potential of pumpkin (Cucurbita pepo L.) seed oil on acute
and chronic skin inflammation in mice
(Potencial anti-inflamatório tópico do óleo de semente de abóbora (Cucurbita pepo L.) sobre
a inflamação cutânea aguda e crônica em camundongos)
Artigo publicado no periódico Acta Scientiae Veterinariae
(v. 41, pub. 1168, 2013)
Maria Liduína Maia de Oliveira1; Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro
1, Belise Maria Oliveira
Bezerra1, Luana Oliveira Leite
1, Adriana Rocha Tomé
2, Virginia Cláudia Carneiro Girão
3
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Faculdade de Veterinária,
Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil
2Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brazil
3Departamento de Morfologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará (UFC),
Fortaleza, CE, Brazil
*Corresponding author: M.L.M. Oliveira [[email protected] - Tel.: +55 (85) 3101-9860]. PPGCV,
Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE). Avenida Paranjana nº 1700,
Campus do Itaperi, CEP 60740-903, Fortaleza, CE, Brazil.
64
Topical anti-inflammatory potential of pumpkin (Cucurbita pepo L.) seed oil on acute
and chronic skin inflammation in mice
GRAPHICAL ABSTRACT
ABSTRACT
Background: Inflammation is an adaptive response that is triggered by noxious stimuli and
conditions, which involves interactions amongst many cell types and mediators, and underlies
many pathological process. Unsaturated fatty acids (UFAs) can influence inflammation
through a variety of mechanisms, and have been indicated as alternative anti-inflammatory
agents to treat several inflammatory skin disorders. Pumpkin seed oil (PSO) is rich in UFAs,
but its topical anti-inflammatory properties have not been investigated. Therefore, the aim of
this paper was to evaluate the effects of PSO on acute and chronic cutaneous inflammation
experimental models.
65
Materials, Methods & Results: PSO was purchased commercially and analyzed
phytochemically. The topical anti-inflammatory activity of PSO at different concentrations
was evaluated on acute models (xylene- and 12-O-tetradecanoylphorbol acetate (TPA)-
induced ear edema) and chronic model (multiple applications of oxazolone-induced
dermatitis) in mice. Indomethacin and dexamethasone were used as reference drugs. The ear
swelling was measured in both ear thickness (µm) and weight tissue (mg) at 1 and 4 h after
xylene and TPA application, respectively. In the chronic model, the effectiveness of
treatments was measured each 24 h post-challenge with oxazolone for 4 days. At the end of
experiments, ear biopsies were assessed by histological analysis on hematoxylin-eosin- and
toluidine blue-stained slides. Data were submitted to ANOVA followed Student Newman
Keuls test (P < 0.05). PSO was characterized by a high content of unsaturated fatty acids
(UFAs) (79.80%), including linoleic acid (ω-6, 55.83%) and oleic acid (ω-9, 23.47%). PSO
caused a dose-dependent inhibition of xylene and TPA-induced ear edema in both skin
thickness and weight when compared to respective positive controls (P < 0.05). This anti-
inflammatory effects was maximum when PSO was applied in nature (inhibition of
69.9±2.8% and 78.1±7.7% for inflammation induced by xylene and TPA, respectively; P <
0.05), and was similar to, at least, one drug reference (P < 0.05). In addition, the topical
treatment with PSO caused the inhibition of inflammation-induced by oxazolone in
60.9±9.8% when compared to control positive (P < 0.05), which was similar to
dexamethasone (68.7±8.1%, P < 0.05). In histological analysis, PSO reduced the
inflammatory parameters (edema, congestion, epidermal hyperplasia and cellular infiltration)
in inflammation models studied. However, the number of mastocytes in cell infiltration was
reduced (17.6±4.0) when compared to positive control (39.4±5.8 cells) in chronic model (P <
0.05), but no differences were observed in acute models.
Discussion: Topical anti-inflammatory activity of plant-originated substances can be
evaluated in several experimental models. In this study, we used as phlogistic agents: xylene,
a promoter of neurogenic inflammation; TPA, a phorbol ester that activate protein kinase C,
leading to production of lipid-derived mediators; and oxazolone, an inductor of contact
delayed-type hypersensitivity. Our results suggest that PSO alter inflammatory response via
modulation of cellular and molecular mediators involved in inflammatory pathways activated
by theses phlogistic agents. In addition, this oil was able to resolve a persistent inflammatory
lesion similar to dexamethasone, but we did not observe any cutaneous alterations caused by
its topical use as related for corticosteroids. This is the first report on topical anti-
66
inflammatory potential of PSO in acute and chronic skin inflammation. This activity may be
attributed the proper balance of -6 and -9 UFAs present in PSO, suggesting this oil as
alternative therapy for the treatment of inflammatory skin diseases. Further investigations are
needed to support its application in clinical practice.
Keywords: Vegetable oils, unsaturated fatty acids, pumpkin, topical inflammation, skin
disorders.
INTRODUCTION
Inflammation is a normal defense mechanism that protects the host from infection and
other insults. It involves interactions amongst many cell types and chemical mediators for
restoring homeostasis [13]. These mediators include lipid-derived mediators, peptide
mediators, enzymes, and adhesion molecules, depending upon the cell type involved and the
nature of the injurious stimulus [3,10,15]. However, when produced in an unregulated
fashion, they can cause damage to host tissues, leading to disease [3].
Inflammatory skin disorders can be treated with some success by pharmaceutical
agents, such as corticosteroids and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs).
However, they can frequently cause a set of undesirable side effects [31]. Because of these
risks, alternative bioactive molecules are being intensively investigated. In this scenario, fatty
acids are highlighted as important effectors and regulators molecules in the immune-
inflammatory response [18].
Unsaturated fatty acids (UFAs) are found in significant quantities in vegetable oils.
Pumpkin (Cucurbita pepo L.; Cucurbitaceae) seed oil (PSO) is extraordinarily rich in UFAs,
which represent about 84% of the total fatty acids. It is also rich in minerals and antioxidants
as tocopherols and carotenoids [20]. Despite several vegetable oils rich in UFAs have been
related as promising alternative anti-inflammatory agents on skin disorders [17,19,22],
information is not available about the anti-inflammatory properties of PSO.
The aim of the present study was to investigate the effects of PSO on acute and
chronic cutaneous inflammation models in mice, in order to verify its topical anti-
inflammatory potential.
67
MATERIALS AND METHODS
Phytochemical analysis
The oil from the seeds of pumpkin (PSO1) was purchased commercially and used for
transesterification reactions [5]. The recovered fatty acid methyl esters were analyzed by gas
chromatography coupled to mass spectrometry, using a CGC AGILENT 68650 series GC
system under the following conditions-column: Methylpolysiloxane DB-23 AGILENT capillary
column (60 m x 0.25 mm); carrier gas: He (1 mL/min); injector temperature: 250°C; detector
temperature: 280°C; column temperature: 110°C/5 min, 110-215°C at 5°C/min and then
215°C/24 min; mass spectrum: electronic impact 70 eV. The identification of the constituents
was performed by a computer-based library search, retention indices and visual interpretation of
the mass spectra [1,2].
