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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
FUNGEMIA DIAGNOSTICADA POR HEMOCULTURA E PCR MULTIPLEX EM
PACIENTES NEUTROPÊNICOS FEBRIS ONCO-HEMATOLÓGICOS
HEBERTON MEDEIROS TEIXEIRA
RECIFE
2011
HEBERTON MEDEIROS TEIXEIRA
FUNGEMIA DIAGNOSTICADA POR HEMOCULTURA E PCR MULTIPLEX EM
PACIENTES NEUTROPÊNICOS FEBRIS ONCO-HEMATOLÓGICOS
ORIENTADORA: PROFA. DRA. VERA MAGALHÃES DA SILVEIRA
COORIENTADOR: PROF. DR. CARLOS ALEXANDRE ANTUNES DE BRITO
RECIFE
2011
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À BANCA EXAMINADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL – CCS/UFPE COMO REQUISITO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM MEDICINA TROPICAL ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: MEDICINA TROPICAL.
Teixeira, Heberton Medeiros Fungemia diagnostica por hemocultura e PCR multiplex em pacientes neutropênicos febris onco-hematológicos / Heberton Medeiros Teixeira. – Recife: O Autor, 2011.
112 folhas: il., quadro. ; 30 cm .
Orientador: Vera Magalhães da Silveira
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2011.
Inclui bibliografia, apêndices e anexos.
1. Diagnóstico. 2. Fatores de risco. 3. Fungemia. 4. Neutropenia. 5. Reação em cadeia de polimerase. I. Silveira, Vera Magalhães da. II.Título.
UFPE
616.994 18 CDD (20.ed.) CCS2011-069
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Amaro Henrique Pessoa Lins
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
José Thadeu Pinheiro
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
TROPICAL
Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
TROPICAL
Heloísa Ramos Lacerda de Melo
CORPO DOCENTE
Ana Lúcia Coutinho Domingues
Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Fábio André Brayner dos Santos
Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Maria Amélia Vieira Maciel
Maria do Amparo Andrade
Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
Marli Tenório Cordeiro
Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Vera Magalhães da Silveira
Valdênia Maria Oliveira de Souza
Vláudia Maria Assis Costa
Dedico esta dissertação de mestrado:
A Deus, nosso pai e criador, sem ele nada disso existiria.
À minha amada Carolina, esposa, amiga e companheira, razão do meu
viver, e que tanto me apoiou nessa caminhada, sem você não teria
conseguido essa realização.
À nossa filha desejada e já querida, Maria Eduarda, esperamos que a
sua geração seja mais humana e menos egoísta.
Aos meus queridos pais Osman Teixeira (in memorian) e Marlene
Medeiros Teixeira, que abdicaram de seus sonhos em favor dos meus,
sempre fornecendo carinho, ensinamentos e apoio em todos os
momentos, amo vocês.
Aos meus irmãos Anderson e Robson e suas esposas Nóia e Isabelly,
pela amizade de todas as horas, compreensão e auxílio.
Aos meus sogros Dr. Kleber e Dra. Heide, à minha cunhada Gabriela,
ao seu esposo Rafael e ao meu sobrinho Rafinha pelo suporte, amparo,
companhia e convivência familiar salutares.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Dra. Vera Magalhães, por suas considerações, paciência, disponibilidade e importância no desenvolvimento desse trabalho.
Ao meu coorientador Dr. Carlos Brito, pela amizade e ajuda na definição e elaboração dessa pesquisa.
À toda a equipe do laboratório de biologia molecular do serviço de oncologia do instituto materno-infantil professor Fernando Figueira (IMIP), em especial, à Dra. Norma Lucena pela inspiração do projeto e por todo o suporte ao longo da sua realização e ao colega Jurandy Magalhães pelas orientações e realizações das técnicas moleculares empregadas.
Ao centro de pesquisa e corpo clínico da enfermaria do HEMOPE, em especial Dra. Paula Loureiro, chefe do centro de pesquisa, Dra. Fernanda Souto, chefe da enfermaria, Dra. Maria Conceição Barros, médica assistente responsável pelo andamento da pesquisa nessa instituição e toda a equipe de enfermagem pelo auxílio na aquisição das amostras.
À Dra. Helóisa Ramos, que muito me auxiliou no planejamento do estudo.
Aos professores do Departamento de Medicina Tropical e seus colaboradores, admiro sua dedicação e amor pelo que fazem.
Aos amigos adquiridos durante a pós graduação.
A Alice Lourenço e Walter Leite Galdino, pelo apoio e orientação na Secretaria da Pós-graduação de Medicina Tropical.
À toda minha família (Nascimento, Matias, Medeiros e Teixeira), por fazerem parte dessa história.
Aos pacientes, pela contribuição e disposição para participar da pesquisa, apesar de tanto sofrimento durante as suas internações. Não podemos esquecer nunca, que vocês são a razão maior da realização dessa pesquisa.
Aos amigos e colegas de trabalho, em especial a José Fernando e Ana Caroline Patu, que entenderam e deram suporte, no período em que estive mais ausente.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
“Há homens que lutam um dia, esão bons; Há outros que lutam um ano, e sãomelhores; Há aqueles que lutam muitos anos,e são muito bons; Porém há os que lutam toda umavida.
RESUMO
FUNGEMIA DIAGNOSTICADA POR HEMOCULTURA E PCR MULTIPLEX EM PACIENTES NEUTROPÊNICOS FEBRIS ONCO-HEMATOLÓGICOS
Neutropenia febril é uma complicação infecciosa frequente em oncologia clínica, no entanto, só consegue-se isolar o agente etiológico, causador da infecção, em 20 a 30% dos casos, desses, apenas 5 % deve-se a infecção fúngica invasiva. Essa infecção é a principal causa de letalidade em neutropênicos febris. O isolamento de fungos por hemocultura é um processo demorado e nem sempre viável. Dessa forma, na prática clínica, utiliza-se critérios clínicos, radiológicos e a presença de fatores de risco para definir-se doença fúngica invasiva (DFI) e iniciar antifúngicos. Objetivo: Avaliar a frequência de fungemia e sua etiologia em pacientes onco-hematológicos com episódios de neutropenia febril utilizando-se de hemocultura e multiplex PCR (MT-PCR) panfúngica no Hemocentro de Pernambuco (HEMOPE) e descrever as características oncológicas e os fatores de risco dos pacientes. Método: Estudo descritivo, do tipo série de casos, avaliando os resultados de hemocultura e MT-PCR após coleta de sangue durante episódios de neutropenia febril em pacientes onco-hematológicos, no período entre fevereiro e novembro de 2010. Neutropenia febril foi definida conforme critérios da IDSA 2010, considerando-se neutropenia um número de neutrófilos < 500/mm3 ou entre 500 a 1000/mm3 com tendência a declínio. Febre foi definida por uma mensuração maior ou igual a 37,8°C ou maior ou igual a 37,5°C por mais de uma hora. Novo episódio de neutropenia febril foi determinado por reinício da febre após um período de 72 horas afebril. DFI foi definida como comprovada, provável ou possível de acordo com o EORTC-MSG, no dia da coleta da amostra de sangue para realização da MT-PCR. Para avaliação estatística utilizou-se o programa SPSS versão 13, com a qual obteve-se a análise descritiva dos dados. Resultados: Foram constatados 74 episódios de neutropenia febril em 44 pacientes portadores de doença onco-hematológica, com e sem critérios para doença fúngica invasiva. A hemocultura foi positiva em dois episódios de doença fúngica comprovada, decorrentes de Candida parapsilosis e tropicalis, enquanto a MT-PCR foi positiva em um dos episódios. Ocorreram ainda mais 16 casos com critérios clínicos para infecção fúngica, (3 prováveis e 13 possíveis) com a MT-PCR identificando fungemia em 12. Entre os 50 episódios negativos para critérios de DFI, a MT-PCR foi positiva em 20 (40%). A PCR conseguiu registrar quarenta e duas infecções fúngicas através da presença de ITS positivo na reação, com a determinação por MT-PCR de vinte e três espécies em 21 análises (duas PCRs identificaram duas espécies de fungo no mesmo episódio), assim distribuídos: C. parapsilosis 10 (43,5%), Cryptococcus neoformans 6 (26,1%), C. glabrata 4 (17,4%), C. tropicalis 2 (8,7%) e C. albicans 1(4,3%). Em 11 (61,2%) episódios de DFI os pacientes apresentavam leucemia mielóide aguda
(LMA) como doença oncológica. A mediana de dias de neutropenia foi de 9, 20 e 20, para DFI comprovada, provável e possível, respectivamente. Conclusão: A utilização da MT-PCR associada a hemocultura aumentou o número de documentação microbiológica, em episódios de neutropenia febril, quando infecção fúngica invasiva é suspeita, demonstrando uma frequência de fungemia de 21%, o equivalente a 14 infecções fúngicas, das quais 2 (3,0%) correspondiam a DFI comprovada, 2 (3,0%) DFI provável e 10 (14%) a infecção fúngica possível. LMA como neoplasia de base e o tempo de neutropenia acima de dez dias foram os fatores de risco que ocorreram com maior frequência em pacientes onco-hematológicos com episódios de neutropenia febril (NF) e infecção fúngica.
Palavras-chave: Diagnóstico. Fatores de risco. Fungemia. Neutropenia. Reação em cadeia de polimerase.
ABSTRACT
FUNGEMIA DIAGNOSED BY BLOOD CULTURE AND MULTIPLEX PCR IN ONCO-HEMATOLOGICAL PATIENTS WITH FEBRILE NEUTROPENIA
Febrile neutropenia is a frequent infectious complication in clinical oncology and the use of empyrical broad-spectrum antibacterial therapy has reduced the mortality in this group of patients in the last decades. The microbiological documentation of infection is achieved in only 20-30% of cases and 5% of these are due to invasive fungal disease (IFD), which is a major cause of mortality in neutropenic patients with fever. Because laboratory diagnosis of fungemia by blood cultures lacks sensibility and is often delayed, the definition and treatment of IFD is often made by clinical and radiologic criteria and by the presence of risk factors. Objective: To evaluate the fungemia frequence and its etiology in onco-hematological patients with febrile neutropenia using blood cultures and panfungal multiplex PCR (MT-PCR) at the Hemocentro de Pernambuco (HEMOPE) and to describe the oncologic characteristics and risk factors of IFD of these patients. Methods: Descriptive case series study evaluating the blood cultures and MT-PCR samples collected during each febrile neutropenia episode in onco-hematological patients between February and November 2010. Febrile neutropenia was defined based on IDSA 2010 criteria, considering neutropenia the absolute neutrophil count < 500/mm3 or < 1000/mm3 with predicted decline to < 500 cells/mm3 and fever as a single temperature >38oC or > 37,8oC for more than one hour. A new episode of febrile neutropenia was determined as fever reappearance after a 72-hour period without fever. IFD was defined as proven, probable or possible according to EORTC-MSG at the day blood sample was collected for MT-PCR. Statistical analyses were performed with SPSS version 13. Results: 74 febrile neutropenia episodes in 44 onco-hematological patients with and without IFD criteria were analysed. Blood cultures were positive in two cases of proven IFD, due to Candida parapsilosis and Candida tropicalis while MT-PCR was positive in one of proven IFD episodes. In other 16 cases with clinical criteria for IFD (3 probable and 13 possible), MT-PCR indentified fungemia in 12. Among the 50 episodes without clinical criteria for IFD, MT-PCR was positive in 20 (40%). The PCR was able to register forty two fungal infections through the presence of ITS in the positive reaction, as determined by MT-PCR of twenty three species in 21 tests (two PCRs identified two species of fungus in the same episode), as follows: C. parapsilosis 10 (43.5%), Cryptococcus neoformans 6 (26.1%), C. glabrata 4 (17.4%), C.
tropicalis 2 (8.7%) and C. albicans 1 (4.3%). In 11 (61,2%) of IFD episodes the patients had acute myeloid leukemia (AML) diagnosis. The median neutropenia duration was 9, 20 and 20 for proven, probable and possible IFD, respectively. Conclusion: MT-PCR combined with blood cultures increased the number of microbiological documentation during febrile neutropenia when IFD was suspected. AML diagnosis and neutropenia duration of more than 10 days were the most frequent risk factors for IFD in onco-hematological patients with febrile neutropenia and fungemia.
Keywords: Diagnosis. Fungemia. Neutropenia. Polymerase chain reaction. Risk Factors.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Definição operacional e categorização das variáveis pág.38
Quadro 2. Espectro de análise da MT-PCR panfúngica e seus iniciadores pág.43
LISTA DE
TABELAS
Revisão de literatura Tabela 1. Escore MASCC (Multinational Association for Supportive Care in Cancer), para classificação de risco do episódio de neutropenia febril
pág.20
Artigo 1
Tabela 1. Espectro de análise da MT-PCR panfúngica e seus iniciadores pág.51
Tabela 2. Sexo , idade e tipo de neoplasia em 42 pacientes com episódios de neutropenia febril
pág.52
Tabela 3. Dias de neutropenia, número de episódios, micro-organismos isolados e sítio de infecção em 67 episódios de neutropenia febril Tabela 4. Espécies de fungos identificadas por hemocultura e MT- PCR Tabela 5. Distribuição dos resultados de hemocultura, MT-PCR, resposta à antifúngico e óbito segundo os critérios para doença fúngica invasiva
pág.53 pág.54 pág.54
Artigo 2
Tabela 1. Espécies de fungos identificadas por hemocultura e MT- PCR, nas doenças fúngicas invasivas (DFIs), em 74 episódios de neutropenia febril
pág.69
Tabela 2. Características oncológicas, idade e tempo de neutropenia dos pacientes nos 18 episódios de neutropenia febril e doença fúngica invasiva (DFI)
pág.70
Tabela 3. Frequência dos fatores de risco de acordo com a classificação de doença fúngica invasiva (DFI), em 74 episódios de neutropenia febril
pág.71
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
aids - Síndrome da imunodeficiência adquirida
β - Beta
BIOL MOL - Laboratório de biologia molecular
°C - Graus Celsius
CE - Corticosteróide
Cols - Colaboradoes
CVC - Cateter venoso central
DECH - Doença do enxerto contra hospedeiro
DEPC - Dietil pirocarbonato
DFI - Doença fúngica invasiva
DM - Diabetes mellitus
DNA - Deoxyribonucleic acid
DPOC - Doença pulmonar obstrutiva crônica
dNTP - Desoxirribonucleotídeo trifosfato
ECOG - Eastern Cooperative Oncology Group
EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid
e.g. - em geral
ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay
EORTC - European Organization for Research and Treatment of Cancer
EUA - Estados Unidos da América
FMUSP - Faculdade de Medicina da Universidade do estado de São Paulo
FNT –α - Fator de necrose tumoral alfa
gpdH - glicerol 3-fosfato desidrogenase
HEMOPE - Hemocentro de Pernambuco
IDSA - Infectious Diseases Society of America
IMIP - Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira
ITS - Internal transcribed spacer
Kg - Quilograma
LA - Leucemia aguda
MASCC - Multinational Association for Supportive Care in Cancer
mg - Miligrama
MgCl2 - Cloreto de magnésio
min - Minutos
µl - Microlitro
ml - Mililitro
mM - Milimolar
mm3 - Milímetro cúbico
MSG - Mycoses Study Group
MT-PCR - multiplex PCR
NF - Neutropenia febril
ng - Nanograma
NIAID - National Institute of Allergy and Infectious Disease
NPT - Nutrição parenteral total
PBS - Phosphate buffered saline
PCR - Polymerase chain reaction
PE - Pernambuco
pmol - Picomol
QT - Quimioterapia
RNM - Ressonância nuclear magnética
rpm - Rotações por minuto
seg - Segundo
SMD - Síndrome mielodisplásica
SNC - Sistema nervoso central
SVD - Sonda vesical de demora
Taq - Thermus aquaticus
TC - Tomografia computadorizada
TMO - Transplante de medula óssea
US - Ultrassom
UTI - Unidade de terapia intensiva
VPP - Valor preditivo positivo
VPN - Valor preditivo negativo
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE QUADROS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
1. DELIMITAÇÃO DO TEMA ------------------------------------------------------------------ pág.17
2. REVISÃO DA LITERATURA ----------------------------------------------------------------pág.19
2.1. NEUTROPENIA FEBRIL ------------------------------------------------------------- pág.19
2.2. FUNGEMIA ------------------------------------------------------------------------- ----- pág.21
2.3. NEUTROPENIA FEBRIL E FUNGEMIA ---------------------------------------- pág.28
2.4. PCR PARA FUNGEMIA -------------------------------------------------------------- pág.33
3. OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------------------------- pág.36
3.1. OBJETIVO GERAL -------------------------------------------------------------- ----- pág.36
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS -------------------------------------------------------- pág.36
4. PACIENTES E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------- pág.37
4.1. DESENHO DO ESTUDO --------------------------------------------------------------- pág.37
4.2. POPULAÇÃO ALVO -------------------------------------------------------------------- pág.37
4.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ---------------------------------------------------------- pág.37
4.4. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO --------------------------------------------------------- pág.37
4.5. DEFINIÇÃO DE TERMOS E VARIÁVEIS ---------------------------------------- pág.37
4.6. MÉTODO DE COLETA DE DADOS ------------------------------------------------ pág.40
4.7. QUALIDADE DOS INSTRUMENTOS DE MEDIDA E PADRONIZAÇÃO DAS TÉCNICAS ----------------------------------------------- pág.41
4.8. PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS --------------------------------- pág.43
5. ASPECTOS ÉTICOS --------------------------------------------------------------------------- pág.44
ARTIGO 1: FREQUÊNCIA E ETIOLOGIA DE INFECÇÕES FÚNGICAS DIAGNOSTICADAS ATRAVÉS DE HEMOCULTURA E/OU PCR MULTIPLEX PANFÚNGICA EM PACIENTES ONCO- HEMATOLÓGICOS NEUTROPÊNICOS FEBRIS ----------------------------------------- pág.45
ARTIGO 2: CARACTERÍSTICAS ONCOLÓGICAS E FATORES DE RISCO EM PACIENTES NEUTROPÊNICOS FEBRIS COM INFECÇÕES FÚNGICAS INVASIVAS --------------------------------------------------------- pág.63
6. CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------------------------------- pág.
79
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ----------------------------------------------------------------- pág. 79
8. REFERÊNCIAS --------------------------------------------------------------------------------- pág.80
APÊNDICE A (TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO-HEMOPE) ---------------------------------------------------------------------- pág.90 APÊNDICE B (TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO-FIOCRUZ) ---------------------------------------------------------------------- pág.91 APÊNDICE C-(FICHA DE COLETA DE DADOS/QUESTIONÁRIO) ----------------- pág.92
ANEXOS ----------------------------------------------------------------------------------------------- pág.96
ANEXO A – (APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA DO HEMOPE) ANEXO B – (APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA DA FIOCRUZ) ANEXO C - (NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS ORIGINAIS DA REVISTA EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY & INFECTIOUS DISEASES)
ANEXO D - (NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS ORIGINAIS DA REVISTA BRASILEIRA DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA)
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1. DELIMITAÇÃO DO TEMA
Neutropenia febril (NF) é uma complicação infecciosa frequente em pacientes
oncológicos, com incidência que pode chegar a mais de 20% dependendo do protocolo
antineoplásico utilizado (FREIFELD et al, 2011), sendo classificada em alto ou baixo risco de
letalidade, de acordo com a duração da neutropenia (TALCOTT et al, 1992).
