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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO
MOSTO NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
MÍRIAM ROBERTA HENRIQUE
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para
obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na
Agricultura).
BOTUCATU - SP
Fevereirode 2013
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO
MOSTO NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
MÍRIAM ROBERTA HENRIQUE
Orientador: prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências
Agronômicas da UNESP – Campus de Botucatu, para
obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na Agricultura).
BOTUCATU - SP
Fevereirode 2013
III
Aos meus pais,
João e Maria Helena ...
...que me deram a vida e que nunca mediram esforço para me dar tudo que estava ao seu alcance. Sempre estiveram ao meu lado me apoiando, me incentivando em tudo e corrigindo meus erros com sabedoria, dignidade e respeito. Sempre com muito amor, amor esse que é meu alicerce. Obrigada Deus por me dar a oportunidade de ser filha de tão pessoas maravilhosas.
Dedico.
IV
Aos meus irmãos, Marcos e André... ... que sempre estão ao meu lado, são meus conselheiros e companheiros.
A minhas cunhadas,
Edivirges e Andreia..... ... pelo carinho e incentivo diário.
Aos meus sobrinhos,
Matheus, Emanuel e Heitor .... ... que são o sol do meu dia, que alegram a minha vida e sempre estão me ensinando alguma coisa.
As minha avós,
Vó Cida (in memória) e Vó Angelina (in memória) .... ... que fizeram toda a diferença na minha vida, me ensinaram muitos valores e principalmente o amor a vida e pra com o próximo. Saudades.
Ofereço.
V
Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o sino que tine. E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse amor, nada seria.”
Paulo de Tarso
VI
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus, pela minha vida e por mais essa
oportunidade, juntamente com as pessoas que mais amo.
Agradeço meu orientador Waldemar GastoniVentiruni Filho, pelo apoio e
compreensão de sempre, entendendo minhas dificuldades e limitações, mas sempre
acreditando em mim. Obrigada pelo carinho, incentivo e paciência dedicados ao nosso
trabalho.
Ao Prof. ToshioNojimotoe aProfaMarthaMariaMischanpelas orientações de
estatística.
A ProfaDra Magali Leonel e ao Prof. Dr. Ricardo Figueira pelas sugestões
apresentadas na qualificação e na defesa que muito acrescentaram no meu trabalho e no
meu crescimento profissional.
A Luciana Brunelli que estava sempre pronta pra me ajudar.
Ao Roberto M. Fulan (in memoria) e ao Marcos A. Risseti que foram os
primeiros a acreditarem em mim como profissional, e a me dar várias oportunidades.
Muito obrigada pelo carinho, paciência e dedicação.
A Usina São Manoel, por me liberar para as aulas e permitir que o trabalho
fosse realizado na empresa.
Ao Cristiano Azeredo, que sempre me motivou em todos os momentos.
Também contribuiu diretamente com o assunto abordado neste trabalho.
Aos colaboradores do laboratório industrial que direta ou indiretamente
colaboraram para que tivéssemos os resultados das análises para a conclusão do
trabalho. Em especial a Roberta Bronzatto, Elisangela Madaleno e ao Elton Rodrigues
que muitas vezes participaram diretamente com muito companheirismo. Valeu pessoal!!
Ao Cleber Aguiar, que sempre esteve pronto para tirar dúvidas e ajudar.
Ao Bruno Innocenti, e aos colegas de trabalho que me estiveram presente no
dia-a-dia auxiliando direta ou indiretamente para que esse trabalho fosse concluído.
As minhas amigas queridas Márcia Lafão, Jaqueline Travalim, Rosane
Menchiori Francisco, Kátia Castro, Eliana Alves, Andrea Benito que sempre me
apoiaram e vibraram com minhas conquistas. Que bom que Deus colocou vocês em
minha vida.
VII
A Andréia Innocenti, que muitas vezes foi um anjo em minha vida, sempre me
alertando para as matrículas e datas acadêmicas, me socorrendo em muitos momentos.
Aos meus familiares queridos que sempre estão junto comigo, me dando muito
amor e carinho, e tudo isso me dá forças para novos desafios. Principalmente aos meus
pais que sem eles, que são meus exemplos, nada disso estaria acontecendo.
VIII
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .............................................................................................. XI
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. XII
RESUMO .................................................................................................................. 1
SUMMARY .............................................................................................................. 3
CAPÍTULO I ............................................................................................................. 5
CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................. 6
1.1INTRODUÇÃO .................................................................................................. 6
1.2REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 8
1.2.1Cana-de-açúcar ............................................................................................... 8
1.2.2Mel final ou melaço ........................................................................................ 9
1.2.3Levedura Alcoólica ........................................................................................ 10
1.2.4Fermentação alcoólica .................................................................................... 15
1.2.4.1Processos ..................................................................................................... 16
1.2.4.2Processo batelada ......................................................................................... 17
1.2.4.3Processo batelada alimentada ...................................................................... 17
1.2.4.4Processo contínuo ........................................................................................ 18
1.2.5Fatores que interferem o processo fermentativo ............................................ 19
1.2.5.1 pH ................................................................................................................ 19
1.2.5.2Temperatura ................................................................................................. 20
1.2.6Contaminação microbiana .............................................................................. 21
1.2.7Culturas puras de levedura ............................................................................. 22
1.2.7.1Identificação da levedura no processo fermentativo ................................... 22
1.2.8Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ..................................................... 23
1.2.9Compostos fenólicos e fermentação alcoólica .............................................. 26
1.3REFERÊNCIAS ................................................................................................ 27
CAPÍTULO II ............................................................................................................ 32
RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO
MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE
BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA
ALCOÓLICA............................................................................................................ 33
SUMMARY .............................................................................................................. 34
IX
2.1INTRODUÇÃO ................................................................................................. 35
2.2MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 36
2.2.1Descrição do processo industrial de fermentação .................................... 36
2.2.2Planejamento experimental e análise estatística ...................................... 38
2.3ANÁLISES QUÍMICAS E MIROBIOLÓGICAS ............................................ 38
2.3.1Compostos fenólicos ....................................................................................... 38
2.3.2Identificação das leveduras ..................................................................... 38
2.3.3Viabilidade, viabilidade de brotamento e brotamento celular ......................... 38
2.4RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 39
2.5CONCLUSÃO .................................................................................................... 45
2.6REFERÊNCIAS ................................................................................................. 45
CAPÍTULO III ................................................................................................... 47
RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS
DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR
SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO..................................................... 48
SUMMARY .............................................................................................................. 49
3.1INTRODUÇÃO .................................................................................................. 50
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 51
3.2.1Descrição do processo industrial de fermentação ..................................... 51
3.2.2Planejamento experimental e análise estatística ......................................... 52
3.3ANÁLISES QUÍMICAS E CALCULO DA EFICIÊCIA FERMENTATIVA
POR SUBPRODUTOS ............................................................................................. 53
3.3.1Compostos fenólicos ....................................................................................... 53
3.3.2Calculo da eficiência da fermentação por subprodutos ................................... 53
3.3.3Análises dos subprodutos para cálculo da eficiência da fermentação ............. 54
3.3.3.1Porcentagem de fermento vinho delevedurado e do creme de levedura ..... 55
3.3.3.2 Teor alcoólico do vinho deleveduradoe do creme de levedura .................... 55
3.3.3.3ARRT do vinho delevedurado............................................................. 55
3.3.3.4Glicerol do vinho delevedurado .................................................................. 55
3.3.3.5Acidez sulfúrica do mosto, do vinho levedurado e do fermento tratado 55
3.4RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 56
3.5CONCLUSÃO .................................................................................................... 61
3.6REFERÊNCIAS ................................................................................................. 61
X
CAPÍTULO IV ................................................................................................................ 63
CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................... 64
XI
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I ............................................................................................................ 5
CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................. 6
Tabela 1.1 - Compostos fenólicos e flavonóides em cana-de-açúcar e seus
produtos, identificados por diversos autores.............................................................. 25
CAPÍTULO II ............................................................................................................ 32
RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO
MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE
BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA
ALCOÓLICA..................................................................................................... 33
Tabela 2.1 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:
compostos fenólicos x viabilidade celular................................................................. 42
Tabela 2.2 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:
compostos fenólicos x viabilidade de brotamento ..................................................... 43
Tabela 2.3 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:
compostos fenólicos x brotamento celular ................................................................ 44
CAPÍTULO III ................................................................................................... 47
RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS
DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR
SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO..................................................... 48
Tabela 3.1 - Resultados das análises de cariotipagem ............................................... 57
Tabela 3.2 Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t::
compostos fenólicos x rendimento de fermentação por subprodutos ........................ 58
Tabela 3.3 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:
compostos fenólicos x ARRT do vinho ..................................................................... 60
XII
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I ............................................................................................................ 5
CONSIDERAÇÕES INICIAIS ................................................................................. 6
Figura 1.1 – Composição da cana-de-açúcar ............................................................. 9
Figura 1.2 – Via de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP) ............................................ 12
CAPÍTULO II ............................................................................................................ 32
RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO
MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE
BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA
ALCOÓLICA..................................................................................................... 33
Figura 2.1 – Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São
Manoel.............................................................................................................. 37
Figura 2.2 – Resultados das análises de cariotipagem............................................... 39
Figura 2.3 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e
aviabilidade celular de levedura
alcoólica.................................................................... 42
Figura 2.4 – Correlação entre aconcentração de compostos fenólicos do mosto e a
viabilidade de brotamento de levedura alcoólica....................................................... 43
Figura 2.5 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos no mosto e o
brotamento de levedura alcoólica .............................................................................. 44
CAPÍTULO III ................................................................................................... 47
RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS
DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR
SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO .................................................... 48
Figura 3.1 Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São
Manoel ....................................................................................................................... 52
Figura 3.2 – Correlação entre a concentração dos compostos fenólicos do mosto e
a eficiência de fermentação por subprodutos ............................................................. 58
Figura 3.3 - Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e o
ARRT do vinho .......................................................................................................... 59
1
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da concentração
dos compostos fenólicos do mosto com a viabilidade celular, viabilidade de brotamento,
brotamento celular da levedura alcoólica e a eficiência da fermentação por subprodutos
durante a safra 2011/2012 na Usina São Manoel, São Manuel (SP). Esta unidade iniciou
a safra com a levedura selecionada CAT-1. Durante a safra, as cepas nativas adentraram
o processo fermentativo e também foram avaliadas quanto à sensibilidade a
concentração dos compostos fenólicos. A pesquisa foi desenvolvida como um estudo de
caso na planta industrial de fermentação contínua. As análises de concentração dos
compostos fenólicos do mosto foram realizadas através do método FolinCiocalteu,
enquanto que as análises de viabilidade celular, viabilidade de brotamento e brotamento
da levedura foram feitas através de contagem em câmara de Neubauer utilizando
corante azul de metileno. A eficiência da fermentação foi determinada por subprodutos
gerados durante o processo fermentativo. A análise estatística foi avaliada pelo
coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t. Concluiu-se
que, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação negativa sobre a
viabilidade celularno período com leveduras 100% das nativas e no período geral da
safra; sobre a viabilidade de brotamento somente o período com leveduras 100% nativas
tiveram relação negativa. Os compostos fenólicosnão apresentaram relação com o
2
brotamento celular da levedura e com a eficiência da fermentação em nenhumdos
períodos estudados.
_________________________________________________________________________
Palavras-chave: compostos fenólicos, Saccharomycescerevisiae, viabilidade celular,
brotamento e eficiência da fermentação.
3
EFFECTS OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS
CONCENTRATIONINTHEALCOHOLIC FERMENTATION, Botucatu, 2013, 64p.
Dissertação (Mestrado em Agronomia / Energia na Agricultura – Faculdade de Ciências
Agronômicas, Universidade Paulista).
Author: MIRIAM ROBERTA HENRIQUE
Adviser: WALDEMAR GASTONI VENTURINI FILHO
SUMMARY
The aim of this project was to evaluate the relationship of the
must phenolic compounds concentration with the cellular viability, budding viability,
cellular budding of alcoholic yeast and the efficiency of the fermentation for by-
products during the harvest 2011/2012 in São Manoel Sugar Mill, São Manuel (SP).
This unit began the harvest with the selected yeast called CAT-1. During the harvest,
the native stumps penetrated the fermentation process and they were also appraised as
for the sensibility to the concentration of the phenolic compounds.The research was
developed as a case study in the industrial plant of continuous fermentation. Analyses of
concentration of the must phenolic compounds were accomplished through the
FolinCiocalteu method, while the analyses of cellular viability, budding viability and
budding yeast were made through counting in Neubauer chamber using a marker ( m-
ethilen blue).The efficiency of the fermentation was determined using by-products
generated during the fermentation process . Statistical analysis was evaluated by
Pearson’s correlation coefficient and its significance through the “t” test .It was
concluded that the must phenolic compounds had negative relationship about the
cellular viability in the periods with 100% of native yeasts along the general period of
the harvest; about the budding viability only the period with 100% native yeasts had
negative relationship. The phenolic compounds didn't present relationship with the
4
budding cellular yeast and with the efficiency of the fermentation in none of the studied
periods.
_________________________________________________________________________
Key-words: phenolic compounds, Saccharomyces cerevisiae, cellular viability, budding
and fermentation efficiency.
6
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1.1 INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar (Saccharumspp.), por apresentar potencial
genético favorável para acúmulo de sacarose, é a principal responsável pela produção de
açúcar e etanol no Brasil, que se destaca como maior produtor mundial de etanol de
cana-de-açúcar (UNICA, 2009).