Animals
Female Swiss mice weighing 25-30 g, obtained from Central Animal House of the
Federal University of Ceará were used for this study. Mice were housed in standard
polypropylene cages under controlled conditions of temperature (23-25°C), relative humidity
(40-45%) and 12 h light/dark cycle, with free access to commercial pellet diet and water.
Xylene and 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA)-induced acute ear edema
Ear edema was induced in mice (n=7/group) by topical application on the inner and
outer surfaces of the right ear of the following phlogistic agents: xylene2 (20 µL/ear) and 12-
O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA3) 2.5 µg/ear in acetone
2. Immediately after the
application of each phlogistic agent, the right ears were topically treated with PSO at 100%
(in nature), 50% and 25% (v/v) in acetone (20 µL/ear), vehicle (acetone, 20 µL/ear, positive
control), indomethacin4 (0.5 mg/ear) and dexamethasone
5 (0.05 mg/ear). The left ear was
considered as contralateral control and received only vehicle or saline solution (negative
control, 20 µL/ear). The ear edema was evaluated 1 h after xylene and 4 h after TPA
application [8,14,19].
Ear edema measurement
Ear thickness was measured before and after induction of the inflammatory response
using a digital micrometer. The micrometer was applied near the tip of the ear just distal to
68
the cartilaginous ridges and the thickness was recorded in µm [22]. To evaluate the ear
weight, animals were euthanized, and then both ears biopsies were removed and individually
weighed [19]. Edema was expressed as right ear thickness variation and as the weight
difference between the right and left ears. The inhibition edema percentage was calculated as
weight reduction in comparison to positive control.
Oxazolone-induced chronic dermatitis
Contact dermatitis induction was performed according to Ginner et al. [8]. Briefly,
mice (n=7/group) were sensitized by topical application of 2% solution (w/v) oxazolone3 in
acetone (50 µL) on the shaved abdomen skin for two consecutive days (days 1 and 2). On day
6, the challenge was performed by application of 2% oxazolone (30 µL) on both sides of the
mouse right ear (20 µL/ear). PSO at 100% (in nature), 50% and 25% (v/v) in acetone (20
µL/ear), vehicle (acetone, 20 µL/ear, positive control) and dexamethasone (0.05 mg/ear) were
topically applied (20 µL) to right ear 6, 24, 48, 72 and 96 h after challenge. The left ear was
considered as contralateral control (negative control). Ear thickness was measured before
treatment application each 24 h for 4 days using a digital micrometer as described above. The
final measurement (102 h after challenge) was performed immediately before the animals
were euthanized. The weight of ears were measured as described for xylene and TPA tests,
and activity was expressed as inhibition percentage referred to the positive control.
Histological analysis
Ear samples were fixed in 10% neutral buffered formalin (pH 7.0) for 48 h and then
processed by standard histological methods. Each sample was embedded in paraffin, cut into
5 µm sections and stained with hematoxylin-eosin (HE) and toluidine blue (TB). On the
cross-sections stained with HE, a representative area was selected for qualitative light
microscopic analysis at 200× magnification [22]. Mastocytes were evaluated with a
semiquantitative method on TB-stained slides in five areas randomly selected at magnification
of 400× [8].
Statistical analysis
Data were initially submitted to Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests to confirm
normal distribution and homogeneity of variance, respectively. Thereafter, multiple
comparisons were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by
69
Student Newman Keuls test. All analyses were made using GraphPad Prism 5.0 software.
Differences were considered significant at P < 0.05 and the results were expressed as means ±
SD.
RESULTS
Chemical analysis of PSO is displayed in Table 1. This oil was characterized by a high
content of UFAs (79.80%). The main fatty acids found were linoleic, oleic and palmitic acids.
In the acute models of inflammation, exposure to xylene and TPA on the ear of the
mouse resulted in marked increases in both ear thickness (Figures 1A and 2A) and tissue
weight (Figures 1B and 2B). Topical application of the vehicles (acetone or saline solution) or
PSO alone on the ear did not alter the skin thickness significantly (data not shown). However,
PSO inhibited the xylene and TPA-induced ear edema in both skin thickness and weight when
compared to respective positive controls (P < 0.05) at times 1 and 4 h, respectively. This
inhibition occurred in a dose-dependent fashion within the range of evaluated concentrations
and was similar to indomethacin and/or dexamethasone results (Figures 1 and 2). The
maximal anti-inflammatory effects of PSO were verified at concentration 100% (in nature) on
the TPA-induced ear edema model. In this model, in nature PSO reduced the ear edema in
78.71%, which was significantly higher as compared to inflammation inhibition promoted by
others phlogistic agents (Table 2).
In the chronic model of inflammation, the topical application of oxazolone to ear of
sensitized mice caused a marked inflammatory response as verified by presence of erythema,
edema and sometimes induration. Ear thickness significantly increased from 24 h and
persisted until 102 h after the challenge (Figure 3A). At the end of experimental period, it was
also observed a significant increase of ear weight (Figure 3B). The topical treatment with PSO
significantly reduced the oxazolone-induced increase in both ear thickness (Figure 3A) and
tissue weight (Figure 3B) during the period of study. In addition, this inhibition was dose-
dependent and reached its maximum 102 h after the challenge at concentration 100% (P <
0.05), showing a reduction of inflammatory response of 60.86% (Table 2).
Histological analysis of the ear tissue clearly supported the results described above.
Ears exposed to xylene and TPA applications revealed an intense dermal edema and
congestion, epidermal hyperplasia and a large number of infiltrating inflammatory cells
(Figures 4A and 4D). These findings were reduced in ear tissues of animals treated topically
70
with in nature PSO (Figures 4B and 4E) and dexamethasone (Figures 4C and 4F). Repeated
applications of oxazolone induced a slight dermal edema, intense congestion, epidermal
hyperproliferation and infiltration of leukocytes and mastocytes into the dermis (Figure 4G).
The PSO treatment as well as dexamethasone prominently reduced the keratinocyte
hyperproliferation as well as other inflammatory parameters, such as edema, congestion and
cells infiltration (Figures 4H and 4I).
Additionally, in the oxazolone-induced dermatitis model, the ears treated with in
nature PSO showed a significant reduction in number of mastocytes when compared to
positive control, but this reduction was inferior (P < 0.05) to dexamethasone (Table 3 and
Figures 5G, 5H and 5I). On the other hand, no differences were observed in the number of
mastocytes among treatment groups in xylene (Figures 5A, 5B and 5C) or TPA-induced ear
edema models (Figures 5D, 5E and 5F), except inflamed ears with TPA and treated with
dexamethasone (Table 3).
DISCUSSION
Models of topical inflammation induced by different phlogistic agents has been
extensively used as pharmacological tools for the investigation of several substances with
anti-inflammatory potential in alternative medicine. These compounds include products of
plant origin as vegetable oils, which can be useful in the treatment of inflammatory skin
disorders [7]. In the present study, we have examined the pharmacological properties of PSO
in acute and chronic skin inflammation in order to demonstrate its topical anti-inflammatory
potential.