As causas de febre em neutropênicos são: de etiologia bacteriana em 30-35% dos casos,
fúngica em 5%, viral em outros 5% e em 50 a 60% dos casos por causas não determinadas como
medicamentos, mucosite, febre tumoral ou infecções não diagnosticadas (FREIFELD et al, 2011).
Quando a infecção é devida a fungemia, em 90 % dos casos se deve a Candida sp ou
Aspergillus sp e raramente ocorre em neutropenias menores que uma semana (CUNHA, 2006).
Candidemia nosocomial é a principal causa de infecção fúngica invasiva no ser humano e
apresenta uma taxa de letalidade de até 47% (GUDLAUGSSON et al, 2003), correspondendo a
quarta maior causa de infecção nos Estados Unidos da América (EUA), com uma incidência de
0,46 casos por 1000 admissões (GAREY et al, 2006). A incidência, no Brasil é maior que nos
EUA com uma taxa de 2,49 casos por 1000 admissões (COLOMBO et al, 2006) e um estudo
realizado no Recife em hospital terciário demonstrou uma incidência de 3,9 casos por mil
admissões (HINRICHSEN et al, 2008).
O diagnóstico de candidíase invasiva é obtido habitualmente através de culturas (sangue,
tecidos, líquidos cavitários ou fluídos estéreis) ou na presença de evidências clínicas de doença
disseminada, que incluem anormalidades oftalmoscópicas ou alterações em exames de imagem
abdominal (MARIE, 2000).
No diagnóstico de candidemia a PCR (polymerase chain reaction) pode ser utilizado por
apresentar sensibilidade que varia entre 60 a 100%, dependendo da metodologia utilizada, da
sequência iniciadora para amplificação (primer), da população de pacientes e dos critérios
utilizados para o diagnóstico (COLOMBO, 2007), entretanto, na prática clínica ainda é de uso
limitado, uma vez que as técnicas são desenvolvidas em laboratórios individuais e, portanto, não
há uma padronização que possa ser utilizada de forma universal (PONTÓN, 2009).
Outra importante causa de infecção fúngica em pacientes neutropênicos é a aspergilose
invasiva, e sua taxa de letalidade pode variar de 42% a 100%, e até o momento, não existe um
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teste rápido, confiável e viável para a detecção de Aspergillus sp em procedimentos de rotina
(NOVARETTI et al, 2008). Exames de imagem como raios-X ou tomografia de tórax, podem
auxiliar ao diagnóstico, porém as alterações produzidas podem ser encontradas, também, em
infecções bacterianas e em condições não infecciosas (WHEAT, 2006).
Métodos sorológicos e por cultura para detecção de infecção por Aspergillus sp mostram-
se inefetivos do ponto de vista de sensibilidade e especificidade. Por outro lado, vários estudos
têm proposto métodos baseados em PCR para detecção precoce da infecção por Aspergillus sp,
com sensibilidade variando entre 45 e 92%, e uma especificidade média em 91%, (WHEAT,
2006), no entanto, ainda falta uma sistematização técnica para que possa ser utilizada de rotina
(NOVARETTI et al, 2008).
Outros fungos têm importância como agentes de infecções oportunistas em pacientes
neutropênicos febris, como Cryptococcus sp, Fusarium sp e Trichosporon sp, que também
apresentam baixa sensibilidade a cultura (< 50%), além de curva de crescimento lento o que
retarda o seu isolamento (COLOMBO, 2007).
O diagnóstico laboratorial da fungemia é habitualmente realizado através de hemocultura,
que apresenta baixa sensibilidade (35%) além de fornecer resultados tardios (superiores a uma
semana), o que dificulta o seu reconhecimento. A PCR parece ser um exame promissor por
apresentar maior sensibilidade e rapidez dos resultados. Entretanto, o desempenho desse método
no diagnóstico da doença fúngica apresenta resultados variados, possivelmente por falta de
padronização dos primers e das técnicas utilizadas (POTÓN, 2009).
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 NEUTROPENIA FEBRIL
Neutropenia febril é definida como contagem de neutrófilos abaixo de 500/mm3, ou entre
500 a 1000/mm3 e com tendência à queda, associada à febre, que é caracterizada como
temperatura oral isolada maior ou igual a 38,3°C (37,8°C axilar) ou temperatura oral mantida, por
mais de uma hora, entre 38 e 38,3°C (entre 37,5 e 37,8°C axilar) (HUGHES et al, 2002; LIMA et
al, 2006; FREIFELD et al, 2011).
A maioria dos episódios de neutropenia febril ocorrem em pacientes submetidos a
quimioterapia, mas podem ocorrer também em pacientes com leucemias agudas, síndromes
mielodisplásicas (SMD) ou infiltração tumoral da medula óssea, além de neutropenia secundária à
radioterapia que abrange grandes áreas de medula óssea (HALFDANARSON et al, 2006).
De uma forma geral as causas de febre em neutropênicos são: infecção bacteriana em 30-
35% dos casos, infecção fúngica em 5%, infecção viral em 5% e 50 a 60% por causas não
determinadas (medicamentos, mucosite, febre tumoral) ou infecções não diagnosticadas
(PICAZO, 1998; LIMA et al, 2006; BANACLOCHE et al, 2008; FREIFELD et al, 2011).
Apesar da frequência relativamente alta da neutropenia febril em pacientes oncológicos, a
documentação microbiológica é baixa. Hummel e cols (2009) isolaram o agente etiológico em
apenas 8,7% dos casos de alto risco e desses, ocorreu crescimento de fungos em 0,5% dos casos.
Dentre as bactérias, os bacilos gram-negativos entéricos (Escherichia Coli e Klebsiella
sp), Pseudomonas aeruginosa, e germes relacionados a infecções de cateteres como
Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase negativo, são as mais frequentemente
isoladas, enquanto as bactérias anaeróbias são menos comuns e normalmente encontram-se
associadas a infecções mistas como abcessos perianais e gengivites necrosantes (PICAZO, 2004).
O diagnóstico clínico do sítio de infecção, normalmente utilizado para nortear a terapia
empírica em não neutropênicos, nos imunocomprometidos torna-se difícil devido à ausência de
sinais inflamatórios causados pela diminuição ou escassez dos fagócitos circulantes e,
consequentemente, da redução da capacidade inflamatória tecidual (SICKLES et al, 1975;
20
HUGHES et al, 2002; COLOMBO, 2007; FREIFELD et al, 2011). Na década de 70 a letalidade
chegava a 75% dos casos, pois havia retardo no início da terapia antimicrobiana, esperando-se
sinais clínicos de infecção ou o resultado de cultura positiva (SCHIMPFF et al, 1971).
Atualmente, observa-se taxa de letalidade em torno de 5% após a introdução da antibioticoterapia
de amplo espectro empírica e imediata (HALFDANARSON et al, 2006).
A chance de complicação grave ou óbito não é a mesma para todos os pacientes
neutropênicos febris, e de uma forma geral, a duração da neutropenia é o fator prognóstico mais
importante (TALCOTT et al, 1992). Como a duração da neutropenia é difícil de ser avaliada, na
prática utiliza-se alguns escores de risco que classificam esses pacientes em alto e baixo risco de
mortalidade e dessa forma pode-se escolher a antibioticoterapia mais adequada e se há a
necessidade de internação hospitalar (tabela 1).
Tabela 1. ESCORE MASCC (Multinational Association for Supportive Care in Cancer) para classificação de risco do episódio de neutropenia febril
CARACTERÍSTICA PONTOS
Intensidade dos sintomas * Ausência de hipotensão 5 Ausência de DPOC 4 Portador de tumor sólido ou ausência de infecção fúngica
4
Ausência de desidratação 3 Não hospitalizado ao aparecimento da febre 3 Idade menor que 60 anos 2
*Sem sintomas ou com sintomas leves = 5 pontos; sintomas moderados a graves= 3 pontos. DPOC: Doença pulmonar obstrutiva crônica. O RISCO = SOMATÓRIA DOS PONTOS: ≥ 21: Baixo risco de complicações (6%); < 21: Alto risco de complicações (39%). Adaptado: Pracchia et al, 2004.
Em pacientes neutropênicos febris de baixo risco existem evidências de que a terapia
inicial com antibióticos por via oral ou parenteral seguida de oral apresentam resultados
satisfatórios (KERN et al, 1999; SHENEP et al, 2001). Contudo em pacientes de alto risco,
deverá ser iniciada antibioticoterapia intravenosa com atividade contra Pseudomonas sp, podendo
ser associado a um glicopeptídeo ou outros agentes ativos contra aeróbios gram-positivos na
21
presença de fatores de risco, como infecção relacionada a cateter central, infecção de pele ou
mucosite importante, uso profilático de quinolona, sepse grave, cultura positiva para gram-
positivo, colonização conhecida por S. pneumoniae resistente a cefalosporina ou S.aureus
meticilina-resistente (HUGHES et al, 2002; FREIFELD et al, 2011).
2.2 FUNGEMIA
Entre os agentes oportunistas, os fungos são aqueles que apresentam maior distribuição na
natureza. Estão presentes no ar, nas superfícies inanimadas de hospitais e dos domicílios, nas
plantas, solo, água, alimentos e nos animais domésticos. Colonizam pele, mucosas do trato
gastrintestinal, genitais e também do trato respiratório do hospedeiro (COLOMBO, 2007).
Portanto, é natural que pacientes portadores de imunodeficiências adquiridas ou induzidas
apresentem alto risco para o desenvolvimento de infecções fúngicas invasivas, localizadas ou
disseminadas e desde o início dos anos 80 esses micro-organismos têm emergido como uma das
principais causas de doença nesses pacientes (PAULA et al, 2007).
Os fungos oportunistas, causadores de infecções nosocomiais, têm se expandido
continuamente, e incluem, entre outras, inúmeras espécies do gênero Candida, outras leveduras
como Cryptococcus sp, Trichosporon sp, Rhodotorula sp e Picchia sp e filamentosos como
Aspergillus sp, Acremonium sp, Fusarium sp, Scedosporium sp, Paecilomyces sp e Scopulariopsis
sp (COLOMBO, 2007; DEL NEGRO, 2008). Estas infecções, frequentemente diagnosticadas
tardiamente, estão associadas a alta letalidade (MELO, 2009).
A detecção de fungemia por hemocultura, o principal método empregado, apresenta
limitações. A técnica apresenta baixa sensibilidade (35 a 50%), mesmo quando seriadas,
normalmente são demoradas (> 7 dias) e seu isolamento pode não representar infecção, mas
apenas contaminação, uma vez que pode se tratar de agente comensal (PEMÂN e ALMIRANTE,
2008).
2.2.1 CANDIDEMIA
A candidemia é a principal doença fúngica invasiva no ser humano (DFI). Muitos
episódios são transitórios e autolimitados, no entanto, têm potencial para progressão sistêmica,
22
resultando em lesões cutâneas embólicas, abscessos renais e hepatoesplênicos, endoftalmites,
entre outras (DEL NEGRO, 2008).
Candida sp são leveduras ovais de cerca de 5 micrômetros, pleomórficos, de ciclo sexual
incompleto, existindo mais de 200 espécies, muitas destas fazem parte da microbiota humana,
com menos de 10 % delas consideradas patogênicas, podendo levar a diversos tipos de infecção
(EGGIMANN et al, 2003). As principais espécies de interesse clínico são C. albicans, C.
parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei, esta menos frequentemente causa candidíase
(COLEMAN et al, 1998). Apesar de C. albicans continuar sendo a espécie mais isolada em
hemoculturas, com uma frequência que varia de 40 a 70% (SANDVEN, 2000; PFALLER e
DIKEMA, 2007), a contribuição de espécies não albicans vem sendo cada vez mais documentada
(SANDVEN, 2000; COLOMBO e GUIMARÃES, 2003).
Candidemia é a quarta maior causa de infecção em corrente sanguínea nosocomial nos
Estados Unidos da América (EUA), com incidência de 0,46 casos por 1000 admissões
(WISPLINGHOFF et al, 2004; GAREY et al, 2006). A incidência de candidemia no Brasil é
maior que nos EUA com uma taxa de 2,49 casos por 1000 admissões (COLOMBO et al, 2006).
Estudo realizado em Recife em hospital terciário demonstrou uma incidência de 3,9 casos por mil
admissões (HINRICHSEN et al, 2008).
Nucci e colaboradoes (cols) em 1995 avaliaram 313 episódios de neutropenia febril e
encontraram uma incidência de 10 % de infeções fúngicas, sendo metade destas decorrente de
diferentes espécies de Candida sp. O estudo é um dos poucos trabalhos publicados no Brasil, em
neutropênicos febris não transplantados.
Nas últimas décadas, devido aos avanços tecnológicos nos cuidados médicos hospitalares
em diversas áreas e que prolongam a sobrevida de pacientes críticos, vem aumentando a
frequência de candidemia. São fatores de risco classicamente conhecidos para infecções fúngicas:
uso prévio de antibióticos de largo espectro, cateteres centrais, nutrição parenteral, terapia
dialítica em unidades de suporte intensivo, uso de agentes imunossupressores (incluindo
corticosteróides) e neutropenia (PAPPAS et al, 2009).
A candidemia pode ser adquirida por via endógena, através da translocação do fungo pela
mucosa do trato gastrintestinal, provocadas por um desequilíbrio na microbiota residente, ou
23
lesões da mucosa intestinal, causada por procedimentos cirúrgicos, quimioterápicos e desnutrição
grave, ou por via exógena através de mãos contaminadas de profissionais de saúde, e pela
utilização de cateteres e soluções parenterais contaminadas (COLOMBO e GUIMARÃES, 2003;
TORTORANO et al, 2006; PERLROTH et al, 2007).
Sinais e sintomas de infecção sistêmica por Candida sp são frequentemente inespecíficos,
sendo o sintoma mais comumente descrito a febre não responsiva ao tratamento antibiótico. São
relatados em menor frequência: dores abdominais, náuseas, vômitos e anorexia, além da
endoftalmite (CANTU, 2005).
A fundoscopia em pacientes hospitalizados pode ajudar a confirmar o diagnóstico em
pacientes com suspeita de candidemia, o exame precisa ser cuidadoso e deve-se procurar
abscessos, ruptura de corpo vítreo e necrose retiniana, no entanto, endoftalmite por Candida sp só
ocorre em 9 a 26% dos pacientes e devido a baixa frequência de alterações a fundoscopia não é
comumente realizada (UPTODATE, 2011b).
A cultura sanguínea e o exame histológico são os métodos mais importantes para o
diagnóstico de candidemia, no entanto, ambas as modalidades são limitadas. A cultura tem uma
baixa sensibilidade, resultado positivo em apenas 40% dos casos, necessitando de um longo
tempo de incubação, enquanto a biópsia tecidual é um procedimento invasivo estando associado a
morbidade, principalmente em pacientes neutropênicos e/ou com plaquetopenia (CANTU, 2005).
Além disso, como Candida sp são micro-organismos da microbiota do trato
gastrointestinal, a observação tecidual e o isolamento em cultura, frequentemente são
insuficientes para a determinação da etiologia, pois essas provas laboratoriais não distinguem
entre o fungo patogênico e o comensal. Assim, o quadro clínico e a resposta ao tratamento são
necessários para sua confirmação diagnóstica (GUERY, et al, 2009).
Evidência radiológica de doença disseminada ocorre ao encontrar-se alterações tipo “roda
dentro de roda" ou “olho de boi”, que representam microabscessos em fígado ou baço, ao
ultrassom (US) ou tomografia computadorizada (TC) de abdome, entretanto, exames de imagem
apresentam baixa sensibilidade e comumente não auxiliam o diagnóstico (DE MARIE, 2000).
A pesquisa do anticorpo antimanana, antígeno constituinte da parede fúngica da Candida
sp, no diagnóstico de candidemia encontra-se em investigação e apesar de uma boa
24
especificidade, apresenta sensibilidade baixa em torno de 50% (ALEXANDER e PFALLER,
2006). Ensaios que detectam metabólitos secretados pela Candida sp como o D-arabinitol e
outros componentes da parede celular como a β-1,3-glucana, têm sido relatados por alguns
autores, mas sua aplicação clínica ainda é restrita (PONTÓN e DEL PALACIO, 2007).
A detecção do agente etiológico através da PCR (polymerase chain reaction) pode ser uma
alternativa diagnóstica. Um estudo realizado em população de alto risco para desenvolver
candidemia, demonstrou uma sensibilidade do método de 72,1%, especificidade de 91,2%, valor
preditivo negativo (VPN) de 93,2% e valor preditivo positivo (VPP) de 65,9% (MOREIRA-
OLIVEIRA et al, 2005). A utilização da PCR para o diagnóstico de candidemia pode ajudar a
diminuir a taxa de letalidade dessa infecção que chega a 47%, pois evitaria o diagnóstico tardio,
com consequentes falhas no tratamento decorrentes da demora na instituição da terapêutica ou à
utilização de antifúngico ineficaz para as espécies resistentes (GUDLAUGSSON et al, 2003).