A fermentação alcoólica é uma das principais etapas do processo
para produção do etanol, na qual as leveduras (Saccharomycescerevisiae) transformam
açúcares presentes no mosto em etanol, gás carbônico e componente secundários. Este
processo pode ser influenciado por vários fatores, entre eles, temperatura, pH, pressão
osmótica, composição do meio, bactérias, leveduras contaminantes, etc.
A qualidade da matéria-prima afeta diretamente a eficiência
fermentativa, levando à queda do rendimento alcoólico, quando o mosto contem ácidos
orgânicos e inorgânicos que inibem o processo fermentativo (PAYNE, 1989).
A matéria-prima não se restringe somente ao caldo da cana-de-
açúcar. Nas unidades de produção de etanol acopladas a unidades de produção de
açúcar, a matéria-prima utilizada para obtenção deste produto é o mel final diluído em
caldo secundário (extraído a partir do segundo terno) ou filtrado após tratamento, ou
somente em água. Nos últimos anos, a utilização de mel com maior nível de
esgotamento como matéria-prima de fermentação vem se tornando uma pratica comum.
Neste mel estão presentes açucares fermentescíveis e não fermentescíveis, cinzas, sais,
compostos coloridos e outros (TOSETTO, 2008).
As variedades da cana-de-açúcar, as condições ambientais de
cultivo, o grau de maturação e a incidência de pragas e doenças, podem influenciar
diretamente na qualidade da matéria-prima. Como mecanismo de defesa contra as
pragas e doenças a cana-de-açúcar pode produzir metabólitos, sendo estes muitas vezes
inibidores do processo fermentativo.Entende-se por inibição da fermentação a atuação
de compostos sobre as leveduras, que são as responsáveis pela transformação do açúcar
em etanol. O nível de inibição deste processo de conversão de açúcar em álcool vai
depender do tipo da linhagem de levedura utilizada, associada aos compostos inibitórios
e as suas concentrações (TOSETTO, 2008).
7
A contribuição dos fatores de inibição provenientes da cana-de-
açúcar pode ser atribuída à própria variedade utilizada, assim como a deterioração dessa
planta, ocorrida devido às operações envolvidas nos processo de colheita, como horas
de queima, tempo de corte e transporte.
O mel final, oriundo do processo de fabricação de açúcar, faz
parte da composição do mosto de fermentação, que por sua vez, agrega, além de todos
esses fatores vindos com a cana-de-açúcar, também os inibidores provenientes das
operações envolvidas na produção do açúcar, tais como os ácidos orgânicos (lático,
fórmico e acético) e hidroximetil-furfural - HMF (CRUIKSHANK; PERKIN, 1964;
FRIEND, 1979; GODSHALL; LEGENDRE, 1988).
Segundo Amorim et al. (1996), as destilarias brasileiras têm
como prática frequente iniciar os processos fermentativos com uma determinada
levedura, seja pela tradição de seu uso, como a Saccharomycescerevisiae, pela
facilidade de obtenção em grandes quantidades, como as leveduras de panificação, ou
ainda, pelo fato da mesma ter sido obtida através de melhoramento genético para se
melhor adequar às necessidades do processo industrial.
As destilarias brasileiras, por não possuírem unidades de
esterilização de mosto, são consideradas abertas do ponto de vista microbiológico. Elas
trabalham com populações mistas, ou seja, varias linhagens de levedura presentes. Estas
linhagens podem ser classificadas como sendo selecionadas, nativas ou selvagens. As
linhagens selecionadas são aquelas adquiridas de forma pura para serem utilizadas como
inóculo nas partidas das plantas industriais. As nativas são aquelas encontradas no
processo, que apresentam características fermentativas satisfatórias, mas são diferentes
em relação às selecionadas. As linhagens selvagens são aquelas presentes nos processos
que apresentam características fermentativas não adequadas aos processos industriais e
normalmente não são Saccharomyces, sendo consideradas oportunistas, dominando o
processo somente em condições anormais, tais como: operação com baixa concentração
de etanol, paradas prolongadas, paradas curtas ou longas sequenciais, etc.
(ANDRIETTA, 2007).
Estudos da defesa das plantas contra pragas e doenças
(FONTANIELLA et al., 2003) mostraram um aumento no nível de fenóis totais em
cana. Compostos fenólicos possivelmente têm desempenhado algum papel negativo na
fisiologia da levedura durante a fermentação, que resulta no aumento de açúcares
8
redutores residuais totais (ARRT) e menor rendimento fermentativo e
consequentemente perdas na produção do etanol (RAVANELI, 2010).
Inserido nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo
investigar os efeitos da concentração dos compostos fenólicos presentes no mosto sobre
a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento celular, taxa de brotamento celular e a
eficiência fermentativa durante a safra 2011/2012 da Usina São Manoel, São Manuel,
SP.
1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.2.1 Cana-de-açúcar
A provável origem da cana-de-açúcar é o norte da Índia. Há
referências sobre a produção de açúcar na Pérsia 500 D.C. Da Pérsia, foi levada para
costa ocidental através do Mar Mediterrâneo e daí para a Espanha, por volta do século
VIII. Nos séculos XI e XII, através das Cruzadas, espalhou-se por toda a Europa, África
e China. Na América, foi introduzida por Colombo em São Domingos, em 1.494. No
Brasil, o plantio iniciou-se em São Vicente, em 1.522, trazida por Martin Afonso de
Souza (MARQUES, 2001).
A cana-de-açúcar pertence ao gênero Saccharum e possui várias
espécies. Sua reprodução pode ser por sementes (sexuada) ou por brotação de gemas
(assexuada). A via sexuada é fortemente influenciada por fatores como localização
geográfica e variáveis climáticas. Em condições de produção industrial, o processo
baseia-se na brotação de gemas de plantas sadias de variedades selecionadas, por
apresentar características de interesse industrial (MARQUES, 2001).
Segundo Marques (2001) as variedades comerciais, de um modo
geral, apresentam características de composição tecnológica que variam dentro de certos
limites (Figura 1.1).
9
Fibra
8 a 18%
Celulose
Lignina
Pentosanas
Caldo
86 a 92%
Água
75 a 82%
Sólidos Solúveis
18 a 25%
Açúcares
15,5 a 27%
Sacarose (12 a 18%)
Glicose (0,2 a 1%)
Frutose (0 a 0,5%)
Não-açúcares
(impurezas)
1 a 2,5%
Orgânicos
0,8 a 1,8%
Inorgânicos
0,2 a 0,7%
Aminoácidos
Ácidos
Ceras
Corantes
Gorduras
SiO2
K2O
P2O5
CaO
MgO
N2O
Fe2O3
SO3
Figura 1.1 – Composição da cana-de-açúcar.
1.2.2 Mel final ou melaço
O mel final ou melaço é o subproduto da produção do açúcar
cristal. É utilizado associado ao caldo da cana-de-açúcar ou simplesmente diluído em
água, como substrato do processo fermentativo. Embora seja atribuído o nome de mel
final ou melaço para o produto obtido depois da cristalização da sacarose contida no
caldo de cana-de-açúcar, as particularidades atribuídas a cada processo não permitem
uma generalização em relação à composição dessa matéria-prima. Mas o que se conhece
é que existem inúmeros compostos comuns, os quais são encontrados em maior ou
menor quantidade nos melaços de cana-de-açúcar. O mel final além de carrear, de um
modo concentrado, componentes da matéria-prima (nutrientes, sais, compostos
fenólicos), também pode conter ácidos orgânicos (acido lático, fórmico e acético) e
hidroximetil-furfural (HMF) proveniente do processo, que propicia o acúmulo e ou
formação de produtos, que podem atuar como inibidores da fermentação (TOSETTO,
2008).
10
1.2.3 Levedura alcoólica
As leveduras são seres eucariontes e forma uma das classes mais
importante dos fungos. A Saccharomycescerevisiae, que são as leveduras mais
utilizadas na produção de etanol, apresenta-se na forma unicelular com 2 a 8
micrômetros de diâmetro. São anaeróbicas facultativas (STECKELBERG, 2001).
Encontram-se predominantemente na forma unicelular e facilmente se diferenciam das
bactérias em virtude de suas dimensões maiores e de suas propriedades morfológicas.
Uns dos aspectos que as caracterizam como fungos são a composição da parede celular,
a perda de mobilidade e a ausência de fotossíntese (McKANE; KANDEL, 1996;
MORTIMER, 2000, citados por WIESIOLEK, 2007).
Como resultado de seu modo reprodutivo, condições de cultivo,
idade e cultura, a célula da levedura pode apresentar diferentes formas e tamanhos,
sendo as mais comuns as esféricas, globosas, ovoides e alongadas. As leveduras podem
multiplicar-se por gemulação (brotamento), esporulação ou por fissão. O método mais
comum é o de gemulação (brotamento), sendo que durante sua vida uma célula madura
(célula mãe) pode gerar até 24 brotos (células filhas). As principais microestruturas das
leveduras são a parede celular, a membrana citoplasmática, o núcleo, os vacúolos e as
mitocôndrias (AMORIM et al., 1996).
O crescimento pode ser definido como um aumento dos
constituintes celulares, levando a um aumento no número de células, quando
microrganismos crescem através de processos como brotamento ou fissão binária. Esse
crescimento pode ser descrito como função logarítmica do número de células em
determinado período de incubação, resultando numa curva de quatro fases diferentes
(GLAZER, 1998).
1. Fase lag: quando os microrganismos entram num meio de cultura fresco,
usualmente não aumentam imediatamente o número de células ou massa. A
divisão celular não ocorre imediatamente, pois a célula está sintetizando novos
componentes. Esta fase varia seu comprimento consideravelmente com as
condições do microrganismo e a natureza do meio (GLAZER, 1998).
2. Fase exponencial ou fase log: os microrganismos estão crescendo ou dividindo
ao ritmo máximo possível em função do seu potencial genético, da natureza do
meio e das condições na qual estão crescendo. Seu ritmo de crescimento é
exponencial durante esta fase, visto estarem crescendo e se duplicando a
11
intervalos regulares. A população é mais uniforme em termos químicos e
fisiológicos nesta fase (GLAZER, 1998).
3. Fase estacionária: o crescimento populacional cessa e a curva se torna
horizontal. O tamanho da população final depende da disponibilidade de
nutrientes, dentre outros fatores. Nessa fase, o número total de organismos
viáveis permanece constante. Este pode ser resultado de um balanço entre
divisão e morte celular ou a população pode simplesmente cessar a divisão e
permanecer em atividade metabólica. Sabe-se que os microrganismos entram em
fase estacionária por muitas razões, sendo uma delas a limitação de nutrientes.
Porém o crescimento também pode cessar devido ao acúmulo de produtos
tóxicos, limitando principalmente culturas anaeróbias (GLAZER, 1998;
PRESCOTT, 1999).
4. Fase de morte: restrições ambientais ocorrem com a privação de nutrientes e a
produção de metabólitos tóxicos que levam ao declínio no número de células
viáveis. A morte da população microbiana, como seu crescimento, é
exponencial. Este padrão ocorre mesmo quando o número total de células
permanece constante porque as células simplesmente não se dividem após
morrerem (GLAZER, 1998; PRESCOTT, 1999).
Nas leveduras, encontra-se uma variedade de reações
fisiológicas. O metabolismo de açúcar como a glicose, pode ocorrer anaeróbica
(fermentação) ou aerobica (respiração). O processo mais característico é o metabolismo
anaeróbico, também conhecido comumente como fermentação alcoólica, cujos produtos
finais são etanol e gás carbônico (PELCZAR; REID; CHAN, 1980 citados por
WIESIOLEK, 2007).
O metabolismo da levedura, como o de qualquer ser vivo, pode
ser dividido didaticamente em anabolismo e catabolismo. O processo anabólico diz
respeito a reações de síntese de material celular, tais como proteínas, gorduras,
polissacarídeos, etc., à custa de energia celular armazenada na molécula de ATP. No
catabolismo o processo se inverte, as moléculas são quebradas e oxidadas, sendo que a
energia química produzida nessas reações é acumulada nas moléculas de ATP
(VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001).
A transformação do açúcar (glicose) em etanol e CO2envolve
reações em sequência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica. Tal
aparato enzimático está confinado no citoplasma celular sendo, portanto, nessa região
12
da célula que a fermentação alcoólica se processa. Essas enzimas, referidas como
“glicolíticas”, sofrem ações de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas,
inibidores, substâncias do próprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que
estimulam e outros que reprimem a ação enzimática, afetando o desempenho do
processo fermentativo conduzido pelas leveduras (LIMA et al., 2001).
Segundo Wiesiolen (2007), a glicólise é a soma total de reações
bioquímicas pelas quais a glicose é convertida em piruvato. A via mais frequente é a de
Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP) (Figura 1.2).
Figura 1.2 – Via de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP)
Glicose
(1)↓
Glicose 6-fosfato
(2)↓
Futose 6-fosfato
(3)↓ Frutose 1,3-difosfato
(4)↓
Gliceraldeído-3-fosfato
(5)↓
1,3 difosfato-Glicerato
(6)↓
3-Fosfoglicerato
(7)↓
2-Fosfoglicetato
(8)↓
Fosfoenolpiruvato
(9)↓
Piruvato
(10)↓
Acetaldeído
(11)↓
Etanol
Enzimas envolvidas
1- Hexoquinase (Mg
++ATP convertido em
ADP)
2- Fosfohexoseisomerase
3- Fostofrutoquinase (Mg++
ATP convertido em
ADP)
4- Aldolase
5- Gliceraldeído 3-P-desidrogenase (entra
NAD sai NADH + H++
+ Pi)
6- Fosdoglicerilquinase (entra ADP sai ATP)
7- Fosfoglicerilmutase
8- Enolase
9- Piruvatoquinase (entra ADP sai ATP)
10- Piruvato descarboxilase (Liberação de CO2)
11- Álcool desidrogenase
13
Convém ressaltar que a levedura Saccharomycesé um anaeróbio
facultativo, ou seja, tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições
de aerobiose como de anaerobiose (ausência de oxigênio molecular). Os produtos finais
da metabolização do açúcar irão depender das condições ambientais em que a levedura
se encontra. Assim, enquanto uma porção do açúcar é transformada em biomassa, CO2 e
H2O em aerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO2 em anaerobiose,
processo denominado fermentação alcoólica (LIMA et al., 2001).