Firstly, we studied the anti-inflammatory activity of PSO in two models of topical
acute edema. The xylene is a phlogistic agent that act on target cells in the periphery such as
mast cells, immune cells, and vascular smooth muscle via VR1 receptors, and promote
neurogenic inflammation, which is characterized by redness and warmth, swelling, and
hypersensitivity. This inflammatory response result from the release of neuropeptides from
primary sensory nerve terminals [15,21]. Another phlogistic agent, TPA is a phorbol ester
able to activate protein kinase C, which activates other enzymatic cascades in turn, such as
phospholipase A2, leading to release of arachidonic acid (AA). This signaling pathway
stimulates local inflammation with vascular permeability, edema formation and
polymorphonuclear leukocytes infiltration as consequence of the production of inflammatory
71
eicosanoids by cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) enzymes [6,7]. Many drug
classes, such as corticosteroids and NSAIDs, can modulate the acute ear edema response in
varying degrees, depending on the nature of edematogen and involved mediators [7,21]. In the
present work, we observed that the topical application of PSO was able of reducing
inflammation in xylene and TPA-induced acute ear edema in a dose-dependent fashion, and
this effect was similar to, at least, one drug reference (Figures 1 and 2). Moreover, PSO
reduced the inflammatory lesion and cellular infiltration in both acute ear edema models
(Figures 4B and 4E). Taken together, these results suggest that this oil alter inflammatory
response via modulation of cellular and molecular mediators involved in inflammatory
pathways activated by theses phlogistic agents.
A third model used in this study was the chronic skin inflammation induced by
repeated exposure to oxazolone. Skin inflammation is persistent in this model, which induces
a contact delayed-type hypersensitivity resembling human contact dermatitis. This response is
characterized by a sustained ear swelling, marked polymorphonuclear, macrophage,
mastocytes and T lymphocytes infiltration, and abundant pro-inflammatory mediators [16].
Increased skin thickening is often the first hallmark of events that occur during cutaneous
inflammation, including dermal edema, inflammatory cells infiltration and proliferation of
epidermal keratinocytes [12]. Here we verified that the topical application of PSO were active
both in the early stage and throughout the inflammatory process and decreased the ear
thickness in model of oxazolone-induced chronic dermatitis. This reduction was dose-
dependent and similar to dexamethasone results. Corticosteroids are well known to have
potent anti-inflammatory effects, however its topical use can cause intense skin atrophy, one
of the serious side effects limiting their uses for chronic skin diseases [23]. Thus, our findings
support the ability of PSO to resolve a persistent inflammatory lesion, with an efficacy
comparable to dexamethasone. In addition, we did not observe any cutaneous alterations
when PSO alone was applied to mice skin.
With an extent of activity comparable to reference drug, PSO reduced two important
events related to the skin inflammatory response induced by oxazolone: the migration of
neutrophils and the number of mastocytes, as determined by HE and TB staining,
respectively. Indeed, the accumulation of polymorphonuclear cells and mastocytes plays a
critical role in cutaneous inflammatory diseases such as contact dermatitis, and is related to
the pathological mechanism of disease [16]. Neutrophils recruitment is an essential factor in
the acute inflammatory process, acting as first-line defense cells in the initiation and
72
resolution phases of this process [11]. Another immune cell, the mastocytes act as important
sentinels in the skin, helping to limit or even prevent the damage that results from injurious
agent due to release of various biochemical mediators [25]. Under condition in which
uncontrolled infiltration of these cells occurs, they can become the main aggressor factor and
have pathological role [11,25]. Thus, our results directly illustrate the inhibitory effects of
PSO on neutrophils and mastocytes within the target tissue, providing further evidence that
PSO ameliorates oxazolone-induced contact dermatitis and indicating the therapeutic effect of
this oil for chronic skin disorders.
With respect to this study, for the first time, we demonstrate the topical anti-
inflammatory potential of PSO in acute and chronic skin inflammation. Altogether, we
believed that the results evidenced here may be attributed the promising ratio of -6 and -9
UFAs (2:1) present in PSO, namely linoleic and oleic acids (Table 1).
Fatty acids are a diverse set of molecules that act as cell membranes constituents, gene
expression regulators, signal transduction modifiers and cell proliferation, generating products
that modulate a variety of biological mechanisms, including those linked to homeostasis,
immune responsiveness, and inflammation [9]. These bioactive molecules have shown to be
potential anti-inflammatory agents due, at least in part, to their ability to inhibit enzymes that
modulate the production of AA metabolites, or produce anti-inflammatory eicosanoids [4]. In
this context, linoleic and oleic acids have been reported to modulate the skin immune-
inflammatory responses [4,10,18]. These previous findings are consistent with our results,
which we suggest that the proper balance of these UFAs present in PSO can have a great
importance in modulation of different inflammatory signaling according to injurious stimulus.
In recent years, plant-derived natural products have become known for its beneficial
effects on inflammatory response [12,14,24]. Amongst the natural products as rich source of
UFAs, the vegetable oils have been indicated as alternative therapy for treat skin inflammatory
process [17,18]. Previously, we reported that Caryocar coriaceum oil (-6:-9 / 1:24),
inhibited the xylene-induced ear edema, but this inhibition was twice less effective compared to
the current study [19]. In other study, this same oil demonstrated significant topical
antiedematous effect against croton oil, but did not present significant reduction on capsaicin-
induced ear neurogenic inflammation [22]. Here we verified that PSO showed topical anti-
inflammatory activity similar to reference drugs that inhibit the production of eicosanoids via
modulation of phospholipase A2, COX and LOX enzymes [7,23], suggesting that this finding
may be focused for future studies aiming to unravel mechanism of action of PSO.
73
In conclusion, this study represents the first report that PSO acts as a topical anti-
inflammatory agent, and it is effective against acute and chronic skin inflammatory processes.
The anti-inflammatory activity of PSO may be attributed to promising proportions of ω-6 and
ω-9 UFAs present in it, due to either their individual activity or the synergistic effect of these
bioactive molecules. Together, these finding suggest that PSO may be an important
alternative therapy for the treatment of inflammatory skin diseases, such as psoriasis, contact
dermatitis and atopic dermatitis. Nevertheless, further investigations need to be performed to
determine the precise mechanism of action and support its application in clinical practice.
SOURCES AND MANUFACTURERS
1Vital Âtman, Uchoa, SP, Brazil.
2Dinâmica Química, Diadema, SP, Brazil.
3Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.
4Merck Sharp & Dohme, Cramlington, Northumberland, UK.
5EMS, Hortolândia, SP, Brazil.
Acknowledgements. The authors would like to thank the Vital Âtman for providing the
pumpkin seed oil and phytochemical analysis, and Laboratório de Manipulação de Oócitos e
Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA/UECE) for support with histological photomicrographs.
Ethical approval. Experimental protocols were approved by the Ethics Committee for Use of
Animals of the State University of Ceará, under number 103401806-49.
Declaration of interest. The authors declare no conflicts of interest.
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and wound healing activities of the fixed oil of Caryocar coriaceum Wittm. seeds. Journal of
Ethnopharmacology. 129(2): 214-219.
20 Procida G., Stancher B., Cateni F. & Zacchigna M. 2013. Chemical composition and
functional characterization of commercial pumpkin seed oil. Journal of the Science of Food
Agriculture. 93(5): 1035-1041.
21 Richardson J.D. & Vasko M.R. 2002. Cellular mechanisms of neurogenic inflammation.
The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 302(3): 839-845.