A droga de escolha para o tratamento das candidemias é o fluconazol na dose de 400mg ao
dia, porém deve-se atentar para o fato de que C.glabrata e C.tropicalis, podem apresentar
resistência primária ou secundária ao fluconazol, enquanto C. krusei, envolvida em 4% das
candidemias nesse grupo de pacientes, é intrinsecamente resistente ao mesmo (DELNEGRO,
2008).
2.2.2 ASPERGILOSE INVASIVA
O termo aspergilose refere-se à doença devido à invasão tecidual por espécies de
Aspergillus sp, tendo habitualmente como porta de entrada, no ser humano, o pulmão por
aspiração de conídios, sua forma infectante (UPTODATE, 2011a).
Este grupo de fungos filamentosos são ubíquos no ambiente, encontrados em todas as
estações do ano, dispersos no solo, vegetais, ou qualquer matéria em decomposição, o que garante
a dispersão dos conídios, prioritariamente no domicílio, em alimentos, solo e piscina, entre outros
(RICHARDSON e JOHNSON, 2000).
O número de espécies de Aspergillus que causam doença clínica tem se expandido nos
últimos anos, principalmente em pacientes com leucemias agudas (LA) e receptores de
transplantes de medula óssea (TMO), além de usuários de corticosteróide e outros
imunossupressores. Na década passada até 90% dos casos de aspergilose se devia ao A.
25
fumigatus, atualmente, apesar do mesmo continuar sendo a espécie mais frequente, outras,
ganham importância como A. flavus, A. terreos e A. niger (UPTODATE, 2011a).
Por outro lado, a aspergilose invasiva é incomum em pacientes com aids (síndrome da
imunodeficiência adquirida), provavelmente porque a deficiência imunológica destes pacientes
afeta principalmente as células T, mais do que os granulócitos e macrófagos (STAPLES et al,
1995).
A primeira linha de defesa do organismo contra o conídio do Aspergillus sp inalado são os
macrófagos alveolares, que possuem a capacidade de destruir os conídios. No entanto, em
situações em que o inóculo inalado apresenta alta carga infectante ou quando ocorre uma
diminuição no número e/ou função dos macrófagos, como ocorre em pacientes que receberam
repetidos ciclos de quimioterapia, os conídios podem iniciar sua germinação e formar hifas.
O desenvolvimento dessas hifas leva a um influxo de neutrófilos, secundário a ativação do
complemento e a produção de fatores quimiotáticos dos neutrófilos, que podem debelar a
infecção. Caso a infecção progrida, o crescimento das hifas leva a produção de vários metabólitos
que inibem as defesas do hospedeiro, como inibidores de complemento, várias proteases e
micotoxinas (SEGAL, 2005; STANZANI et al, 2005).
Com o desenvolvimento da infecção o micro-organismo penetra os tecidos e invade os
vasos sanguíneos do hospedeiro, com subsequentes infartos e necrose, o que leva a disseminação
hematogênica (BHATTI et al, 2006; MASCHMEYER et al, 2007).
As principais manifestações clínicas são tosse em 87% dos casos, hemoptise em 50-80%
dos casos, dispnéia, emagrecimento em 61% dos casos, podem também estar presentes fadiga, dor
torácica e febre. A complicação de pior prognóstico é a hemorragia, que pode levar o paciente ao
óbito (AMORIM et al, 2004).
Essas apresentações clínicas sugestivas da doença como dor torácica e hemoptise, são
raras em pacientes neutropênicos. São várias as alterações radiológicas pulmonares,
principalmente nas tomografias de alta resolução, porém raramente específicas, com exceção da
detecção de nódulos com o sinal do halo, que corresponde a nódulos envoltos por halo em vidro
fosco ou áreas de consolidação segmentares, por vezes em forma de cunha, com a base voltada
26
para superfície pleural, associados ou não a áreas de atenuação em vidro fosco, cujos achados
correspondem a infartos hemorrágicos (MARCHIORI et al, 2002).
A taxa de letalidade por aspergilose é inaceitavelmente elevada, chegando a 90% em
pacientes submetidos ao TMO e 50% em portadores de LA (DENNING, 1996), sendo um
diagnóstico precoce crítico para orientar a terapêutica e melhorar o prognóstico dessa infecção, no
entanto, até o momento, não há nenhum método suficientemente sensível e específico que possa
ser utilizado na prática clínica (PFEIFFER et al, 2006).
Culturas de material do trato respiratório em pacientes de alto risco são altamente
específicas (em pacientes neutropênicos superior a 80%), mas, infelizmente com sensibilidade
extremamente baixa, correspondendo a menos de 30%, o que a torna pouco confiável em
amostras negativas (PFEIFFER et al, 2006).
Outro método para o diagnóstico do Aspergillus sp, utilizando ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay) para detecção do antígeno galactomanana, vem sendo descrito. Trata-se de
um constituinte da parede do fungo, liberado durante o crescimento das hifas, com sensibilidade
de 71% e especificidade de 89%, segundo metanálise da European Organization for Research
and Treatment of Cancer (EORTC) (PFEIFFER et al, 2006).
O sequenciamento do DNA, seguido de PCR, atualmente ainda é considerado
investigacional, principalmente pela falta de padronização da técnica, no entanto, estudos tem
demonstrado sensibilidade do teste variando entre 45 e 92%, com especificidade média de 91%
(WHEAT, 2006).
Estudo realizado em 2008 por NOVARRETTI e cols em pacientes onco-hematológicos em
programação de TMO na faculdade de medicina da universidade do estado de São Paulo
(FMUSP), desenvolveram PCR para detecção de Aspergillus sp, e demonstraram uma
sensibilidade de 100%, especificidade de 94,4%, VPN de 83,3% e VPP 100%.
Diante desses resultados, o desenvolvimento de uma PCR apresenta-se com boas
perspectivas diagnósticas em pacientes com aspergilose (MARIE, 2000; WHEAT, 2006).
A combinação da dosagem de galactomanana e o sequenciamento de DNA por PCR,
parece ser uma estratégia promissora para melhorar a sensibilidade e especificidade de ambos os
27
métodos, em pacientes de alto risco para desenvolvimento dessa infecção (FLORENT et al,
2006).
A droga de escolha no tratamento da aspergilose invasiva é o voriconazol (8mg/kg/dia)
(MICHALET et al, 2009).
2.2.3 CRIPTOCOCOSE
A criptococose é uma micose profunda causada por espécies de Cryptococcus,
destacando-se o Cryptococcus neoformans, que é adquirido através da inalação de basidiósporos
ou pequenas leveduras pobremente encapsuladas, facilitando seu depósito em alvéolos e
bronquíolos terminais (UPTODATE, 2011c).
O C. neoformans é um basidiomiceto que se apresenta na forma tecidual como levedura
encapsulada, tem distribuição mundial encontrado principalmente em solos e excrementos de
aves, apresentando duas variedades fúngicas, com quatro sorotipos: variedade neoformans
(sorotipos A e D) e variedade gatti (sorotipos B e C) (DARZÉ, 2000).
O principal grupo de pacientes predispostos a essa infecção são os pacientes
imunocomprometidos como os pacientes com aids e câncer (principalmente aqueles com
malignidades hematológicas, utilizando altas doses de corticosteróides e receptores de TMO
alogênico).
A principal via de entrada no organismo é inalatória, com o basidiomiceto chegando aos
alvéolos e sendo destruído pelos macrófagos nos indivíduos imunocompetentes. Nos pacientes
com funcionamento insuficiente dos macrófagos alveolares ou com déficits em seu número, o
fungo produz infecção local e se dissemina, inicialmente aos linfonodos mediastinais e
posteriormente, invadindo a corrente sanguínea, atingindo olhos e sistema nervoso central
(SNC).
Clinicamente a infecção por esse fungo pode produzir febre persistente na ausência de
outros sintomas, além de quadros de pneumonia, coriorretinite, meningite e meningoencefalite
(GARCIA-RUIZ et al, 2004).
28
Classicamente o diagnóstico se baseia na cultura fúngica, histologia, antígeno criptocócico
e radiografia.
A visualização de leveduras encapsuladas em escarro, lavado bronco-alveolar e espécies
de tecidos são sugestivos de infecção criptocócica e a cultura dessas amostras são frequentemente
positivas, diferentemente das hemoculturas.
A determinação do antígeno criptocócico em sangue periférico auxilia no diagnóstico da
infecção, encontra-se positivo em 56 a 70% dos pacientes imunocomprometidos com
criptococose e altos níveis (títulos <1:512) podem indicar infecção disseminada.
A radiografia de tórax, apesar de auxiliar o diagnóstico em pacientes imunocompetentes,
com achados de nódulos não calcificados, infiltrados lobares e hilar e adenopatia mediastinal, em
pacientes imunocomprometidos raramente encontra-se essas alterações.
A punção lombar está indicada para qualquer paciente com sintomas sugestivos de
acometimento de SNC, bem como em pacientes imunocomprometidos com altos títulos de
antígeno criptocócico, independente dos sintomas neurológicos (UPTODATE, 2011c).
O sequenciamento do DNA é extremamente promissor na criptococose, um estudo
realizado na índia, realizando PCR sérica, mostrou sensibilidade 85,7 a 92,9%, especificidade de
100%, VPN e VPP de 100% (SAHA et al, 2009).
O tratamento de escolha é a anfotericina B (0,7mg/kg/dia) associado a 5-flucitosina
(100mg/kg/dia) por 2 semanas, seguido por manutenção com fluconazol (400mg/dia)
(BANACLOCHE et al, 2008).
2.3 NEUTROPENIA FEBRIL E FUNGEMIA
Pacientes portadores de imunossupressão, como os neutropênicos, e que evoluem com
micose oportunista apresentam dificuldade para o diagnóstico etiológico dessas infecções. A
redução da resposta inflamatória do hospedeiro faz com que sinais e sintomas da infecção, assim
como suas alterações laboratoriais, apresentem-se de forma discreta ao longo do quadro
infeccioso, o que dificulta a suspeita diagnóstica.
Além disso, habitualmente, existe uma dificuldade de aquisição de espécimes biológicos
por biópsia, pois, com frequência esses pacientes encontram-se neutropênicos e plaquetopênicos,
29
ou algumas vezes, apresentam graus variados de instabilidade hemodinâmica o que contraindicam
procedimentos médicos invasivos (COLOMBO, 2007).
Muitas infecções graves por fungos em pacientes neutropênicos não são diagnosticadas
ante mortem, como demonstrou estudo realizado em pacientes submetidos à necrópsia, onde
metade dos pacientes com candidíase disseminada apresentavam hemoculturas positivas. Esta
baixa positividade se deve ao fato do crescimento de leveduras em hemoculturas serem
dependentes de vários fatores, como quantidade de sangue colhido, concentração do fungo na
corrente sanguínea, espécie do fungo e tipo de sistema empregado para a realização da
hemocultura (BUCHNER et al, 2002).
Em pacientes neutropênicos febris a letalidade por DFI aumenta quanto mais postergado
for o início do tratamento específico (GAREY et al, 2006). O fato de se isolar ou determinar o
agente causador da infecção altera a conduta terapêutica em mais da metade dos casos
(HUMMEL et al, 2009), sendo a infecção invasiva por esses agentes a maior causa de
mortalidade nessa população (HEBART et al, 2000).
Devido a essa dificuldade diagnóstica do ponto de vista microbiológico, e ao prejuízo à
saúde do paciente caso haja retardo no início da terapêutica antifúngica um consenso
internacional da EORTC/Mycoses Study Group (MSG) of the National Institute of Allergy and
Infectious Disease (NIAID), em 2008, revisou os critérios para definir infecção fúngica em
pacientes neutropênicos, conforme descrito a seguir:
a) Critérios do hospedeiro:
a.1) Recente história de neutropenia (neutrófilos < 500/mm3 por mais de 10 dias)
temporalmente relacionado ao início da infecção fúngica;
a.2) Receptores de TMO alogênico;
a.3) Uso prolongado de corticosteróides (excluindo aqueles com aspergilose
bronco-pulmonar) com uma dosagem mínima de 0,3mg/Kg/dia de prednisona ou
equivalente por mais de três semanas;
30
a.4)Tratamento com outros imunossupressores de células T, como ciclosporina,
bloqueador de FNT-α, anticorpos monoclonais específicos (como o alemtuzumab), ou
análogos nucleosídeos durante os últimos 90 dias;
a.5) Imunodeficiência inata severa (como doença granulomatosa crônica ou
imunodeficiência combinada severa).
b) Critérios micológicos:
b.1) Teste direto (citologia, microscopia direta ou cultura) caracterizado pela
presença de bolores em escarro, lavado bronco-alveolar, escovado brônquico ou
aspirado nasal , indicado por um dos seguintes achados: presença de elemento fúngico
indicando hifas ou isolamento por cultura de uma hifa (e.g. Aspergillus sp, Fusarium
sp, Zygomycetos, ou Scedosporium sp).
b.2) Teste indireto (detecção de antígenos ou constituintes da parede celular) na
aspergilose pela identificação do antígeno galactomanana em soro, plasma, lavado
bronco-alveolar ou líquor e em DFI outras como criptococose e zigomicose pela
detecção sérica do β-D-glucano.
c) Critérios clínicos:
c.1) Doença fúngica do trato respiratório superior, definida pela presença de um
dos três fatores a seguir: lesão densa, bem circunscrita com ou sem sinal do halo; sinal
do ar crescente ou cavitação.
c.2) Traqueobronquite, determinada pela presença de: ulcerações, nódulos,
pseudomembranas, placas ou necrose traqueobrônquicas observadas em análises
broncoscópicas;
c.3) Infecção sinunasal, diagnosticada por imagem mostrando sinusite mais pelo
menos um dos três sinais a seguir: dor localizada aguda (incluindo dor irradiada para
31
olhos); ulceração nasal com secreção enegrecida ou extensão para estruturas vizinhas,
incluindo órbita.
c.4) Infecção em SNC e diagnosticada pela presença de um dos seguintes: lesão ou
imagem focal e envolvimento meníngeo por ressonância nuclear magnética (RNM) ou
TC.
c.5) Candidíase disseminada conceituada pela existência de pelo menos uma das
duas entidades a seguir, após um episódio de candidemia nas duas semanas prévias:
abcessos pequenos, em alvo (lesões em olho de boi) em fígado ou baço e exsudato
retiniano progressivo em exame oftalmológico.
Com base nesses critérios, descritos acima, definem-se as infecções fúngicas como
comprovada, provável e possível, conforme se segue:
a) Infecção fúngica comprovada:
a.1) Infecção comprovada por hifas:
Análise microscópica de material estéril: histopatologia, citopatologia ou exame
microscópico direto obtida de aspiração por agulha ou biópsia mostrando hifas ou
leveduras-like melanizadas associado a evidências de lesão tissular.
Cultura positiva obtida de procedimento estéril, de um tecido ou líquido
normalmente estéril, que tenham alterações clínicas ou radiológicas compatíveis com
infecções, exceto lavado bronco-alveolar, urina e cavidades de seios cranianos.
Hemocultura mostrando hifas (e.g. Fusarium sp) no contexto de doença infecciosa
compatível.
a.2) Infecção comprovada por leveduras:
Análise microscópica de material estéril: histopatologia, citopatologia ou exame
microscópico direto de espécimes obtidas por agulha ou biópsia mostrando leveduras –
32
por exemplo, Cryptococcus sp, indicado por brotamento de leveduras encapsuladas ou
Candida sp mostrando pseudo-hifas ou hifas verdadeiras.
Cultura positiva de material estéril: Isolamento de leveduras obtidas de
procedimento estéril associado a anormalidades consistentes com processo infeccioso
local.
Hemocultura mostrando leveduras (e.g. Cryptococcus sp ou Candida sp) ou fungo
levedura-like (Trichosporon sp).
Análise sorológica do líquor: Antígeno criptocóccico no líquido cefalorraquidiano
indica criptococose disseminada.
a.3) Micose endêmica comprovada, definida pela presença de um dos seguintes
achados, em hospedeiro com doença consistente com micose endêmica:
Cultura comprovada do sítio afetado ou sangue;
Histopatológico ou microscopia direta demonstrando formas morfológicas
apropriadas e consideradas adequadas para fungo dimórfico (Blastomyces dermatidis
com paredes espessas de base ampla e brotamento de leveduras, esporos em
Coccidioides sp, Paracoccidioides brasiliensis mostrando múltiplos brotamentos e no
caso de histoplasmose, a presença de leveduras intracelulares em fagócitos no sangue
periférico ou macrófagos em outros tecidos).
Também na coccidioidomicose, demonstração de anticorpo anticoccidioide em
liquor, ou aumento em duas diluições, em duas amostras consecutivas de sangue,
concomitante a um cenário sugestivo da infecção.
Ainda na paracoccidioidomicose, demonstração em duas amostras consecutivas da
banda precipitina da paracoccidoidina, associado a quadro clínico de infecção.
33
b) Infecção fúngica provável: 1 critério do hospedeiro, associado a 1 critério micológico e
a 1 critério clínico compatível com infecção.
c) Infecção fúngica possível: 1 critério do hospedeiro associado a 1 critério clínico
compatível com infecção.
d) Micose endêmica provável: Presença de um critério do hospedeiro, mais um quadro
clínico sugestivo de micose endêmica além de uma evidência micológica, como um teste
positivo para antígeno Histoplasma sp na urina, sangue ou líquor.
Na prática, utiliza-se essas definições para iniciar tratamento antifúngico empírico ou
preemptivo em pacientes imunocomprometidos (ASCIOGLU et al, 2002; HUGHES et al, 2002;
DE PAUW et al, 2008; FREIFELD et al, 2011).
