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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DANYA BANDEIRA LIMA
VENENO DA FORMIGA Dinoponera quadriceps COMO FONTE DE
PEPTÍDEOS BIOATIVOS
FORTALEZA
2018
1
DANYA BANDEIRA LIMA
Veneno da formiga Dinoponera quadriceps como fonte de peptídeos bioativos
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Área de Concentração: Farmácia
Orientadora: Profa. Dra. Alice Maria C. Martins
Co-orientador: Prof. Dr. Gandhi Rádis- Baptista
FORTALEZA
2018
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca UniversitáriaGerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
L697v Lima, Dânya. VENENO DA FORMIGA Dinoponera quadriceps COMO FONTE DE PEPTÍDEOSBIOATIVOS / Dânya Lima. – 2018. 158 f. : il. color.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Farmácia, Odontologiae Enfermagem, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Fortaleza, 2018. Orientação: Profa. Dra. Alice Maria Costa Martins. Coorientação: Prof. Dr. Gandhi Rádis Baptista.
1. Dinoponeratoxinas. 2. Peptídeos antimicrobianos. 3. Doença de Chagas. 4. Câncer. 5.Dinoponera quadriceps. I. Título.
CDD 615
2
DANYA BANDEIRA LIMA
VENENO DA FORMIGA Dinoponera quadriceps COMO FONTE DE
PEPTÍDEOS BIOATIVOS
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, da Universidade
Federal do Ceará como requisito
parcial para obtenção do título de
Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Aprovada em: ____/____/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Profª. Dra. Alice Maria Costa Martins (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
________________________________________________
Prof. Dr. Gandhi Rádis Baptista (Co-orientador)
Universidade Federal do Ceará – UFC
___________________________________________
Prof. Dra. Maria Jania Teixeira
Universidade Federal do Ceará – UFC
________________________________________________
Profª. Dra. Arlandia Cristina Lima Nobre de Morais
Universidade de Fortaleza-UNIFOR
________________________________________________
Profª. Dra. Helena Serra Azul Monteiro
Universidade Federal do Ceará – UFC
3
À Deus,
que realizou maravilhas ao longo desta caminhada
À minha mãe e meus amigos,
fonte de suporte constante e compreensão
4
AGRADECIMENTOS
Em especial, à Prof. Dra. Alice Costa Martins, que desde o início
sempre confiou em mim e me deu total suporte para a realização deste
trabalho e de vários outros projetos, inclusive durante meu estágio na Espanha.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Gandhi, pela confiança e apoio
científico para realização deste trabalho tão promissor.
“A mi tutora en Centro de Investigación Príncipe Felipe, Mar Orzaéz,
por su larga ayuda cientifica y atención personal comigo.”
Ao Prof. Dr. Yves Patric Quinet por abrir seu laboratório à esta
colaboração.
Aos membros da banca que aceitaram prontamente o convite, me
prestigiando com sua presença e contribuições.
“A mis compañeros del Centro de Investigación Príncipe Felipe
(Laura, Ally, Carmen, Estefania, Irene, Gema, Alejandra, Alba, Paula,
Mônica UPV, Melissa, Racquel, Mônica Sancho, Jordi, Alberto) por toda la
ayuda cientifica y personal en el laboratorio y su amistad. Los echo de menos y
los quiero mucho!”
Às minhas grandes amigas, Clarissa Perdigão e Izabel Bandeira,
que me ajudaram durante essa jornada e de tantas outras com todo carinho e
atenção.
Aos companheiros do Laboratório de Pesquisa em Nefrologia e
Doenças tropicais (LPNDT) e do Laboratório de Venenos e Toxinas
(LAFAVET) pela ajuda nos experimentos e em tantos outros trabalhos, mas em
especial à Gabriela, Tiago, Mariana Maciel, Roberta Jeane, Isabel Oliveira
pelos laços de amizade construídos que levaremos pra vida.
À todos meus sinceros agradecimentos.
5
“O desenvolvimento, na realidade, diz respeito às metas da vida.
Desenvolver para criar um mundo melhor, que responda às aspirações
do homem e amplie os horizontes de expectativas. Só há
desenvolvimento quando o homem se desenvolve.”
Caio Furtado
6
RESUMO
Os peptídeos antimicrobianos possuem propriedades antibacterinas,
antiparasitárias e antitumorais. O veneno da formiga Dinoponera quadriceps
(DqV) é rico em peptídeos antimicrobianos chamados dinoponeratoxinas
(Dntxs) e possui propriedades antimicrobianas e tripanocidas. Na busca de
novos agentes tripanocidas e antitumorais, no presente estudo foi avaliado o
efeito antichagásico do DqV, de Dntxs (sDq-3348, sDq-2561, sDq-1503, sDq-
1319) e seu fragmento sDq-2561[12-23], além do efeito antitumoral das Dntxs
sobre linhagens de câncer de mama e colo de útero. O efeito tripanocida foi
avaliado em formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas de cepa Y de
Trypanosoma cruzi (cepa resistente ao benzonidazol). A toxicidade foi avaliada
nas células hospedeiras LLC-MK2 por MTT e o índice de seletividade (IS) foi
determinado. O mecanismo de ação em T. cruzi foi estudado em formas
epimastigotas através de citometria de fluxo utilizando os marcadores
7AAD/AX, DCF, Rho 123 e laranja de acridina e através de microscopia
eletrônica de varredura (MEV). O efeito antitumoral foi avaliado nas linhagens
tumorais de mama (MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF7) e câncer cervical
(HeLa) por MTS. A toxicidade em linhagem normal de ovário (MCF10A)
também foi mensurada por MTS. O mecanismo de ação antitumoral foi
avaliado por microscopia de “time-lapse” com marcação de AX e PI e ensaio de
liberação de LDH. DqV foi capaz de inibir formas amastigotas de T. cruzi
mostrando um IS de 112, agindo por mecanismos necróticos e apoptóticos.
sDq-2561 e sDq-3348 inibiram as formas epimastigotas, tripomastigota e
amastigota de T. cruzi. sDq-2561 mostrou efeito mais próximo do DqV e
mecanismo de morte predominantemente necrótico. sDq-3348 mostrou
mecanismo de morte apoptótico sem indícios de autofagia. No ensaio
antitumoral, sDq-3348 mostrou efeito contra MDA-MB-468 e HeLa, mas sDq-
3348 não se mostrou seletivo. sDq-2561 demonstrou efeito em MDA-MB-231 e
HeLa por mecanismo necrótico e com efeito máximo em duas horas de
incubação. Nenhuma das Dntxs testadas foi tóxica para a MCF10A. sDq-1319,
sDq-1503 e sDq-2561[12-23] não mostraram efeitos antitumorais ou
tripanocidas promissores.
Palavras-chave: Dinoponeratoxinas; Trypanosoma cruzi; Doença de Chagas;
Peptídeo antimicrobiano; Câncer; Antitumoral;
7
ABSTRACT
Antimicrobial peptides have antibacterial, antiparasitic and antitumor properties.
Dinoponera quadriceps ant venom (DqV) is rich in antimicrobial peptides called
dinoponeratoxins (Dntxs) and it has antimicrobial and trypanocidal properties.
Searching for novel trypanocidal and antitumor agents, we evaluated the
antichagasic effect of DqV, Dntxs (sDq-3348, sDq-2561, sDq-1503, sDq-1319)
and its fragment sDq-2561[12-23], as well the antitumor effect of Dntxs on
breast and cervical cancer strains. The trypanocidal effect was evaluated in
epimastigote, trypomastigote and amastigote forms of Y strain of Trypanosoma
cruzi (benznidazole-resistant strain). Toxicity was assessed in the host cells
LLC-MK2 by MTT and the selectivity index (SI) was determined. The action
mechanism in T. cruzi was evaluated in epimastigote forms by flow cytometry
using the 7AAD/AX, DCF, Rho 123 and acridine orange markers and by
scanning electron microscopy (SEM). The antitumor effect was evaluated in
breast cancer (MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF7) and cervical cancer (HeLa)
by MTS. Toxicity in normal ovarian lineage (MCF10A) was also measured by
MTS. The antitumor mechanism of action was evaluated by time-lapse
microscopy with AX and PI labeling and LDH release assay. DqV was able to
inhibit amastigote forms of T. cruzi showing an IS of 112, acting by necrotic and
apoptotic mechanisms. sDq-2561 and sDq-3348 were able to inhibit
epimastigote, tripomastigote and amastigote forms of T. cruzi. sDq-2561
showed similar effect of DqV and a necrotic mechanism. sDq-3348 showed
apoptotic mechanism with no evidence of autophagy. In the antitumor assay,
sDq-3348 showed effect against MDA-MB-468 and HeLa, but sDq-3348 was
not selective. sDq-2561 demonstrated effect on MDA-MB-231 and HeLa by
necrotic mechanism with maximum effect at two hours of incubation. None of
the Dntxs tested was cytotoxic to MCF10A. sDq-1319, sDq-1503 and sDq-2561
[12-23] showed no promising antitumor or trypanocidal effects.