O balanço global dos dois ciclos pode ser resumido pelas
equações:
Fermentação alcoólica
C6H12O6→ 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 57 Kcal (1)
Respiração
C6H12O6 + 6O2 →6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 Kcal (2)
A reação global da glicólise demonstra que 1 mol de glicose
(180g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (88g), 2 moles
de ATP e 57 Kcal de energia. Assim, o rendimento teórico para a produção de etanol é
de 0,511 g/g. Na prática, segundo Oura (1974), este valor não é observado devido à
utilização de parte da glicose para produção de glicerol e alcoóis superiores, substâncias
necessárias para síntese de material celular e manutenção da levedura.
A via respiratória – energeticamente mais eficiente – é utilizada
no início do processo de fermentação, com a finalidade de promover o crescimento e o
reviramento do fermento. A via fermentativa tem a função de promover a transformação
do açúcar em etanol e gás carbônico (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001). Os
carboidratos considerados substratos para a fermentação, tanto podem ser endógenos
(constituintes da levedura, como glicogênio e trealose) como exógenos (sacarose,
glicose, frutose e outros provenientes da matéria-prima) (LIMA et al., 2001).
O passo inicial na utilização dos açúcares fermentescíveis pela
levedura pode ser tanto a passagem intacta do açúcar através da membrana celular ou a
sua hidrólise fora da membrana celular, seguida pela entrada na célula de alguns ou
todos seus produtos de hidrólise. A sacarose é hidrolisada pela enzima invertase,
localizada na parede celular, sendo seus produtos (glicose e frutose) metabolizados pela
14
célula (ALMEIDA; SILVA, 2005; WALKER, 2000). As leveduras consomem primeiro
a glicose e depois a frutose (RUSSEL, 1994).
Dos fatores ambientais que regulam a respiração e a
fermentação em células de leveduras, a disponibilidade de glicose e oxigênio é o mais
documentado (WALKER, 2000). No caso de algumas leveduras, entre elas a
Saccharomycescerevisiae, em presença de glicose mesmo em condições estritamente
aeróbias, o metabolismo é do tipo respiro-fermentativo. Esse comportamento
metabólico é provocado por um efeito conhecido como efeito Crabtreeou repressão
catabólica. Esse efeito se pronuncia em condições onde a concentração de glicose
ultrapassa um valor limite. O mecanismo responsável pela repressão catabólica pode ser
bastante complexo, mas estudos mostram que ocorre principalmente através do forte
efeito repressivo da glicose sobre a atividade de enzimas respiratórias e também,
possivelmente, pela inibição da expressão genética de enzimas constituintes da via
respiratória, fazendo com que parte do piruvato que não pode ser oxidado pelo ciclo de
Krebs seja reduzido a etanol pelo processo fermentativo (BAKKER et al., 2001). Em
contrapartida, outro efeito conhecido como efeito Pasteur relaciona o oxigênio com a
cinética do catabolismo de açúcar, estabelecendo que, sob condições anaeróbias, a
glicólise aconteça mais rápido do que sobre condições aeróbias. Este fenômeno é
observado somente quando as concentrações de glicose forem baixas (cerca de 5 mM)
ou sob certas condições de nutrientes limitantes (WALKER, 2000). Segundo Nogueira e
Venturini Filho (2005), a principal diferença entre o efeito Pasteur e o efeito Crabtreeé
que no primeiro, observa-se a tendência da levedura respirar em meios aeróbios,
enquanto no segundo, constata-se que a levedura pode fermentar mesmo na presença de
oxigênio.
O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar
anaerobicamente o açúcar, é gerar uma forma de energia (ATP) que será empregada na
realização de diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e
biossínteses, necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação, para
perpetuar a espécie. O etanol e o CO2 resultantes se constituem tão somente de produtos
de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose. Entretanto, o
etanol, bem como outros produtos de excreção (como o glicerol e ácidos orgânicos),
pode ser oxidado metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em
condição de aerobiose (WALKER, 2000; LIMA et al., 2001).
15
Na sequência de reações enzimáticas de produção de ATP, é
intrínseca à formação de etanol, rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a
formação de materiais necessários à constituição da biomassa (polissacarídeos, lipídeos,
proteínas, ácidos nucleicos e outros), bem como para a formação de outros produtos de
interesse metabólico, relacionados direta e indiretamente com a adaptação e
sobrevivência. Assim, juntamente com o etanol e o CO2, o metabolismo anaeróbio
permite a formação e excreção de glicerol, ácidos orgânicos (succínico, acético,
pirúvico e outros), alcoóissuperiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol, além de
outros compostos de menor significado quantitativo (LIMA et al., 2001).
Simultaneamente ocorre o crescimento das leveduras (formação de biomassa). A
formação do glicerol, o mais abundante dos compostos orgânicos secundários da
fermentação, está acoplada à manutenção do equilíbrio redox celular, o qual é alterado
quando da formação de ácidos orgânicos, biomassa e da presença de sulfito no mosto. A
formação de glicerol também está relacionada a uma resposta ao estresse osmótico,
quando de concentrações elevadas de açúcares ou de sais no mosto (WALKER, 2000;
LIMA et al., 2001).
Segundo Amorim et al. (1996), a levedura como entidade viva
independente, realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a energia
química necessária para a sua sobrevivência, sendo o etanol apenas e tão somente um
subproduto desse processo. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade
metabólica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar às leveduras,
condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor, isto e, com maior eficiência
na produção de etanol.
1.2.4 Fermentação alcoólica
Segundo Lima (1985), a primeira destilaria de etanol no Brasil
foi montada em Piracicaba-SP, onde o processo de fermentação era batelada. O
fermento utilizado era multiplicado para cada batelada e nessa época havia dois tipos de
fermentação: a utilizada para produção de álcool nas usinas de açúcar e a desenvolvida
para produção de aguardente.
Um grande avanço ocorreu na produção de etanol, quando
surgiu o método de Melle-Boinot (batelada-alimentada), na França, na década de 1930.
Esse processo consiste no reaproveitamento da levedura já utilizada em processo
fermentativo. Ele possui algumas vantagens sobre a fermentação em batelada como,
16
economia de açúcar devido a menos reprodução celular, elevado rendimento de etanol,
eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho fermentado, fermentação
menos contaminada devido ao tratamento do leite de levedura (tratamento ácido), menor
complexidade das operações (FERREIRA, 2005).
O processo mais difundido no Brasil sempre foi o de batelada-
alimentada com recirculação da levedura, esse processo já era bastante conhecido e
utilizado em outros países e também no Brasil, mas precisou de muito estudo e
aprimoramento para atingir os níveis de produtividade e eficiência obtidos hoje
(CORTEZ, 2010).
Até o início dos anos 60, poucos eram os investimentos feitos na
produção de etanol no Brasil. As causas para este atraso estiveram provavelmente
ligadas ao problema de falta de incentivo, dificuldade de obtenção de equipamentos e
até mesmo ao pequeno interesse que a produção de etanol despertava devido ao
mercado interno ser pequeno e o externo possuir forte concorrência (ANDRIETTA,
1994).
Então, na década de 60 iniciou-se a modernização desta
indústria, onde Borzani e Fernandes (1994) citados por Andrietta (1994), estudaram a
cinética da fermentação alcoólica contínua.
No início da década de 70, praticamente todas as destilarias de
etanol já operavam com o processo Melle-Boint, com grandes ganhos no rendimento e
na produtividade. Nesta década, este processo foi otimizado, chegando aos anos 80 no
seu máximo de eficiência. Nesta mesma década também se intensificou estudos sobre o
processo contínuo de fermentação alcoólica (ANDRIETTA, 1994).
Com o advento do PROALCOOL, houve um maior interesse na
produção de etanol, e algumas indústrias partiram para a fermentação contínua, que no
início apresentara alguns problemas, que segundo Finguerutet al. (1992) citados por
Andrietta (1994), foram devidos às primeiras plantas contínuas serem fruto de
adaptações de baixo custo de plantas de batelada-alimentada já existentes.
1.2.4.1 Processos
Os processos de fermentação são classificados de acordo com a
maneira através da qual o substrato é adicionado e o produto retirado, podendo-se citar
o processo em batelada, o batelada-alimentada e o contínuo.
17
1.2.4.2 Processo batelada
O processo batelada é também conhecido como processo
descontínuo. Este processo no passado foi muito utilizado na produção de etanol, mas
segundo Maiorellaet al. (1981), ele é lento, pois se gasta muito tempo para o preparo do
reator.
Prepara-se um meio de cultura adequado à nutrição e ao
desenvolvimento do microrganismo e também ao acúmulo do produto desejado; coloca-
se este meio de cultura em um biorreator; adiciona-se o microrganismo responsável pelo
processo biológico e se aguarda que o processo ocorra. Após um determinado tempo de
fermentação, retira-se o caldo fermentado do reator e executam-se as operações
unitárias necessárias para a recuperação do produto (SCHIMIDELL; FACCIOTTI,
2001, citados por PACHECO, 2010).
É considerado um processo seguro com relação a assepsia, pois
ao final de cada batelada, o reator pode ser esterilizado juntamente com um novo meio
de cultura, recebendo um novo inoculo (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001, citados por
PACHECO, 2010). Além do menor risco de contaminação, este processo apresenta
grande flexibilidade de operação pela possibilidade de utilização dos fermentadores para
fabricação de diferentes produtos e por permitir melhor condição em relação a
estabilidade genética do microrganismo (CARVALHO; SATO, 2001, citados por
PACHECO, 2010).
A fermentação em batelada pode levar a baixos rendimentos e
produtividade quando o substrato é adicionado de uma só vez, no início do processo,
pois exerce efeitos de inibição, repressão ou desvia o metabolismo celular a produtos
que não interessam (CARVALHO; SATO, 2001, citados por PACHECO, 2010).
A condução da fermentação alcoólica por processo em batelada,
praticamente só ocorre em escala de laboratório e em pequenas destilarias de aguardente
(PACHECO, 2010).
1.2.4.3 Processo batelada alimentada
Este processo é uma variante do processo batelada. É também
conhecido como Melle-Boinot. Neste processo, o substrato é alimentado sob condições
controladas até atingir o volume útil do biorreator. É um processo conveniente e
satisfatório quanto à operação e eficiência de conversão de açúcares a etanol
(PACHECO, 2010)
18
Esse processo possibilita uma vazão de alimentação constante
ou variável com o tempo e a adição de mosto de forma contínua ou intermitente. Devido
à flexibilidade de utilização de diferentes vazões de enchimento dos reatores, no
processo batelada alimentada é possível controlar a concentração de substrato no
fermentador, de modo que o metabolismo microbiano seja deslocado para uma
determinada via metabólica, levando ao acúmulo de um produto específico
(CARVALHO; SATO, 2001).
Almeida (1960) citado por Ferreira (2005) descreveu as
seguintes vantagens do processo Melle-Boinot:
- Economia de açúcar devido à menor reprodução celular elevando o rendimento em
etanol;
- Eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho (separação de células de
levedura);
- Fermentação mais pura devido ao tratamento de leite de levedura (tratamento ácido);
- Eliminação da necessidade de cultura pura no preparo do pé-de-cuba, prática exigida
no processo clássico, diminuindo, portanto, a complexidade das operações da planta.
1.2.4.4 Processo contínuo
Este processo não sofre interrupções, há a retirada continua do
produto a uma vazão igual a da alimentação, permitindo um fluxo contínuo, diminuindo
assim, o efeito inibitório do etanol e do substrato. Este tipo de processo atinge, quando
bem operado, maior produtividade e rendimento.
Segundo Rodrigues et al. (1992), este processo tem apresentado
uma maior produtividade, com um aumento que pode atingir 100% em relação à
batelada alimentada. Os novos projetos que estão sendo desenvolvidos consideram a
cinética do processo e utilizam ferramentas matemáticas e computacionais. Com isto
obtêm-se processos que:
- Reduzem gastos em mão-de-obra;
- Aumentam a produtividade;
- Reduzem o tempo não produtivo (carga, descarga, limpeza);
- Trabalham em condições ótimas de operação no estado estacionário;
- Reduzem a utilização de insumos; entre outros.
19
1.2.5 Fatores que interferem no processo fermentativo
Segundo Luceri et al. (2005), as leveduras são capazes de
sobreviver em flutuações ambientais intensas por adaptarem rapidamente sua máquina
bioquímica interna às novas condiçoes. Um aspecto desta adaptação é a marcada
capacidade de ajuste da expressão gênica às necessidades ambientais requeridas para
seu crescimento.