O regime antibiótico de escolha para o tratamento inicial da neutropenia febril pode variar
conforme o perfil bacteriológico da instituição, a neoplasia de base, as características clínicas dos
pacientes, estado hemodinâmico, entre outros, mas, de uma forma geral opta-se por um
betalactâmico com espectro de ação contra Pseudomonas aeruginosa, associado ou não ao
glicopeptídeo ou linezolida, caso o indivíduo apresente fatores de risco para infecção por
bactérias gram-positivas como infecção relacionada a cateter, colonização por Staphylococcus
aureus meticilina-resistente, cultura mostrando crescimento de germe gram-positivo previamente
à identificação definitiva e ao seu perfil de sensibilidade ou choque séptico (BANACLOCHE et
al, 2008).
Na década de 70, foi observado que o risco de infecção fúngica aumenta naqueles com
neutropenia febril persistente. O retardo no início da terapia antifúngica é claramente associada à
falência terapêutica e morte, justificando o acréscimo dessas drogas ao esquema antimicrobiano
dessa população (AISNER et al, 1977). Baseado nessas informações, os protocolos atuais
recomendam a introdução de antifúngicos, em pacientes com neutropenia e febre persistente após
4 a 7 dias a contar do diagnóstico e início de antibacterianos, sendo recomendado: Anfotericina B
lipossomal, itraconazol, voriconazol ou caspofungina com eficácias semelhantes (BANALOCHE
et al, 2008; FREIFELD et al, 2011).
34
2.4 PCR PARA FUNGEMIA
A detecção de DNA microbiano utilizando a tecnologia de PCR é um grande avanço no
diagnóstico de infecções causadas por bactérias e vírus, entretanto, seu uso para DFI em pacientes
neutropênicos febris ainda é limitado, uma vez que as publicações utilizam técnicas
desenvolvidas em laboratórios individuais e, portanto, não há padronização que possa ser
utilizada de forma universal (PONTÓN, 2009). Como consequência deste fato, a detecção de
DNA fúngico não se inclui nos critérios microbiológicos de diagnóstico de infecção fúngica
invasora estabelecidos pelo EORTC/MSG (DE PAW et al, 2008).
Desde o advento dessa técnica persiste uma série de problemas na detecção de DNA para
o diagnóstico de DFI, incluindo o método de extração do DNA, o formato da PCR, a detecção e
identificação de várias espécies de fungos simultaneamente, o custo, a interpretação de um
resultado positivo para poder diferenciar uma colonização de uma infecção além da amostra ideal
(soro ou sangue total) (BOUGNOUX et al, 1999). Uma das primeiras pesquisas utilizando-se a
PCR convencional em fungemia em pacientes com neutropenia febril foi realizada por Einsele e
cols em 1997, que demonstrou sensibilidade de 100% e especificidade de 98%, em grupo de
pacientes sabidamente infectados por infecção fúngica. Nesse trabalho, houve um grupo de 11
pacientes com PCR persistentemente positiva para infecção fúngica, com hemocultura negativa e
cujos pacientes não melhoraram com terapia específica (EINSELE et al, 1997). Outros estudos
com PCR convencional não conseguiram reproduzir esses valores de sensibilidade e
especificidade (POTÓN, 2009).
A introdução da PCR em tempo real e dos métodos automatizados de extração de DNA
têm solucionado alguns dos problemas associados com a contaminação da amostra e com o tempo
de realização da prova, no entanto, ainda persistem resultados amplamente variados
(BRETAGNE e COSTA, 2005; COLOM et al, 2006; ELLEPOL et al, 2005; LAÍN et al, 2008),
com estudos utilizando técnicas diferentes e mostrando desde uma sensibilidade de 63% e
especificidade de 96% (BADIEE, 2007) até uma sensibilidade e especificidade de 100%, para
ambos, utilizando apenas a espécie Candida albicans (ARANCIA et al, 2006).
35
Além de elevada sensibilidade e especificidade comparativamente às provas fenotípicas,
essas metodologias tem demonstrado boa correlação com a evolução clínica e valores preditivos
negativos em torno de 98% para fungemia em pacientes neutropênicos (ALEXANDER, 2002;
STEVENS, 2002).
A multiplex-PCR (MT-PCR) é uma técnica derivada da PCR clássica onde dois ou mais
loci são simultaneamente amplificados em uma mesma reação, o que possibilita a detecção e
identificação, ao mesmo tempo, de distintos genes de interesse. Por sua simplicidade e rapidez,
tem se mostrado uma boa ferramenta no reconhecimento e diagnóstico de fungos em amostras
clínicas (MÉNDEZ-ÁLVAREZ e PÉREZ-ROTH, 2004). Em um estudo, realizado em 2010, por
Lau e cols aplicaram MT-PCR em sangue e plasma para detecção de múltiplas espécies de
Candida e comparam com a hemocultura em relação ao tempo da coleta ao diagnóstico, a
sensibilidade, especificidade, VPP e VPN, da MT-PCR, e encontraram os seguintes dados: a
hemocultura demorava em média oito dias para detectar a espécie, enquanto o da MT-PCR 2,2
dias, e a MT-PCR demonstrou sensibilidade de 75%, especificidade de 97%, VPP 95% e VPN de
85%.
Outro estudo publicado, em 2002, também com multiplex PCR para detecção de C.
albicans, C. glabrata, C. parapilosis, C. tropicalis, A. fumigatus e C. neoformans, utilizando
diretamente as culturas de fungos como amostra, demonstrou sensibilidade e especificidade de
100% (Luo e Mitchell, 2002).
Acredita-se que para se obter um diagnóstico precoce de micose profunda e/ou fungemia
em pacientes imunossuprimidos, sobretudo em pacientes onco-hematológicos e naqueles
submetidos a TMO, a perspectiva para um futuro a curto e médio prazo é a monitorização
contínua de biomarcadores moleculares, como a detecção de antígenos específicos ou sequência
de DNA, em pacientes com risco de desenvolver infecção fúngica (COLOMBO, 2007).
36
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a frequência de fungemia e sua etiologia em episódios de neutropenia febril em
pacientes onco-hematológicos internados no HEMOPE, de fevereiro a novembro 2010,
utilizando-se hemocultura e MT-PCR desenvolvida in house.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar a frequência de fungemia em pacientes onco-hematológicos com episódios de
neutropenia febril de alto risco utilizando-se hemocultura e MT-PCR.
b) Descrever as espécies de fungos encontradas em pacientes onco-hematológicos com
episódios de neutropenia febril de alto risco, utilizando-se hemocultura e MT-PCR.
c) Relatar as características oncológicas e os fatores de risco, mais frequentes, em pacientes
com neoplasia hematológica e neutropenia febril com doença fúngica invasiva.
37
4. PACIENTES E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
O presente estudo tem caráter descritivo, do tipo série de casos, que nos permitiu
caracterizar os episódios de neutropenia febril em pacientes internados com fungemia
diagnosticada por hemocultura e MT-PCR convencional, através de amostra de conveniência.
Esse estudo é um subprojeto de uma pesquisa multicêntrica denominada “Avaliação de teste
molecular para detecção de infecção fúngica em população vulnerável: pacientes em uso de
quimioterapia e neonatos”.
4.2 POPULAÇÃO ALVO
Pacientes oncológicos com episódios de neutropenia febril internados no HEMOPE,
hospital terciário e que se caracteriza por ser referência no tratamento de leucemias agudas no
estado de Pernambuco, de fevereiro a novembro de 2010.
4.3 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Estar internado durante o episódio de neutropenia febril ou ter indicação de internação por
neutropenia febril.
4.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
38
Coleta de amostra de sangue para realização de PCR apenas 48 horas após o último pico
febril.
4.5 DEFINIÇÃO DE TERMOS E VARIÁVEIS
Definição de termos:
a)Neutropenia febril (IDSA, 2010): Associação descrita a seguir.
Neutropenia: Pacientes com número total de neutrófilos abaixo de 500/mm3 ou
entre 500 e 1.000/mm3 com tendência à queda;
Febre: Um episódio de temperatura oral maior ou igual a 38,3°C, o que equivale a
uma temperatura axilar maior ou igual a 37,8°C, não relacionada à infusão de
hemoderivados, ou temperatura mantida a 38°C (37,5°C axilar), por mais de uma hora.
b) Resolução da neutropenia febril
O episódio de neutropenia febril foi considerado resolvido após o paciente
apresentar-se 72 horas afebril (HUGHES et al, 2002; FREIFELD et al, 2011).
c) Infecção fúngica
Definida como infecção fúngica comprovada, provável ou possível de acordo com
as definições do EORTC/MSG/NIAID, 2002 e revisados em 2008.
A definição operacional e a categorização das variáveis são demonstradas no quadro 1.
Quadro 1. Definição operacional e categorização das variáveis
Idade:
Variável contínua definida como o intervalo de tempo entre a data de nascimento, referida pelo paciente e a data da coleta dos dados, em anos completos.
Sexo Masculino ou feminino.
Detecção de fungo por hemocultura :
Colhida a critério do médico assistente do paciente com diagnóstico de neutropenia febril, categorizada como positiva ou negativa, e discriminado o gênero e espécie isolados.
Detecção de fungo por multiplex PCR
Colhida ao diagnóstico da neutropenia febril ou ao início do antifúngico, categorizada como positiva ou negativa, e discriminado o gênero e espécies detectados.
Tipo de neoplasia Origem da neoplasia de base do paciente, descrita
39
em prontuário, sendo categorizada como síndrome mielodisplásica (SMD), Leucemia Mielóide aguda não M3(LMA), LMA M3 (LMAM3), Leucemia Linfóide Aguda (LLA), Leucemia Bifenotípica Aguda (LBA), outras neoplasias onco-hematológica não SMD e não LA.
Progressão de doença:
Definida como refratariedade da neoplasia ao tratamento ou recidiva após remissão e categorizada como sim na presença e não na ausência de progressão.
Duração da febre: Intervalo de tempo, em dias, entre o início da febre e a coleta da amostra para análise da PCR.
Temperatura máxima registrada: Variável contínua em graus célsius registrada no período em que o paciente encontra-se febril.
Comorbidades:
Presença de outras doenças que contribuam para a imunossupressão no momento do diagnóstico da NF, relatada em prontuário ou pelo paciente. Como hipertensão arterial (HAS), diabetes mellitus (DM), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), outras pneumopatias crônicas, Insuficiência renal crônica (IRC), outras nefropatias, cardiopatias crônicas, cirrose hepática (CH), outras hepatopatias e doenças autoimunes e categorizadas como sim na presença e não na ausência.
Quimioterapia atual: Informação sobre o uso de quimioterápicos. Definidas como QT de indução, consolidação, manutenção, paliativa e de resgate.
Linha de tratamento quimioterápico atual:
Definida como números de protocolos de quimioterapia recebidos pelo paciente antes do episódio de NF, Categorizada como Primeira (0 linha prévia), segunda (1 linha prévia), outras ( 2 ou + linhas prévias).
Uso de antibiótico terapêutico : Informação de uso de antibiótico terapêutico adequado no dia da coleta da amostra da PCR.
Sítio de Infecção : Informação discriminada em prontuário médico.
Mucosite:
Documentada em prontuário ou observada pelo entrevistador durante a coleta de dados e dicotomizada em sim (presença) ou não (ausência).
Internação em Unidade de Terapia Intensiva (UTI):
Internação em UTI atual ou nos trinta dias previamente ao diagnóstico de NF. Categorizada em sim ou não.
Tempo de internação em UTI : Intervalo de dias em que o paciente esteve internado em UTI.
Ventilação mecânica : Informação documentada em prontuário, categorizada em sim ou não.
Presença de acesso venoso central:
Definida como presença de acesso venoso central, provisório e/ou definitivo, atual ou nos sete dias prévios ao diagnóstico de NF. Categorizada com sim (presença) e não (ausência).
40
Tempo de cateter central : Intervalo de dias em que o paciente esteve com cateter central instalado.
Uso de Nutrição Parenteral Total (NPT):. Definida como uso atual de NPT ou nos sete dias prévios ao diagnóstico de NF. Dicotomizada em sim (presença) e não (ausência).
Hemodiálise: Tratamento hemodialítico realizado periodicamente, relatado pelo mesmo ou em prontuário. Categorizada como sim ou não.
Uso prévio de corticosteróides:
Necessidade de uso terapêutico de corticosteróide, equivalente a prednisona 20mg/dia por mais de 30 dias, ou equivalente, informado em prontuário ou pelo paciente. Categorizada em sim ou não.
Uso prévio de imunossupressores não corticosteróides :
Necessidade de uso terapêutico de imunossupressores, com exceção dos corticosteróides, informado em prontuário ou pelo paciente. Categorizada em sim ou não.
Uso de Sonda vesical de demora: Documentada em prontuário ou informada pelo paciente, categorizada em sim ou não.
Hemoglobina : Níveis de hemoglobina checado em prontuário médico no dia da coleta da PCR. Variável contínua.
Leucócitos : Número de leucócitos checado em prontuário médico no dia da coleta da PCR. Variável contínua.
Neutrófilos : Número de neutrófilos checado em prontuário médico no dia da coleta da PCR. Variável contínua.
Duração da neutropenia:
Tempo em dias entre a neutropenia ou neutropenia febril (o que for documentado primeiro) e a recuperação neutrofílica (neutrófilos maior ou igual a 1500/mm3). Variável contínua.
Plaquetas: Número de plaquetas checado em prontuário médico no dia da coleta da PCR. Variável contínua.
Achados tomográficos sugestivos de Doença Fúngica Invasiva (DFI):
Tomografia de tórax e/ou abdome, realizadas durante a internação por NF, sugestivas de IFI (imagens em “roda dentro de roda” ou “olho de boi” em baço ou fígado na tomografia de abdômen e infiltrado intersticial, nódulos de distribuição randômica, imagens com padrão em árvore em brotamento ou consolidação pulmonar na tomografia de tórax), relatadas em laudo ou prontuário médico. Categorizada em presença, ausência ou não realizada.
Oftalmoscopia sugestiva de DFI :
Fundoscopia realizada durante a internação e sugestiva de DFI (endoftalmite), durante a internação por NF, documentada em prontuário médio. Categorizada em presença, ausência ou não realizada.
Dosagem de Antígenos : Dosagem de galactomanana, checado em prontuário, nos 7 dias que precedem a coleta da
41
PCR.
4.6 MÉTODO DE COLETA DE DADOS
Pacientes atendidos na instituição participante da pesquisa com diagnóstico de neutropenia
febril e que tivessem indicação de internação hospitalar ou que estivessem internados ao
desenvolverem neutropenia febril, foram convidados a participar da pesquisa. Após a assinatura
do termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice A), responderam a um questionário pré-
formulado (Apêndice B), seguido de registro de dados clínicos, laboratoriais e de imagem do
prontuário médico e posteriormente eram coletados amostras biológicas para estudo imunológico
(PCR), na rotina do serviço.
Todos os dados, tanto os referentes às variáveis de caráter amostral, quanto às
laboratoriais, foram arquivados em protocolo específico para pesquisa.
4.7 QUALIDADE DOS INSTRUMENTOS DE MEDIDA E PADRONIZAÇÃO DAS
TÉCNICAS
4.7.1 AMOSTRAS DE SANGUE PARA REALIZAÇÃO DE HEMOCULTURA
As hemoculturas dos paciente internados no HEMOPE foram realizadas rotineiramente
pelo laboratório CERPE®, até setembro de 2010, e pelo laboratório LAPAC® a partir de outubro
de 2010, ambos utilizavam cultura automatizada, com BacT/Alert®. A solicitação de
hemoculturas, sua coleta, processamento do material e identificação das espécies, seguiu a rotina
dos laboratórios prestadores desse serviço ao HEMOPE. Os resultados das culturas foram obtidos
através de consultas aos prontuários médicos.
4.7.2 AMOSTRAS DE SANGUE PARA AMPLIFICAÇÕES POR PCR
Estas amostras foram obtidas por coleta de 5 a 8 ml de sangue em tubo contendo EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid), na rotina da enfermaria do HEMOPE, no dia seguinte após
leitura e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido pelo paciente ou seu
responsável (Apêndice A e B). Portanto, para as amplificações por PCR, foram utilizadas
amostras diferentes das encaminhadas para hemoculturas. Foi colhido uma amostra por episódio
de neutropenia febril por paciente e encaminhada ao laboratório de biologia molecular do
42
Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira (IMIP), onde eram realizados os testes
moleculares.
4.7.3 EXTRAÇÕES DE DNA GENÔMICO NAS AMOSTRAS DE SANGUE
Amostras de 5-8 ml de sangue periférico foram diluídas em igual volume de tampão PBS
(phosphate buffered saline) e submetidas a um gradiente de Ficoll-Paque plus (Ge Healthcare,
Uppsala, Suécia) por centrifugação a 1800rpm por 30 min em centrífuga clínica. O anel de células
sanguíneas foi coletado e as células lavadas em PBS e quantificadas. Ao se adquirir 5 x 106
células, as mesmas eram suspensas em 700µl do reagente DNAzol (Invitrogen, São Paulo, Brasil)
visando a lise celular, sendo adicionado 200µl de Isopropanol 100% para a precipitação de DNA
em temperatura ambiente por 5 min. O precipitado obtido com centrifugação a 6.000 rpm por 6
min foi lavado com etanol 75%, após rápida secagem foi ressuspenso em 50µl de água com
(DEPC) dietil-pirocarbonato (LUO e MITCHELL, 2002).
4.7.4 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE INFECÇÃO FÚNGICA
A detecção molecular da infecção fúngica consistiu em três etapas. A primeira etapa foi
submeter à amostra a uma reação em cadeia de PCR para a amplificação do gene humano
constitutivo para glicerol 3-fosfato desidrogenase (gpdH) visando confirmar a qualidade da
amostra nos casos do teste negativo. Na segunda etapa, a amostra foi avaliada quanto à presença
genética de fungo consistindo em sequência conservada da região intercalante do gene ribossomal
chamada de internal transcribed spacer (ITS). A última etapa foi realizada nas amostras positivas
para o ITS e consistiam na amplificação do gene ribossomal das espécies fúngicas mais
frequentes na infecção hospitalar. Nessa etapa, as amostras foram submetidas a duas reações de
MT-PCR com inicializadores específicos para a identificação das espécies Candida glabrata, C.
tropicalis e C. parapsilosis na multiplex 1, e para as espécies de Aspergillus sp, Criptococcus
neoformans e C. albicans na multiplex 2.