22 Saraiva R.A., Araruna M.K.A., Oliveira R.C., Menezes K.D.P., Leite G.O., Kerntopf
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Topical anti-inflammatory effect of Caryocar coriaceum Wittm. (Caryocaraceae) fruit pulp
fixed oil on mice ear edema induced by different irritant agents. Journal of
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23 Schoepe S., Schacke H., May E. & Asadullah K. 2006. Glucocorticoid therapy-induced
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25 Voehringer D. 2013. Protective and pathological roles of mast cells and basophils. Nature
Reviews Immunology. 13(5): 362-375.
76
Table 1. Fatty acids composition of PSO obtained by gas chromatography/mass spectrometry.
Fatty acids Yield (% m/m)
Saturated fatty acids 20.20%
Palmitic acid (C16:0) 12.87
Stearic acid (C18:0) 6.24
Others 1.09
Unsaturated fatty acids 79.80%
Oleic acid (C18:1; -9) 23.47
Linoleic acid (C18:2; -6) 55.83
Linolenic acid C18:3; -3) 0.21
Others 0.29
77
Table 2. Topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drugs in
acute and chronic models of inflammation at the end of the experimental period.
Treatment groups
Inflammation inhibition (%)
Phlogistic agent
Xylene TPA Oxazolone
PSO 100% (in nature) 69.61±2.79a 78.71±7.70
b 60.86±9.81
c
PSO 50% 56.54±4.81a 70.89±5.79
b 32.81±7.32
c
PSO 25% 49.57±7.52a 69.02±6.12
b 28.90±6.90
c
Indomethacin 51.00±12.08a 84.11±5.86
b -
Dexamethasone 65.07±8.98a 88.44±6.60
b 68.69±8.10
a
Results are expressed as means ± SD (n = 7) of ears weight reduction in relation to the
positive control of each model. Different superscripts letters within the same line indicate
statistically significant difference among different inflammation models (P < 0.05).
78
Table 3. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and reference drug on absolute number of
mastocytes in acute and chronic models of inflammation.
Treatment groups
Number of mastocytes
Phlogistic agent
Xylene TPA Oxazolone
Positive control 14.40±3.05a 18.80±3.56
a 39.40±5.81
a
PSO (in nature) 12.80±2.68a 16.20±2.95
a 17.60±4.04
b
Dexamethasone 12.00±3.16a 11.80±2.59
b 11.40±2.97
c
Negative control 8.00±1.58b 8.00±1.58
c 8.00±1.58
c
Results are expressed as means ± SD (n = 5) of mastocytes counting in five fields on toluidine
blue-stained slides. Different superscripts letters within the same column indicate statistically
significant differences among groups (P < 0.05).
79
Figure 1. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and
dexamethasone (Dexa) on xylene (Xyl)-induced ear edema in mice. Ear edema was measured
at 1 h after induction of inflammation in both ear thickness (A) and tissue weight (B). The
positive control only received acetone topically after the challenge with xylene. The bars
represent the mean ± SD for seven animals. Different small letters indicate statistically
significant differences among groups (P < 0.05).
a
b
bc
c c
bc
a
b
cd
c c
bd
(A)
(B)
80
Figure 2. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO), indomethacin (Indo) and
dexamethasone (Dexa) on TPA-induced ear edema in mice. Ear edema was measured at 4 h
after induction of inflammation in both ear thickness (A) and tissue weight (B). The positive
control only received acetone topically after the challenge with TPA. The bars represent the
mean ± SD for seven animals. Different small letters indicate statistically significant
differences among groups (P < 0.05).
a
b
bc c
b
d
a
b bd
c c
d
(B)
(A)
81
Figure 3. Topical activity of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone (Dexa) on
oxazolone (Oxa)-induced chronic dermatitis in mice. The responsiveness of treatments was
measured in ear thickness (A) at 24, 48, 72, 96 and 102 h after challenge and just before drug
application as well as in tissue weight (B) at 102 h post-challenge. The positive control only
received acetone topically after the challenge with oxazolone. The bars represent the mean ±
SD for seven animals. Different small letters indicate statistically significant differences
among groups at different time points (P < 0.05).
a
b
c
b
c
a
b
bc
c
d
a
bd
c
d
bc
a
b
c
b
c
a
b
c
b
c
a
b
c
b
c
(A)
(B)
82
Figure 4. Histological analysis of topical anti-inflammatory effect of pumpkin seed oil (PSO)
and dexamethasone on acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E, F) and
chronic dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H, I). Photomicrograph of
transverse sections from ears collected in the last day of experiments. Generally, inflamed
ears (A, D, G) showed dermal edema, congestion, inflammatory cell infiltration with the
presence of mononuclear and polymorphonuclear cells. Treatment with in nature PSO (B, E,
H) or dexamethasone (C, F, I) reduced these inflammatory parameters. A minimum of two
section from five animals for each treatment were analyzed. HE staining. Original
magnification: 100x. Scale bar: 200 μm.
83
Figure 5. Topical effect of pumpkin seed oil (PSO) and dexamethasone on mastocytes
infiltration in acute ear edema induced by xylene (A, B, C) and TPA (D, E, F) and chronic
dermatitis induced by oxazolone multiple applications (G, H, I). Photomicrograph of
transverse sections from ears collected in the last day of experiments. In chronic model, the
treatment with in nature PSO (B, E, H) and dexamethasone (C, F, I) reduced the number of
mastocytes in inflammatory cell infiltration when compared to respective positive control (A,
D, G). A minimum of two section from five animals for each treatment were analyzed.
Toluidine-blue staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm.
84
8 ARTIGO III – ÓLEO DE SEMENTE DE ABÓBORA REDUZ A EXPRESSÃO DE
CICLOOXIGENASE-2 (COX-2) E MELHORA A EXPRESSÃO DO FATOR DE
CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA CICATRIZAÇÃO
CUTÂNEA
Pumpkin seed oil reduces the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and ameliorates
the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in cutaneous wound
healing
(Óleo de semente de abóbora reduz a expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2) e melhora a
expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) na cicatrização cutânea)
Artigo submetido ao periódico Wound Repair and Regeneration
Maria Liduína M. Oliveira, MSc1; Belise M. O. Bezerra, MSc
1; Luana O. Leite, MSc
1; Neuza F.
G. Rochette, PhD2; Virginia C. C. Girão, PhD
3, Diana C. S. Nunes-Pinheiro, PhD
1
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade
Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
2Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil
3Departamento de Morfologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE,
Brazil
*Corresponding author: Tel: +55 85 32270804; Fax: + 55 85 31019840.
E-mail address: [email protected] (D.C.S. Nunes-Pinheiro)
85
Pumpkin seed oil reduces the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and ameliorates the
expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in cutaneous wound healing
GRAPHICAL ABSTRACT
ABSTRACT
Pumpkin seed oil is rich in unsaturated fatty acids (-6, -9), which are bioactive
molecules that act on generating lipid mediators involved in inflammatory responses and
tissue repair. This paper evaluated the effects of pumpkin seed oil on wound healing and the
expression of mediators, cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth factor, involved
at different phases of this process. Full-thickness wounds were induced on the dorsum of
mice, and pumpkin seed oil at different concentrations was administrated topically on lesion
area for 10 days. Skin lesions were assessed by planimetrical, histological and
immunohistochemical analyses. Treatment with pumpkin seed oil (in nature) promoted
wound healing. The rate of wound closure was higher in this group during the first seven
days, although all the wounds were completely re-epithelized irrespective of treatments on
86
day 10. Furthermore, under the same treatment, polymorphonuclear cells and
cyclooxygenase-2 expression were reduced on day 3, while an enhanced neovascularization
and vascular endothelial growth factor expression were observed on day 7. The results were
similar to reference oil treated group. Our findings have important implications for topical use
of pumpkin seed oil as a promising alternative for wound healing therapy in reparative
medicine. This is the first report of this oil as a healing agent.