Keywords: Dinoponeratoxin; Trypanosoma cruzi; Chagas disease;
Antimicrobial peptide; Cancer; Antitumoral;
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1-
Desenho esquemático descrevendo mecanismos de ação de
peptídeos antimicrobianos interagindo com bicamadas lipídicas.....
21
Figura 2- Distribuição de doença de Chagas no mundo.................................. 25
Figura 3-
Visão geral do ciclo de vida intracelular de Trypanosoma cruzi no
hospedeiro mamífero........................................................................
27
Figura 4- Células do microambiente tumoral................................................... 35
Figura 5-
Efeito do veneno de D. quadriceps e de dinoponeratoxinas sobre
células LLC-MK2 infectadas com a forma amastigota intracelular
de cepa Y de T. cruzi........................................................................
64
Figura 6-
Perfil de morte em formas epimastigotas de T. cruzi após 24 h de
incubação com sDq-2561.................................................................
67
Figura 7-
Perfil de morte em formas epimastigotas de T. cruzi após 24 h de
incubação com sDq-3348.................................................................
68
Figura 8-
Análise de espécies reativas de oxigênio em epimastigotas por
tratados com sDq-2561 citometria de fluxo......................................
70
Figura 9-
Análise de espécies reativas de oxigênio em epimastigotas
tratados com sDq-3348 por citometria de fluxo................................
71
Figura 10-
Análise do ΔΨm de epimastigotas tratados com veneno de D.
quadriceps por citometria de fluxo....................................................
73
Figura 11-
Análise do ΔΨm de epimastigotas tratados com sDq-2561 por
citometria de fluxo............................................................................
73
Figura 12-
Análise do ΔΨm de epimastigotas tratados com sDq-3348 por
citometria de fluxo............................................................................
74
Figura 13-
Fotomicrografia de microscopia confocal de formas epimastigotas
tratadas com veneno de D. quadriceps, sDq-2561 ou sDq-3348 e
marcadas com rodamina..................................................................
75
Figura 14-
Fluorescência relativa de formas epimastigotas tratadas com
veneno de D. quadriceps marcadas com Laranja de Acridina.........
77
Figura 15-
Fluorescência relativa de formas epimastigotas tratadas com sDq-
2561 marcadas com Laranja de Acridina.........................................
78
Figura 16-
Fluorescência relativa de formas epimastigotas tratas com sDq-
3348 marcadas com Laranja de Acridina.........................................
79
9
Figura 17-
Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T. cruzi não tratadas.................................
81
Figura 18-
Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T. cruzi após 12 h de incubação com
DqV...................................................................................................
81
Figura 19-
Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T. cruzi após 12h de incubação com
sDq-2561..........................................................................................
82
Figura 20-
Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T.cruzi após 12h de incubação com a
sDq-3348..........................................................................................
83
Figura 21-
Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células HeLa
após 1h de incubação......................................................................
86
Figura 22-
Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células HeLa
após 2h de incubação......................................................................
87
Figura 23- Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células MDA-
MB-231 após 1h de incubação.........................................................
88
Figura 24- Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células MDA-
MB-231 após 2h de incubação.........................................................
89
Figura 25- Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células
MCF10A após 1h de incubação.......................................................
90
Figura 26- Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células
MCF10A após 2h de incubação.......................................................
91
Figura 27- Liberação de LDH por células HeLa após 1 e 2 horas de
incubação.........................................................................................
92
Figura 28- Liberação de LDH por células MDA-MB-231 após 1 e 2 horas de
incubação.........................................................................................
93
Figura 29- Efeito citotóxico da sDq-2561 sobre a forma epimastigota de
T.cruzi...............................................................................................
127
Figura 30- Efeito citotóxico da sDq-3348 sobre a forma epimastigota de
T.cruzi...............................................................................................
128
Figura 31- Efeito citotóxico da sDq-1503 sobre a forma epimastigota de
T.cruzi...............................................................................................
129
Figura 32- Efeito citotóxico da sDq-1319 sobre a forma epimastigota de
10
T.cruzi............................................................................................... 130
Figura 33- Efeito citotóxico da sDq-2561[12-23] sobre a forma epimastigota
de T.cruzi..........................................................................................
131
Figura 34- Efeito citotóxico da sDq-2561 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.........................................................................................................
132
Figura 35- Efeito citotóxico da sDq-3348 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.........................................................................................................
132
Figura 36- Efeito citotóxico da sDq-1503 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.........................................................................................................
133
Figura 37- Efeito citotóxico da sDq-1319 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.........................................................................................................
133
Figura 38- Efeito citotóxico da sDq-2561[12-23] sobre a forma tripomastigota
de T.cruzi....................................................................................................
134
Figura 39- Efeito citotóxico de DqV sobre LLC-MK2......................................... 134
Figura 40- Efeito citotóxico da sDq-2561 sobre LLC-MK2................................. 135
Figura 41- Efeito citotóxico da sDq-3348 sobre LLC-MK2................................. 135
Figura 42- Efeito citotóxico da sDq-1503 sobre LLC-MK2................................. 136
Figura 43- Efeito citotóxico da sDq-1319 sobre LLC-MK2................................. 136
Figura 44- Efeito citotóxico da sDq-2561[12-23] sobre LLC-MK2..................... 137
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1-
Estrutura e propriedades físico-químicas de dinoponeratoxinas de
D. quadriceps...................................................................................
22
Tabela 2- Estrutura primária de dinoponeratoxinas e sDq-2561[12-23]........... 50
Tabela 3-
Efeito das dinoponeratoxinas sobre formas epimastigotas de cepa
Y de T. cruzi.....................................................................................
61
Tabela 4-
Efeito das dinoponeratoxinas sobre formas tripomastigotas de
cepa Y de T. cruzi.............................................................................
62
Tabela 5-
Efeito das dinoponeratoxinas sobre LLC-MK2 e índice de
seletividade.......................................................................................
65
Tabela 6-
Efeito de dinoponeratoxinas contra linhagens de câncer de mama
e cervical e linhagem normal de ovário............................................
84
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 7-AAD 7-Amino Actinomicina D
Anexina-V Anexina V- ficoeritrina
BZ Benzonidazol
CT Controle
DCF 2’,7’- diclorofluoresceína
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's médium
DMSO Dimetilsulfóxido
DNDi Drugs for Neglected Diseases Initiative
Dntxs Dinoponeratoxinas
EPM Erro Padrão Médio
EROs Espécies reativas de oxigênio
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
IC50 Concentração capaz de inibir 50% do crescimento celular
PI Iodeto de propídeo
IS Índice de seletividade
LAFEPE Laboratório Farmacêutico de Pernambuco
LIT Meio Liver infusion tryptose
LDH Lactato Desidrogenase
LPNDT Laboratório de Pesquisa em Nefrologia e Doenças Tropicais
MEV Microscopia eletrônica de varredura
MOMP Permeabilização da membrana externa mitocondrial
MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-
tetrazólio
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio)
OMS Organização Mundial da Saúde
PAM Peptídeo Antimicrobiano
PBS Tampão fosfato em salina
Rho Rodamina 123
Rpm Rotação por minuto
SBF Soro bovino fetal
SDS Dodecil sulfato de sódio
µH Momento hidrofóbico
ΔΨm Potencial transmembrânico mitocondrial
13
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................... 16
1.1 Biotoxinas como modelo para o desenvolvimento de
medicamentos.................................................................................