A reação de amplificação do gene constitutivo foi preparado com 100 ng de DNA, 25
pmol de cada inicializador, 1,76 mM MgCl2, 0,45 mM de dNTPs, 1x tampão e 1,0 U Taq DNA
polimerase (Invitrogen) em um volume total de 25μL. A amplificação por PCR foi executada no
termociclador Mastercycler, Eppendorf (Hamburgo, Alemanha) utilizando o programa de
ciclagem formulado em 5 minutos para desnaturação inicial a 94°C, seguido de 40 ciclos de 1
43
minuto a 94°C para desnaturação, 1 minuto a 62°C para anelamento dos inicializadores, e 1
minuto a 72°C para extensão; ao final foi adicionado um ciclo de 7 minutos a 72°C.
A reação de amplificação da sequência ITS foi preparada com 100 ng de DNA, 25 pmol
de cada inicializador, 1,5 mM MgCl2, 0.3 mM de dNTPs, 1x tampão e 1,0 U Taq DNA polimerase
em um volume total de 25 μL. A amplificação por PCR foi executada no termociclador
Mastercycler Eppendorf utilizando o mesmo programa de ciclagem citado acima. As
multiplex PCR foram feitas com as concentrações e condições acima citadas e a lista de
iniciadores utilizados está descrito no quadro 2.
Quadro 2. Espectro de análise da MT-PCR panfúngica e seus iniciadores
Alvo Iniciadores
gpdH (gene humano) 5’ GTCTCCACCACCATGGAGAAGGCT 5’ CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA
ITS (sequência fúngica)
5’ TCCCTAGGGTGAACTGCGG 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC
rDNA Aspergillus fumigatus
5’CGCCGAAGACCCCAACATGAACGC 5’TAAAGTTGGGTGTCGGCTGGC
rDNA Candida albicans
5’TTTATCAACTTGTCACACCAGA 5’ATCCCGCCTTACCACTACCG
rDNA Candida glabrata
5’TTATCACACGACTCGACACT 5’CCCACATACTGATATGGCCTACAA
rDNA Candida tropicalis
5’CAATCCTACCGCCAGAGGTTAT 5’TGGCCACTAGCAAAATAAGCGT
44
rDNA Candida parapsilosis
5’GCCAGAGATTAAACTCAACCAA 5’CCTATCCATTAGTTTATACTCCGC
rDNA Cryptoccocus neoformans
5’ATCACCTTCCCACTAACACATT 5’GAAGGGCATGCCTGTTTGAGAG
4.8 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS
A partir dos prontuários, questionários e coletas de sangue dos pacientes envolvidos no
estudo, foi criado um banco de dados na planilha eletrônica excel (2007). Para a caracterização da
amostra em termos de frequência foi utilizado o programa SPSS versão 13, na qual obteve-se a
análise descritiva dos dados.
5. ASPECTOS ÉTICOS
Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética e pesquisa da fundação
HEMOPE (Parecer final n° 34/2009, anexo A) e comitê de ética e pesquisa
CPqAM/FIOCRUZ (parecer final n° 73/2009, anexo B).
Os pacientes assinaram termos de consentimento livre e esclarecido e aprovado pelo
mesmo (Apêndices A e B), de acordo com a resolução 196/96 do conselho nacional de
saúde e responderam a entrevista padronizada (Apêndice C). Os que não concordaram
em participar foi-lhes garantido o mesmo atendimento e tratamento.
45
Os dados serão armazenados pelo pesquisador por pelo menos 5 anos para eventual
comprovação.
ARTIGO 1: FREQUÊNCIA E ETIOLOGIA DE INFECÇÕES FÚNGICAS
DIAGNOSTICADAS ATRAVÉS DE HEMOCULTURA E/OU PCR MULTIPLEX
PANFÚNGICA EM PACIENTES ONCO-HEMATOLÓGICOS NEUTROPÊNICOS
FEBRIS
46
AUTORES: TEIXEIRA, HM; BRITO, CAA; LUCENA-SILVA, N; MAGALHÃES, JJF;
LYRA, JMA; MATIAS, CN; MELO, HRL; JUCÁ, MB; MAGALHÃES, V.
Artigo a ser submetido à revista European Journal of Clinical Microbiology & Infectious
Diseases (Qualis A internacional)
FREQUÊNCIA E ETIOLOGIA DE INFECÇÕES FÚNGICAS DIAGNOSTICADAS
ATRAVÉS DE HEMOCULTURA E/OU PCR MULTIPLEX PANFÚNGICA EM
PACIENTES ONCO-HEMATOLÓGICOS NEUTROPÊNICOS FEBRIS
RESUMO:
O diagnóstico microbiológico tardio, através de hemoculturas, em pacientes com neoplasias
hematológicas e neutropenia febril, posterga o início do tratamento adequado, levando a aumento
da morbimortalidade. A identificação do micro-organismo altera a antibioticoterapia em mais da
metade dos casos, porém, o agente tem sido isolado, em 20 a 30% dos casos. Desse total, 5% se
47
deve a infecção fúngica, causada principalmente por Candida sp e Aspergillus sp. Objetivo:
Avaliar a frequência de fungemia e sua etiologia em pacientes onco-hematológicos com episódios
de neutropenia febril utilizando-se de hemocultura e de multiplex PCR (MT-PCR) panfúngica.
Método: Estudo descritivo, do tipo série de casos, avaliando os resultados de hemocultura e MT-
PCR colhidas ao início de cada episódio de neutropenia febril. Resultados: Foram analisados um
total de 67 episódios de neutropenia febril em 42 pacientes portadores de doença onco-
hematológica, com e sem critérios para doença fúngica invasiva (DFI). A hemocultura foi positiva
em dois episódios de doença fúngica comprovada , decorrentes de C. parapsilosis e C. tropicalis,
enquanto a MT-PCR foi positiva em um dos episódios. Ocorreram ainda mais 15 casos com
critérios clínicos para infecção fúngica, (3 prováveis e 12 possíveis) com a MT-PCR
identificando fungemia em 12. A PCR conseguiu registrar quarenta e duas infecções fúngicas
através da presença de ITS positivo na reação, com a determinação por MT-PCR de vinte e três
espécies em 21 análises (duas PCRs identificaram duas espécies de fungo no mesmo episódio),
assim distribuídos: C. parapsilosis 10 (43,5%), Cryptococcus neoformans 6 (26,1%), C. glabrata
4 (17,4%), C. tropicalis 2 (8,7%) e C. albicans 1(4,3%). Conclusão: A utilização da MT-PCR
associada a hemocultura aumentou o número de documentação microbiológica, em episódios de
neutropenia febril, quando infecção fúngica invasiva é suspeita. Considerações: Ajustes na
técnica e estudos de validação são necessários para determinar a real eficácia da mesma.
Palavras chaves : Diagnóstico. Fungemia. Hospedeiro imunocomprometido. Neutropenia. Reação
em cadeia de polimerase.
OCCURRENCE AND ETIOLOGY OF FUNGAL INFECTIONS DIAGNOSED BY
BLOOD CULTURE AND/OR PANFUNGAL MULTIPLEX PCR IN ONCO-
HEMATOLOGICAL PATIENTS WITH FEBRILE NEUTROPENIA
ABSTRACT
The late microbiological diagnosis using blood cultures in febrile neutropenic onco-hematological
patients delays the prompt initiation of adequate treatment, leading to an increase of
morbimortality in these individuals. The identification of the responsible microorganism changes
48
the antibiotic therapy in more than one half of patients, however, in only 20-30% of cases the
pathogen isolation is achieved. Of these, 5% is due to fungal infections, caused mainly by
Candida sp and Aspergillus sp. Objective: To evaluate the fungemia frequence and its etiology in
onco-hematological patients with febrile neutropenia using blood cultures and panfungal
multiplex PCR (MT-PCR). Methods: Descriptive case series study evaluating the blood cultures
and MT-PCR samples collected during a febrile neutropenia episode. Results: 67 febrile
neutropenia episodes in 42 onco-hematological patients with and without invasive fungal disease
(IFD) criteria were analysed. Blood cultures were positive in two cases of proven IFD, due to
Candida parapsilosis and Candida tropicalis while MT-PCR was positive in one of proven IFD
episodes. In other 15 cases with clinical criteria for IFD (3 probable and 12 possible), MT-PCR
indentified fungemia in 12. Conclusion: the use of MT-PCR combined with blood cultures
improves microbiological documentation in febrile neutropenia episodes when IFD is suspected.
Technical adjustments and validation studies are needed to determine its actual efficacy.
Keywords: Diagnosis. Fungemia. Immunocompromised host. Neutropenia. Polymerase chain
reaction.
INTRODUÇÃO
Neutropenia febril é uma complicação infecciosa frequente em pacientes
portadores de doenças onco-hematológicas, no entanto, o isolamento do agente infeccioso,
através da hemocultura, ocorre em 20 a 30% dos casos (1) e desses 30 a 35% se devem a
bactérias, 5% ocorre por vírus e outros 5% a fungos (2). Quando essa infecção é devida à
fungemia, em 90 % dos casos ocorre por Candida sp ou Aspergillus sp e raramente em pacientes
49
com neutropenias menores que uma semana (3). A redução da resposta inflamatória do
hospedeiro faz com que sinais e sintomas da infecção, assim como alterações laboratoriais,
apresentem-se de forma discreta ao longo do quadro infeccioso, o que dificulta a suspeita
diagnóstica (2). O fato de se isolar ou determinar o agente causador da infecção nesses pacientes
altera a conduta terapêutica em mais da metade dos casos (4), contudo, as hemoculturas para
fungemia, apresentam baixa sensibilidade (35 a 50%), mesmo quando seriadas, e normalmente
apresentam resultados tardios (> 7 dias) (5). A infecção fúngica é a principal causa de mortalidade
em pacientes neutropênicos febris e é maior quanto mais retardado for o início do tratamento
específico (6,7). Devido a dificuldade diagnóstica, do ponto de vista microbiológico, e ao
prejuízo a saúde do paciente caso haja retardo no início da terapêutica antifúngica um consenso
internacional da European Organization for Research and Treatment of Cancer
(EORTC)/Mycoses Study Group (MSG) of the National Institute of Allergy and Infectious Disease
(NIAID), em 2008, revisou os critérios para definir infecção fúngica (8), no entanto, essa
classificação além de ser presuntiva, na maioria das vezes proporciona um diagnóstico tardio (1).
Em pacientes com risco de desenvolver infecção fúngica, a perspectiva para um futuro a
curto e médio prazo é a monitorização contínua de biomarcadores moleculares, como o
sequenciamento de DNA (deoxyribonucleic acid), que são capazes de detectar micro-organismos
rapidamente e sem incubação (9). O desenvolvimento de uma multiplex PCR (MT-PCR) in house
para detecção de fungos em amostras de sangue em pacientes neutropênicos febris tem
demonstrado sensibilidades e especificidades variadas quando comparada a hemoculturas
(10,11,12). Porém, a falta de padronização de técnicas e de inicializadores para detecção
genômica fúngica, limitam a sua utilização rotineira (13).
Foi desenhada uma multiplex PCR convencional para detectar fungos em amostras de
sangue humano em pacientes com neutropenia febril, com a região internal transcript spacer
(ITS) do genoma fúngico sendo o alvo selecionado para a detecção de 06 espécies de fungos
patogênicos.
O objetivo deste estudo foi determinar a frequência de infecção fúngica por hemocultura e
MT-PCR em pacientes com neoplasias hematológicas com episódios de neutropenia febril.
MATERIAIS E MÉTODOS
50
1. PACIENTES: Realizou-se um estudo prospectivo, observacional, conduzido no Hemocentro
de Pernambuco (HEMOPE), hospital de referência para pacientes onco-hematológicos em
Pernambuco (Recife-PE), Brasil, entre fevereiro e novembro de 2010. Foram convidados a
participar da pesquisa, adultos atendidos na instituição com diagnóstico de neoplasias
hematológicas, que estivessem ou não recebendo quimioterapia e que tivessem indicação de
internação hospitalar ou que estivessem internados, ao desenvolverem neutropenia febril. Após a
assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, responderam a um questionário pré-
formulado, seguido de registro de dados clínicos, coleta de amostras sanguíneas para exames
laboratoriais de rotina, hemocultura e para realização de MT-PCR. Esta pesquisa foi aprovada
pelo comitê de ética e pesquisa da fundação HEMOPE (Parecer final n° 34/2009) e comitê de
ética e pesquisa CPqAM/FIOCRUZ (parecer final n° 73/2009).
2. MANEJO CLÍNICO: Pacientes foram internados e conduzidos de acordo com seu médico
assistente. Os pacientes habitualmente recebiam, no momento do diagnóstico, profilaxia para
infecções com fluconazol, aciclovir e levofloxacino. Durante o episódio febril recebiam
antibioticoterapia empírica conduzida de acordo com os protocolos da Infectious Diseases Society
of America (IDSA) (2). Modificações da terapia antibiótica e adição de terapia antifúngica foi
baseada no curso clínico (persistência da febre acima de 72 h, deterioração clínica e/ou novo foco
infeccioso). O manejo clínico foi rotineiramente baseado em resultados das hemoculturas, os
resultados da MT-PCR não foram considerados na decisão terapêutica.
3.DEFINIÇÕES: Neutropenia febril foi definida conforme critérios da IDSA 2010, considerando-
se neutropenia um número de neutrófilos < 500/mm3 ou entre 500 a 1000/mm3 com tendência a
declínio e febre definida por uma mensuração maior ou igual a 38°C ou maior ou igual a 37,8°C
por mais de uma hora (2). Um novo episódio de neutropenia febril foi determinado por reinício da
febre após um período de 72 horas afebril. Doença fúngica invasiva foi definida como
comprovada, provável ou possível de acordo com o EORTC-MSG (8), no dia da coleta da
amostra de sangue para realização da MT-PCR.
4.COLETA DAS AMOSTRAS SANGUÍNEAS: As hemoculturas automatizadas foram realizadas
utilizando-se o sistema BacT/Alert®. A solicitação de hemoculturas e sua coleta, processamento
do material e identificação das espécies, seguia a rotina dos laboratórios prestadores desse serviço
51
ao HEMOPE. As amostras para execução da MT-PCR foram obtidas por punção periférica
através do sistema vacutainer com coleta de 5 a 8 ml de sangue em tubo contendo EDTA
(ethylenediamine tetraacetic acid). Foi colhida uma amostra por episódio de neutropenia febril
por paciente e encaminhada ao laboratório de biologia molecular do Instituto de Medicina
Integral Professor Fernando Figueira (IMIP), onde foram realizados os testes moleculares.
5. EXTRAÇÃO E AMPLIAÇÃO DO DNA E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO
FÚNGICA: Para extração do DNA genômico 5 a 8 ml das amostras de sangue periférico foram
diluídas em igual volume de tampão PBS (phosphate buffered saline) e submetidas a um
gradiente de Ficoll-Paque plus (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia) por centrifugação a 1800 rpm
por 30 min, o processamento, extração e diagnóstico molecular foi realizado de acordo com Luo e
Mitchell (2002), a lista de iniciadores utilizados está descrita na Tabela 1.
Tabela 1. Espectro de análise da MT-PCR panfúngica e seus iniciadores
Alvo Iniciadores gpdH (gene humano)
5’ GTCTCCACCACCATGGAGAAGGCT
5’ CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA
ITS (sequência fúngica)
5’ TCCCTAGGGTGAACTGCGG
5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC
52
rDNA Aspergillus fumigatus
5’CGCCGAAGACCCCAACATGAACGC
5’TAAAGTTGGGTGTCGGCTGGC
rDNA Candida albicans
5’TTTATCAACTTGTCACACCAGA
5’ATCCCGCCTTACCACTACCG
rDNA Candida glabrata
5’TTATCACACGACTCGACACT
5’CCCACATACTGATATGGCCTACAA
rDNA Candida tropicalis
5’CAATCCTACCGCCAGAGGTTAT
5’TGGCCACTAGCAAAATAAGCGT
rDNA Candida parapsilosis
5’GCCAGAGATTAAACTCAACCAA
5’CCTATCCATTAGTTTATACTCCGC
rDNA Cryptoccocus neoformans
5’ATCACCTTCCCACTAACACATT
5’GAAGGGCATGCCTGTTTGAGAG
6. DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA: A partir dos prontuários, questionários e coletas de
amostras de sangue dos pacientes envolvidos no estudo, foi criado um banco de dados na planilha
eletrônica excel (2007). Para a avaliação estatística utilizou-se o programa SPSS versão 13, com
a qual obteve-se a análise descritiva dos dados. Os resultados da MT-PCR panfúngica foram
interpretadas de acordo com os critérios do EORTC-MSG para classificação e infecção fúngica
(8) associado à resposta ou não a introdução de antifúngicos. Os episódios de neutropenia febril
em que não conseguiu-se extração gênica de controle (alvo humano) para a realização da PCR
(polymerase chain reaction) não foram analisados.
