UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

CURSO DE PS-GRADUAO EM BIOQUMICA

CARACTERIZAO DA PROTENA DESACOPLADORA DE PLANTA

(pUCP) DE Vigna unguiculata (L.) Walp.

FRANCISCO EDSON ALVES GARANTIZADO

FORTALEZA CE

2007

CARACTERIZAO DA PROTENA DESACOPLADORA DE PLANTA

(pUCP) DE Vigna unguiculata (L.) Walp.

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FRANCISCO EDSON ALVES GARANTIZADO

DISSERTAO SUBMETIDA COORDENAO DO CURSO DE PS-GRADUAO EM BIOQUMICA COMO REQUISITO PARCIAL PARA

OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM BIOQUMICA.

ORIENTADORA: Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo

FORTALEZA CE

2007

Dados Internacionais de Catalogao na PublicaoUniversidade Federal do Cear

Biblioteca de Cincias e Tecnologia

G193c Garantizado, Francisco Edson Alves.Caracterizao da protena desacopladora de planta (pUCP) de Vigna unguiculata (L.) Walp.

/ Francisco Edson Alves Garantizado. 2007.121 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal do Cear, Centro de Cincias, Departamento de

Bioqumica e Biologia Molecular, Programa de Ps-Graduao em Bioqumica, Fortaleza, 2007.rea de Concentrao: Bioqumica Vegetal.Orientao: Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo.Coorientao: Prof. Dr. Jos Hlio Costa.

1. Protenas de transporte. 2. Qumica vegetal. 3. Mitocndrias. 4 . Feijo-de-corda I. Ttulo.

CDD 574.192

AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS

Fundao Cearense de Apoio Pesquisa (FUNCAP), pela concesso de bolsa de

estudos.

Ao Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular da UFC, pelo apoio e suporte na

realizao dos experimentos deste trabalho.

Esta dissertao foi feita e apresentada como parte dos requisitos necessrios

para a obteno do grau de mestre em Bioqumica, outorgado pela Universidade Federal

do Cear, encontrando-se a disposio dos interessados na Coordenao do curso.

A transcrio de qualquer trecho desta monografia ser permitida desde que seja

feita de acordo com as normas de tica cientfica.

__________________________________________

Francisco Edson Alves Garantizado

Defesa formal de Dissertao aprovada em 26 de abril de 2007 pela banca

Examinadora constituda por:

_________________________________________

Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo

Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular/UFC

Orientadora

__________________________________________

Jos Hlio Costa

Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular/UFC

Co-Orientador/Examinador

___________________________________________

Profo. Dr. Ivan de Godoy Maia

Departamento de Gentica/Unesp- So Paulo

Examinador

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................ix

LISTA DE TABELAS...................................................................................................xii

LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................xiii

RESUMO........................................................................................................................xv

ABSTRACT.................................................................................................................xvii

INTRODUO.............................................................................................................01

1 Breve histrico sobre a descoberta das pUCPs.........................................................04

2 Regulao das UCPs..................................................................................................06

3 Relao entre a pUCP e a AOX.................................................................................10

4 Caracterizao bioqumica........................................................................................11

5 Relaes filogenticas e estrutura dos genes da famlia de pUCPs/UCPs................16

6 Expresso dos genes pUCPs em tecidos especficos.................................................19

7 Funo das pUCPs.....................................................................................................22

7.1 Participao das pUCPs durante amadurecimento de frutos..................................22

7.2 Controle da produo de espcies reativas do oxignio (EROS)...........................22

7.3 Resposta a estresses ambientais..............................................................................27

7.4 Termognese...........................................................................................................27

7.5 Eficincia fotossinttica..........................................................................................28

OBJETIVOS..................................................................................................................29

MATERIAL E MTODOS..........................................................................................30

1 MATERIAL VEGETAL.........................................................................................30

2 CARACTERIZAO BIOQUMICA.....................................................................31

2.1 Extrao da frao mitocondrial.............................................................................31

2.2 Determinao da protena mitocondrial.................................................................33

2.3 Ensaios polarogrficos............................................................................................33

2.4 Clculo do consumo de oxignio............................................................................34

2.5 Clculo do controle respiratrio (C.R.)..................................................................35

2.6 Clculo da relao ADP/O.....................................................................................35

2.7 Avaliao da integridade da membrana externa.....................................................36

2.8 Caracterizao da atividade da pUCP....................................................................37

3 CARACTERIZAO MOLECULAR.....................................................................37

3.1 Desenho dos primers para pUCP............................................................................37

3.2 Extrao de RNA total............................................................................................39

3.3 Quantificao e avaliao da qualidade do RNA total...........................................39

3.4 Ensaios de expresso da pUCP...............................................................................40

3.4.1 Transcrio reversa (RT).....................................................................................40

3.4.2 Reao em cadeia da DNA Polimerase (PCR)....................................................40

3.5 Eletroforese dos produtos amplificados por RT-PCR............................................44

3.6 Purificao dos produtos de RT-PCR.....................................................................44

3.7 Ligao inserto-vetor..............................................................................................45

3.8 Vetor de clonagem pCR4-TOPO............................................................................47

3.9 PCR em colnia......................................................................................................49

3.10 Mini preparao de plasmdios por lise alcalina..................................................49

3.10.1 Preparao de meios de cultura.........................................................................51

3.10.2 Solues usadas na mini preparao de plasmdios..........................................52

3.11 Sequenciamento....................................................................................................53

3.12 Alinhamento de sequncias e anlises filogenticas............................................53

3.13 Isolamento de DNA genmico.............................................................................53

3.14 Eletroforese do DNA............................................................................................54

3.15 Amplificao do(s) fragmento(s) genmico(s) codificando pUCP em V.

unguiculata .....................................................................................................................55

RESULTADOS..............................................................................................................58

CARACTERIZAO BIOQUMICA...........................................................................58

Integridade da membrana mitocondrial externa..............................................................58

Relao ADP/O e Controle Respiratrio (C.R.)..............................................................58

Caracterizao da atividade enzimtica da pUCP em Vigna unguiculata.......................61

CARACTERIZAO MOLECULAR DA pUCP EM Vigna unguiculata ...................67

Aplicao de estresse abitico em plntulas de Vigna unguiculata ...............................67

Extrao de RNA total.....................................................................................................67

Expresso de gene(s) da pUCP em folhas de Vigna unguiculata ...................................70

Clonagem e seqenciamento de gene(s) da pUCP em folhas de Vigna unguiculata .....70

Purificao d