16
1.2 Doença de Chagas........................................................................ 24
1.3 Características do câncer.............................................................. 31
1.4 Mecanismos de morte celular........................................................ 37
2. JUSTIFICATIVA ........................................................................... 44
3. OBJETIVOS.................................................................................. 47
3.1 Objetivo geral................................................................................. 47
3.2 Objetivos específicos..................................................................... 47
4. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................. 49
4.1 Obtenção do veneno..................................................................... 49
4.2 Peptídeos e benzonidazol............................................................. 49
4.3 Avaliação da atividade tripanocida in vitro em cepas Y de T.
cruzi...............................................................................................
50
4.3.1 Ensaio em formas epimastigotas de T. cruzi................................. 50
4.3.2 Ensaio em formas tripomastigotas de T. cruzi............................... 51
4.3.3 Ensaio em formas amastigotas de T. cruzi.................................... 51
4.4 Avaliação da toxicidade in vitro nas células hospedeiras e índice
de seletividade...............................................................................
52
4.5 Avaliação do mecanismo de morte celular em cepa Y de T.
cruzi................................................................................................
53
4.5.1 Efeito necrótico e/ou apoptótico em formas epimastigotas de T.
cruzi.................................................................................................
53
4.5.2 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) 54
4.5.3 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm) 54
4.5.3.1 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm)
por citometria de fluxo....................................................................
54
4.5.3.2 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm)
por microscopia confocal................................................................
55
4.5.4 Avaliação de indução de autofagia ................................................ 55
4.5.5 Avaliação de alterações morfológicas ultraestruturais.................... 56
14
4.6 Avaliação da atividade antitumoral in vitro...................................... 56
4.6.1 Linhagens celulares e cultivo.......................................................... 56
4.6.2 Avaliação do efeito antiproliferativo de células tumorais................ 57
4.6.3 Análise mecanismo de morte celular.............................................. 57
4.6.3.1 Microscopia de “time-lapse”............................................................ 57
4.6.3.2 Ensaio da atividade da enzima Lactato Desidrogenase................. 58
4.7 Análise de dados............................................................................ 59
5. RESULTADOS............................................................................... 61
5.1 Avaliação da atividade tripanocida in vitro em cepas Y de T. cruzi 61
5.1.1 Ensaio em formas epimastigotas de T. cruzi.................................. 61
5.1.2 Ensaio em formas tripomastigotas de T. cruzi................................ 62
5.1.3 Efeito em formas amastigotas de T. cruzi....................................... 63
5.2 Avaliação da toxicidade in vitro nas células hospedeiras e índice
de seletividade................................................................................
65
5.3 Avaliação do mecanismo de morte celular em cepa Y de T. cruzi 66
5.3.1 Efeito necrótico e/ou apoptótico em formas epimastigotas de T.
cruzi.................................................................................................
66
5.3.2 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) 69
5.3.3 Determinação do ΔΨm................................................................... 72
5.3.4 Avaliação de indução de autofagia................................................. 76
5.3.5 Avaliação de alterações morfológicas ultraestruturais.................... 80
5.4 Avaliação da atividade antitumoral in vitro...................................... 84
5.4.1 Avaliação do efeito antiproliferativo de células tumorais................ 84
5.4.2 Microscopia de “time-lapse”............................................................ 85
5.4.3 Ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH)..................... 92
6. DISCUSSÃO................................................................................... 95
7. CONCLUSÃO................................................................................. 105
8. REFERÊNCIAS.............................................................................. 107
APÊNDICE A.................................................................................. 127
APENDICE B.................................................................................. 139
15
_________INTRODUÇÃO
16
1. INTRODUÇÃO
1.1 Biotoxinas como modelo para o desenvolvimento de medicamentos
Os venenos animais, durante várias décadas, têm sido estudados
na busca de moléculas farmacologicamente ativas. Nestas pesquisas com
biotoxinas, a indústria farmacêutica conseguiu alguns sucessos notáveis, que
originaram medicamentos amplamente comercialidados, utilizados desde
para fins estéticos até o tratamento de doenças crônicas. Alguns exemplos
mais comuns de fármacos derivados ou inspirados em biotoxinas que
originaram novos medicamentos são o captopril, ziconotida e vários produtos
de toxina botulínica (HARVEY, 2014).
O captopril é o exemplo mais famoso de biotoxina que foi utilizada
para o desenvolvimento de medicamentos. Este medicamento é amplamente
utilizado para tratar a hipertensão e insuficiência cardíaca congestiva e deu
origem à classe de antihipertensivos inibidores da enzima conversora de
angiotensina (ECA). Do veneno da serpente Bothrops jararaca foi isolado o
peptídeo potencializador de bradicinina, inibidor da ECA, enzima que origina
angiotensina II, um hormônio que causa vasoconstrição e o aumento da
pressão arterial. Este peptídio inibidor se liga ao sítio ativo da ECA de forma
semelhante aos substratos naturais e reduz a pressão arterial. O captopril foi
desenvolvido após estudos de modelagem molecular a partir deste peptídeo
isolado (CUSHMAN; ONDETTI, 1999; FERREIRA, 1965). Seu sucesso foi a
principal causa dos venenos animais serem reconhecidos como fontes de
novos fármacos (HARVEY, 2014).
As toxinas botulínicas, amplamente utilizadas para fins estéticos e
terapêuticos, foram desenvolvidas a partir de toxinas microbianas do
Clostridium botulinum, uma bactéria patogênica anaeróbia que produz
potentes exotoxinas neurologicamente dirigidas. Oito tipos sorológicos (A, B,
C1, C2, D, E, F e G) são reconhecidos de acordo com a especificidade
antigénica de cada exotoxina. Mas somente os sorotipos A (Botox®,
Xeomin®) e B (Myobloc®) estão disponíveis no mercado. Essas toxinas
foram aprovadas para uso clínico em pacientes com uma variedade de
condições causadas pela hiperatividade de neurônios, mostrando sucesso
17
em estrabismo, distonias, hiperidrose, amenizar e previnir as linhas de
expressão (ABRAMS; HALLETT, 2013; MATAK; LACKOVIĆ, 2014).
O diabetes do tipo 2, doença de alta prevalência em indivíduos
obesos, também recebeu um reforço em seu tratamento com um
medicamento desenvolvido a partir de uma biotoxina, a Exenatida®. Dois
peptídeos, Exendin-3 e Exendin-4, identificados na saliva do monstro de gila,
Heloderma suspectus, estimulam a secreção de insulina em resposta ao
aumento da glicemia e modulam esvaziamento gástrico para retardar a
entrada de açúcares ingeridos no sangue. Assim, o Exendin-4 foi utilizado
para o desenvolvimento deste medicamento (JOY; RODGERS; SCATES,
2005; TIWARI, 2015).
O tratamento da dor crônica severa também foi beneficiado pela
descoberta da neurotoxina ω-conopeptideo MVIIA, identificada no veneno do
molusco marinho Conus magus. Esta toxina e seu equivalente sintético
ziconotida (Prialt ®), bloqueiam canais de cálcio sensíveis à voltagem tipo-N
em neurônios sensoriais de dor de mamíferos e, portanto, possui potente
ação anti-nociceptiva em condições em que a morfina é pouco ou não ativa
(MCDOWELL; POPE; POPE, 2016; POPE; DEER, 2013).
Vários estudos com venenos animais vêm demonstrando grande
potencial biotecnológico, como no caso de alguns venenos de formigas das
subfamílias Ponerinae, Myrmiciinae, Pseudomyrmecinae e Ecitonina
(JOHNSON et al., 2010; PIEK et al., 1991; WANANDY et al., 2015) que são
ricos em peptídeos e proteínas (PALMA, 2006).