Keywords: Vegetable oils, fatty acids, wound healing, COX-2, VEGF.
INTRODUCTION
Skin provides the first line of defense against microbial pathogens and traumatic
injury. After skin injury, a complex series of events must proceed for the epidermal and
dermal wound recovery and cutaneous homeostasis maintenance.1 Wound repair can be
broken down into several overlapping phases. Generally, it starts with blood clot formation,
and then progresses through the inflammation, formation of new granulation tissue,
angiogenesis and matrix remodelling. This process involves multiple cell population,
extracellular matrix components and many bioactive soluble mediators such cell adhesion
molecules, cytokines, growth factors and eicosanoids.2,3
Eicosanoids such as prostaglandins (PGs) has been reported to be involved in the
inflammatory phase of wound repair.4 PGs are formed by the combined actions of
phospholipase, which releases arachidonic acid (AA) and other fatty acid precursors from cell
membrane phospholipids, and cyclooxygenase (COX), which converts AA to PGs.5 There are
2 main enzymes in the COX pathway: COX-1 and COX-2. In general, COX-1 is
constitutively expressed in most tissues as skin and it is related with the vascular homeostasis,
while COX-2 is inducible under inflammatory stress.6,7
The expression of COX-2 in the
inflammatory phase of cutaneous wound healing has been reported in murines,8,9
dogs10
and
humans,11
thus suggesting that it plays important role during skin repair.
Angiogenesis is a crucial event for new granulation tissue formation in the
proliferative stage. This process is early stimulated by vascular endothelial growth factor
(VEGF) and other factors produced by effector cells in the wound.12
The new blood vessels
support the delivery of nutrients and inflammatory cells to the healing tissue, and facilitate the
removal of debris and deposition of the fibrin-rich matrix required for wound closure.13
87
Although great advances have been verified in the understanding of different events
that occur during tissue repair, the wound healing remains a challenging clinical problem,
which depends on an efficient wound management. In recent years, much effort has been
focused on understanding the physiology of healing and wound care with emphasis on new
therapeutic approaches.3 Previous studies have shown that unsaturated fatty acids (UFAs)
present in vegetable oils can be therapeutically used to treat cutaneous wounds.14-16
UFAs
have been reported to modulated the wound repair process17-19
by regulating cell proliferation
and signaling and through activation of growth factor and other mediators.5
Among several oleaginous plants, pumpkin (Cucurbita pepo L.; Cucurbitaceae) seeds
contain between 400 and 540 g/kg oil, which is extraordinarily rich in UFAs and represent
about 84% of the total fatty acids. It is also rich in minerals and antioxidants as tocopherols
and carotenoids and others compounds such as phytosterols.20,21
Despite of various vegetable
oils abundant in UFAs have been related to promote cutaneous cicatrization,22-25
the
therapeutic effects of pumpkin seed oil (PSO) on skin wound repair were not reported. Thus,
the aim of the present study was to investigate the effects of topical treatment with PSO on
experimentally induced cutaneous lesions in mice, in order to evaluate the expression of
mediators, COX-2 and VEGF, involved in the wound healing process.
MATERIALS AND METHODS
Chemical analysis
The oils from the seeds of pumpkin (Curcubita pepo L.) and sunflower (Helianthus
annus; reference oil) was acquired commercially from a natural products company specialized
in the production and marketing of vegetable oils extracted by cold-pressing the seeds (Vital
Âtman, Uchoa, São Paulo, Brazil).
Fatty acid methyl esters were prepared following the AOCS Official Method Ce 1-
62.26
The recovered methyl esters were analyzed by gas chromatography coupled to mass
spectrometry, using a CGC AGILENT 68650 series GC system under the following conditions-
column: Methylpolysiloxane DB-23 AGILENT capillary column (60 m x 0.25 mm); carrier
gas: He (1 mL/min); injector temperature: 250 °C; detector temperature: 280 °C; column
temperature: 110 °C/5 min, 110-215 °C at 5 °C/min and then 215 °C/24 min; mass spectrum:
electronic impact 70 eV. The identification of the constituents was performed by a computer-
based library search, retention indices and visual interpretation of the mass spectra.27
88
Animals
A total of 42 male Swiss albino mice, weighing 25-30 g, from the central vivarium of
the Federal University of Ceará were used for this study. The animals were individually
housed in clean polyethylene cages with free access to a commercial pellet diet and water ad
libitum. The animals were maintained under standard experimental conditions of relative
humidity (40-45%), room temperature (23-25 °C) and 12 h light dark cycle. The experimental
protocols were approved by Ethics Committee for Use of Animals of the State University of
Ceará, Fortaleza, Brazil (n° 103401806-49).
Wound healing evaluation
Excision wound model was used to evaluate the wound healing activity of PSO. Mice
were anesthetized with xylazine (5 mg/kg, i.p.) and ketamine (80 mg/kg, i.p.) prior to the
creation of the wounds.28
The dorsal surface of animals was shaved 48 h before surgical
intervention and shaved area was disinfected with povidone-iodine. Four full thickness of the
excision wounds of circular area were made with a 5 mm diameter punch on the dorsum of
animals, below their shoulder blades at a distance of about 2.5 cm among wounds.22
In each
animal, one wound was used for planimetry and the others three lesions were used for
histological and immunohistochemical analyses.
The animals were randomly divided into six groups (n=7/group). The test group
animals were treated (20 μL for direct application into the wound bed) with in natura PSO
and PSO at 50% (v/v) and 25% (v/v). Control groups animals received the vehicle (mineral
oil) or saline 0.9% and reference group animals were treated with in natura sunflower seed oil
(Helianthus annuus) at a dose of 20 μL per wound. The wounds were left undressed to open
environment and observed daily. The treatments were applied topically once a day every 24 h,
starting from the wound induction until complete healing. The wounding day was considered
as day 0.
Planimetry
The progressive changes in wound area were monitored by a digital photographic
camera (Sony, Tokyo, Japan). Planimetry was performed on days 0, 3, 7 and 10 on
anesthetized animals. The anesthesia protocol used to create the wounds was repeated. The
contraction rate was assessed by tracing the raw wound on each evaluation day using
transparency paper and a permanent marker. The wound area and one piece of millimeter
89
paper with known area (1 cm2) were digitalized using a scanner (Hewlett-Packard, Palo Alto,
CA, USA). The measuring area was obtained comparing the amount of pixels inside perimeter
and inside the known area using the mathematic expression: Wa=(Ka×Nw)/Nk, where Wa =
wound area, Ka = known area, Nw = number of pixels inside wound area and Nk = number of
pixels inside known area. Thus, the unhealed wound area and the percentage of wound
contraction were calculated as reduction of initial wound size on day 0 and used for statistical
analysis.22
Histology
Skin samples were isolated from different healed wounds of each group of mice on
days 3, 7 and 10 for histological examination. Tissues sample were fixed in 10% neutral
buffered formalin and were embedded in paraffin wax by usual histological processing. Five-
micrometer sections were cut and stained with hematoxylin-eosin. Sections were semi-
quantitatively assessed under the light microscope (Olympus BX51, Tokyo, Japan) at 400x
magnification and graded as absent (0), partial (1) and total (2) for epidermal recovery. Also,
the presence of edema, fibroblast proliferation, mononuclear and polymorphonuclear cells and
neovascularization in dermis were scored as following: (0) absent or normal, (1) mild, (2)
moderate and (3) intense. All histological sections were blindly evaluated by the same
investigator.