Organismos unicelulares requerem condições internas
específicas para crescimento. Estratégias múltiplas existem para manter essas condições
internas, face a vários e frequentes ambientes externos instáveis. Considerando que
organismos multicelulares podem usar órgãos e tecidos especialidados para prover um
ambiente interno relativamente estável e homogêneo, organismos unicelulares como a
levedura S. cerevisiae tem desenvolvido mecanismos autônomos para adaptação de
mudanças ambientais drásticas. As leveduras regularmente resistem a flutuações nos
tipos e quantidades de nutrientes disponíveis, temperatura, osmolaridade e acidez de seu
ambiente, a variável presença de agentes nocivos, como radiação e agentes tóxicos. De
fato, quando condições ambientais mudam abruptamente, a célula deve rapidamente
ajustar seu programa de expressão genômica para adaptarem-se as novas condições
(GASH et al., 2000).
1.2.5.1 pH
Segundo Amorim et al. (1996), o pH é fator significativo para as
fermentações industriais devido à sua importância tanto no controle da contaminação
bacteriana quanto ao seu efeito sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentação e
formação de subprodutos.
Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-
se na faixa de 4,5 a 5,5 com uma boa capacidade tampão, mas as leveduras mantêm uma
homeostase de forma independente dos valores de pH do meio, por isso toleram o
tratamento ácido. O tratamento ácido também provoca lixiviação de nutrientes tais
como N, P e K da levedura que acaba por elevar o pH. Embora o tratamento ácido se
mostre estressante à levedura, ele apresenta efeito benéfico de controlar a contaminação
bacteriana, pois ocorre uma redução significativa no número de bactérias durante esse
tratamento (AMORIM et al., 1996).
O pH ótimo para a produção de etanol por leveduras
Saccharomycescerevisiae situa-se geralmente, na faixa de 4 a 5. Aumentando-se o
20
pHaté 7, observa-se via de regra, uma diminuição do rendimento em etanol, com
aumento da produção de ácido acético (MAIA, 1989).
Segundo Blanchet e Ballerini, citados por Maia (1989), o pH
interno da célula se mantêm na faixa de 5,8 a 6,8, entretanto, baixos valores de pH
tornam o meio mais agressivo, uma vez que exigem das leveduras um maior dispêndio
de energia na manutenção do pH interno, além, de afetar as proteínas de transporte da
membrana citoplasmática que ficam expostas ao meio externo. O pH do meio externo
também, afeta a velocidade de crescimento das leveduras, a qual atinge um máximo
quando o pH está compreendido entre 5 e 6. Na fermentação alcoólica, o
estabelecimento e controle do pH do meio em valores inferiores a 5 é também
considerado importante como meio para prevenir contaminação por bactérias láticas e
acéticas.
1.2.5.2 Temperatura
Na indústria, a temperatura do mosto é um fator crítico no
processo fermentativo. Segundo Steckelberg (2001) a temperatura ótima de fermentação
é uma função que depende do teor do etanol no meio, tendendo a diminuir com o
aumento do teor alcoólico. Portanto, teoricamente, a otimização de um processo de
fermentação com relação à temperatura requer uma redução da temperatura do processo,
à medida que o etanol é produzido. A temperatura de fermentação também influencia a
fluidez na membrana citoplasmática e a atividade das enzimas, alterando a
permeabilidade na membrana e o metabolismo das células.
O efeito inibitório do etanol está intimamente relacionado à
temperatura da fermentação. Segundo Sá-Correia e Van Uden (1983), a faixa de melhor
resistência ao etanol para cepas usuais de Saccharomycescerevisiae é de 13 a 27ºC a
11% (v/v) de etanol. A tolerância ao etanol diminui para temperaturas mais baixas que
13ºC ou mais altas que 27ºC, de forma que a inibição do crescimento do microrganismo
ocorre tanto em processos à baixa temperatura (cervejas, espumantes), como em
processos à alta temperatura (etanol combustível, vinhos tintos).
De acordo com Van Uden (1985) existem três temperaturas
chaves de um processo de crescimento de leveduras: Tmaxi(temperatura máxima inicial
de crescimento), Tmaxf(temperatura máxima final de crescimento) e Topt (temperatura
ótima de crescimento). O aumento da concentração de etanol ao longo da fermentação
21
provoca uma diminuição das 3 temperaturas. Quando Tmaxf se iguala a temperatura do
processo, o crescimento celular torna-se nulo.
Segundo Maia (1989), a temperatura ótima de crescimento das
leveduras é geralmente, inferior à temperatura ótima para produção de etanol. A
fermentação alcoólica geralmente é conduzida em torno de 30 a 32ºC, quando se
pretende maximizar a produtividade em etanol.
1.2.6 Contaminação microbiana
A característica microbiológica da cana-de-açúcar que entra no
processo de extração das unidades sucroenergéticas no Brasil normalmente apresenta
altos níveis de microrganismos contaminantes, sejam eles bactérias, leveduras ou
fungos. Isso porque, segundo Dorta (2006), a decomposição da sacarose por
microrganismos inicia-se quando a cana-de-açúcar está ainda no campo. Quanto mais
rápido a cana for levada à usina para ser convertida em sacarose ou etanol, mais
eficiente será o processo de obtenção de tais produtos. Oliva-Neto (1995), citado por
Dorta (2006), durante o processamento da cana até a etapa de fermentação alcoólica nas
dornas das destilarias, a microbiota contaminante passa por uma grande seleção em
função do pH, temperatura, condições atmosféricas e produtos inibidores (presentes no
substrato) a que são submetidas. Assim, durante o processo fermentativo, a microflora
restringe-se a poucos gêneros, uma vez que o pH torna-se mais baixo e existe o aumento
do teor alcoólico, ficando difícil a adaptação para a maior parte dos microrganismos.
Entretanto, o processo de batelada alimentada ou contínuo com o reciclo de célula,
utilizado nas usinas sucroenergéticas favorece a proliferação de alguns gêneros
contaminantes nas dornas fermentativas (OLIVA-NETO E YOKOYA, 1994).
O aumento das contaminações na cana-de-açúcar pode ser
favorecido por geadas como mostram os trabalhos de Irvine eFriloux (1965) e Coll et al.
(1978), e também por doenças e parasitas como as galerias formadas pela
Diatraeasaccharalis, que facilitam a entrada de bactérias, fungos e leveduras nos
colmos da cana, facilitando sua deterioração (TILBURY, 1969). Mayeux e Colmer
(1975); Duncan e Colmer (1964), relatam o aumento das contaminações no caldo de
cana-de-açúcar como consequência da terra que se adere às raízes, colmos e folhas
quando são carregadas até a indústria.
A literatura aponta como principais contaminantes do meio
fermentativo bacilos Gram-positivos compostos pelos gêneros Lactobacillus, Bacilluse
22
Leuconostoc, sendo este último menos comum devido a menor resistência ao teor
alcoólico (OLIVA-NETO, 1995). Oliva-Neto (1990) isolou como principal
contaminante da fermentação alcoólica o gênero Lactobacillus, a partir de amostras de
leite de levedura, em usinas do estado de São Paulo. A análise taxonômica demonstrou
que L. fermentumfoi a bactéria predominante (62%), seguida por L. murinus(9%), L.
vaccinostercus(9%), L. plantarum(2%) e Leuconostocsp (2%). Do total da referida
microflora, 64% resistiu a 10% (v/v) de etanol em cultivo isolado.
Segundo Narendranathet al. (1997), a contaminação por
bactérias láticas é o maior problema da fermentação industrial de etanol. O crescimento
das referidas bactérias reduz o rendimento alcoólico devido o consumo de glicose que
seria destinada à síntese etanólica, além da competição dos nutrientes do meio, e do
efeito tóxico do ácido lático (YOKOYA, 1991, NARENDRANATHet al. 1997). Além
disso, tais bactérias podem induzir a floculação do fermento causando o assentamento
de células de leveduras no fundo das dornas e perda de células nas centrífugas
contribuindo ainda mais para a diminuição do rendimento, produtividade e viabilidade
celular (OLIVA-NETO; YOKOYA, 1994).
1.2.7 Culturas puras de levedura
No final dos anos 1920, começou-se a falar no Brasil da
substituição da fermentação espontânea pela cultura de levedo puro, já empregado nos
países desenvolvidos, desde o final do século anterior.
1.2.7.1 Identificação da levedura no processo fermentativo
As fermentações industriais geralmente iniciam-se com uma
cepa de levedura selecionada. Entretanto, no decorrer dos ciclos fermentativos, as
linhagens que iniciaram o processo podem ser substituídas por outras leveduras. Tais
leveduras, denominadas nativas ou selvagens ou contaminantes, podem predominar no
processo em função de alguns fatores, tais como agressividade na competição por
nutrientes, maior velocidade de multiplicação, pressão de seleção favorável e adaptação
às condições do meio fermentativo. Como consequência, o processo pode ser
negativamente afetado, através de redução no rendimento alcoólico, maior tempo de
fermentação e produção de metabólitos indesejáveis. Entretanto, essas leveduras podem
também apresentar excelente rendimento alcoólico, possibilitando assim ser
23
selecionadas para o processo fermentativo (CABRINI; GALLO, 1999) citados por
Steckelberg, 2001.
Os métodos moleculares têm sido bastante empregados na
identificação de leveduras, uma vez que são mais precisos quando comparados aos
testes tradicionais (morfológicos, bioquímicos e fisiológicos).
Atualmente, vários métodos moleculares são utilizados para
caracterizar linhagens de leveduras no processo fermentativo, tais como o Polimerase
Chain Reaction (PCR), RandomAmplifiedPolymorphic DNA
(RAPD),RestrictionFragmentLengthPolymorfism (RFLP),
AmplifiedFragmentLenghtPolymorphism (AFLP) (RAVANELI, 2010). Entretanto,
quando se pretende verificar a permanência de uma linhagem durante todo o processo
de fermentação, a técnica mais empregada é a PFGE (Pulsed Field Gel Eletrophoresis),
ou eletroforese em campo pulsado. Essa técnica consiste em separar o DNA
cromossômico intacto, de acordo com o tamanho dos cromossomos, e tem-se mostrado
uma importante ferramenta na identificação de gêneros, espécies ou estirpes de
leveduras (BASSO et al.,1993). A técnica de eletroforese em campo pulsado tem sido
amplamente empregada por diversos autores, segundo Ravaneli, 2010. Basso et al.
(1993), citados por Ravaneli (2010), investigando o emprego da técnica de PFGE no
acompanhamento de linhagens industriais de Saccharomycescerevisiae, verificaram que
as leveduras de panificação não permanecem no processo fermentativo industrial após
40 dias, sendo substituídas por leveduras dominantes típicas de cada destilaria. Outro
método também utilizado é Método PCR Microssatélite (ANTONANGELO et al.
2009).
Basso et al. (2008) citados por Ravaneli (2010), relatam que a
principal razão pela qual essas leveduras são incapazes de permanecer no processo pode
ser a condição de estresse imposta pelas fermentações, tais como alta concentração de
etanol, estresse osmótico, elevadas temperaturas, presença de sulfito e bactérias
contaminantes.
1.2.8 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar
Os compostos fenólicos consistem basicamente de um anel de
benzeno, ao qual se ligam grupo tipo hidroxila, carboxila e metoxila. Uma grande
variedade de compostos fenólicos, tais como cumarinas, taninos, ligninas e flavonoides
são considerados fenóis vegetais (BOVI, 1997).
24
A concentração destes compostos na planta está relacionada ao
ataque de fungos, bactérias e insetos (CRUIKSHANK; PERKIN, 1964; FRIEND,
1979). Em adição, injuria mecânica e química e doenças virais e bacterianas induzem a
produção de cor vermelha no tecido possivelmente como resposta ao estresse na cana-
de-açúcar (GODSHALL; LEGENDRE, 1988).
Os componentes fenólicos sofrem reações não enzimáticas,
incluindo oxidação e autopolimerização com pigmentos marrom escuro, reações com
proteínas e aminoácidos, para produzirem melaninas, pigmentos de coloração marrom e
reações com aldeídos para produzir produtos de condensação vermelhos na presença de
ácidos (BOVI, 1997). Os compostos fenólicos também sofrem reações de
escurecimento por via enzimática. A reação de cor catalisada por enzima resulta da ação
de o-difenol-O2oxiredutase sobre os fenólicos, particularmente ácido clorogênico. A o-
diquinona resultante dessa oxidação é quimicamente reduzida a um o-difenol secundário
e a quinina secundária assim formada, polimeriza para formar cor. Compostos
poliméricos coloridos podem também ser formados a partir da quinonaclorogênica após
reação com aminoácidos (GROSS; COOMBS, 1976, citados por TOSETTO, 2008).
Paton (1978) utilizou cromatografia em camada delgada em
placas de celulose para a identificação de ácidos fenólicos presentes em folhas de cana-
de-açúcar, caldo de cana, e outros produtos oriundos da cana-de-açúcar, identificando
treze ácidos fenólicos (Tabela 1.1).
Larrahondoet al. (1996) promoveram identificação dos
compostos fenólicos em açúcar bruto empregando cromatografia gasosa (CG) acoplada
a espectrometria de massa (MS). Esta analise indicou a presença de diversos ácidos
fenólicos no açúcar bruto, os quais estavam presentes na cana-de-açúcar como ácido
fenólico, siríngico e derivados do ácido cinâmico, além de derivados de ácido benzoico.
Leite (2000) estudou a presença dos compostos fenólicos no
colmo, bainha, folha e palmito da cana-de-açúcar. Foram encontrados no caldo e
confirmados através de cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE), derivados de
ácidos cinâmicos e hidroxibenzóicos, além de derivados de flavonas apigenina,
luteolina, tricina. Observou-se composição mais complexa nas outras partes da cana,
como nove derivados de flavonas na bainha, onze na folha e dezoito no palmito, além
dos ácidos cinâmicos e benzoicos. As folhas, bainhas e palmito contêm compostos
pertencentes às classes já encontradas no colmo, como ácidos 3,5-dihidroxicinamico, o-
cumárico e gentísico.