A espécie Dinoponera quadriceps, pertencente à subfamília
Poneriane, é uma formiga primitiva de grande tamanho (~3 cm) distribuída no
nordeste brasileiro (PAIVA; BRANDÃO, 1995). As colônias do gênero
Dinoponera tem uma pobre organização social, formando pequenas colônias
que não possuem rainha. Ao contrário da maioria das espécies de formigas,
todas as operárias da colônia de Dinoponera possuem capacidade
reprodutora (MONNIN; PEETERS, 1998). As formigas do gênero Dinoponera
são, em sua maioria, predadoras, alimentando-se de pequenos e médios
artrópodes, que são paralizados pela sua picada (ARAÚJO; RODRIGUES,
2006).
18
Este veneno possui conteúdo protéico de 64% (SOUSA et al.,
2016) e nosso grupo de estudo demonstrou diversas propriedades
farmacológicas, como antinoceptiva (SOUSA et al., 2012), anticonvulsivante
(LOPES et al., 2013), anti-inflamatória, anti-agregante plaquetária,
anticoagulante (MADEIRA et al., 2015), antimicrobiana (LIMA et al., 2014) e
antiparasitária (LIMA, 2014).
Concomitantemente, nosso grupo de pesquisa realizou o
transcriptoma da glândula de veneno da D. quadriceps e revelou um
repertório de toxinas que inclui dinoponeratoxinas (DnTxs), toxinas
semelhantes a pilosulina, toxinas ICK, proteínas alérgenas, esterases
(fosfolipases e carboxilesterases) e toxinas letais (TORRES et al., 2014).
Esses achados abriram caminho para as investigações funcionais
e farmacológicas desses novos (poli) peptídeos preditos do veneno desta
formiga gigante. Os precursores transcricionais que codificam duas DnTxs de
comprimento total foram proporcionalmente os transcritos mais expressos.
Estes códigos de transcrições de DnTxs para pré-propeptídeos longos que
são propensos a modificação pós-tradução na glândula de veneno, através
da qual vários fragmentos peptídicos podem ser liberados, conforme
detectado, respectivamente, por nosso grupo de estudo na peptidômica de
veneno de D. quadriceps (BANDEIRA LIMA et al., 2017) e no trabalho de
Johnson et al. (2010), no veneno de D. Australis.
As DnTx foram denominados tomando em consideração seu peso
molecular teórico ou experimental e por uma nomenclatura normalizada: Dq-
2561 (M-PONTXDq3a; 23 resíduos de aminoácidos), Dq-1503 (M-PONTX-
Dq3b; 13 resíduos de aminoácidos), Dq-1319 (M-PONTX-Dq3c, 11 resíduos
de aminoácidos) e Dq-3348 (MPONTX- Dq4e; 30 resíduos de aminoácidos)
(BANDEIRA LIMA et al., 2017).
As Dntxs maduras compartilham semelhanças de variáveis na
sequência primária com peptídeos antimicrobianos de outras formigas de seu
mesmo gênero (Ponerinae), como ponericina G2 e G3, e de sapo, como
dermaseptina-H65, no caso de DnTxs longas, e em caso de DnTxs curtas
com ponericin W3, rã Gaegurin-5 e Brevinin-1PTa (BANDEIRA LIMA et al.,
2017; COLOGNA et al., 2013; JOHNSON et al., 2010; TORRES et al.,
2014).
19
Tanto o veneno total de D. quadriceps como os peptídeos
relacionados às Dntxs demonstraram atividade antimicrobiana contra uma
ampla gama de microorganismos (COLOGNA et al., 2013), incluindo
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (LIMA et al., 2014), sugerindo
as Dntxs como peptídeos antimicrobianos (PAMs), que mostram grande
potencial biotecnológico.
PAMs são um grupo heterogêneo de proteínas de natureza
pequena, catiônica e anfipática em sua maioria, sendo usados pelo sistema
imune inato de animais, plantas e seres humanos, como componentes-
chave, atuando como primeira linha de defesa imediata contra organismos
patogênicos. Estes peptídeos foram selecionados no curso da evolução por
sua capacidade de atacar bactérias, fungos, protozoários e vírus (COLE;
LEHRER, 2003; TORRENT et al., 2013; ZASLOFF, 2002).
Os peptídeos no geral, oferecem mínima imunogenicidade,
excelente penetrabilidade nos tecidos, baixo custo de produção e facilidade
em modificações moleculares para melhorar a estabilidade in vivo e a
atividade biológica. Assim, PAMs são potenciais candidatos para antibióticos,
antiparasitários ou antineoplásicos (SUN; SUN; HUANG, 2016; TORRENT et
al., 2012; YAVARI et al., 2018).
As propriedades físico-químicas são muitas vezes analisadas para
caracterizar um determinado peptídeo e/ou prever seu comportamento em
diferentes ambientes. Normalmente, os peptídeos PAMs são caracterizados
por ter um tamanho menor que 50 resíduos de aminoácidos e ficam
desestruturados em solução aquosa, mas quando estão associados à
membranas adotam conformações correspondentes à estrutura secundária,
tais como α-hélice ou conformação-β (SALDITT; LI; SPAAR, 2006).
Desde a década de oitenta foram realizados estudos para
estabelecer uma relação entre as diferentes propriedades físico-químicas e a
atividade antibacteriana ou hemolítica de peptídeos com atividade biológica.
Um exemplo clássico disso é o trabalho realizado por Eisenberg et al. (1982),
que criou uma ferramenta físico-matemática nomeada "momento hidrofóbico"
(µH) muito útil para caracterizar sequências de peptídeos e proteínas. Este
parâmetro, juntamente com a hidrofobicidade (H) e a carga líquida (z) de
peptídeos, tem sido amplamente utilizado em estudos de análise racional de
20
interações peptídeo-membrana (DRIN; ANTONNY, 2010).
O momento hidrofóbico é uma medida quantitativa direta de
anfipaticidade. Calcula-se através da soma dos vetores individuais da
hidrofobicidade de cada aminoácido presente na sequência de um peptídeo
ou proteína (TEIXEIRA; FEIO; BASTOS, 2012) e nos diz se uma determinada
sequência, considerado idealmente helicoidal, exibe potencialmente uma
localização espacial assimétrica (em frente) de resíduos hidrofóbicos e
polares. Ou seja, informa-nos sobre a existência de uma face hidrofóbica e
polar na estrutura helicoidal assumida para o peptídeo.
As mudanças na hidrofobicidade de uma sequência estão
intimamente relacionadas com sua capacidade de permear membranas
eletricamente neutras. De acordo com Wieprecht et al. (1997), um aumento
de µH de um peptídeo, mantendo todos os outros parâmetros físico-químicos
constantes, potencializa consideravelmente sua permeabilização em
vesículas constituídas lipídicas, o que é atribuído a um aumento da afinidade
do peptídeo para a membrana.
No final dos anos 90, Dathe et al. (1997) foram mais longe e
sugeriram que a atividade hemolítica de peptídeos catiônicos e
potencialmente helicoidais é substancialmente modulada e aumentada com o
incremento da hidrofobicidade, do momento hidrofóbico e do ângulo da face
polar da hélice. Por outro lado, a seletividade antibacteriana mostrou-se
ótima em peptídeos de hidrofobicidade moderada que, por sua vez,
apresentam um momento hidrofóbico e um ângulo da face polar reduzido
(YIN et al., 2012).
As diferentes propriedades físico-químicas dos peptídeos
antimicrobianos e as diferentes composições de membrana podem levar à
diferentes mecanismos para desestabilizar as bicamadas lipídicas, entretanto,
o mesmo peptídeo pode manifestar mais que um caminho para interagir com
membranas (LI; DING; MA, 2016). Os modelos clássicos de formação de poros
por peptídeos antimicrobianos são nomeados de poro barril de hélices, poro
toroidal e tapete/detergente como mostrado na Figura 1 (SALDITT; LI; SPAAR,
2006).
21
Figura 1: Desenho esquemático descrevendo mecanismos de ação de
peptídeos antimicrobianos interagindo com bicamadas lipídicas
Fonte: Adaptado de (SALDITT; LI; SPAAR, 2006).