Immunohistochemistry
Immunohistochemical investigations were performed on paraffin-embedded sections
from skin tissue on days 3 or 7 for COX-2 and VEGF, respectively. Sections of 5 μm were
mounted on positive-charged glass slides and dried for 1 h at 60°C. Slides were deparaffinised
and submitted to retrieval antigen process with Dako EnVision TM FLEX Target Retrieval
Solutions High pH (Code DM828) or Low pH (Code DM829) for 20 min. at 97 °C using the
Dako pre-treatment (PT) link module (Dako, Glostrup, Denmark). Endogenous peroxidase
activity was inhibited by Peroxidase Block (Dako) for 5 minutes, and slides were subjected
either to mouse monoclonal anti-human COX-2 (clone CX-294; Dako) diluted 1:100; and
mouse monoclonal anti-human VEGF (clone VG1; Dako) diluted 1:100 and incubated for 1 h
at room temperature. The slides were then washed three times in phosphate-buffered saline
(PBS, pH=7.2) and then incubated with EnVision polymer reagent (EnVision TM + Dual
Link System/HRP; Dako) for 30 min at room temperature and finally diaminobenzidine
90
(DAB; Dako) for 10 min according to the manufacturer’s instructions (Dako Corporation,
Carpinteria, CA, USA). The sections were counterstained with Mayer’s hematoxylin for 3
min. The specificity of this immunohistochemical procedure was verified using a negative and
positive control before evaluation. For negative control purposes, a slide was treated
according to the full protocol but without the primary antibody, which was replaced by
antibody diluents. Samples from kidney and endometrium were used as positive control for
COX-2 and VEGF, respectively, according to the manufacturer’s instructions (Dako
Corporation, Carpinteria, CA, USA).
The intensity of the staining was analyzed by light microscopy (Olympus BX51,
Tokyo, Japan) at 400x magnification and scored accordingly to the following scale: (–), no
immunohistochemical staining; (+), slight positive staining, up to 15% positive cells; (++),
moderate positive staining, from 15% to 30% positive cells; and (+++), strong positive
staining with more than 30% positive cells as described previously.29
Statistical analysis
Parametric and nonparametric tests were performed using GraphPad Prism 5.0
software (San Diego, CA, USA). Unhealed wound area and wound contraction data were
initially submitted to Shapiro-Wilk and Bartlett tests to confirm normal distribution and
homogeneity of variance, respectively. Then, results were submitted to the one-way analysis
of variance (ANOVA), followed by SNK post-test for comparison of means. Histological data
were assessed by Kruskal-Wallis test. Values of p<0.05 were considered statistically
significant. Results were expressed as means±standard desviation (S.D.).
RESULTS
Chemical analysis of PSO showed similar fatty acid composition to reference oil, and
the results are presented in Table 1. The main constituents were linoleic acid (ω-6), oleic acid
(ω-9), palmitic acid and stearic acid. Other minor fatty acids as linolenic acid and palmitoleic
acid were also identified.
The effects of PSO on the wound healing in mice are shown in Figure 1, which
demonstrates the evolution of cicatrization throughout 10 days of study. The wounds
appeared clean and free of exudates throughout the study in all groups. The granulation tissue
formation was noticeable at wound edges on day 3. It was verified an enhanced wound
91
closure in PSO treated group and reference group on days 3 and 7. The measured values of
the progression of wound healing are shown in Table 2. On day 3, in natura PSO treated
group significantly decreased the lesion area when compared to the control group (p<0.05).
This effect was also observed on day 7, when this oil group showed higher wound contraction
in comparison to the other groups (p<0.05), except to reference group. On day 10, all the
lesions were completely closed and re-epithelized.
Histological parameters of cicatrization process that were evaluated and scored
throughout the study are presented in Table 3. Representative images demonstrating this
process were also added (Figure 2). On the hematoxylin-eosin staining, epithelization,
infiltration of inflammatory cells, fibroblastic and vascular proliferations were commonly
seen on all the wounds; but differentiated results were noted in PSO treated group and
reference group. The treatment with in natura PSO decreased polymorphonuclear cells
infiltration at the wound bed (p<0.05) on day 3, and increased fibroblastic activity and
vascular proliferation (p<0.05) on day 7 when compared to the control group, and this results
was equivalent to the reference group. On day 10, all the wounds were completely re-
epithelized irrespective of treatments, despite the re-epithelization capacity have already been
evidenced from day 3 in wounds treated with in natura PSO (p<0.05). Congestion and
necrosis were not observed on the wound areas during the period of study.
Immunohistochemical analysis results are summarized and displayed in Figure 3. The
wounds treated with in natura PSO presented a slight COX-2 expression in inflammatory
cells on day 3, and a moderate VEGF expression in both inflammatory and epidermal cells on
day 7, as compared to the control group. Differences in the staining intensity of COX-2 and
VEGF were not verified between lesions that received in natura PSO and reference oil.
DISCUSSION
In recent years, the search for topical new drugs and bioactive molecules that are
effective in stimulating wound healing has been intensified. In this scenario, the role of fatty
acids as effectors, mediators and regulators molecules in a variety of biological processes
including those linked to homeostasis, immune responsiveness, and inflammation is still an
object of scientific investigation. Fatty acids a diverse set of molecules that act as cell
membranes constituents, gene expression regulators, signal transduction modifiers and cell
proliferation, generating products that modulate the biological mechanisms.30
In the present
work, we investigated the role of UFAs present in PSO on modulation of the inflammatory
92
and proliferative stages of cutaneous wound healing, in order to evaluate cellular and
molecular mechanisms involved in this process.
The fatty acids composition of PSO used in our study indicated the presence of
linoleic acid (ω-6) and oleic acid (ω-9), which was similar to composition of other varieties of
pumpkin seeds employed for oil production.20,21
Linoleic and oleic acids have been previously
related to modulate the skin immune-inflammatory responses and wound repair,5,19,31,32
and
we believed that the proportion of these UFAs in PSO may exert positive effects via
regulation of molecular mediators expression during wound healing.