25
Tabela 1.1 - Compostos fenólicos e flavonóides em cana-de-açúcar e seus produtos,
identificados por diversos autores.
Compostos fenólicos e flavonóides
Derivados do ácido benzóico
ácidogentístico
ácido p-hidroxibenzóico
ácido m-hidroxibenzóico
ácido 3,4-dihidroxibenzóico
ácidovanílico
ácidosiríngico
ácido salicílico
3,4-dihidroxibenzaldeído
p-hidroxibenzaldeído
ácido 2,3-dihidroxibenzóico
vanilina
Derivados do ácido cinâmico
ácido o-cumárico
ácido p-cumárico
ácidocafeico
ácidoferúlico
ácidosinápico
ácidoclorogênico
éster de ácido ferúlico
Derivados de cumarina
cumarina
umbeliferona
esculina
Flavonas
apigenina
luteolina
tricina
Flavonóis
quercetina
rutina
kaempferol
Outros derivados
ácido quiníco-3'-cafeiol
ácido quiníco-3'p-cumaroil
ácido quínico-4-p-cumaroil
coniferina
sinapoil glicose
p-cumaroil glicose
Fonte: TOSETTO (2008)
26
1.2.9 Compostos fenólicos e fermentação alcoólica
Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma
de ação dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos
desinfetantes. Klarmann e Shternov (1936) citados por O’Connor e Rubino (1991),
realizaram testes para comprovar a ação germicida de compostos fenólicos e concluíram
que a potência germicida contra os microrganismos testados aumenta com o aumento do
peso molecular dos compostos fenólicos.
O’Connor e Rubino, (1991) relatou que o fenol e seus derivados
apresentam diversos tipos de ação bactericida. Em altas concentrações estes compostos
atuam como um violento veneno protoplasmático, penetrando e rompendo a parede
celular e precipitando as proteínas celulares. Entretanto, em baixas concentrações, os
fenóis e seus derivados inativam o sistema de enzimas essenciais.
Segundo Borzani e Falcone (1960), o fenol se dissolve no
protoplasma. Sua ação depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e os
lipídeos do protoplasma. Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa um valor
máximo, as proteínas precipitam irreversivelmente e a célula morre.
Martin e Jonsson (2003) compararam a resistência de onze cepas
(industrial e laboratório) de Saccharomyces e Zigosaccharomycesa inibidores da
fermentação de derivados lignocelulósicos. Eles prepararam um coquetel inibidor, em
diferentes concentrações, contendo dois ácidos alifático, dois furaldeídos e dois
compostos fenólicos. Concluíram que dentro de uma mesma espécie existe uma cepa
que é mais resistente ao coquetel inibidor tendo uma redução no rendimento em etanol
de 10% em presença do coquetel inibidor na concentração de 100%, enquanto que a
cepa mais sensível não produziu etanol na presença de 25% do coquetel inibidor.
Conforme Narendranathet al. (2001), os ácidos orgânicos
também são potenciais inibidores das leveduras. Estes compostos estão presentes nas
plantas da cana-de-açúcar e são carreados pelo caldo e acabam se acumulando nos méis
que posteriormente serão fermentados. Este acúmulo acontece quando o caldo passa
pelos evaporadores e cozedores para a retirada da água e cristalização do açúcar, mas a
temperatura que o caldo é submetido não é suficiente para evaporar ou decompor estes
compostos que possuem elevados ponto de ebulição e boa estabilidade térmica.
Polakovic (1992) constatou que os compostos fenólicos atuam
como inibidores do processo de fermentação alcoólica, atuando sobre a enzima
invertase da levedura.
27
1.3 REFERÊNCIAS
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33
RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO
MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE
BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA
ALCOÓLICA.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da concentração
dos compostos fenólicos do mosto com a viabilidade celular, viabilidade de brotamento
e a taxa brotamento celular de levedura alcoólica, durante a safra 2011/2012 na Usina
São Manoel, em São Manuel-SP. A pesquisa foi desenvolvida como um estudo de caso
na planta industrial de fermentação contínua. Esta usina iniciou a safra com a levedura
selecionada CAT-1, sendo que durante a safra as cepas nativas adentraram o processo
fermentativo. As análises de concentração de compostos fenólicos do mosto foram
realizadas através do método FolinCiocalteu, enquanto que as análises de viabilidade
celular, viabilidade de brotamento e brotamento da levedura foram feitas através de
contagem em câmara de Neubauer com corante azul de metileno. A análise estatística
foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do
teste t. Concluiu-se que, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação
negativa sobre a viabilidade celularnos períodos com leveduras 100% das nativas e no
período geral da safra; sobre a viabilidade de brotamento somente o período com
leveduras 100% nativas tiveram relação negativa. Os compostos fenólicosnão
apresentaram relação com o brotamento celular da levedura em nenhumdos períodos
estudados.
Palavras-chave: compostos fenólicos, Saccharomycescerevisiae, viabilidade celular,
brotamento.
34
RELATIONSHIP OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS
CONCENTRATION WITH THE CELLULAR VIABILITY, BUDDING
VIABILITY AND THE CELLULAR BUDDING TAX OF THE ALCOHOLIC
YEAST.
SUMMARY
The aim of this project was to evaluate the relationship of the
must phenolic compounds concentration with the cellular viability, budding viability,
alcoholic yeast cellular budding tax during the harvest 2011/2012 in São Manoel Sugar
Mill, São Manuel (SP).The research was developed as a case study in the industrial
plant of continuous fermentation. This unit began the harvest with the selected yeast
called CAT-1. During the harvest, the native stumps penetrated the fermentation process
Analyses of concentration of the must phenolic compounds were accomplished through
the FolinCiocalteu method, while the analyses of cellular viability, budding viability
and budding yeast were made through counting in Neubauer chamber using a
marker(m-ethilen blue).Statistical analysis was evaluated by Pearson’s correlation
coefficient and its significance through the “t” test.It was concluded that the must
phenolic compounds had negative relationship about the cellular viability in the periods
with 100% of native yeasts along the general period of the harvest; about the budding
viability only the period with 100% native yeasts had negative relationship. The
phenolic compounds didn't present relationship with the budding cellular yeast and with
the efficiency of the fermentation in none of the studied periods.
Key-words: phenolic compounds, Saccharomyces cerevisiae, cellular viability, budding.
35
2.1 INTRODUÇÃO
As leveduras são organismos eucarióticos e formam uma das
classes mais importantes de fungos. As células de Saccharomycescerevisiae
apresentam-se normalmente na forma unicelular, com 2 a 8 micrometros de diâmetro.
Estas se reproduzem basicamente por brotamento, onde a célula mãe, após um período
de união entre os citoplasmas, dá origem a uma nova célula (TOSETTO, 2008).
Segundo Okoloet al. (1987) citado por Ravaneli (2010), a
porcentagem de células e brotos viáveis durante a fermentação é de extrema importância
para a manutenção da população de leveduras, sendo seu monitoramento
imprescindível, uma vez que, além de metabólitos indesejáveis na matéria-prima,
compostos tóxicos às leveduras que são produzidos durante a fermentação podem
acumular-se no fermento promovendo perdas de viabilidade e reduzindo a eficiência
industrial.
Entre os compostos tóxicos que merecem especial destaque,
como inibidores das leveduras alcoólicas, estão os ácidos orgânicos e os compostos
fenólicos. Na literatura há vários trabalhos que descrevem os efeitos danosos de
compostos fenólicos sobre uma população microbiana, estando incluídas no grupo
suscetível as células de levedura (BORZANI; FALCONE, 1960; O’CONNOR;
RUBINO, 1991; MARTIN; JONSSON, 2003). Alguns destes compostos estão
presentes no caldo da cana, dentre eles o ácido gálico, ácido salicílico, ácido cafeico,
ácido ferúlico, ácido sináptico, ácido vanílico, conforme Leite (2000).
Os compostos fenólicos são originados do metabolismo
secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento e reprodução, além de
se formarem em condições de estresse, como infecções, ferimentos, radiações UV,
dentre outros (ANGELO; JORGE, 2007). Basicamente são substâncias formadas pelo
anel benzênico com grupos hidroxilas associados diretamente à estrutura cíclica. Esses
compostos são sintetizados a partir de duas rotas metabólicas principais: a via do ácido
chiquímico e a via do ácido mevalônico (KEGG, 2008).
Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma
de ação dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos
desinfetantes (Klarmann; Shternov, 1936 citados por O’Connor; Rubino, 1991).
Segundo Borzani e Falcone (1960), o fenol se dissolve no protoplasma e sua ação
depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e os lipídeos do protoplasma.
36
Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa um valor máximo, as proteínas
precipitam irreversivelmente e a célula morre.
Os compostos fenólicos que estão presentes nas plantas da cana-
de-açúcar e são carreados pelo caldo, acabam se acumulando nos méis que
posteriormente serão fermentados (TOSETTO, 2008).
Durante o processo de fermentação, a presença de compostos
fenólicos podem inibir a reprodução da levedura, o que resulta em menor viabilidade
das células e brotos, comprometendo o reaproveitamento de células (RAVANELI et al.
2006). Ravaneli (2010) que trabalhou com os efeitos dos compostos fenólicos na
viabilidade celular de leveduras alcoólica, afirmou que a redução da viabilidade celular
no decorrer dos ciclos fermentativos foi menor em relação ao início dos primeiros
ciclos. Nesse trabalho, o autor concluiu que a queda na viabilidade ao longo dos ciclos
possivelmente ocorreu em função do estresse acumulado pela levedura, causado pela
presença das biomoléculas inibidoras do processo fermentativo, tais como compostos
fenólicos, ácidos e a presença de contaminantes.
Tosetto (2008) trabalhou com duas cepas isoladas (Y904 e SA1)
para avaliação dos efeitos dos compostos fenólicos encontrados em melaço (ácido
cafeico 10,75 ppm, vanílico 59,70 ppm, gálico 1,49 ppm e siríngico 72,18 ppm) sobre a
viabilidade celular. Concluiu que a substância que mais afetou a cepa SA1 foi ácido
gálico; o decréscimo por ciclo foi de 6,87% em relação ao valor de viabilidade inicial; já
para a outra cepa, nenhum composto fenólico afetou significativamente a viabilidade
celular.
Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos compostos
fenólicos do mosto sobre a viabilidade celular, viabilidade brotamento e brotamento da
levedura Saccharomycescerevisiae durante o processo de fermentação contínua, na safra
de 2011 da Usina São Manoel, município de São Manuel, estado de São Paulo.
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1 Descrição do processo industrial de fermentação
Na Usina São Manoel, o processo de produção de etanol é
contínuo. O volume útil total dos reatores é de 2.800 m³ e a capacidade de produção
diária é de 1.200 m³ de etanol hidratado e 500 m³ etanol anidro. A planta de
fermentação é composta por três linhas de quatro fermentadores (total de 12) e uma
37
única dorna final. Após o término da fermentação, o vinho passa por centrífugas da
marca Alfa Laval, modelo FESX 512-S-34-60 com rotação de eixo de 1.700 a 1800 rpm
para separação do creme de levedura. O vinho delevedurado (sem as leveduras) segue
para a destilação e o creme de levedura para o tratamento do fermento. Na safra
2011/2012, a Usina São Manoel adotou o processo de recentrifugação, em que o creme
de levedura obtido da centrifugação é diluído com água acidulada (o pH do creme é de
aproximadamente 3,0) e novamente centrifugado, para obter um novo creme que será
tratado (água e ácido sulfúrico) mantendo um pH entre 2,1 a 2,3 e recirculado no
processo fermentativo. Durante a centrifugação ocorre a sangria de fermento para a
fábrica de levedura seca (Figura 2.1).
A multiplicação do fermento para o início da safra foi feita com
270 kg levedura selecionada CAT-1, em cubas de fermentação.
Figura 2.1 – Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São
Manoel.
Dornas de
fermentação
Centrifugação
Cuba de fermento Água
Ácido sulfúrico
Centrifugação
Cubas de fermento Água Ácido sulfúrico
Dornas de
fermentação
Volante - vinho
Aparelhos
destilação
Volante - vinho
Sangria
38
2.2.2 Planejamento experimental e análise estatística
O trabalho foi desenvolvido como um estudo de caso, realizado
na Usina São Manoel, município de São Manuel, estado de São Paulo, durante a safra
2011/2012. Os resultados das análises da concentração de compostos fenólicos do
mosto foram relacionados com a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento e o
brotamento da levedura, no mesmo período.
Após as paradas prolongadas por chuva, foram excluídos três
dias após o reinicio de moagem, para desconsiderar as oscilações que ocorrem durante o
período da parada até estabilizar o processo novamente.
A relação entre as variáveis estudadas foram avaliadas pelo
coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t ao nível de 5%
de probabilidade (GOMES, 1976).
2.3 ANÁLISES QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS
2.3.1 Compostos fenólicos
Amostras pontuais de mosto foram coletadas a cada 4 horas
(6/dia), misturadas e congeladas à temperatura de -3ºC. Para a análise de compostos
fenólicos, a amostra composta foi descongelada, em banho-maria, e submetida à análise
por meio do método de Folin-Ciocalteu, com leitura de absorbância a 650 nm em célula
de 10 mm. O espectrofotômetro utilizado foi da Marca Hach, modelo DR 5000
(CLARKE, et al., 1985).