Legenda: Conformação α-hélice com suas zonas hidrofílicas e hidrofóbicas,
conformação representada esquematicamente como um cilindro anfifílico com uma
face hidrofóbica (vermelha) e uma face hidrofílica (azul). Os peptídeos antimicrobianos
se ligam à superfície da membrana com as cadeias laterais hidrofóbicas ancorando no
núcleo lipídico hidrófobo da bicamada, dando origem a resultados diferentes, como
esquematizado o poro toroidal (A), o poro barril (B) e o modelo do tapete: aglomerado
de peptídeos antimicrobianos na superfície da membrana e subsequentemente conduz
à sua destruição através de um processo da micelação (C).
Apesar dos modelos citados acima serem os mais relacionados à
atividades antimicrobianas, os PAMs também podem interagir com alvos
intracelulares através da inibição da síntese de RNA mensageiro, do bloqueio
da síntese proteica, de dificultar o enovelamento conformacional das proteínas,
da ligação irreversivel, dentre outros (JENSSEN; HAMILL; HANCOCK, 2006).
As diferentes dinoponeratoxinas possuem estruturas e
propriedades fisico-químicas diferentes, o que pode predizer e explicar seus
efeitos. Estas estruturas e propriedades fisico-químicas dos 4 peptídeos (Dq-
3348, Dq-2561, Dq-1503 e Dq-1319) estão dispostas na tabela 1.
22
Tabela 1. Estrutura e propriedades físico-químicas de dinoponeratoxinas de D. quadriceps
Dinoponeratoxina (nomenclatura normalizada)
sDq-3348 (M-PONTX-Dq4e)
sDq-2561 (M-PONTX-Dq3a)
sDq-1503 (M-PONTX-Dq3b)
DnTx-1319 (M-PONTX-Dq3c)
Estrutura primária GLKDWWNKHKDKIVKVVKEMGKAGINAAGK FWGTLAKWALKAIPAAMGMKQNK FWGTLAKWALKAI FWGTLAKWALK
Peso molecularb 3348,97 (3350,02) 2561,13 (2562,16) 1503,83 (1504,85) 1319,59 (1320,61)
Predição de modeloc
Carga líquida (z)d 6,1 5,0 3,0 3,0
pId 10,9 14,0 14,0 14,0
Hidrofobicidade, He 0,148 0,509 0,823 0,781
µHe 0,458 0,248 0,531 0,523
Roda α-helicoidale
Fonte: Adaptado de Bandeira Lima et al., 2018.
Legenda: Peptídeos amidados C-terminal; bMassa molecular experimental e teórica entre parenteses respectivamente; cPredição de modelo
arquivado com o servidor PEP-FOLD 2 (http://bioserv.rpbs.univ- paris-diderot.fr/services/PEP- FOLD/); dCarga líquida em pH e pI neutro,
calculado por http://pepcalc.com; eFrom http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/, com resíduos carregados negativamente em vermelho, positivamente em
azul, não polares em preto e polares em amarelo; µH = momento hidrofóbico;
23
Os peptídeos menores Dq-1319 e Dq-1503 são fragmentos do
peptídeo Dq-2561 clivados e amidados no aminoácido 11 e 13 respectivamente
no seu terminal carboxílico por modificações pós-tradução na glândula do
veneno da formiga gigante. Estes peptídeos curtos e maduros têm cargas
líquidas relativamente baixas (+3), hidrofobicidades "H" (H = 0,781 e 0,823,
respectivamente) e momentos hidrofóbicos "μH" (tendência a adoção de
estruturas a-helicoidais em solução) mais altos em comparação com os seu
peptídeo parental Dq-2561, apesar de terem também um alto valor pI (pI=14).
Em contraste, Dq-3348 é o peptídeo predito mais longo relacionado a DnTx
expresso na glândula de veneno, com 30 resíduos de aminoácidos, uma carga
líquida de +6, um valor de H de 0,148 e um μH = 0,458 (BANDEIRA LIMA et
al., 2017).
Por todas as suas características as Dntx e seus derivados
sintéticos demonstram grande potencial biotecnológico e provável efeito
contra membranas lipídicas, visto que o veneno total de D. quadriceps
demonstrou efeito antimicrobiano com permeabilização de membrana em S.
aureus (LIMA et al., 2014). Além disso, também foi evidenciado efeito
antiparasitário contra formas epimastigotas e tripomastigotas de cepa Y de
Trypanosoma cruzi. Nas formas tripomastigotas, formas circulante no sangue
de pacientes chagásicos, as concentrações capazes de matar 50% dos
parasitos foram de 2 µg/mL, enquanto que o benzonidazol, medicamento de
referência, para conseguir o mesmo efeito necessitou de 73 µg/mL. A
avaliação da via de morte celular em formas epimastigotas indicou
mecanismos também envolvendo dano em membrana (necrose) e
envolvendo apoptose (LIMA, 2014). A apoptose é um mecanismo de morte
almejado por drogas antitumorais, por sua baixa imunogenicidade
(CZABOTAR et al., 2013), deixando estes peptídeos também interessantes
para estudo contra o câncer.
Haja vista que este veneno possui conteúdo de aproximadamente
30% de dinoponeratoxinas (TORRES et al., 2014) e considerando suas
estruturas e propriedades físico-químicas, elas podem ser as principais
responsáveis por tais efeitos, tornando assim, importante sua investigação
contra doença de Chagas e câncer.
24
1.2 Doença de Chagas
A doença de Chagas foi descrita pela primeira vez em 1909, quando
Carlos Chagas identificou o parasito protozoário Trypanosoma cruzi como o
causador de uma doença febril aguda que afligia trabalhadores da ferrovia
brasileira em Minas Gerais. Também conhecida como tripanossomíase
americana, é uma doença potencialmente fatal, sendo transmitida por um vetor,
o inseto triatomíneo hematófago, conhecido popularmente como “barbeiro”
(BONNEY, 2014).
Há aproximadamente 200 a 300 anos, quando a mudança rápida do
habitat do vetor passou da floresta natural para as terras agrícolas, surgiram
inúmeras oportunidades para a disseminação de T. cruzi em animais
domesticados, tornando a doença de Chagas uma zoonose endêmica
(COURA; VIÑAS, 2010). A urbanização das populações rurais em meados do
século XX, que envolveu a migração de um grande número de indivíduos
infectados para áreas com um risco comparativamente baixo de transmissão
vetorial, estendeu a endemia às cidades. No entanto, a doença permaneceu
em grande parte limitada às áreas rurais pobres. No final do século XX, a
doença de Chagas tornou-se reconhecida pela Organização Mundial da Saúde
(OMS) e outras instituições de saúde pública como uma doença tropical
negligenciada, porque afeta principalmente as populações de baixa renda,
sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade crônica em
países tropicais em desenvolvimento, e tem sido historicamente sub-
representada na alocação de recursos de promoção da saúde de organizações
de pesquisa, governamentais e de auxílio público (BONNEY, 2014).
Uma vez que afeta desproporcionalmente os indivíduos de baixa
renda, que são os menos capazes de proteger-se contra a infecção e
completar o tratamento adequado, tem um efeito substancialmente deletério
sobre a capacidade desses indivíduos de estudar e obter seus ganhos, fazendo
parte assim, de um ciclo de auto-propagação da pobreza em muitas regiões
endêmicas (BONNEY, 2014).
Atualmente, a doença de Chagas afeta cerca de 6 a 8 milhões de
pessoas no mundo, causando aproximadamente 12.000 mortes por ano
decorrentes de suas complicações. Além disso, estima-se que cerca de 70
25
milhões de pessoas estejam em áreas de risco de contrair esta doença (DNDI,
2016). Mais recentemente, a emigração generalizada de latino-americanos,
incluindo um grande número infectado por T. cruzi, resultou em uma ameaça
emergente para a saúde pública em áreas historicamente não endêmicas do
mundo, como Estados Unidos, Canadá, Europa Ocidental, Japão e Austrália
(CHATELAIN, 2017). Nas últimas décadas, tem sido cada vez mais encontrada
nos Estados Unidos da América, estimando-se cerca de 300 mil casos (BERN,
C. et al., 2011) e em alguns países europeus, estimando-se cerca de 100 mil
casos (PÉREZ-MOLINA; NORMAN; LÓPEZ-VÉLEZ, 2012) (Figura 2).