Wound repair is a dynamic and complex process that requires inflammatory reaction,
formation of new tissue, wound contraction and angiogenesis to heal the lesion.3 In this present
study, the topical treatment with in natura PSO stimulated a higher wound contraction, which
was confirmed by histological analysis. Among the microscopic findings, PSO induced an
enhanced proliferation of fibroblasts in the granulation tissue. These activated cells are
responsible for wound contraction and produce extracellular matrix proteins and growth factors,
which regulate the proliferative and remodeling phases of wound healing.33
In addition, PSO
presented equivalent reparative response to the reference oil used in this work, which may be
attributed to similar UFAs composition. Sunflower seed oil (H. annuus) was selected as
reference oil because it is used widely to treat skin lesions in clinical dermatology (Declair,
1997). Alternatively, the topical use of others vegetable oils rich in ω-6 and ω-9 UFAs, such as
pequi,22
sesame,23
linseed,24
and avocado25
oils, has also been reported to accelerate the
cutaneous repair process. However, when these UFAs were used separately, it was observed
that ω-9 UFA induced faster wound closure when compared to ω-3 and ω-6 UFAs.31
To understand part of the molecular mechanisms through which topical treatment with
PSO modifies the rate of the wound contraction, we investigated the immunohistochemical
staining intensity of COX-2 and VEGF on days 3 or 7, respectively. It is known that wound
healing involves induction of COX-2 expression in different mammalian species.8-11
In the
present work, despite low COX-2 expression, we did not observe significant differences in
edema induced by PSO treatment (Table 3). The COX-2 pathway is responsible for the
production of the PGs and thromboxanes from AA, whose precursor is linoleic acid.5 Some
PGs are potent vasodilators that also act synergistically with other mediators to increase
microvascular permeability and promote edema; stimulate local neovascularization, cellular
migration, fibroblastic proliferation and differentiation along with extracellular matrix
synthesis during the wound healing.4-7
However, it has been demonstrated that administration
93
of selective COX-2 inhibitor does not affect healing of cutaneous wounds.9 Considering that
oleic acid is not metabolized into AA derived metabolites19
and the high content linoleic acid
present in PSO, we suggest that the reduced COX-2 expression verified in our study can be
associated with a low production of pro-inflammatory lipid mediators in PSO treated lesions
without affect wound repair.
In contrast to declined COX-2 expression, we also verified diminished
polymorphonuclear cells infiltration in lesions treated with in natura PSO (Table 3). Previous
study have demonstrated that the accumulation of phagocytes in the inflamed area is possible
through the activation of endothelial cells and the increased expression of adhesion molecules,
which are regulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α).34
In addition, TNF-α production is
regulated by nuclear factor κB (NF-κB), which is the principal transcription factor involved in
up-regulation of others inflammatory cytokines, adhesion molecules and COX-2 genes.35
In this
context, UFAs can affect the gene expression of inflammatory mediators.32
It was previously
reported that the use of ω-3,17
ω-6 and ω-9 UFAs18
may increase pro-inflammatory cytokines
production in wound site during cicatrization process. In a more recent study, an elevated TNF-
α expression was detected in oleic acid treated cutaneous lesions.19
In contrast, a diminished
leukocyte infiltration and low COX-2 gene expression in lesions treated with this ω-9 UFA was
also verified, which were associated to an enhanced reparative response in vivo.19
Another study
reported that NF-κB activation can be mediated by linoleic acid in endothelial cells, which
increased production of TNF-α and other inflammatory mediators.36
Taken together, these
information supported the suggestion that the proportions of linoleic and oleic acids present in
PSO may down-regulate the TNF-α expression and, consequently, reduce polymorphonuclear
cells infiltration in lesions treated with this oil. Moreover, we also suggest that oleic acid may
modulate COX-2 expression in cutaneous wounds treated with PSO.
Angiogenesis is another important event that plays a central role in tissue repair.
Formation of vessels-rich granulation tissue is regulated by locally liberated potent angiogenic
factors as VEGF.12,13
VEGF is a glycoprotein that enhances vascular permeability, induces
chemotaxis and activation of monocytes/macrophages, and promotes growth of vascular
endothelial cells.12
In our work, we verified that in natura PSO treatment stimulated
neovascularization in the granulation tissue and induced a moderate VEGF expression in
inflammatory cell. Previous studies reported that ω-6 and ω-9 UFAs relatively increased
expression of VEGF and promoted higher angiogenesis in wound healing experimental
models.18,23,37
Furthermore, it is interesting to observe that VEGF is produced by multiple
94
cells in different phases of the wound repair, such as polymorphonuclear cells, macrophages,
fibroblast-like cells, and endothelial cells.38
Thus, we can assume the important role of this
mediator during the wound healing process.
In summary, the current study provides firm evidences that PSO presents wound healing
potential and highlights its underlying molecular pathways, in party by reduced COX-2
expression associated with diminished inflammatory cells infiltration as well as ameliorated
VEGF expression in skin lesions. Considering that there is an exacerbated production of
inflammatory mediators in skin inflammatory diseases, it is possible that down-regulated
expression of COX-2 may accelerate the wound healing by reducing inflammatory response.
The modulation of reparative activity may be attributed to promising proportions of ω-6 and ω-
9 UFAs present in PSO, due to either their individual activity or the synergistic effect of these
bioactive molecules. This study opens new perspectives in the use of PSO as alternative option
for topical wound healing therapy in reparative medicine. If translated to the clinic, this will
lower costs and make skin care easier. Nevertheless, further understanding of others signaling
pathways involved in this process should be provided to support its use in clinical practice.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful to Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (FUNCAP) for financial support, and to Vital Âtman
for providing
the pumpkin seed oil and chemical analysis. They also extend their thanks to Maria do
Socorro França Monte for help with histological processing, to Suzana Moreira de Souza for
assistance with the PT link module, and to Conceição da Silva Martins for
immunohistochemical techniques help.
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98
Table 1. Fatty acids composition of pumpkin seed oil (PSO) and reference oil obtained by gas
chromatography/mass spectrometry.
Constituents Yield (% m/m)
Fatty acids Structural formula PSO Reference
Saturated
Lauric acid C12:0 0.02 -
Myristic acid C14:0 0.17 0.10
Pentadecanoic acid C15:0 0.03 -
Palmitic acid C16:0 12.87 6.45
Margaric acid C17:0 0.17 0.10
Stearic acid C18:0 6.24 4.46
Arachidic acid C20:0 0.47 0.32
Behenic acid C22:0 0.13 0.88
Lignoceric acid C24:0 0.10 0.32
Mono and polyunsaturated
Palmitoleic acid C16:1 (ω-7) 0.13 0.13
Cis-10-heptadecenoic acid C17:1 ω-7) 0.07 0.07
Oleic acid C18:1 (ω-9) 23.47 32.15
Linoleic acid C18:2 (ω-6) 55.83 54.65
Linolenic acid C18:3 (ω-3) 0.21 0.08
Eicosenoic acid C20:1 (ω-9) 0.09 0.17
99
Table 2. Effect of pumpkin seed oil (PSO) on wound healing by excision wound model.
Day
Unhealed wound area (mm2) and wound contraction (%)
PSO
(in natura) PSO 50% PSO 25% Reference Vehicle Saline 0.9%
0 21.992.53a 22.862.03
a 22.301.98
a 20.212.50
a 21.642.70
a 23.441.76
a
3 10.272.37
a
(53.129.32)A
13.011.83ab
(42.808.98)AB
12.461.96ab
(43.5711.09)AB
10.032.78a
(51.108.05)A
14.111.94b
(34.339.03)B
15.032.35b
(35.988.07)B
7 1.060.43
a
(95.122.07)A
2.731.18b
(88.025.38)B
2.600.61b
(88.292.93)B
1.830.75ab
(91.202.84)AB
4.591.01c
(78.455.95)C
4.501.39c
(80.805.60)C
10 0.000.00
(100.0)
0.000.00
(100.0)
0.000.00
(100.0)
0.000.00
(100.0)
0.000.00
(100.0)
0.000.00
(100.0)
Results are expressed as means±S.D. (n=7).