2.3.2 Identificação das leveduras
A identificação das cepas de leveduras foi feita por meio de
cariotipagem (técnica que separa por eletroforese os cromossomos de leveduras, na sua
forma intacta), sendo que a amostragem foi realizada mensalmente durante a safra pelo
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícola
(CPQBA/UNICAMP).
2.3.3 Viabilidade celular, viabilidade de brotamento e brotamentocelular
Foram realizadas em amostras de vinho da dorna final, por meio
de coletas pontuais (2/dia). O método usado para a determinação da viabilidade celular,
39
viabilidade de brotamento e brotamento foi o da contagem em câmara de Neubauer e
coloração das células com azul de metileno (CTC, 2011).
2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante a safra ocorreu a contaminação do fermento original
com leveduras nativas.A Figura 2.2 mostra a sucessão de cepas de leveduras
Saccharomycescerevisiae durante a safra. A levedura CAT-1 foi utilizada como inóculo
para o processo de fermentação. Observa-se que nos dois primeiros meses de safra (abril
e maio), a cepa CAT-1 representou 100% da população, não havendo contaminação por
leveduras nativas. Nos meses de junho e julho, a cepa CAT-1 (60%) foi contaminada
por quatro leveduras nativas (40%), iniciando o processo de sua eliminação. Nos três
últimos meses de safra (agosto, setembro e outubro), a cepa CAT-1 foi eliminada dos
fermentadores, restando apenas às leveduras nativas. Essa contaminação por leveduras
ocorre devido às variações de condições de processo, das condições climáticas,
qualidade da matéria-prima, etc. (BASSO, 211). Antonangelo, 2009, também observou
o surgimento de outras cepas de leveduras nativas na usina São Manuel na safra
2008/2009.
Figura 2.2 – Resultados das análises de cariotipagem.
Neste estudo, os compostos fenólicos do mosto variaram de 623
a 1.749 mg/L (média de 1.109 mg/L). Essa variação ocorreu em função do tipo de
mosto empregado (caldo/mel ou caldo/mel/água ou mel/água em diferentes proporções)
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
100,0%
14/abr (multiplicação)
09/mai 15/jun 07/jul 09/ago 09/set 24/out
Acompanhamento cariotipagem Safra 2011/2012
Nativa (Biotipo H) não floculante Nativa (Biotipo G) não floculante Nativa (Biotipo F) Floculação forte
Nativa (Biotipo E) Floculação leve Nativa (Biotipo D) Floculação leve Nativa (Biotipo C) Floculação leve
Nativa (Biotipo B) Floculação forte Nativa (Biotipo A) Floculação forte CAT1 - não floculnte
40
e de acordo com concentração de compostos fenólicos contidos no caldo e/ou melaço, a
qual foi influenciada pela qualidade da cana-de-açúcar.
No vinho, a viabilidade celular variou de 70,3 a 98,1% (média
de 89,6%), a viabilidade de brotamento de 55,9 a 100% (média de 84,8%) e o
brotamento celular de 8,5 a 29,4% (média de 15,1%). Essa variação foi decorrente da
instabilidade de processo durante a safra, como paradas prolongadas por chuva ou por
possíveis inibidores presentes no mosto, oriundos da matéria-prima de baixa qualidade.
As Figuras 2.3, 2.4 e 2.5 ilustram a relação da concentração de
compostos fenólicos do mosto sobre a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento e
o brotamento, respectivamente.
Os valores dos coeficientes de correlação, r e do teste t, entre as
variáveis, compostos fenólicos e viabilidade celular estão na tabela 2.1. Para os itens: a)
levedura – 100% CAT-1 e b) levedura – 60% CAT-1 e 40% nativas, as correlações são
não significativa e mostrando que os compostos fenólicos neste caso não estão
relacionados com a viabilidade celular. Já para os itens: c) levedura – 100% nativa e d)
levedura - Geral da Safra, as correlações foram significativas e os compostos fenólicos
no mosto relacionam-se negativamente com a viabilidade celular.
Na tabela 2.2 os valores dos coeficientes de correlação, r e do
teste t, as correlações entre os compostos fenólicos no mosto e a viabilidade do
brotamento apenas o item: c) levedura -100% nativa foi significativo, sendo que neste
caso os compostos fenólicos tiveram relação negativa sobre viabilidade de brotamento.
Para os demais períodos as correlações não são significativas, mostrando que os
compostos fenólicos não tiveram relação com o brotamento celular.
Os compostos fenólicos e o brotamento celular representados na
tabela 2.3, em todos os itens as correlações são não significativas de acordo com os
valores dos coeficientes de correlação, r e do teste t, onde os compostos fenólicos não se
relacionaram com o brotamento celular.
A literatura especializada afirma que a presença de alguns
compostos fenólicos no mosto em fermentação prejudica o metabolismo da levedura
alcoólica, inibindo a reprodução da levedura e a viabilidade celular (RAVANELI, et al.
2006; TOSETTO, 2008; RAVANELI, 2010) Segundo Tosetto (2008) as linhagens de
leveduras tem comportamentos diferentes quando relacionados aos compostos
fenólicos, isso pode explicar a relação entre os compostos fenólicos em determinados
41
momentos da safra, onde observamos a relação hora significativa outra não
significativa.
Os autores que trabalharam nesse tema fizeram uso de
laboratórios, enquanto que o presente trabalho foi realizado em planta industrial; ou
seja, em condições ambientais diferentes. Por exemplo, nos experimentos laboratoriais,
o número de reciclagem é pequeno, 10 ciclos (RAVANELI, 2010; GARCIA et al.,
2010) em relação ao processo industrial, onde o fermento permanece em atividade
durante 6 a 7 meses (aproximadamente 570 ciclos). Mesmo este sendo um estudo em
planta industrial, observamos em determinado período a mesma relação dos compostos
fenólicos sobre a viabilidade celular e a viabilidade de brotamento.
Ravaneliet al. (2006) constaram que houve redução da
viabilidade celular no decorrer dos ciclos fermentativos. Observaram também que a limpeza
de fundo de dorna realizada ao final da maioria dos ciclos (do 3º ao 8º), contribuiu para a
melhoria da viabilidade celular. Neste caso, os autores podem ter feito uma sangria
involuntária, retirando do fermentador células velha, favorecendo a renovação do fermento.
Estima-se que a biomassa de levedura aumente entre 5 a 10%
durante um ciclo de fermentação, sendo suficiente para substituir as células de levedura
perdida durante a centrifugação (BASSO et al., 2011). Considerando esse raciocínio, na
Usina São Manoel, ocorre à sangria (média de 14g de massa seca por litro de etanol
produzido) do fermento para a secagem da levedura, favorecendo a renovação da
população de levedura (AMORIM, 2005), ou seja, as células mais novas estariam
menos suscetíveis ao efeito dos compostos fenólicos em suas concentrações.
Outro fator que deve ser considerado no presente estudo é que
na Usina São Manoel o mosto entra na dorna de fermentação na proporção de 2:1 em
relação ao fermento que foi centrifugado duas vezes, sendo a última com água. Dessa
forma, pode-se considerá-lo com menor concentração de compostos fenólicos. Portanto,
a concentração de compostos fenólicos no mosto em fermentação diminui, passando a
ser em torno de dois terços (67%) da concentração inicial.
Durante o processo de fermentação, o controle operacional
possibilita manobras de condução de processo para garantir a sanidade e vitalidade das
células, como preparo do mosto (caldo/mel ou caldo/mel/água ou mel/água em
diferentes proporções), composição química do mosto (nutrientes presentes no mosto
como nitrogênio amoniacal), centrifugação e controle de contaminação bacteriana,
controle da temperatura nos reatores, etc. Esses controles operacionais podem ter
42
colaborado para que a concentração dos compostos fenólicos não tivesse relação
significativa sobre a viabilidade (levedura 100% CAT-1 e levedura 60% CAT-1 e 40%
nativa), viabilidade de brotamento em alguns períodos e sobre o brotamento em todos
os períodos. Mesmo assim, em alguns períodos os compostos fenólicos tiveram relação
significativa com a viabilidade e a viabilidade de brotamento.
Figura 2.3 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e
aviabilidade celular de levedura alcoólica. a) população composta por 100% da cepa
CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1
e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por
100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras
durante todo o período de safra (período 18/04 a 09/10/11).
Tabela 2.1 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t: compostos
fenólicos x viabilidade celular. a) população composta por 100% da cepa CAT-1
(período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40%
de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de
cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o
período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).
Compostos fenólicos no mosto x Viabilidade celular r t(r)
a) Levedura - 100% CAT-1 0,61 1,71
b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa -0,02 0,14
c) Levedura - 100% nativa -0,32 3,42 *
d) Levedura - Geral Safra -0,25 3,17 *
* Significativo ao nível 5% de probabilidade
(a) (c)
(b) (d)
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% CAT-1
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% nativa
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
bili
dad
e ce
lula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - Geral Safra
43
Figura 2.4 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e a
viabilidade de brotamento de levedura alcoólica. a) população composta por 100% da
cepa CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa
CAT-1 e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta
por 100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras
durante todo o período de safra (período 18/04 a 09/10/11).
Tabela 2.2 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t: compostos
fenólicos x viabilidade de brotamento. a) população composta por 100% da cepa CAT-1
(período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40%
de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de
cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o
período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).
Compostos fenólicos no mosto x Viabilidade brotamento r t(r)
a) Levedura - 100% CAT-1 0,35 0,82
b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa -0,03 0,20
c) Levedura - 100% nativa -0,23 2,29 *
d) Levedura - Geral Safra -0,12 1,55
* Significativo ao nível 5% de probabilidade
(a) (c)
(b) (d)
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
b. b
rota
men
to (
%)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% CAT-1
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
b. b
rota
men
to (
%)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% nativa
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
b. b
rota
men
to (
%)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa
50
60
70
80
90
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Via
b. b
rota
men
to (
%)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - Geral Safra
44
Figura 2.5 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos no mosto e o
brotamento de levedura alcoólica. a) população composta por 100% da cepa CAT-1
(período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40%
de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de
cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o
período de safra (período 18/04 a 09/10/11).
Tabela 2.3 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t: compostos
fenólicos x brotamento celular. a) população composta por 100% da cepa CAT-1
(período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40%
de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de
cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o
período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).
Compostos fenólicos no mosto x Brotamento celular r t(r)
a) Levedura - 100% CAT-1 -0,38 0,93
b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa 0,24 1,69
c) Levedura - 100% nativa -0,06 0,20
d) Levedura - Geral Safra 0,11 1,31
Tosetto (2008) identificou os compostos fenólicos do mel e
concluiu que há linhagens de leveduras que são sensíveis a determinados compostos
fenólicos, enquanto outras cepas não o são. Neste trabalho não foram identificados
isoladamente os compostos fenólicos contidos no mosto. Foi observado que asleveduras
(a) (c)
(b) (d)
0
10
20
30
40
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Bro
tam
ento
cel
ula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% CAT-1
0
10
20
30
40
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Bro
tam
ento
cel
ula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% nativa
0
10
20
30
40
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Bro
tam
ento
cel
ula
r (%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa
0
10
20
30
40
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
Bro
tam
ento
cel
ula
r (%
)Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - Geral Safra
45
nativas apresentaram maior sensibilidade em relação aos compostos fenólicos do mosto,
quando se refere à viabilidade celular e à viabilidade de brotamento.
2.5 CONCLUSÃO
Dentro das condições de trabalho em que os testes foram
realizados, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação negativa sobre a
viabilidade celularno período com leveduras 100% das nativas e no período geral da
safra. Tiveram relação negativa sobre a viabilidade de brotamento somente no período
com leveduras 100% nativas.
Os compostos fenólicosno mosto não apresentaram relação com
o brotamento celular da levedura em todos os períodos.
2.6 REFERÊNCIAS
ANGELO, P. M.; JORGE, N. Compostos fenólicos em alimentos – Uma breve
revisão. Revista Instituto Adolfo Lutz, v. 66, n. 1, p. 232-240, 2007.
ANTONANGELO, A. T. B. F.; et al., D. (2009), Topic 6. Yeasts as cell factories.
Yeast, 26: S125–S135. doi: 10.1002/yea.1689.Abstracts of the 24th International
Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Manchester, UK, 19-24 July
2009.
BASSO, L. C.; BASSO, T. O.; ROCHA, S. N. Ethanol Production in Brazil: The
Industrial Process and Its Impact on Yeast Fermentation. Biofuel Production-Recent
Developments and Prospects,(Bernardes M. A. S., edited by), p. 85-100.. InTech,
ISBN: 978-953-307-478-8, 2011. Disponível em:
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BORZANI, W.; FALCONE, M. Curso de Bioquímica industrial – Fundamentos. Escola
Politécnica da Universidade de Sao Paulo, v.1, 1960.
CTC - CENTRO DE TECNOLOGIA CANAVIEIRA.Manual de métodos analíticos
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CLARKE, M. A. R. S. et al. Color components in sugar refinery processes. In: Annual
meeting of sugar industry technologists, 44., 1985, California. Proceedings.California:
SIT, 1985. p. 53-87. (Paper, 522).
KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Disponível em
http://www.genome.jp/kegg/. Acesso em: 17 de dez. 2009.
46
LEITE, R. A. Compostos fenólicos do colmo, bainha, folha e palmito da cana-de-
açúcar. Campinas, 2000. 142 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Engenharia de
Alimentos - Universidade Estadual de Campinas.