Figura 2. Distribuição de doença de Chagas no mundo
Fonte: DNDi, 2016.
O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas é um
protozoário unicelular e parasito obrigatório. É classificado dentro da Ordem
Kinetoplastida, da classe Zoomastigophorea, da família Trypanosomatidae que se
desenvolve em insetos hematófagos da família Reduviidae, em pequenos
mamíferos e em humanos (CHAGAS, 1909). Possui um único flagelo (exceto na
forma intracelular, que não possui flagelo) e uma única mitocôndria, alongada e
termina em um cinetoplasto que contem o DNA mitocondrial (DE SOUZA,
WANDERLEY, 2002; GIRARD et al., 2016).
Durante seu ciclo de desenvolvimento, o T. cruzi apresenta três
formas evolutivas principais: epimastigota (forma proliferativa não infectante,
26
presente no intestino médio do inseto), tripomastigota (forma não proliferativa
infectante, presente na circulação sanguínea) e amastigota (forma proliferativa
intracelular) (ADADE et al., 2013). Este parasito possui ciclo de vida complexo
que requer passagem obrigatória em dois hospedeiros, o inseto vetor
triatomíneo, e um hospedeiro vertebrado (FRANCISCO et al., 2017).
O inseto vetor triatomíneo se alimenta do sangue de um hospedeiro
vertebrado infectado, contendo formas tripomastigotas sanguíneas, que no
estômago do inseto se transformam em formas epimastigotas, que por sua vez
migram para o intestino médio e dividem-se intensivamente por divisão binária,
mantendo a infecção no vetor. Parte desses epimastigotas migra para o
intestino posterior onde se diferenciam em formas tripomastigotas metacíclicas,
forma infectante para várias espécies de mamíferos. A infecção ocorre quando
o triatomíneo ao realizar o repasto sanguíneo, deposita junto a região da picada,
seus excrementos (fezes e urina) contaminados com formas tripomastigotas
metacíclicas. Uma substância irritante que ocasiona prurido também é liberada
pelo inseto. A coceira local faz com que os tripomastigotas metacíclicos sejam
arrastados para o orifício da picada pelo próprio hospedeiro vertebrado
(CHATELAIN, 2017).
O tripomastigota metacíclico, se liga aos receptores de superfície
celular no hospedeiro mamífero, onde o parasito é levado para um vacúolo
parasitóforo. Isso ocorre independentemente da célula hospedeira ser ou não
fagocítica. Em seguida, o parasito sofre uma divisão celular assimétrica,
resultando em duas células filhas, um amastigota de replicação competente
com um flagelo curto e a outra um fragmento citoplasmático com flagelação
sem núcleo. O amastigota escapa para o citoplasma e começa replicação por
fissão binária, enquanto o restante dos componentes do parasito é degradado
pelo proteassoma e seus antígenos são apresentados na superfície. Alguns
amastigotas podem tornar-se metaquimamente quiescentes, podendo residir
em longo prazo em tecido cronicamente infectado. Os amastigotas que
continuam a se replicar se diferenciam em uma forma intracelular semelhante
aos epimastigotas e finalmente, se diferenciam em tripomastigotas flagelados,
que lisam a célula hospedeira e escapam para a corrente sanguínea, fluidos
biológicos ou outros tecidos do corpo, podendo ser ingeridas por outro inseto,
propagando o ciclo (Figura 3) (FRANCISCO et al., 2017).
27
Figura 3. Visão geral do ciclo de vida intracelular de Trypanosoma cruzi no
hospedeiro mamífero.
Fonte: Francisco et al. (2017).
Legenda: O tripomastigota metacíclico, se liga aos receptores de superfície celular no
hospedeiro mamífero (1), onde o parasito é levado para um vacúolo parasitóforo (2).
Em seguida, o parasito sofre uma divisão celular assimétrica, resultando em duas
células filhas, um amastigota de replicação competente com um flagelo curto e a outra
um fragmento citoplasmático com flagelação sem núcleo (3). O amastigota escapa
para o citoplasma e começa replicação por fissão binária (4), enquanto o restante dos
componentes do parasito é degradado pelo proteassoma e seus antígenos são
apresentados na superfície (5). Alguns amastigotas podem tornar-se metaquimamente
quiescentes, podendo residir em longo prazo em tecido cronicamente infectado (6). Os
amastigotas que continuam a se replicar (7) se diferenciam em uma forma intracelular
semelhante ao epimastigotas (8) e finalmente, se diferenciam em tripomastigotas
flagelados (9), que lisam a célula hospedeira e escapam para a corrente sanguínea,
fluidos biológicos ou outros tecidos do corpo (10).
A principal forma de transmissão da doença de Chagas ainda é a
vetorial, através do contato com os excrementos do triatomíneo infectado
28
(COURA, 2007; COURA; BORGES-PEREIRA, 2012). No Brasil, 52 espécies de
triatomíneos foram descritas, destas 27 foram encontradas no nordeste, com
maior atenção para espécies de três gêneros distintos, Triatoma, Rhodnius e
Panstrongylus, sendo estes vetores importantes para a transmissão entre
animais domésticos e o homem nas áreas endêmicas (RASSI; RASSI; MARIN-
NETO, 2010). Além da transmissão vetorial, existem outros tipos de
transmissão, como transfusão de sangue, congênita, transplante de órgãos e
através da ingestão de alimentos contaminados (via oral) (CHATELAIN, 2017).
A transfusão sanguínea é o segundo mecanismo mais comum de
transmissão da doença (GASCON; BERN; PINAZO, 2010), onde o receptor
recebe sangue contendo os parasitos. A transmissão congênita pode ocorrer
em qualquer fase da doença materna e também pode se dar em qualquer
época da gestação, sendo mais provável no último trimestre, ou ocorrer
durante o parto, pelo contato das mucosas do feto com o sangue da mãe
infectada (REQUENA-MÉNDEZ et al., 2015). A transmissão por meio de
transplante de órgãos tem adquirido relevância nas últimas décadas, devido ao
aumento do número desses procedimentos. Essa forma de transmissão
apresenta manifestações clínicas graves uma vez que os receptores estão
imunocomprometidos (PEREIRA; NAVARRO, 2013). A infecção pela via oral é
responsável por surtos de transmissão em áreas urbanas e regiões onde não
há circulação de insetos vetores domiciliados. Esta via de transmissão é
geralmente associada com uma alta concentração parasitária, resultando em
uma manifestação clínica aguda mais severa com altos índices de mortalidade
(TOSO M; VIAL U; GALANTI, 2011).
A doença de Chagas foi dividida em três fases distintas. O estágio
inicial "agudo", que ocorre nas primeiras 4-6 semanas após a infecção,
geralmente manifesta-se como condição febril leve e transitória, e em muitos
casos, é assintomática. No entanto, a fase aguda causa morte de 2 a 5% das
pessoas infectadas, geralmente envolvendo crianças, que morrem de
miocardite ou mieloencefalite (CHATELAIN, 2017). Com o desenvolvimento de
uma adaptação vigorosa da resposta imune, em que CD8+, IFN-γ+ e células T
desempenham um papel importante (CARDILLO et al., 2015; TARLETON,
2015), a infecção é suprimida, mas a imunidade estéril não é alcançada. Esta
fase "indeterminada" ou estágio "cronológico assintomático" é caracterizado
29
por uma parasitemia intermitente e extremamente baixa. No entanto,
aproximadamente 10-30 % das pessoas infectadas eventualmente evoluem
para o estágio "sintomático crônico", muitas vezes décadas após a infecção
primária. No estágio crônico sintomático, a cardiomiopatia se desenvolve na
maioria desses indivíduos, enquanto uma minoria (aproximadamente 10% das
pessoas infectadas) sofrem megasíndromes do trato digestivo (CUNHA-NETO;
CHEVILLARD, 2014; DNDI, 2018; RIBEIRO et al., 2012).
A forma indeterminada pode durar de 10 anos ao resto da vida e os
pacientes podem transmitir para outros, mesmo sem mostrar sinais da doença.
A forma indeterminada foi descrita por Carlos Chagas em 1985 como
assintomática e com resultados normais para eletrocardiograma e raio-x de
coração, esôfago e cólon (DNDI, 2018; RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010).