RESULTADOS:
Analisou-se 67 episódios de neutropenia febril (NF) apresentados por 42 pacientes com
neoplasias hematológicas. A cada episódio de NF obteve-se pelo menos uma amostra de sangue
para cultura e uma amostra para realização da PCR, sendo 25 homens e 17 mulheres, com uma
53
mediana de idade de 43anos (variando de 19 a 70 anos). As características dos pacientes com
episódios de neutropenia febril estão listadas na tabela 2. Tabela 2. Sexo , idade e tipo de neoplasia em 42 pacientes com episódios de Neutropenia febril
Características dos pacientes com Neutropenia febril (n=42) Valores (%)
Masculino/Feminino.......................................... 25 (60)/ 17 (40)
Mediana de idade............................................... 43 anos Neoplasias Hematológicasa
LMAb não M3................................................. 24 (58,5) LLAc................................................................ 8 (19,5) LBAd................................................................ 4 (9,8) SMDe ............................................................... 2 (4,9) LMAb não M3 ................................................. 1 (2,4) Outros.............................................................. 2 (4,9)
aEm um paciente não se identificou o tipo de neoplaisa hematológica b Leucemia Mielóide Aguda c Leucemia Linfóide Aguda d Leucemia Bifenotípica Aguda e Síndrome mielodisplásica
Do total de episódios de NF analisados, 42 corresponderam ao primeiro episódio e 25 a
episódios recorrentes. A mediana de dias de neutropenia foi de 11 dias e variou entre 2 a 95 dias.
O sítio de infecção foi identificado em 35 (52,2%) casos, sendo 4 (6,0%) do trato
gastrintestinal, 22 (32,8%) do trato respiratório e 9 (13,4%) de cateteres, pele ou partes moles e
32 (47,8%) não teve um sítio de infecção definido (Tabela 3).
Tabela 3. Dias de neutropenia, número de episódios, micro-organismos isolados e sítio de infecção em 67 episódios de neutropenia febril
Características dos episódios de Neutropenia febril (n=67) Valores (%)
Mediana de dias de Neutropenia........................................................................ 11
Número de episódios febris
Primeiro episódio............................................................. 42 (62,7) Episódios recorrentes....................................................... 25 (37,3) Antimicrobiano adequado ao início da febre................... 63 (98,4)
54
Infecção documentada microbiologicamente
Bactérias Gram-positivas.................................................. 9 (52,9) Bactérias Gram-negativas................................................. 6 (35,3) Fungos............................................................................... 2 (11,8)
Sítio de infecção
Sítio desconhecido........................................................... 32 (47,8) Vias aéreas superiores e inferiores ................................. 22 (32,8) Cateteres,pele e partes moles........................................... 9 (13,4) Trato gastro-intestinal superior e inferior ....................... 4 (6,0)
Documentação microbiológica. Foram identificados através de hemoculturas 17 micro-
organismos, sendo isoladas 9 (52,9%) bactérias gram-positivas, 6 (35,3%) bactérias gram-
negativas e apenas 2 (11,8%) fungos, uma Candida parapsilosis e uma Candida tropicalis (tabela
3 e 4). A PCR conseguiu registrar quarenta e duas infecções fúngicas através da presença de ITS
positivo na reação, com a determinação por MT-PCR de vinte e três espécies em 21 análises (duas
PCRs identificaram duas espécies de fungo no mesmo episódio), assim distribuídos: C.
parapsilosis 10 (43,5%), Cryptococcus neoformans 6 (26,1%), C. glabrata 4 (17,4%), C.
tropicalis 2(8,7%) e C. albicans 1 (4,3%). Esses resultados são demonstrados na tabela 4.
Tabela 4. Espécies de fungos identificadas por hemocultura e MT- PCR
Espécie Número de espécies detectadas
Hemocultura PCR Total
Candida glabratab 0 4 4 Candida parapsilosisc 1 8 9 Cryptococcus neoformans 0 4 4 Candida tropicalisb 1 2 3 Candida albicans 0 1 1
55
Candida parapsilosis + Cryptococcus neoformans 0 2 2
Não identificada 36a 22 58 a Número de hemoculturas negativas para fungos e bactérias b Em um caso a hemocultura demonstrou C.tropicalis e a MT-PCR C.glabrata c Em um caso a hemocultura demonstrou C. parapsilosis e MT-PCR foi negativa, no entanto, esta foi colhida após 24h do início de antifúngico terapêutico.
Doença fúngica invasiva (DFI). DFI foi diagnosticada de acordo com o EORTC-MSG (8) em
dezessete episódios (25,4%): 2 (3,0%) infecções comprovadas, 3 (4,4%) infecções prováveis e 12
(18,0%) infecções possíveis e não foram preenchidos critérios para infecção fúngica em 50
(74,6%). Enquanto a hemocultura demonstrou infecção por fungos nas duas DFIs comprovadas a
MT-PCR foi positiva apenas em uma (o paciente havia inciado antifúngico 24 horas antes da
coleta da MT-PCR).
Dos 3 casos de DFI prováveis a MT-PCR para fungo foi positiva em dois e nos 12 casos
de DFI possíveis a MT-PCR foi positiva em dez. Existiram ainda 29 episódios em que a MT-PCR
foi positiva e não se preenchia critérios para DFI (tabela 5), destes 17 episódios apresentaram
resposta terapêutica à introdução de antifúngico.
Tabela 5. Distribuição dos resultados de hemocultura, MT-PCR, resposta à antifúngico e óbito segundo os critérios para doença fúngica invasiva
DFIa Hemoculturab MT-PCR Resposta à AFc,d Óbito positiva negativa positiva negativa sim não Sim Não
Comprovada 2(100,0%) 0(0,0%) 1(50,0%) 1(50,0%) 2(100,0%) 0(0,0%) 0(0,0%) 2(100,0%) Sem critérios 0(0,0%) 38(100,0%) 29(59,2%) 20(40,8%) 20(41,7%) 28(58,3%) 4(8,2%) 45(91,8%) Provável 0(0,0%) 3(100,0%) 2(66,7%) 1(33,3%) 2(66,7%) 1(33,3%) 0(0,0%) 3(100,0%) Possível 0(0,0%) 10(100,0%) 10(83,3%) 2(16,7%) 7(70,0%) 3(30,0%) 4(33,3%) 8(66,7%) a Em um episódio de NF não foi possível realizar a classificação de DFI conforme critérios da EORTC-MSG b Houve 13 casos de hemoculturas não colhidas ou extraviadas c Antifúngico d Em três dos episódios de DFI possível não conseguiu-se avaliar a resposta ao AF.
Para todos os 17 casos de DFI (comprovada, provável ou possível), treze (76%) PCR
foram positivas. Entre os 50 episódios negativos para critérios de DFI, a PCR foi positiva em 20
(40%).
56
Quando analisados os 31 casos que apresentaram resposta terapêutica a introdução de
antifúngico, 26 tiveram PCR positivas. Entre os 32 sem resposta terapêutica a introdução da
droga, PCR estava negativa em 18.
DISCUSSÃO
Utilizando-se os critérios do EORTC-MSG (8), no corrente estudo, foi demonstrado uma
frequência de 17 casos de DFI em 42 pacientes com neoplasias hematológicas em um total de 67
episódios de neutropenia febril (25,8%), sendo 2 comprovadas, 3 prováveis e 12 possíveis. Desses
a MT-PCR foi capaz de registrar 13 episódios (19%), através da detecção do ITS fúngico em
amostras sanguíneas. Rabagliati e cols ao utilizar esses mesmos critérios para identificar DFI
encontrou uma incidência de 26,2 % enquanto Lamoth e cols demostraram uma frequência de
5%.
Quanto à comprovação da infecção fúngica através do isolamento do agente por
hemocultura a literatura relata variação entre 5 a 10% (2,16,17,18,19). Na casuísta, aqui descrita,
a percentagem de hemoculturas positivas para fungos foi de 3,0 % dos episódios, representadas
por dois casos de candidemia, sendo isolada uma C. parapsilosis e uma C. tropicalis. Mesmo
utilizando-se hemocultura automatizada, o fato de ter sido coletado apenas uma amostra
sanguínea para a realização da mesma, pode ter diminuído a sensibilidade do método e justificar a
frequência abaixo do esperado em literatura.
Essa baixa incidência de isolamento microbiológico de fungos, demonstram a importância
do desenvolvimento de técnicas como a MT-PCR, que sejam capazes de documentar um maior
número, e com maior efetividade, essas infecções.
A ausência de um procedimento diagnóstico padrão-ouro adequado para a identificação de
infecção fúngica em neutropênicos febris, devido a hemocultura apresentar baixa sensibilidade e
apresentar resultados tardios, é uma limitação ao desenvolvimento e avaliação de novos métodos
moleculares. No presente estudo o pequeno número de DFIs prováveis e possíveis, além do baixo
número de infecções documentadas por hemoculturas, e a ausência de documentação
histopatológica, são fatores que dificultaram a avaliação de desempenho da MT-PCR. Dessa
57
forma é recomendado a interpretação de PCR positiva com hemocultura negativa de acordo com
cada contexto clínico (20,21).
A falência da MT-PCR em diagnosticar um caso comprovado de fungemia pode dever-se
ao fato de se ter iniciado o antifúngico antes da coleta da amostra para realização da MT-PCR, ou
até mesmo contaminação da hemocultura na hora da coleta ou de seu manuseio (22,23).
A PCR detectou 2 DFI nos 3 casos de infecções fúngicas prováveis e 10 DFI em 12 casos
de infecção fúngica possível, em ambos os casos, não houve isolamento de fungos através das
hemoculturas. Alguns desses achados podem dever-se a resultados falso-positivos da MT-PCR,
mas, sua interpretação é difícil, devido a limitação do método padrão-ouro (hemocultura) (22,
23).
A maioria (90%) dos casos de fungemia em neutropênicos febris deve-se a Candida sp ou
Aspergillus sp. Raramente, esses episódios ocorrem em neutropenias com duração menor que
uma semana, sendo exatamente após esse período que se espera a maioria dos casos de fungemia
(3).
Apesar de não ter identificado a espécie, em episódios de DFI que apresentavam imagens
sugestivas de aspergilose, a PCR conseguiu detectar a presença de infecção fúngica através do
ITS positivo na maioria desses casos (tabela 5). Esse fato pode dever-se a ausência de primers
específicos para detecção de outras espécies de Aspergillus emergentes, as quais vem sendo
detectados cada vez mais com maior frequência nesses pacientes. Na década passada até 90% dos
casos de aspergilose se devia ao Aspergillus fumigatus, atualmente, outras espécies estão sendo
reconhecidas, como: o A. flavus, A. terreos e A. niger (24).
Vários outros fungos têm importância emergente como agentes de infecções oportunistas
em pacientes neutropênicos febris como Fusarium sp e Trichosporon sp, e que também
apresentam baixa sensibilidade a cultura (< 50%), além de curva de crescimento lento o que
retarda o seu isolamento (9), e que podem também explicar o fato da MT-PCR ter demonstrado
infecção fúngica, sem no entanto, ter identificado a espécie, devido a falta de primers específicos
da mesma.
Apesar de mais de 90% dos casos de candidemia serem causadas por C. albicans, C.
glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. krusei, as variedades de espécies de Candida
58
causadoras de infecção continuam a crescer, provavelmente pelo uso, cada vez mais frequente,
de antifúngicos profiláticos e a melhorias nos métodos de identificação laboratoriais (25,26). No
presente estudo, a espécie encontrada com maior frequência foi C. parapsilosis, que está
relacionada principalmente à presença de cateteres e à falta de higienização das mãos dos
profissionais de saúde (25,27). Seguida de C. glabrata, segunda espécie mais incidente nos
Estados Unidos da América (EUA), enquanto que nos países latino americanos corresponde a
apenas 4 a 7% dos casos. Esta diferença pode ser decorrente de fatores ligados ao hospedeiro,
variações geográficas dos diversos países além de diferenças nos métodos de isolamento
utilizados nos laboratórios de microbiologia (25-29). A C. tropicalis, importante causa de
candidemia em pacientes com neoplasias hematológicas, foi a terceira espécie mais comumente
isolada nesse estudo. Sua incidência vem decaindo, mundialmente, com a utilização, cada vez
mais difundida, de triazólicos profiláticos (25,30). A C. albicans, em literatura, permanece sendo
a espécie mais frequentemente isolada, estando associada a índices de letalidade elevados
(29,31,32). No presente estudo foi demonstrado uma baixa incidência dessa espécie, sendo
documentada em um único caso.
O uso de fluconazol profilático (utilizado rotineiramente pelo HEMOPE) pode justificar a
baixa frequência de C. albicans, espécie intrinsecamente sensível ao mesmo. Ainda como
consequência de seu uso rotineiro, pode ocorrer a seleção de espécies naturalmente resistentes
aos triazólicos, como a C. krusei, ou propiciar o surgimento de cepas resistentes de C.
parapsilosis e tropicalis.
Aumento de Candida sp, ditas emergentes, e da própria C. krusei, não contemplada na
MT-PCR, pode ser uma outra explicação para o alto número de PCRs com ITS para fungo
positivo sem conseguir isolar-se o agente.
A infecção multifúngica é mais comumente observada em pacientes com neoplasias
hematológicas do que em pacientes com tumores sólidos. Sua incidência varia de 2 a 10% dos
casos de fungemia. Classicamente, os fatores que mais se correlacionam com esse achado são
neutropenia prolongada (10±17 dias), neutropenia grave (neutrófilos < 500/mm3), uso de
fluconazol profilático e infecção fúngica prévia (33).
59
Na presente pesquisa observou-se dois casos (3,0%) de superinfecção. Dois mostrando
Cryptococcus neoformans e Candida parapsilosis , em pacientes portadores de LMA M2 e SMD,
com neutrófilos de 0 e 125/mm3, com um tempo de 28 e 39 dias de neutropenia, respectivamente.
Ambos utilizaram antifúngico profilático, porém, não apresentavam histórico de infecção fúngica
prévia. Ocorreu ainda um caso verosímil de infecção fúngica por multiespécie, causada por C.
tropicalis e C.glabrata, diagnosticada através de hemocultura e MT-PCR, respectivamente,em um
paciente com LMA M2, com 0 neutrófilos em sangue periférico e tempo de neutropenia
relativamente curto, 4 dias.
O uso de técnicas moleculares para detecção de DNA fúngico pode ter impacto na decisão
e início precoce da terapêutica em pacientes com neoplasias hematológicas e neutropenia febril
(34-36) e a utilização da MT-PCR desenvolvida in house associado a hemocultura e aos critérios
para DFI da EORTC-MSG aparentemente aumentou o número de documentação de micro-
organismos e do diagnóstico de micoses invasivas em pacientes com neoplasias hematológicas e
NF, no presente estudo.
CONCLUSÕES
a) A frequência de fungemia em pacientes oncológicos com episódios de neutropenia
febril de alto risco, determinadas por hemocultura e PCR panfúngica, internados no HEMOPE
foi de 21%, o equivalente a 14 infecções fúngicas, das quais, 2 (3,0%) correspondiam a DFI
comprovada, 2 (3,0%) DFI provável e 10 (15%) a infecção fúngica possível.
b) As espécies de fungos encontradas em pacientes oncológicos com episódios de
neutropenia febril de alto risco, através de hemocultura e MT-PCR foram: C. parapsilosis em 9
episódios (13%), C. glabrata em 4 casos (6%), Cryptococcus neoformans em 4 (6%) amostras, 3
(4%) demonstraram Candida tropicalis, 1 Candida albicans e 2 superinfecções por C.
parapsilosis e C. neoformans.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Infecção fúngica em pacientes portadores de neoplasias hematológicas não são incomuns,
porém a documentação microbiológica é difícil. Os resultados apresentados sugerem que a MT-
60
PCR combinada a hemocultura e a avaliação de critérios clínicos, em pacientes com neoplasias
hematológicas e neutropenia febril, podem fornecer importantes informações diagnósticas na
suspeita de infecções fúngicas. No entanto, estudos de validação e o desenvolvimento de MT-
PCR panfúngica em tempo real são necessários para confirmar esses dados e melhorar sua
performance.
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64
ARTIGO 2: CARACTERÍSTICAS ONCOLÓGICAS E FATORES DE RISCO EM
PACIENTES NEUTROPÊNICOS FEBRIS COM INFECÇÕES FÚNGICAS INVASIVAS
AUTORES: TEIXEIRA, HM; BRITO, CAA; LUCENA-SILVA, N; MAGALHÃES, JJF;
LYRA, JMA; MATIAS, CN; MELO, HRL; JUCÁ, MB; MAGALHÃES, V.
Artigo a ser submetido à Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia (QUALIS B1 nacional)
65
CARACTERÍSTICAS ONCOLÓGICAS E FATORES DE RISCO EM PACIENTES
NEUTROPÊNICOS FEBRIS COM INFECÇÕES FÚNGICAS INVASIVAS
RESUMO
Infecção fúngica é uma importante causa de mortalidade em pacientes com câncer, especialmente,
nos doentes com neoplasias hematológicas. O reconhecimento das características e dos fatores de
risco para o desenvolvimento de micose invasiva nessa população, é essencial para o início
precoce da terapêutica e melhora nos seus resultados. Objetivo: Descrever as características
oncológicas e os fatores de risco para doença fúngica invasiva (DFI) em pacientes com neoplasias
hematológicas e neutropenia febril (NF). Métodos: Estudo tipo série de casos, descrevendo
pacientes onco-hematológicos com episódios de NF e infecção fúngica diagnosticada através de
hemocultura, multiplex PCR panfúngica (MT-PCR) e com critérios para DFI. Resultados: Foram
avaliados 74 episódios de NF em 44 pacientes (26 homens e 18 mulheres) com neoplasias
hematológicas no Hemocentro de Pernambuco (HEMOPE), hospital de referência em neoplasias
hematológicas. Dezoito episódios de NF preencheram critérios para DFI, dos quais, em 11
(61,2%) episódios os pacientes apresentavam leucemia mielóide aguda (LMA) como doença
oncológica. A mediana de dias de neutropenia foi de 9, 20 e 20, para DFI comprovada, provável e
possível, respectivamente. Em 11 (61,2%) dos episódios, os pacientes utilizavam acesso venoso
central ao momento do diagnóstico de fungemia. Nenhum desses pacientes recebia arabinosídeo-
C (ARA-C) em altas doses, fludarabina ou tinha sido submetido à transplante de medula óssea
(TMO), fatores de risco conhecidos para desenvolvimento de fungemia. CONCLUSÃO: LMA
como neoplasia de base e o tempo de neutropenia acima de dez dias foram os fatores de risco que
ocorreram com maior frequência em pacientes onco-hematológicos com episódios de NF e
infecção fúngica.