MARTIN, C.; JONSSON, L. J. Comparison of the resistance of industrial and
laboratory strains of Saccharomyces and Zygosaccharomyces to lignocelluloses derived
fermentation inhibitors. Enzyme and Microbial Technology, v.32, p. 386-395, 2003.
O’CONNOR, D. O.; RUBINO, J. R. Phenolic compounds. IN: Seymor S. Block,
Disinfection, sterilization, and preservation.Lea &Febiger, Philadelphia/London,
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RAVANELI, C. G. Qualidade da matéria-prima, microbiota fermentativa e
produção de etanol sob ataque de Mahanarvafimbriolata em cana-de-açúcar.
Jaboticabal, 2010. 103p. Tese (Doutorado),Faculdade de Ciências Agrárias e
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RAVANELI, G.C. et al. Spittlebug infestation in sugarcane affects ethanolic
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TOSSETTO, M. G. Comportamento de linhagens industriais
deSaccharomycesfrente a compostos inibidores no melaço de cana-de-açúcar na
produção de bioetanol.Campinas, 2008. 257p. Tese (Doutorado) - Faculdade de
Engenharia Química - Universidade Estadual de Campinas.
48
RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO
MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR
SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo avaliar a relação entre a
concentração dos compostos fenólicos do mosto sobre a eficiência da fermentação
alcoólica por subprodutos, em processo contínuo, durante a safra 2011/2012, na Usina
São Manoel, município de São Manuel-SP. Esta unidade iniciou a safra com a levedura
selecionada CAT-1, sendo que durante a safra as cepas nativas contaminaram o
processo fermentativo e a cepa CAT-1 foi eliminada do processo. A pesquisa foi
desenvolvida como um estudo de caso na planta de fermentação. As análises de
concentração de compostos fenólicos do mosto foram realizadas através do método
FolinCiocalteu com corante azul de metileno, enquanto a eficiência da fermentação foi
calculada através de subprodutos gerados durante o processo de fermentação alcoólica.
A análise estatística foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson e sua
significância através do teste t. Concluiu-se que os compostos fenólicos contidos no
mosto não se relacionam com a eficiência da fermentação por subprodutos em processo
fermentativo contínuo industrial em nenhumdos períodos estudados.
Palavra chave: Eficiência da fermentação, compostos fenólicos, levedura alcoólica.
49
RELATIONSHIP OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS
CONCENTRATION WITH THE ALCOHOLIC FERMENTATION
EFFICIENCY USING BY-PRODUCTS METHOD IN A CONTINUOUS
PROCESS.
SUMMARY
The aim of this project was to evaluate the relationship of the
must phenolic compounds concentration whit the alcoholic fermentation efficiency
using by-products method in a continuous process, during the harvest 2011/2012 in São
Manoel Sugar Mill, São Manuel (SP).This unit began the harvest with the selected yeast
called CAT-1 and during the harvest, the native stumps contaminated the fermentation
process eliminating CAT-1 stump from the process. Analyses of concentration of the
must phenolic compounds were accomplished through the FolinCiocalteu method using
a marker (m-ethilen blue),while the fermentation efficiency was calculated using by-
products generated along the alcoholic fermentation process.Statistical analysis was
evaluated by Pearson’s correlation coefficient and its significance through the “t” test.
It was concluded that the must phenolic compounds had negative relationship with by-
products fermentation efficiency in industrial fermentation continuous process in none
of the studied periods.
Key-words: fermentation efficiency, phenolic compounds, alcoholic yeast.
50
3.1 INTRODUÇÃO
O processo de fermentação contínua tornou-se popular no Brasil
principalmente devido ao aperfeiçoamento das tecnologias de resfriamento e agitação
do vinho em dornas de grande volume, com manutenção estável da temperatura. Nesse
processo, as células de levedura recuperadas são recirculadas por fermentações
consecutivas durante toda a safra canavieira (FERNANDES, 2011).
Segundo Fernandes (2011), a eficiência é um indicador
porcentual, ou seja, representa o produto recuperado por cento da quantidade disponível
na matéria-prima. Este parâmetro mede com maior fidelidade o desempenho do setor
industrial. No caso da fermentação alcoólica, a eficiência deve ser expressa como a
porcentagem de etanol produzido em relação ao açúcar consumido.
A eficiência da fermentação por subprodutos é medida de
acordo com os subprodutos gerados no processo fermentativo (CTC, 2007, citado por
FERNANDES, 2011), para aplicação em sistemas de fermentação contínua ou
descontínua. Fornece a estimativa da eficiência de fermentação e depende da precisão
das medidas analíticas necessárias para os cálculos (FERNANDES, 2011).
No processo de fermentação há muitos fatores que podem
interferir em um bom rendimento fermentativo, dentre eles está a matéria-prima que
pode conter muitos inibidores celulares. Entende-se por inibição da fermentação a
atuação de compostos sobre as leveduras, que são as responsáveis pela transformação
do açúcar em etanol (TOSETTO, 2008).
Entre os compostos que merecem especial destaque, como
inibidores das leveduras nos processos de fermentação alcoólica, estão os ácidos
orgânicos e os compostos fenólicos. Na literatura há vários trabalhos que descrevem os
efeitos danosos de compostos fenólicos sobre uma população microbiana, estando
incluídas no grupo suscetível as células de levedura (BORZANI; FALCONE, 1960;
O’CONNO; RUBINO, 1991; MARTIN; JONSSON, 2003). Alguns destes compostos
estão presentes no caldo da cana como descrito por LEITE (2000). Dentre os compostos
citados estão o acido gálico, acido salicílico, acido cafeico, acido ferúlico, acido
sináptico, acido vanílico entre outros.
Garcia et al. (2010) ao avaliar o açúcar redutor residual total
(ARRT) em vinho, observaram que os compostos fenólicos, exerceram um efeito
negativo sobre as leveduras, prejudicando sua capacidade de usar os açúcares
51
disponíveis no ambiente, causando uma menor eficiência da fermentação. Observaram
também, que o caldo da cana-de-açúcar com danos causados por pragas, apresentou
níveis mais elevados de contaminantes e os níveis mais elevados de compostos
fenólicos que interferem e prejudicam o processo de fermentação.
Os compostos fenólicos consistem basicamente de um anel de
benzeno, ao qual se ligam grupos hidroxila, carboxila e metoxila. Uma grande variedade
de compostos fenólicos, cumarinas, taninos, ligninas e flavonóides são considerados
fenóis vegetais (BOVI, 1997).
Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma
de ação dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos
desinfetantes (O’CONNOR; RUBINO, 1991).
Polakovic (1992) em seu trabalho constatou que os compostos
fenólicos (fenol, guaiacol e ácido vanílico) atuam como inibidores do processo de
fermentação alcoólica, atuando sobre a enzima invertase da levedura.
Amorim et al. (1996) também relacionaram que o acúmulo de
estresse nas leveduras durantes os ciclos de fermentação, pode ser causado pela
presença de biomoléculas que inibem o processo fermentativo, como os compostos
fenólicos e ácidos orgânicos produzidos durante a fermentação. A presença destes
inibidores são indesejáveis e podem se acumular nas leveduras durante os ciclos,
causando redução na viabilidade e diminuindo eficiência industrial.
Este trabalho teve como objetivo avaliar a relação entre a
concentração dos compostos fenólicos do mosto e a eficiência da fermentação alcoólica
por sobproduto em processo contínuo.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1 Descrição do processo industrial de fermentação
O processo de produção de etanol na Usina São Manoel é
contínuo, sendo que o volume útil total dos reatores soma 2.800 m³. A capacidade de
produção diária é de 1.200 m³ de etanol hidratado e 500 m³ etanol anidro. A planta de
fermentação é composta por três linhas de quatro fermentadores (total de 12) e uma
única dorna final. Após o término da fermentação, o vinho passa por centrífugas da
marca Alfa Laval, modelo FESX 512-S-34-60 com rotação de eixo de 1.700 a 1800 rpm
para separação do creme de levedura. O vinho delevedurado (sem as leveduras) segue
52
para a destilação e o creme de levedura para tratamento do fermento. Na safra
2011/2012, a Usina São Manoel adotou o processo de recentrifugação, em que o creme
de levedura obtido da centrifugação é diluído com água acidulada (o pH do creme é de
aproximadamente 3,0) e novamente centrifugado, para obter um novo creme que será
tratado (água e ácido sulfúrico) mantendo um pH entre 2,1 a 2,3 e recirculado no
processo fermentativo. Durante a centrifugação ocorre a sangria de fermento, que segue
para a fábrica de levedura seca (Figura 3.1).
A multiplicação do fermento para o início da safra foi feita com
270 kg levedura selecionada CAT-1, em cubas de fermentação.
Figura 3.1 Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São Manoel.
3.2.2 Planejamento experimental e análise estatística
O trabalho foi desenvolvido como um estudo de caso, realizado
na Usina São Manoel, município de São Manuel, estado de São Paulo, durante a safra
2011/2012. Os resultados das análises da concentração de compostos fenólicos do
mosto foram relacionados com aeficiência da fermentação no mesmo período.
Após as paradas prolongadas por chuva, foram excluídos três
dias após o reinicio de moagem, para desconsiderar as oscilações que ocorrem durante o
período da parada até estabilizar o processo novamente.
Dornas de Fermentação
Centrifugação Cuba
Tratamento do fermento
Centrifugação
Cuba
Tratamento do fermento
Água + ácido sulfúrico Água + ácido sulfúrico
Sangria do
fermento
Volante
Vinho delevedurado Aparelho destilação
53
A relação entre as variáveis estudadas foram avaliadas pelo
coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t ao nível de 5%
de probabilidade (GOMES, 1976).
3.3 ANÁLISES QUÍMICAS E CÁLCULO DA EFICIÊCIA FERMENTATIVA
POR SUBPRODUTOS.
3.3.1 Compostos fenólicos
Amostras de mosto foram coletadas de forma pontual a cada 4
horas (6/dia), misturadas e congeladas à temperatura de -3ºC. Para a análise de
compostos fenólicos, a amostra composta foi descongelada, em banho-maria, e
submetida à análise por meio do método de Folin-Ciocalteu, com leitura de absorbância
a 650 nm em célula de 10 mm. O espectrofotômetro utilizado foi da Marca Hach,
modelo DR 5000 (CLARKE, et al., 1985).
3.3.2 Cálculo da eficiência da fermentação por subprodutos
𝑬𝒇 = 100
1 + 1,19 . 𝐾1 + 0,5 . 𝐾𝑔 + 0,51 . 𝐾𝑎𝑐 + (0,51 . 𝐾𝑎𝑟𝑟𝑡) (1)
Onde:
Kl = perdas porcentuais devido ao fermento produzido:
𝑲𝟏
= 𝐿𝑒𝑣𝐷𝑉 . 0,33
𝐺𝑟𝑎𝑉𝑉𝐶 . 0,7893 (2)
Karrt Perdas devidas aos açúcares redutores residuais totais
𝑲𝒂𝒓𝒓𝒕 =𝐴𝑅𝑅𝑇
𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝑉𝐶 . 0,7893 (3)
Kg Teor de glicerol no vinho delevedurado
54
𝑲𝒈 = 𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙
𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝑉𝐶. 0,7893(4)
Kac Acidez produzida
𝑲𝒂𝒄 =𝐴𝑐𝑉𝐷𝐹 − 𝐴𝑐𝐹𝑇
𝐿𝑒𝑣𝑉𝑐
𝐿𝑒𝑣𝐹𝑇 – 𝐴𝑐𝑀 1 −
𝐿𝑒𝑣𝑉𝑐
𝐿𝑒𝑣𝐹𝑇
1,837 . 789,3 𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝑉𝐶
100 −
𝐿𝑒𝑣𝑉𝐶
𝐿𝑒𝑣𝐹𝑇
𝐺𝑟𝑎𝑢𝑉𝐹𝑇
100
(5)
Legenda:
LevDV - Porcentagem de fermento vinho delevedurado.
GraVVC - Teor alcoólico vinho delevedurado (% v/v).
Glicerol - Teor de Glicerol vinho delevedurado (%).
AcVDF - Acidez sulfúrica vinho dorna final (g/L).
AcFT - Acidez sulfúrica fermento tratado (g/L).
LevVC - Porcentagem de fermento vinho delevedurado (%).
LevFT - Porcentagem de fermento tratado (%).
AcM - Acidez sulfúrica do mosto (g/L).
GrauVFT - Teor alcoólico fermento tratado (% v/v).
ARRT - Açúcares redutores residuais totais (%)
3.3.3 Análises dos subprodutos para cálculo da eficiência da fermentação
55
3.3.3.1 Porcentagem de fermento vinho deleveduradoe do creme de levedura
As amostras de vinho delevedurado foram coletadas de forma
pontual a cada 4 horas e as amostras do creme de levedura foram coletadas de forma
pontual a cada 8 horas
A porcentagem foi medida através da centrifugação de 10 mL da
amostra em um tubo graduado de 10 mL com fundo cônico em uma centrífuga de
bancada marca Metroterm, modelo MTD – Plus com rotação de 3.500 rpm por 3 min.
Ao final do tempo, observou-se o volume do precipitado no tubo graduado e
multiplicou-se por 10. Sendo o resultado expresso em % (CTC, 2011).
3.3.3.2 Teor alcoólico do vinho deleveduradoe do creme de levedura
As amostras de vinho delevedurado foram coletadas de forma
pontual a cada 4 horas eas amostras de creme de levedura foram coletadas de forma
pontual a cada 8 horas.