A cardiomiopatia é caracterizada por infiltração inflamatória, morte
celular e fibrose intersticial reparativa, levando a distúrbios no sistema de
condução cardíaco (disfunção no nódulo sinusal, arritmia ventricular e bloqueio
intraventricular e atrioventricular) e miocardite, causando instabilidade elétrica
(arritmia atrial), redução da contratilidade (trombose intracavitária e
insuficiência cardíaca) e distúrbios microvasculares que podem resultar em
morte súbita. Alterações no sistema nervoso intracardíaco podem causar dor
torácica atípica e também morte súbita (MARIN-NETO et al., 2007; PEREIRA;
NAVARRO, 2013). A falha cardíaca progressiva (70%) e morte súbita (30%)
permanecem as principais causas de morte de pacientes portadores da
cardiomiopatia chagásica (CHATELAIN, 2017).
As megasíndromes do trato digestivo usualmente resultam em
dilatação do trato gastrointestinal. A forma digestiva é responsável pelo
desenvolvimento de mega-esôfago e cólon. O comprometimento do esôfago
inclui a perda do peristaltismo esofágico e falta de relaxamento do esfíncter
inferior durante a deglutição, causando progressiva dilatação do órgão. A
disfunção esofágica pode ser associada com alterações no trânsito intestinal.
Esta forma da doença é caracterizada por destruição de neurônios
ganglionares, aumentando a lentidão do transito intestinal, levando a hipertrofia
muscular e, em casos exacerbados, a dilatação do órgão. Os sintomas mais
comuns são disfagia, dor no peito e regurgitação (LESCURE et al., 2010;
PEREIRA; NAVARRO, 2013). Existe a estimativa de 300.000 indivíduos com
30
megacólon no Brasil e os relatando sintomas como constipação crônica, dor
abdominal e impactação fecal. Pacientes com megacólon também podem
apresentar vólvulo, obstruções e até perfurações intestinais (PEREIRA;
NAVARRO, 2013; SILVA et al., 2003).
Embora a doença de Chagas seja uma das principais causas de
morte prematura em muitas áreas da América do Sul, apenas existem dois
medicamentos para o tratamento desta doença, os derivados nitroimidazólicos
benzonidazol e nirfutimox. Estes são utilizados por quase 50 anos, apesar das
evidências generalizadas de falhas de tratamento (MORILLA; ROMERO,
2015). Outras desvantagens incluem o longo período de tratamento
(geralmente 60 a 90 dias), a frequência e severidade dos efeitos colaterais, e o
potencial para resistência cruzada, que decorre da exigência desses agentes
nitroheterocíclicos serem ativados pelo mesma enzima, a nitroredututase
mitocondrial do parasito, TcNTR-1 (CAMPOS et al., 2017).
Além de só existirem duas opções terapêuticas, o nirfutimox teve sua
comercialização cancelada em diversos países, inclusive no Brasil (CANÇADO,
2002). Assim, o benzonidazol tornou-se o único medicamento usado no Brasil
para tratar esta doença (MORILLA; ROMERO, 2015).
O tratamento com benzonidazol é eficaz logo após a infecção,
possuindo uma taxa média de cura entre casos agudos e recentes de 80%,
entretanto inferior a 20% nos crônicos (COURA; BORGES-PEREIRA, 2012;
SESTI-COSTA et al., 2014). Além disso, o tratamento é contra indicado para
pacientes com insuficiência renal ou hepática, e durante gravidez
(HASSLOCHER-MORENO et al., 2012; RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010),
permanecendo incerto também, se este fármaco poderia prevenir ou aliviar a
patologia cardíaca crônica, principal complicação da doença de Chagas que
leva à morte (MORILLO et al., 2015).
Mesmo aprovado pelo Ministério da Saúde e amplamente
comercializado, o tratamento com benzonidazol além de possuir eficácia
limitada, desencadeia muitos efeitos adversos (PÉREZ-AYALA et al., 2011). Os
efeitos adversos comumente observados em pacientes que utilizam este
medicamento são reações cutâneas, febre, dermatite atópica, eritomatose,
erupções sensíveis à luz, púrpura, perda de peso e distúrbios gastrointestinais,
logo nas primeiras semanas de tratamento. O avançar do tratamento pode
31
culminar em leucopenia, trombocitopenia e distúrbios neurológicos como
degeneração neuronal e desmielinização (HASSLOCHER-MORENO et al.,
2012; VIOTTI et al., 2009). A necessidade do emprego deste medicamento em
esquemas posológicos prolongados, de pelo menos dois meses, com doses
diárias de 5-7 mg/kg de peso corporal, facilita o surgimento dessas reações
(COURA; BORGES-PEREIRA, 2012; HASSLOCHER-MORENO et al., 2012).
Assim, existe uma necessidade urgente de se desenvolver uma
forma mais eficaz de terapia contra a doença de Chagas com mínimos efeitos
colaterais (CHATELAIN, 2017). Uma das abordagens mais utilizadas
ultimamente são pesquisas na busca de novos modelos moleculares
antichagásicos com eficácia em todas as fases do tratamento que levem a
morte do parasito, causando pouco dano ao paciente. Substâncias com alto
índice de seletividade, efeito contra as formas intracelulares do parasito e que
atuem por mecanismos de ação pouco imunogênicos são alvos destas
pesquisas (DNDI, 2018). Várias biotoxinas já mostraram potencial
antichagásico atendendo à maioria destas características como a melittina,
batroxicidina e crotalicidina (ADADE et al., 2013, 2014; BANDEIRA et al.,
2017; MELLO et al., 2017).
1.3 Características do câncer
Além das doenças negligenciadas, algumas doenças que possuem
alto investimento em pesquisas para sua cura, altos custos com seus
tratamentos e alta taxa de mortalidade, continuam sem cura efetiva. O câncer
é uma dessas doenças.
Câncer é um termo geral que se refere a mais de 100 doenças
distintas que afetam vários tecidos diferentes e vários tipos de células
(ROBBINS & COTRAN, 2016), sendo um dos principais causadores de morte
em países em desenvolvimento, como o Brasil. Durante as últimas décadas,
o número de pacientes com câncer e sua mortalidade aumentou
consideravelmente. No ano de 2012, surgiram 14 milhões de novos casos e
8,2 milhões de pessoas morreram por câncer (FERLAY et al., 2015).
A autossuficiência na sinalização de fatores de crescimento, a
evasão de supressores de crescimento, a resistência à morte celular,
32
imortalização da capacidade replicativa, a indução de angiogênese, a
ativação de invasão e metástase, a inflamação e o microambiente tumoral
são características específicas do câncer que tornam sua cura tão difícil
(HANAHAN, DOUGLAS; WEINBERG, 2011).
Os tecidos normais controlam cuidadosamente a produção e
liberação de sinais promotores de crescimento que levam ao crescimento e
divisão celular, promovendo a homeostase do número de células e a
manutenção da arquitetura e função do tecido. As células tumorais, pela
desregulação destes sinais, se tornam donas do seu próprio destino. Além da
característica distintiva de induzir e sustentar sinais de estimulação de
crescimento de ação positiva, as células cancerígenas também contornam
programas poderosos que regulam negativamente proliferação celular, onde
muitos desses programas dependem das ações de genes supressores de
tumor. Dezenas de supressores de tumores que operam de várias maneiras
para limitar o crescimento celular e a proliferação foram descobertos através
da sua inativação característica em uma ou outra forma de câncer animal ou
humano (VITIELLO et al., 2018).
A morte celular programada apoptótica serve como uma barreira
natural ao desenvolvimento do câncer, por sua função de manter a
homeostase de organismos multicelulares eliminando células defeituosas ou
lesadas. A elucidação dos circuitos de sinalização que regem o mecanismo
apoptótico revelou como esta é desencadeada em resposta a vários
estresses fisiológicos que as células cancerosas passam durante a evolução
da tumorigênese ou como resultado de terapia anticancerígena. Entre os
estresses indutores de apoptose destacam-se os desequilíbrios de
sinalização resultantes de níveis elevados de sinalização oncogênica e danos
ao DNA associado à hiperproliferação. No entanto, pesquisas revelaram que,
como a apoptose é atenuada nos tumores, estes conseguem progredir para
estados de malignidade de alto grau e resistência à terapia (ADAMS; CORY,
2007; LOWE; CEPERO; EVAN, 2004).