PALAVRAS CHAVE: Fatores de risco. Fungemia. Neutropenia. Reação em cadeia de
polimerase.
66
ONCOLOGICAL CHARACTERISTICS AND RISK FACTORS FOR INVASIVE FUNGAL
DISEASE IN PATIENTS WITH FEBRILE NEUTROPENIA
ABSTRACT
Fungal infection is an important cause of mortality in patients with cancer, specially in those with
hematologic malignancies. The recognition of clinical characteristics and risk factors for invasive
fungal disease in this population is essential for prompt treatment and improvement in therapy
outcomes. Objective: To describe oncological characteristics and risk factors for fungemia in
patients with invasive fungal disease (IFD). Methods: Descriptive case series study describing
onco-hematological patients with febrile neutropenia (FN) and fungal disease diagnosed by blood
culture, panfungal MT-PCR and clinical criteria for IFD. Results: 74 FN episodes in 44 onco-
hematological patients (26 men and 18 women) treated at the Hemocentro de Pernambuco
(HEMOPE) were evaluated. Eighteen NF episodes had clinical criteria for IFD. In eleven cases
(61,2%) the patients had acute myeloid leukemia diagnosis. The median neutropenia duration was
9, 20 and 20 for proven, probable and possible IFD, respectively. In 11 cases (61,2%) patients had
a central venous access at the moment fungemia was diagnosed. None of these patients had
received citarabine at high doses, fludarabine or had been submitted to a bone marrow
transplantation, well known risk factors for fungemia development. Conclusion: Oncological
diagnosis of acute myeloid leukemia and neutropenia duration of more than 10 days were the
most frequent risk factors for fungemia in onco-hematological patients with FN.
Keywords: Fungemia. Neutropenia. Polymerase chain reaction. Risk factors.
INTRODUÇÃO
A doença fúngica invasiva (DFI) é reconhecidamente uma importante causa de
morbimortalidade em pacientes neutropênicos febris (1). Sua incidência varia de 5 a 10% entre
os casos em que se identifica o agente (2). As manifestações clínicas, habitualmente, são
67
inespecíficas e apresentam como sintoma mais comum a febre. Apresenta taxa de letalidade que
pode chegar a 60%.
Normalmente, existe dificuldade de aquisição de espécimes biológicos por biópsia, pois,
com frequência esses pacientes encontram-se neutropênicos e plaquetopênicos, ou algumas vezes,
apresentam graus variados de instabilidade hemodinâmica o que contraindicam procedimentos
médicos invasivos (3). Em consequência desse fato, muitas infecções graves por fungos em
pacientes neutropênicos não são diagnosticadas ante mortem, como demonstrou estudo realizado
em pacientes submetidos à necrópsia, onde apenas metade dos pacientes com candidíase
disseminada apresentavam hemoculturas positivas. A baixa positividade deve-se ao fato do
crescimento de leveduras em hemoculturas serem dependentes de vários fatores, como
quantidade de sangue colhido, concentração do fungo na corrente sanguínea, espécie do fungo e
do tipo de sistema empregado para a realização da hemocultura (4).
Portanto, o reconhecimento dos fatores de risco para infecção fúngica em pacientes
neutropênicos são essenciais para o diagnóstico e início de terapia precoces, possibilitando, dessa
forma, a diminuição da letalidade (5,6). Vários desses fatores têm sido identificados, e o mais
importante descrito em pacientes onco-hematológicos, parece ser o tempo de neutropenia superior
a 10 dias (2,7). No entanto, outros fatores apresentam importância como o uso prévio de
corticosteróide (CE), internação em unidade de terapia intensiva (UTI), necessidade de ventilação
mecânica, uso de cateter venoso central (CVC), comorbidades (destacadamente diabetes
mellitus), nutrição parenteral , entre outros (8-11).
Quanto às características oncológicas, as micoses invasivas são mais comumente
observadas em pacientes com neoplasias hematológicas, principalmente, leucemias agudas e
mielodisplasia. Os pacientes submetidos a TMO, notadamente os que desenvolvem doença do
enxerto versus hospedeiro (DEVH), aqueles que estejam recebendo o primeiro ciclo de
quimioterapia (QT) de indução e exposição a alguns antineoplásicos como ARA-C em altas doses
e fludarabina, além de recorrência da doença neoplásica hematológica de base são fatores
relacionados a fungemia (7.8,12,13).
O presente estudo descreve os fatores de risco e as características neoplásicas encontradas
em pacientes onco-hematológicos com NF e DFI diagnosticada por hemocultura e MT-PCR.
68
PACIENTES E MÉTODOS
1. LOCAL DO ESTUDO E PACIENTES: O estudo foi realizado no HEMOPE, hospital de
referência para o atendimento de pacientes onco-hematológicos em Pernambuco, Brasil. O
período do estudo foi o compreendido entre fevereiro e novembro de 2010. Foram convidados a
participar da pesquisa, adultos atendidos na instituição participante da pesquisa com diagnóstico
de neoplasias hematológicas e com indicação de internação hospitalar ou que estivessem
internados, ao desenvolverem neutropenia febril. Após a assinatura do termo de consentimento
livre e esclarecido, responderam a um questionário pré-formulado, seguido de registro de dados
clínicos, coleta de amostras sanguíneas para exames laboratoriais de rotina, hemocultura e MT-
PCR. Esta pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética e pesquisa da fundação HEMOPE (Parecer
final n° 34/2009) e comitê de ética e pesquisa CPqAM/FIOCRUZ (parecer final n° 73/2009).
2. DEFINIÇÕES: Neutropenia febril foi definida conforme critérios da IDSA 2010, da forma que,
neutropenia foi definida por número de neutrófilos < 500/mm3 ou entre 500 a 1000/mm3 com
tendência a queda e febre definida por uma mensuração axilar maior ou igual a 37,8 °C ou maior
ou igual a 37,5 °C por mais de uma hora (2). Um novo episódio de neutropenia febril foi
determinado por reinício da febre após um período de 72 horas afebril. Doença fúngica invasiva
foi classificada de acordo com as definições do EORTC-MSG (2).
3. COLETA DAS AMOSTRAS SANGUÍNEAS: As hemoculturas automatizadas foram
realizadas utilizando-se o sistema BacT/Alert®. A solicitação de hemoculturas e sua coleta,
processamento do material biológico, bem como a identificação das espécies, seguiu a rotina dos
laboratórios prestadores desse serviço ao HEMOPE. As amostras para execução da MT-PCR
foram obtidas por punção periférica através do sistema vacutainer com coleta de 5 a 8 ml de
sangue em tubo contendo EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid). Foi colhida uma amostra por
episódio de neutropenia febril por paciente e encaminhada ao laboratório de biologia molecular
do Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira (IMIP), para realização dos testes
moleculares.
4. EXTRAÇÃO E AMPLIAÇÃO DO DNA E DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO
FÚNGICA : Para extração do DNA genômico 5 a 8 ml das amostras de sangue periférico foram
diluídas em igual volume de tampão PBS (phosphate buffered saline) e submetidas a um
69
gradiente de Ficoll-Paque plus (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia) por centrifugação a 1800rpm
por 30 min. O processamento e identificação do patógeno, ocorreram conforme publicado por
Luo e Mitchell (2002).
5. DESENHO DO ESTUDO, DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA: Foi realizado um estudo tipo
série de casos, por amostra de conveniência.
Para todos os pacientes inclusos na pesquisa foram coletados dados a partir dos
prontuários e questionários, sobre:
Sexo, idade, tempo de neutropenia, presença de comorbidades (diabetes mellitus,
hipertensão arterial, doenças autoimunes, pneumopatias, hepatopatias, nefropatias e cardiopatias
crônicas);
Presença nos últimos 30 dias de: internação em UTI e necessidade de ventilação
mecânica, uso de CVC, necessidade de hemodiálise, nutrição parenteral total (NPT) e sonda
vesical de demora (SVD) e de CE (dose de prednisona maior que 20 mg/dia, ou equivalente, por
mais de 30 dias);
Resultados de níveis de hemoglobina, número de leucócitos, neutrófilos e plaquetas, além
do tempo total de neutropenia;
Características oncológicas: Tipo, estadiamento e progressão da neoplasia, ciclo e tipo de
QT, TMO prévio, presença de DEVH.
Com essas variáveis associadas ao resultado das coletas de amostras de sangue dos
pacientes envolvidos no estudo, foi criado um banco de dados na planilha eletrônica excel, 2007.
Para a avaliação estatística utilizou-se o programa SPSS versão 13, com a qual obteve-se a análise
descritiva dos dados. Os resultados da MT-PCR panfúngica e hemocultura foram interpretadas de
acordo com os critérios do EORTC-MSG para classificação e infecção fúngica (15) associado a
resposta ou não à introdução de antifúngicos.
RESULTADOS
População do estudo. Foram analisados 74 episódios de neutropenia febril apresentados por 44
pacientes com neoplasias hematológicas. A cada episódio de NF obteve-se pelo menos uma
70
amostra de sangue para cultura e uma amostra para realização da PCR, sendo incluídos 26 (59%)
homens e 18 (41%) mulheres, apresentando uma idade mediana de 40 (19-70) anos.
Do total de episódios analisados, 44 corresponderam ao primeiro episódio e 30 a episódios
recorrentes. A mediana de dias de neutropenia foi de 11 dias e variou entre 2 a 95 dias. O episódio
de neutropenia febril foi o inicial em 44 (59,4%) dos casos, enquanto foi recorrente em 30
(40,6%). O antibiótico inicial estava adequado em 67 (94,3%) dos episódios, segundo Friefeld e
cols.
Doença fúngica invasiva. DFI foi diagnosticada de acordo com o EORTC-MSG (15) em dezoito
episódios (24,4%), dos quais 2 (2,8%) foram infecções comprovadas, através de uma hemocultura
positiva para Candida tropicalis e outra para C.parapsilosis, 3 (4,0%) infecções prováveis e 13
(17,6%) infecções possíveis (tabela 1). A documentação desses agentes através da hemocultura e
da MT-PCR, encontra-se na tabela 1. Não foram preenchidos critérios para infecção fúngica em
55 (74,3%) e em um (1,3%) episódio não foi possível sua classificação quanto a DFI.
Tabela 1. Espécies de fungos identificadas por hemocultura e MT- PCR, nas doenças fúngicas invasivas (DFIs), em 74 episódios de neutropenia febril
Espécies
Número de espécies detectadas DFI Comprovadaa
DFI Provávelb
DFI Possívelc
Candida glabratab 1 1 1 Candida parapsilosisc 1 0 2 Candida tropicalisb 1 0 0 Candida albicans 0 0 1 C.parapsilosis + C.neoformans 0 1 0
a Em um caso de DFI comprovada a hemocultura isolou C.tropicalis e a MT-PCR C. glabrata. b Em um caso não conseguiu-se a documentação etiológica. c Em 9 casos não conseguiu-se a documentação etiológica,entretanto, a MT-PCR conseguiu identificar genôma fúngico em 7 dessas amostras.
Características oncológicas e fatores de risco para infecção fúngica. A mediana de idade foi
de 61, 38 e 38 anos, respectivamente, para DFI comprovada, provável e possível. A LMA com 11
casos de DFI, foi a neoplasia mais frequente, seguida de leucemia linfóide aguda (LLA), que
apresentou 4 casos. Leucemia plasmocítica aguda (LPA), leucemia bifenotípica aguda (LBA) e
leucemia linfóide crônica (LLC), em cada uma delas ocorreu DFI em 1 caso (Tabela 2). Nove
(50%) pacientes com DFI apresentaram diagnóstico de progressão doença onco-hematológica,
71
enquanto outros nove (50%) não tiveram diagnóstico de progressão. Nenhum paciente com
critério para DFI recebeu QT com ARA-C em altas doses ou fludarabina. Em toda a casuística,
não houve qualquer paciente submetido a TMO. Tabela.2. Características oncológicas, idade e tempo de neutropenia dos pacientes nos 18 episódios de neutropenia febril e doença fúngica invasiva (DFI)
DFI comprovada
DFI provável
DFI possível
Mda idade (em anos) 61 (60-63) 38 (30-47) 38 (22-50)
Neoplasia
LMA 2 (11,2%) 2 (11,2%) 7 (38,8%)
LLA 0 (0,0%) 0 (0,0%) 4 (22,3%)
LBA 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,5%)
LPA 0 (0,0%) 1 (5,5%) 0 (0,0%)
LLC 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,5%)
Progressão neoplasia
Sim 0 (0,0%) 3 (100%) 6 (46%)
Não 2 (100%) 0 (0,0%) 7 (54%)
Ciclo incial de QTb
Sim 1 (50,0%) 1 (33,3%) 7 (58,3%)
Não 1 (50,0%) 2 (66,7%) 5 (41,7%)
Mda de dias de neutropenia 9 (4-14) 20 (3-28) 20 (4-95)
a Mediana
72
b Em um caso de DFI possível não conseguiu‐se determinar o ciclo atual de QT Ao realizar-se a correspondência dos fatores de risco para infecção fúngica com a
classificação de DFI da EORTC-MSG, observou-se que apenas 2 (2,8%) episódios de NF o
paciente apresentou necessidade de hemodiálise, em um outro (1,4%) o paciente necessitou usar
SVD, em 2 (2,8%) casos utilizou outros imunossupressores que não corticosteróide, assim como,
apenas 2 pacientes fizeram uso de ventilação mecânica em UTI, e nenhum desses preencheu
critérios para infecção fúngica. Vinte e sete (40,3%) dos indivíduos apresentavam outra
comorbidade associada a neoplasia (como hipertensão arterial, diabetes mellitus, hepatopatia ou
pneumopatia crônicas). A tabela 3 mostra a distribuição dos demais fatores de risco para DFI nos
episódios de neutropenia febril.
Tabela 3. Frequência dos fatores de risco de acordo com a classificação de doença fúngica invasiva (DFI), em 74 episódios de neutropenia febril
DFI Mucosite UTI Comorbidades
Acesso central
Mda de dias de acesso central
Uso de corticóide
Comprovada 1 (50,0%) 0 (0,0%) 1 (50,0%)# 2 (100,0%) 9 (3-15) 0 (0,0%) Sem critérios 10 (19,6%)c 4 (7,4%) 15 (27,3%)* 44 (80,0%)d 14 (0-94) 19 (35,0%) Provável 0 (0,0%) 1 (33,3%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0-0) 1 (33,3%)
Possível 3 (33,3%)c 2 (16,6%)c 3 (23,0%)# 9 (82,0%)c 17 (0-70) 5 (41,6%) a Mediana b 4 pacientes sem dados c 2 pacientes sem dados d 3 pacientes sem dados
DISCUSSÃO:
Pacientes neutropênicos, em tratamento quimioterápico, constituem um grupo com alta
prevalência de micoses invasivas. O reconhecimento de fatores de risco para o desenvolvimento
de infecção fúngica torna-se importante para o início precoce da terapêutica (3).
É descrito em literatura a associação de fungemia com pessoas mais idosas em receptores
de TMO, no entanto, essa tendência não foi observada em pacientes neutropênicos não
submetidos a TMO (7). Colombo e cols em estudo multicêntrico, por um período de 22 meses,
avaliaram casos de candidemia nesse período, e verificaram uma mediana de idade de 34,3 anos.
73
Na casuística do presente estudo observou-se a mediana de 60 anos para pacientes com
DFI e 38 anos para DFI provável e possível. O fato dos pacientes com DFI provável ter
apresentado uma mediana de idade elevada, pode dever-se a presença de comorbidades,
notadamente diabetes mellitus (DM) e mucosite (tabelas 2 e 3).
O número de micoses invasivas, nos últimos anos, vem aumentando, principalmente, por
espécies de Candida não albicans, apesar de C. albicans permanecer a espécie mais
frequentemente isolada em diferentes sítios anatômicos e em toda a parte do mundo (3). Esta
espécie é naturalmente sensível a todas as drogas antifúngicas de uso sistêmico (16), o que pode
ser uma justificativa para a baixa frequência dessa espécie aqui encontrada, uma vez que, usa-se
fluconazol profilático de rotina para pacientes neutropênicos febris, no HEMOPE.
A espécie mais frequentemente detectada foi C. parapsilosis, uma por hemocultura e 3 por
MT-PCR (1 delas associada a Cryptococcus neoformans), desde a década de 80, apresenta-se
como um importante patógeno hospitalar de fungemias, sendo responsável por 7 a 15% das
candidemias em séries publicadas nos EUA e Europa (17,18). Esse agente apresenta capacidade
de proliferar-se em soluções glicosadas e produção de biofilme e dessa forma, apresentam clara
associação com a presença de CVC (19). No atual estudo, dos 5 episódios em que se documentou
C. parapsilosis (1 por hemocultura e 4 por MT-PCR), 4 (80%) pacientes encontravam-se em uso
atual de CVC. Apesar de ser uma espécie normalmente sensível ao fluconazol, a sua facilidade
em produzir biofilmes pode ser uma das causas da sua alta frequência aqui demonstrada apesar do
uso de triazólico profilático.
A outra fungemia detectada por hemocultura foi por C. tropicalis, considerada como
importante agente oportunista em hospedeiro neutropênico. Tem sido relatada como segundo ou
terceiro agente fúngico mais comum em candidemia em pacientes neutropênicos, com maior
frequência em leucemias do que em tumores sólidos (20). Apesar de sensível ao fluconazol,
existem cepas resistentes (21,22). No caso aqui relatado, em que isolou-se C. tropicalis, apesar de
um tempo relativamente curto (4 dias), o paciente apresentava neutropenia grave (0 neutrófilos).
Candida glabrata foi documentada em um episódio de DFI provável, um episódio
comprovado e em um episódio de DFI possível. Normalmente associada a candidemia em idosos,
representando 25% das fungemias em indivíduos acima de 65 anos de idade. Outra
74
particularidade desse agente é a emergência de cepas resistente a fluconazol (10%) e algumas à
anfotericina B (23). Encontrou-se três casos, em pacientes com 60, 63 e 30 anos, em DFI
comprovada, provável e possível respectivamente, o que demonstra uma tendência de
conformidade com a literatura quanto à idade dos pacientes infectados por esse agente.