As amostras foram destiladas em microdestilador de álcool,
marca Tecnal modelo TE-012 e a leitura do teor alcoólico do destilado feita em
densímetro eletrônico: marca Anton Paar – modelo DMA 4500, sendo o resultado
expresso em % v/v(CTC, 2011).
3.3.3.3 ARRT do vinho delevedurado
As amostras de vinho delevedurado foram coletadas de forma
pontual a cada 8 horas. O método utilizado foi Lane &Eynon e titulação com solução de
Fehling A e B. O resultado foi expresso em porcentagem (CTC, 2011).
3.3.3.4 Glicerol do vinho delevedurado
As amostras de vinho delevedurado foram coletadas de forma
pontual a cada 8 horas. O glicerol foi determinado pelo método enzimático, empregando
espectrofotometria, cuja absorbância é medida a 540 nm. Resultado foi expresso em %
m/v (CTC, 2011).
3.3.3.5 Acidez sulfúrica do mosto, do vinho levedurado e dofermento tratado
As amostras do mosto, do vinho levedurado e do fermento tratado foram
coletadas de forma pontual a cada 4 horas. A determinação foi feita através de titulação
56
com solução de hidróxido de sódio 1mol/L, gota a gota e sob agitação até pH 8,7. O
pHmetro usado foi da marca Mettler Toledo modelo AG 8603 (CTC, 2011).
3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 3.1 mostra a sucessão de cepas de leveduras
Saccharomycescerevisiae no mosto em fermentação, durante a safra. Observa-se que
nos dois primeiros meses de safra (abril e maio), a cepa CAT-1 representou 100% da
população, não havendo contaminação por leveduras nativas. Nos meses de junho e
julho, a cepa CAT-1 (60%) foi contaminada por leveduras duas nativas (40%), iniciando
o processo de sua eliminação. Nos três últimos meses de safra (agosto, setembro e
outubro), a cepa CAT-1 foi eliminada dos fermentadores, restando apenas às leveduras
nativas. Andriettaet al. (2011) também observaram substituição da população de
leveduras no processo fermentativo ao monitorarem a safra de uma usina
sucroalcooleira através de cariotipagem.
A biodiversidade de leveduras encontradas em ambientes de
destilaria poderia ser uma importante fonte de tensões. Isto porque durante a reciclagem
de células de levedura, a pressão seletiva (evolução adaptativa) é aplicada sobre as
células, conduzindo a cepa com maior tolerância para as condições de estresse de
fermentação industrial a predominar (BASSO, et al., 2008).
57
Tabela 3.1 - Resultados das análises de cariotipagem.
Resultado das Análises de Cariotipagem - Safra 2011/2012
Cepas de
Saccharomyces
Data da amostragem do vinho dorna final
14/04/11
(início) 09/05/11 15/06/11 07/07/11 09/08/11 09/09/11 24/10/11
CAT1 - sem perfil
floculação 100,0% 100,0% 64,9% 61,0% - - -
Nativa (Biotipo A)
fortemente
floculante
- - 13,0% - - - -
Nativa (Biotipo B)
fortemente
floculante
- - 13,0% - - - -
Nativa (Biotipo C)
levemente
floculante
- - 9,1% 2,4% 92,9% 54,5% 8,3%
Nativa (Biotipo D)
levemente
floculante
- - - 36,6% - - -
Nativa (Biotipo E)
levemente
floculante
- - - - 7,1% - -
Nativa (Biotipo F)
floculação pesada - - - - - 45,5% -
Nativa (Biotipo G)
não floculante - - - - - - 75,0%
Nativa (Biotipo H)
não floculante - - - - - - 17,0%
Os compostos fenólicos variaram de 623 a 1.749 mg/L (média
de 1.106 mg/L). Essa variação ocorreu em função da concentração dos compostos
fenólicos contidos na matéria-prima (caldo e/ou melaço) sobre o tipo mosto empregado
(caldo/mel ou caldo/mel/água ou mel/água em diferentes proporções) durante a safra.
A eficiência da fermentação por subprodutos variou de 78,4 a
95,72% (média de 91,5%). Essa variação ocorreu por diversos motivos, dentre eles: a
presença de leveduras nativas durante o processo fermentativo (tabela 3.1), retornos de
paradas prolongadas por chuva com matéria-prima com altas horas de queima, o que
compromete a qualidade do mosto.
A Figura 3.2 ilustram a relação da concentração de compostos
fenólicos do mosto e a eficiência da fermentação alcoólica.Pode-se constatar que os
coeficientes angulares assumiram valores próximos de zero, indicando que as retas estão
praticamente paralelas ao eixo x; portanto, não devendo haver correlação entre os dados
analisados, em todos os períodos de safra.
58
Os valores dos coeficientes de correlação, r e do t, entre as
variáveis, compostos fenólicos no mosto e eficiência da fermentação por subprodutos,
em todos os períodos estudados (Tabela 3.2) as correlações são não significativas,
mostrando que neste caso não estão relacionados os compostos fenólicos com a
eficiência da fermentação.
Figura 3.2 – Correlação entre a concentração dos compostos fenólicos do mosto e a
eficiência de fermentação por subprodutos. a) população composta por 100% da cepa
CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1
e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por
100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras
durante todo o período de safra (período 18/04 a 09/10/11).
Tabela 3.2 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:: compostos
fenólicos x rendimento de fermentação por subprodutos. a) população composta por
100% da cepa CAT-1 (período 18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60%
da cepa CAT-1 e 40% de cepas nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população
composta por 100% de cepas nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de
leveduras durante todo o período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).
Compostos fenólicos no mosto x Eficiência da Fermentação r t(r)
a) Levedura - 100% CAT-1 -0,35 0,93
b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa 0,08 0,56
c) Levedura - 100% nativa 0,11 1,06
d) Levedura - Geral Safra 0,05 0,68
(a) (c)
(b) (d)
70
75
80
85
90
95
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic
iên
cia
Ferm
enta
ção
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% CAT-1
70
75
80
85
90
95
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic
iên
cia
Ferm
enta
ção
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% nativa
70
75
80
85
90
95
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic
iên
cia
Ferm
enta
ção
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa
70
75
80
85
90
95
100
500 750 1000 1250 1500 1750 2000Efic
iên
cia
Ferm
enta
ção
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - Geral Safra
59
Polakovic (1992) constatou que os compostos fenólicos como o
fenol, o guaiacol e o ácido vanílico são inibidores do processo de fermentação alcoólica,
atuando sobre a enzima invertase da levedura. Através da Tabela 3.3 os valores dos
coeficientes de correlação, r e do t, entre as variáveis, compostos fenólicos no mosto e
ARRT do vinho, em todos os períodos estudados as correlações são não significativas,
mostrando que neste caso não estão relacionados os compostos fenólicos com o ARRT
do vinho todos os períodos de safra. Neste presente estudo, não foram feitas análises
específicas de identificação de compostos fenólicos.
O comportamento do ARRT do vinho é semelhante ao resultado
sobre a eficiência da fermentação por subproduto. A Figura 3.3 ilustra a correlação entre
as concentrações de compostos fenólicos do mosto e do ARRT do vinho.
Figura 3.3 - Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e o
ARRT do vinho. a) população composta por 100% da cepa CAT-1 (período 18/04/11 a
09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40% de cepas nativas
(período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de cepas nativas
(período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o período de
safra (período 18/04 a 09/10/11).
(a) (b)
(c) (d)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
AR
RT
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% CAT-1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
AR
RT
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
AR
RT
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - 100% nativa
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
500 750 1000 1250 1500 1750 2000
AR
RT
(%
)
Compostos fenólicos mosto (mg/L)
Cepa levedura - Geral Safra
60
Tabela 3.3 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t: compostos
fenólicos x ARRT do vinho. a) população composta por 100% da cepa CAT-1 (período
18/04/11 a 09/05/11); b) população composta por 60% da cepa CAT-1 e 40% de cepas
nativas (período 10/05/11 a 07/07/11); c) população composta por 100% de cepas
nativas (período 08/07/11 a 09/10/11); d) população de leveduras durante todo o
período de safra (período 18/04/11 a 09/10/11).
Compostos fenólicos no mosto x ARRT vinho r t(r)
a) Levedura - 100% CAT-1 0,34 0,88
b) Levedura - 60% CAT-1 e 40% nativa -0,22 1,57
c) Levedura - 100% nativa -0,04 0,37
d) Levedura - Geral Safra 0,06 0,81
Garcia et al. (2010) constatou que durante os ciclos estudados
(10) os compostos fenólicos exerceram um efeito negativo sobre as leveduras,
prejudicando sua capacidade de usar os açúcares disponíveis, resultando em baixa
eficiência da fermentação.
Ao contrário do que foi observado pelos autores citados
anteriormente, no presente trabalho não foi possível relacionar os danos dos compostos
fenólicos do mosto sobre as leveduras, com consequente redução da eficiência da
fermentação. É provável que as metodologias de análise química empregadas não
permitiram que as equações de regressão fossem estatisticamente significativas. Além
disso, os autores que trabalharam nesse tema fizeram uso de laboratórios, enquanto que
o presente trabalho foi realizado em planta industrial; ou seja, em condições ambientais
diferentes. Por exemplo, nos experimentos laboratoriais, o número de reciclagem é
pequeno (10 ciclos) em relação ao processo industrial, onde o fermento permanece em
atividade durante 6 a 7 meses (aproximadamente 570 ciclos).
Durante o processo de fermentação, o controle operacional
possibilita manobras de condução de processo para garantir a sanidade das células, e
melhor rendimento industrial, tais como o preparo do mosto (caldo/mel ou
caldo/mel/água ou mel/água em diferentes proporções), composição química do mosto
(nutrientes presentes no mosto como nitrogênio amoniacal), centrifugação e
recentrifugação do creme, controle de contaminação bacteriana e sangria. Esses
controles operacionais podem ter colaborado para que os compostos fenólicos não
interferissem no rendimento fermentativo por subprodutos.
61
3.5 CONCLUSÃO
Dentro das condições de trabalho em que os testes foram
realizados, concluiu-se que os compostos fenólicos contidos no mosto não se
relacionam com a eficiência da fermentação por subprodutos em processo fermentativo
contínuo industrial.
3.6 REFERÊNCIAS
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controle e monitoramento. FERMENTEC/FEALQ/ESALQ-USP. Piracicaba,1996.
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has Brazil learned about yeasts inhabiting the ethanol production processes from sugar
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edited by), p.67-84. InTech, ISBN: 978-953-307-478-8, 2011. Disponível em:
http://www.intechopen.com/articles/show/title/bioethanol-what-has-brazil-learned-about-yeasts-inhabiting-the-ethanol-production-processes-from-sug.
Acessoem: 24 out. 2012.
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fuel ethanol production in Brazil. FEMS YeastResearch, Amsterdam, v. 8, p. 1155-
1163, 2008.
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Politécnica da Universidade de São Paulo, v.1, 1960.
BOVI, R. Avaliação do efeito de diferentes fontes de impurezas fibrosas da cana-de-
açúcar sobre as características do caldo. Campinas, 1997. 81p. Tese (Doutor)
Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas.
CLARKE, M. A. R. S. et al. Color components in sugar refinery processes. In:
ANNUAL MEETING OF SUGAR INDUSTRY TECHNOLOGISTS, 44th, 1985,
California. Proceedings.California: SIT, 1985. p. 53-87. (Paper, 522).
CTC - CENTRO DE TECNOLOGIA CANAVIEIRA.Manual de métodos analíticos
controle químico da fermentação. Piracicaba, 2011.
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Piracicaba: STAB, p. 416. 2011
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process.ScientiaAgricola, Piracicaba, SP, v. 67, n. 5, p. 555-561, September/October
2010.
62
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açúcar. Campinas, 2000. 142 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Engenharia de
Alimentos - Universidade Estadual de Campinas.
MARTIN, C.; JONSSON, L. J. Comparison of the resistance of industrial and
laboratory strains of Saccharomyces and Zygosaccharomycestolignocelluloses derived
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(Mestrado) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Universidade Estadual
Paulista.
TOSSETTO, M. G. Comportamento de linhagens industriais de Saccharomyces
frente a compostos inibidores no melaço de cana-de-açúcar na produção de
bioetanol.Campinas, 2008. 257p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Engenharia Química
- Universidade Estadual de Campinas.
64
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A literatura especializada relata que o aumento da concentração de
compostos fenólicos na cana-de-açúcar pode estar relacionado com infestações de pragas na
lavoura, sendo que este aumento pode prejudicar o processo de fermentação alcoólica.
Por esse motivo, no inicio da Safra 2011/2012, a Usina São Manoel
adotou em sua rotina laboratorial, a análise de compostos fenólicos no caldo de cana-de-
açúcar e mosto de fermentação. O propósito dessas análises foi monitorar a concentração
dos compostos fenólicos durante a safra e sua relação com as leveduras e a eficiência de
fermentativa.
Como foi o primeiro ano que foi realizado esse trabalho com
compostos fenólicos, a Usina São Manoel optou por fazer um acompanhamento com essa
análise durante as próximas safras, a fim de gerar um histórico sobre os resultados e poder
comparar entre as safras.
Como sugestão de novos trabalhos, seria interessante direcionar
estudos de identificação e a quantificação dos compostos fenólicos contidos no caldo de
cana-de-açúcar de acordo com índices de infestações por praga, como por exemplo, a broca,
comparando com o caldo de cana-de-açúcar considerado sadio. Relacionar os dados
encontrados, com o efeito destes como inibidores celulares sobre o processo fermentativo e
também, sobre as cepas de primeira geração e com cepas de reciclos, as quais podem ou não
sofre influencia de saturação.