Different small letters within the same line indicate significant difference of unhealed wound
area among groups (p<0.05).
Different capital letters within the same line indicate significant difference of wound
contraction among groups (p<0.05).
100
Table 3. Histological evaluation of wound healing process in different groups of treatment
per biopsy day.
Treatment groups
per biopsy day
Wound healing process
Ed PMN MNC FP NV RE
Day 3
PSO (in natura) 0.501.22a 1.670.52
a 0.170.41
a 1.500.55
a 0.670.52
a 1.331.03
a
PSO 50% 0.830.98a 2.830.41
b 0.170.41
a 0.670.52
b 0.500.55
ab 0.830.98
ab
PSO 25% 1.000.89a 2.670.52
b 0.670.82
a 0.500.55
b 0.000.00
b 0.330.82
ab
Reference 0.330.52a 2.000.71
a 0.830.75
a 1.000.63
ab 0.330.52
ab 0.600.55
ab
Vehicle 1.171.47a 3.000.00
b 0.330.52
a 0.170.41
b 0.000.00
b 0.000.00
b
Saline 0.9% 1.001.55a 2.830.41
b 0.500.84
a 0.330.52
b 0.000.00
b 0.000.00
b
Day 7
PSO (in natura) 0.000.00a 0.330.52
a 2.000.89
a 2.670.52
a 2.170.75
a 1.670.52
a
PSO 50% 0.170.41a 0.500.55
a 2.000.63
a 1.830.41
b 1.170.41
b 1.670.52
a
PSO 25% 0.330.82a 0.670.52
a 1.331.03
a 1.170.75
b 0.670.82
b 1.170.75
a
Reference 0.170.41a 0.330.52
a 2.170.75
a 2.000.63
ab 2.000.63
a 1.170.41
a
Vehicle 0.670.82a 0.670.52
a 1.670.82
a 1.330.52
b 0.830.75
b 1.001.10
a
Saline 0.9% 0.500.84a 0.670.82
a 1.830.98
a 1.500.55
b 1.000.63
b 1.330.52
a
Day 10
PSO (in natura) 0.000.00 0.000.00 0.670.52a 1.670.52
ab 1.330.52
a 2.000.00
PSO 50% 0.000.00 0.000.00 0.830.41ab
1.000.63a 1.170.98
a 2.000.00
PSO 25% 0.000.00 0.000.00 1.000.00ab
0.670.82a 1.170.41
a 2.000.00
Reference 0.000.00 0.000.00 0.830.41ab
1.500.55ab
1.330.82a 2.000.00
Vehicle 0.000.00 0.000.00 1.330.52ab
2.330.52b 1.830.41
a 2.000.00
Saline 0.9% 0.000.00 0.000.00 1.500.55b 2.170.75
b 1.670.52
a 2.000.00
Results are expressed as means±S.D. (n=6).
Different small letters within the same column indicate significant difference of histological
parameters among groups per biopsy day (p<0.05).
Haematoxylin and eosin stained sections were scored as absent or normal (0), mild (1),
moderate (2) and intense (3) for epidermal and/or dermal re-modeling. Re-epithelization was
scored as absent (0), partial (1) and total (2). Ed: edema; PMN: polymorphonuclear cells; MNC:
mononuclear cells; FP: fibroblast proliferation; NV: neovascularization; RE: re-epithelization.
101
Figure 1. Macroscopic wound closure on days 0, 3, 7 and 10 post-surgery. The in natura PSO
treated group shown an enhanced wound closure when compared to other treatment groups,
except to reference group on day 7.
102
Figure 2. Histological progression of the wound healing in PSO (in nature) treated group,
reference and saline 0.9% control groups (top to bottom, respectively) on days 3 (left column)
and 7 (right column). On day 3, a single cells layer in re-epithelized epidermis could be
observed in group treated with in natura PSO, while ulcer areas could still be verified in the
other groups. Wound healing was characterized by a complete re-epithelization and higher
proliferation of fibroblasts and neovascularization in PSO (in nature) treated group on day 7.
Haematoxylin and eosin staining. Original magnification: 100x. Scale bar: 200 μm.
103
Figure 3. Immunohistochemical staining for COX-2 and VEGF on days 3 and 7, respectively.
In natura PSO treated lesions decreased COX-2 expression on day 3 and increased relatively
VEGF expression as compared to saline 0.9% control group on day 7. Similar results was
found in reference group. Sections were scored as +, slight positive staining, up to 15%
positive cells; ++, moderate positive staining, from 15% to 30% positive cells; +++, strong
positive staining with more than 30% positive cells. Original magnification: 400x. Scale bar:
50 μm.
104
9 CONCLUSÕES
O óleo essencial de L. sidoides, quando usado continuamente sobre a pele, possui
efeito irritativo e promove uma resposta inflamatória no tecido afetado. Entretanto, a
atividade pró-inflamatória observada não retarda o fechamento de lesões durante o processo
de cicatrização cutânea. Essas atividades biológicas podem estar relacionadas ao alto teor de
timol encontrado nesse óleo.
O óleo fixo de C. pepo possui atividades anti-inflamatória tópica e cicatrizante,
sendo capaz de inibir processos inflamatórios cutâneos agudos e crônicos, e modular a
expressão dos mediadores COX-2 e VEGF, envolvidos nas diferentes fases do processo
cicatricial. Esses efeitos podem ser atribuídos à proporção promissora de AGI ω-6 e ω-9
presentes neste óleo, seja pelos efeitos individuais ou sinérgicos dessas moléculas bioativas.
105
10 PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste trabalho, associados à ação antimicrobiana do óleo
essencial de L. sidoides previamente relatada na literatura, sugerem que a utilização deste óleo
em concentrações adequadas pode ser indicada como uma modalidade terapêutica alternativa
para tratamento tópico de feridas cutâneas infectadas. No entanto, estudos mais aprofundados
envolvendo os mecanismos celulares e moleculares da resposta cutânea modulada pelo óleo
essencial de L. sidoides deverão ser realizados para o estabelecimento de protocolos clínicos
em diversas espécies.
Além disso, a partir deste estudo surgem novas perspectivas sobre a utilização do
óleo fixo de C. pepo como uma nova opção terapêutica para o tratamento de doenças
inflamatórias crônicas associadas ou não à lesões cutâneas na medicina alternativa e
complementar. No entanto, torna-se necessário o entendimento de outras vias de sinalização
envolvidas nesses processos, para definir mecanismos de ação mais precisos e, assim, apoiar o
uso terapêutico deste óleo na prática clínica humana e veterinária.
106
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APÊNDICES
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Apêndice A – Artigo publicado na Acta Veterinaria Brasilica, v. 7, n. 2, 2013
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
Apêndice B – Artigo publicado na Acta Scientiae Veterinariae, v. 41, n. 1168, 2013
135
136
137
138
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140
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142