O Cryptococccus neoformans foi isolado em um caso de superinfecção associado a C.
parapsilosis, em um paciente com episódio de NF compatível com DFI provável. Trata-se de uma
infecção oportunista, relativamente frequente, em pacientes com aids e que vem diminuindo sua
incidência devido a introdução de HAART (highly active antiretroviral therapy). Criptococose em
pacientes onco-hematológicos é raramente relatada devido a baixa frequência e dificuldade
diagnóstica (11), na maioria das vezes, ocorre em casos de leucemias agudas. Os fatores
associados, que predispõem, a essa micose são: o uso de CE e a presença de comorbidades,
principalmente, DM, mas também hepatopatia crônica, doenças autoimunes e insuficiência renal
(11). O paciente aqui relatado com criptococose documentada por MT-PCR, era portador de
LMA, mas, não apresentava comorbidades ou havia feito uso de CE em doses predisponentes a
infecção por fungos.
De acordo com investigações prévias, pacientes portadores de leucemias agudas e
síndrome mielodisplásica (SMD) tem maior chance de desenvolver DFI (12% para comprovada e
provável) (24). Dos doentes com leucemias agudas, aqueles portadores de LMA apresentam
maior risco do que os com LLA, no entanto, com maior chance de óbito nestes últimos (25). Na
casuística apresentada não obtivemos nenhum caso de DFI em SMD, no entanto, algumas LMAs
podem ter se desenvolvido a partir de SMD não diagnosticada, principalmente, em idosos. Dos 5
casos de DFI comprovada e provável, 4 (5,4% do total de episódios de NF) ocorreram em
pacientes portadores de LMA. Apesar de estudos mostrarem associação de DFI com mieloma
múltiplo, encontramos apenas um caso de doença fúngica provável em paciente com leucemia
plasmocitária, neoplasia, habitualmente, originada de mieloma múltiplo prévio. Outro fato que
pode explicar essa baixa frequência é que o tratamento de escolha atual do mieloma múltiplo é
ambulatorial e com drogas com baixo potencial de neutropenia (talidomida associada à
corticosteróide).
75
Bow e cols descreveram uma associação entre quimioterapia com ARA-C em altas doses e
infecção fúngica invasiva. Dos 74 episódios avaliados, em 62 os pacientes estavam recebendo
quimioterapia, dos quais, 6 encontravam-se recebendo ARA-C HD, entretanto, nenhum deles
desenvolveu DFI definida pelos critérios do EORTC-MSG.
O uso de CE faz parte do tratamento sistêmico de inúmeras neoplasias hematológicas,
principalmente, linfomas, LLA e mieloma múltiplo, além de sua utilização rotineira, em
esquemas de quimioterapia, como potente antiemético. O CE encontra-se envolvido na
predisposição a infecções fúngicas pela sua ação inibitória do linfócito T e consequente déficit de
imunidade celular (7). Observou-se utilização de CE, em doses consideradas como predisponente,
em 1 paciente dos 3 com DFI provável e em 5 dos 13 doentes com DFI possível.
O risco de infecção fúngica é 3 vezes mais frequente no primeiro ciclo de indução de
quimioterapia (QT) do que nos subsequentes (27, 28). Uma provável explicação para esse fato é a
aplasia de medula prolongada, que habitualmente, antecede o diagnóstico da neoplasia
hematológica (27).
Das 2 infecções fúngicas comprovadas, uma ocorreu no ciclo inicial de QT e a outra em
ciclo subsequente. Nos episódios de NF, que preencheram critérios para DFI provável, uma
ocorreu no primeiro ciclo de QT e duas em ciclos subsequentes. Enquanto nos episódios de NF
com DFI possível 7 ocorreram no primeiro ciclo de QT e 5 em ciclos subsequentes.
Neutropenia prolongada é descrita como o principal fator de risco para aquisição de DFI
em pacientes neutropênicos febris, classicamente, naquelas com duração superior a 10 dias,
devido ao longo período de imunossupressão (2). Sua recuperação é um fator de bom prognóstico
quanto ao desfecho da infecção fúngica (12). Avaliando-se os pacientes com DFI pelo EORTC-
MSG, os números encontrados de mediana foram 9 (4-14), 20 (3-28) e 20 (3-95), em infecções
comprovadas, prováveis e possíveis, respectivamente.
Em 55 episódios de NF os pacientes apresentavam cateter central e curiosamente nos 3
casos de DFI provável, os pacientes não utilizavam esse dispositivo, possivelmente, porque
nesses três casos a principal suspeita era de aspergilose e o uso de acesso vascular central não é
relatado como fator de risco para essa infecção (7).
76
A presença de comorbidades crônicas, principalmente DM, são classicamente descritas
como fatores de risco associados a fungemia em pacientes neutropênicos. Na casuística aqui
descrita 1 (50%) paciente com DFI comprovada apresentava comorbidade, 3 (23%) em DFI
possível e nenhum em DFI provável e aparentemente foi um fator secundário em pacientes com
neoplasia hematológica, mais uma vez devido ao fato da duração da neutropenia sobrepujar os
demais.
Internação em UTI, utilização de SVD, ventilação mecânica, mucosite e uso de outros
imunossupressores não CE, estavam presentes em 1 ou 2 casos apenas e devido à sua baixa
frequência dificulta inferir a sua importância nessa população.
CONCLUSÃO
LMA como neoplasia de base e o tempo de neutropenia acima de dez dias foram os
fatores de risco que ocorreram com maior frequência em pacientes onco-hematológicos com
episódios de NF e infecção fúngica.
RECOMENDAÇÃO
Estudos de coorte prospectivos são necessários para confirmação dessas variáveis como
fatores de risco para essa população.
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6. CONCLUSÕES
6.1 A frequência de fungemia em pacientes oncológicos com episódios de neutropenia febril de
alto risco, determinadas por hemocultura e PCR panfúngica, internados no HEMOPE foi de 21%,
o equivalente a 14 infecções fúngicas, das quais, 2 (3,0%) correspondiam a DFI comprovada, 2
(3,0%) DFI provável e 10 (15%) a infecção fúngica possível.
6.2 As espécies de fungos encontradas em pacientes oncológicos com episódios de neutropenia
febril de alto risco, através de hemocultura e MT-PCR foram: C. parapsilosis em 9 episódios
(13%), C. glabrata em 4 casos (6%), Cryptococcus neoformans em 4 (6%) amostras, 3 (4%)
demonstraram Candida tropicalis, 1 Candida albicans e 2 superinfecções por C. parapsilosis e C.
neoformans.
6.3 LMA como neoplasia de base e o tempo de neutropenia acima de dez dias foram os fatores de
risco que ocorreram com maior frequência em pacientes onco-hematológicos com episódios de
NF e infecção fúngica.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Infecção fúngica em pacientes portadores de neoplasias hematológicas não são incomuns,
porém a documentação microbiológica é difícil. Os resultados apresentados sugerem que a MT-
PCR combinada a hemocultura e a avaliação de critérios clínicos, em pacientes com neoplasias
hematológicas e neutropenia febril, podem fornecer importantes informações diagnósticas na
suspeita de infecções fúngicas. No entanto, estudos de validação e o desenvolvimento de MT-
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PCR panfúngica em tempo real são necessários para confirmar esses dados e melhorar sua
performance.
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APÊNDICE A - TERMO DE CONSETIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (HEMOPE) Prezado(a) senhor(a), As pessoas podem ter a sua pele e mucosas habitadas por germes, incluindo os fungos. O fungo é um tipo de micro-organismo e quando há diminuição das defesas do indivíduo, este germe pode causar doenças. O presente projeto trata da dissertação de mestrado acadêmico em Medicina Tropical, do programa de pós-graduação em Medicina Tropical da UFPE sobre a pesquisa: Título: Ocorrência de fungemia Dignosticada por Hemocultura e PCR em Pacientes neutropênicos febris Oncológicos Pesquisador: Heberton Medeiros Teixeira Avaliação do risco da pesquisa: risco mínimo A pesquisa tem objetivos: de identificar o número de episódios de neutropenia febril que são causados por fungos, diagnosticados por hemocultura e PCR, além de determinar as suas espécies que causam essa infecção. O senhor(a) será informado pessoalmente, por telefone ou por carta, caso algum dos resultados de seus exames de sangue seja positivo para infecção por fungo. Para esse estudo, o(a) senhor(a) está sendo convidado(a) para participar de uma entrevista respondendo um questionário acerca do processo de sua neoplasia e a infecção atual, além de uma coleta de 5 ml de sangue. O procedimento será com agulha e tubo de coleta descartável. Este procedimento pode causar leve desconforto. Será garantido o anonimato dos participantes da pesquisa, assim como, a confidencialidade das informações repassadas. Os dados obtidos serão utilizados exclusivamente para o protocolo de pesquisa proposto, enfatizando que existe risco mínimo ou malefícios previsíveis. Sua participação é voluntária, ou seja, o(a) senhor(a) terá o direito de se recusar à participar da pesquisa. Entretanto, lembramos a importância de sua contribuição para o desenvolvimento do trabalho, que trará benefícios diretos e coletivos à comunidade.
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A recusa em participar desse estudo não trará qualquer prejuízo no seu atendimento ou tipo de assistência médica, ou de seus familiares. Os resultados obtidos serão divulgados em eventos , e ou periódicos científicos, nacionais ou internacionais e poderão sustentar estratégias ou ações de saúde. Em caso de dúvida, o(a) senhor(a) poderá entrar em contato com o responsável pelo projeto, Dr. Heberton Medeiros Teixeira no telefone (81) 9164-9746, no horário comercial das 8 às 16 horas ou com o Comitê de Ética da Fundação Hemope no telefone (81) 3182-4671. Eu, ____________________________________, declaro estar esclarecido(a) sobre os termos apresentados e concordo em participar desse estudo, assinando esse termo em duas vias, ficando comigo uma cópia. Recife-PE, ___ de __________ de 2010. ______________________________________ Assinatura do paciente voluntário ou responsável ______________________________________ Assinatura do pesquisador responsável Testemunha 1 _______________________________________ APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (FIOCRUZ) Título da pesquisa: Avaliação de teste molecular para detecção de infecção fúngica em população vulnerável: pacientes em uso de quimioterápicos e neonatos. Pesquisadora responsável: Norma Lucena Cavalcanti Licinio da Silva, Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães / Fundação Oswaldo Cruz / Ministério da Saúde. Endereço: Av. Moraes Rego, s/n, Campus da UFPE, Cidade Universitária, Recife, PE, 50670‐420. Tel: 21012618, 99623975. Eu,_______________________________________________________________________ aceito participar de forma voluntária desta pesquisa na qual procurarei contribuir respondendo a perguntas sobre a minha doença através de um questionário e doação de amostra de sangue equivalente a uma colher de sopa ou 10 ml ou secreção que será colhida para os exames de rotina e encaminhada para o laboratório, para que seja também utilizada nesse estudo e armazenadas para futuros estudos. Esse estudo tem por objetivo desenvolver um teste de laboratório para a detecção de infecção, sei que os testes realizados nesse estudo poderão não me beneficiar, e que eu não terei nenhuma despesa com os testes realizados. Os resultados desse estudo serão divulgados com a garantia de sigilo sobre a identidade dos participantes. Os riscos a que estarei exposto são aqueles relacionados com a coleta de sangue, ou seja, dor, infecção, sangramento e manchas arroxeadas no local da coleta, que serão minimizados com cuidados de higiene na coleta e a pressão local após a coleta do sangue. O acompanhamento da minha doença não será alterado, caso eu desista de participar deste estudo. Este projeto foi avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Aggeu Magalhães e qualquer dúvida contactarei a pesquisadora responsável. Sendo assim, concordo em participar como voluntário não remunerado dessa pesquisa, estando ciente dos riscos e benefícios desses procedimentos para minha pessoa, conforme exposto acima. Sei que tenho a liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo sem que
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isso traga prejuízo para mim. Visto que nada tenho contra a pesquisa, concordo em assinar o presente termo de consentimento em duas vias (uma ficará comigo).
Recife, _____,_____, _____ ____________________________ ____________________________ Voluntário Assinatura _____________________________ ____________________________ 1° testemunha Assinatura
__________________________________________ Pesquisador responsável
Contato do voluntário: Rua____________________________________________________________No.__________________ Bairro________________________________________________________Cidade_________________ Telefone ______________________________________ APÊNDICE C - FICHA DE COLETA DE DADOS/QUESTIONÁRIO
1) Número do questionário: _ _ _ 2) Número do prontuário: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3) Iniciais do nome do paciente:___________ 4) Data de Nascimento:__/__/___ 5) Sexo:
a. Masculino (1) b. Feminino (2)
6) Naturalidade: a. Recife (1) b. Outro (2) Qual?________.
7) Procedência: a. Recife (1) b. Outro (2) Qual?________.
8) Grau de escolaridade: a. Analfabeto (1) b. Primeiro grau c. - completo (2)
9) - incompleto (3) Série:______. a. Segundo grau b. - completo (4)
10) - incompleto (5) Série:_______.
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a. Terceiro grau b. - completo (6)
11) -incompleto. (7) Anos: ______. 12) Profissão: ____________________. 13) Renda familiar: ________________. 14) Instituição:
a. HEMOPE (1) b. Esperança (2) c. Outro (3) Qual:______________.
15) Tipo de neoplasia: a. Síndroome mielodisplásica (SMD) (1) b. Leucemias Agudas (LA) (2) c. Onco-hematológica ( não SMD, não LA) (3) d. - Qual: _______________________ e. Tumores sólidos (4) f. - Qual:_______________________
Data do diagnóstico da neoplasia:____/____/____ 16) Estadiamento oncológico, ao diagnóstico: ____________________ 17) Progressão/Recidiva da neoplasia:
a. Sim (1) Data: ____/____/____ b. Não (2)
18) Estadiamento oncológico, na recidiva: _______________________. 19) Performance status, conforme Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) atual :
a. 0 b. 1 c. 2 d. 3 e. 4 20) Temperatura axilar: 21) D0 de febre :___/___/___ 22) Máxima registrada: ____. Data: ___/___/___. 23) Duração da febre: ____ (dias), antes do diagnóstico de NF. 24) Duração da febre: ____ (dias), antes do início do antifúngico. 25) Comorbidades:
a. Sim (1) Qual? ____________. Data do diagnóstico: __/__/__ b. Não (2)
26) Etilismo. a. Sim (1) Duracao: _______ b. Nao (2)
27) Tabagismo. a. Sim (1) Macos/ano: ______ b. Nao (2)
28) Transplante de medula óssea (TMO) prévio: a. Sim (1) Quando: ____________ Qual: ______________ b. Não (2)
29) Quimioterapia (QT) atual
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a. Sim (1) - Qual:_______________ - Data do último ciclo: ___/___/___ - Quantos ciclos: b. Não (2)
30) Linha de tratamento atual: a. primeira (1) b. segunda (2) c. outra (3) qual? ________
31) Uso de antibiótico atual: a. Sim (1) Qual?____________ tempo de uso: ____________ a.1. profilático. a.2. terapêutico sítio de infecção:______________________ Agente isolado: _______________________ b. Não (2)
32) Colonização fúngica prévia: a. Sim (1) b. Não (2)
33) Infecção fúngica prévia: a. Sim (1) Qual o sítio:____________ Tratamento:____________ b. Não (2)
34) Mucosite: a. Sim (1) Grau:________ b. Não (2)
35) Encontra-se ou esteve internado em Unidade de Terapia Intensiva (UTI): a. Sim (1) Quando?_____Por quanto tempo?_____Ventilação mecânica? ____. b. Não (2)
36) Acesso Venoso Central: a. Sim (1) a.1. Provisório. Quanto tempo:______ a.2 Definitivo. Qual:________. Quanto tempo: _________. b. Não (2)
37) Nutrição Parenteral Total (NPT): a. Sim (1) Quanto tempo:____________. b. Não (2)
38) HEMODIÁLISE: a. Sim (1) Quanto tempo:____________. b. Não (2)
39) Uso de corticosteróide:
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a. Sim (1) Qual:______ Dose:_________ Duração ______ Indicação_______ b. Não (2)
40) Uso de imunossupressores (não corticosteróide) a. Sim (1) Qual:_______. Duração _________ Indicação_____________. b. Não (2)
41) Uso de sonda vesical de demora a. Sim (1) Duração: _________ b. Não (2)
42) Hemoglobina. Inicial = Valor:_______. Data____/___/____ Pré-antifúngico = Valor: _____. Data: ___/___/___
43) Leucócitos. Inicial = Valor:_______. Data____/___/____ Pré-antifúngico = Valor: _____. Data: ___/___/___
44) Neutropenia: D0 Neutropenia: ___/___/____ Inicial (pré NF) = Valor:_______. Data____/___/____ Pré-antifúngico = Valor: _____. Data: ___/___/___
45) Plaquetas. Inicial = Valor:_______. Data____/___/____ Pré-antifúngico = Valor: _____. Data: ___/___/___
46) Tomografias tórax, abdome e/ou pelve. a. Sim.(1) a.1. Imagem sugestiva de IFI. Data ___/___/____ b. Não.(2)
47) Oftalmoscopia. a. Sim.(1) Data ___/___/___.Resultado:______ b. Não.(2)
48) Testes sorológicos ou de antígenos: Qual: ________________. Resultado: ___________. Data: ___/___/___
49) Datas das coletas coletas e resultados: a. Hemocultura ao diagnóstico: data;__/___/___ resultado: ________. Sensibilidade: __________________________________________. Resistência : ___________________________________________ . b. PCR ao diagnóstico: data: ___/___/___ resultado: _________. c. Hemocultura pré anti-fúngico data: ___/___/___ resultado:________.
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Sensibilidade : _________________________________________ . Resistência : _________________________________________ . d. PCR pré anti-fúngico
data: ___/___/___ resultado:_______.
52) Evolução: _____________________________________________________ .
ANEXOS
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