Além da evasão da morte fisiológica, as células cancerosas
necessitam de um potencial replicativo ilimitado para gerar tumores
macroscópicos. Esta capacidade contrasta com o comportamento das células
na maioria das linhagens celulares normais no corpo, que são capazes de
33
passar apenas por um número limitado de ciclos sucessivos de crescimento e
divisão celular. Essa limitação tem sido associada a duas barreiras distintas à
proliferação: a senescência, uma fase tipicamente irreversível em um estado
não-proliferativo, mas viável, e a crise, que envolve a morte celular. Por
conseguinte, quando as células são propagadas em cultura, os ciclos
repetidos de divisão celular conduzem primeiro à indução da senescência e,
em seguida, as células que conseguem contornar essa barreira, progridem
para a fase de crise, na qual a grande maioria das células da população
morre. Em raras ocasiões, as células emergem de uma população em crise e
exibem um potencial replicativo ilimitado. Esta transição é conhecida como
imortalização, uma característica que as linhas celulares mais estabelecidas
possuem em virtude de sua capacidade de proliferar na cultura sem evidência
de senescência ou crise (HANAHAN, DOUGLAS; WEINBERG, 2011).
Mesmo possuindo mecanismos de evasão, os tumores requerem
sustento na forma de nutrientes e oxigênio, bem como a capacidade de
evacuar resíduos metabólicos e dióxido de carbono, semelhante aos tecidos
normais. A neovasculatura associada ao tumor, gerada pelo processo de
angiogênese, supre essas necessidades. Durante a embriogênese, o
desenvolvimento da vasculatura envolve o nascimento de novas células
endoteliais e sua montagem em tubos (vasculogênese), além da germinação
(angiogênese) de vasos novos. Após esta morfogênese, a vasculatura normal
torna-se bastante quiescente. No adulto, a angiogênese é ativada como parte
de processos fisiológicos, como cicatrização de feridas e ciclos reprodutivos
femininos, mas apenas transitoriamente. Em contraste, durante a progressão
do tumor, um "interruptor angiogênico" é quase sempre ativado
permanentemente, fazendo com que a vasculatura normalmente quiescente
forme continuamente novos vasos que ajudam a sustentar a expansão dos
tumores neoplásicos. Alguns desses reguladores angiogênicos estão
sinalizando proteínas que se ligam a receptores estimulantes ou inibitórios na
superfície das células endoteliais vasculares (HANAHAN, D; FOLKMAN,
1996).
Outro grande problema no câncer é sua disseminação. O processo
de invasão e metástase foi esquematizado como uma sequência de várias
etapas discretas, muitas vezes denominada cascata de invasão-metástase.
34
Esta descrição prevê uma sucessão de mudanças na biologia celular,
começando com a invasão local, depois o intravasamento por células
cancerosas no sangue e vasos linfáticos próximos, seguido do seu trânsito
através dos sistemas linfáticos e hematogênicos e de sua fuga da lumina de
tais vasos para o parênquima de tecidos distantes (extravasamento). Assim
ocorre a formação de pequenos nódulos de células cancerosas
(micrometástases) e, finalmente, o crescimento de lesões micrometastáticas
em tumores macroscópicos, sendo este último passo denominado
"colonização" (TALMADGE; FIDLER, 2010).
Nas últimas décadas, as pesquisa sobre as interseções entre a
inflamação e a patogênese do câncer se ampliaram, produzindo
demonstrações abundantes e convincentes de efeitos e funções que as
células imunes, em grande parte do sistema imune inato, têm na progressão
neoplásica (COLOTTA et al., 2009; DENARDO; ANDREU; COUSSENS,
2010; GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010; QIAN; POLLARD, 2010). A
inflamação pode contribuir para múltiplas características fornecendo
moléculas bioativas ao microambiente do tumor, incluindo fatores de
crescimento que sustentam a sinalização proliferativa, fatores de
sobrevivência que limitam a morte celular, fatores proangiogênicos, enzimas
modificadoras da matriz extracelular que facilitam a angiogênese, invasão e
metástase e sinais indutivos que levam à ativação de transição epitelial-
mesenquimal e outros programas facilitadores (DENARDO; ANDREU;
COUSSENS, 2010; GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010; KARNOUB;
WEINBERG, 2006-2007; QIAN; POLLARD, 2010).
A inflamação é, em alguns casos, evidente nos estágios iniciais da
progressão neoplásica e é comprovadamente capaz de promover o
desenvolvimento de neoplasias incipientes em câncer completo (DE VISSER;
EICHTEN; COUSSENS, 2006; QIAN; POLLARD, 2010). Além disso, células
inflamatórias podem liberar produtos químicos, especialmente espécies
reativas de oxigênio, que são ativamente mutagênicas para células
cancerígenas próximas, acelerando sua evolução genética em direção a
estados de malignidade aumentada. Como tal, a inflamação pode ser
considerada uma característica habilitante por suas contribuições para a
aquisição de recursos para as outras características anteriormente citadas
35
(GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010).
O microambiente tumoral, como mostrado na Figura 4, é composto
por vários tipos de células, com funções individuais na propragação e nutrição
do tumor. Existem células endoteliais e pericitos, células inflamatórias,
fibroblastos associados, células do tumor, células proliferativas do tumor,
dentre outros tipos de células com variadas funções, criando assim, um
ambiente ideal para o desenvolvimento e disseminação do câncer
(HANAHAN, DOUGLAS; WEINBERG, 2011).
Figura 4. Células do microambiente tumoral
Fonte: Adaptado de Hanahan, Douglas e Weinberg (2011).
Por causa de todas suas características, o câncer aflinge todo o
mundo. No ano de 2012, observaram-se 14,1 milhões de novos casos de
câncer, ocorrendo 8,2 milhões de mortes por câncer em todo o mundo. O
câncer de pulmão continua a ser o câncer mais comum no mundo, tanto em
termos de novos casos (1,8 milhões de casos, 12,9% do total) quanto em
mortes (1,6 milhão de óbitos, 19,4%) devido à alta letalidade. O câncer de
36
mama é o segundo câncer mais comum em geral (1,7 milhão de casos,
11,9%), mas ocupa o quinto lugar como causa de óbito (522 mil, 6,4%) devido
ao prognóstico relativamente favorável. Estes tipos de câncer são seguidos,
em termos de incidência, por câncer colorretal (1,4 milhão de casos, 694 mil
mortes), câncer de próstata (1,1 milhão de casos, 307 mil mortes), câncer de
estômago (951 mil casos, 723 mil mortes) e câncer de fígado (782 mil casos e
745 mil mortes). Estes seis tipos de câncer representam 55% do fator de
incidência global em 2012 (FERLAY et al., 2015).
O câncer de mama é o câncer mais frequente entre as mulheres
com cerca de 1,67 milhões de novos casos diagnosticados em 2012 (25% de
todos os cânceres). A maioria dos casos ocorre em mulheres de países
menos desenvolvidas. O câncer de mama é a quinta causa da morte por
câncer em geral (522 mil mortes), enquanto é a mais frequente causa de
morte por câncer em mulheres em regiões menos desenvolvidas (324 mil
mortes, 14,3% do total). A diferença nas taxas de mortalidade entre as
regiões do mundo são menores do que a incidência devido à sobrevivência
mais favorável do câncer de mama em regiões desenvolvidas, por conta do
maior cuidado e acesso à serviços de saúde (FERLAY et al., 2015).
O câncer de mama é uma doença heterogênea que pode ser
classificada com base em subtipos moleculares pela presença ou ausência de
receptor de estrogênio (ER), receptor de fator de crescimento epidérmico
humano 2 (HER2) e receptor de progesterona (PR). Existem tumores que não
expressam nenhum destes 3 receptores que são alvos moleculares de ação de
alguns fármacos contra o câncer de mama (PANAYOTOPOULOU et al., 2017;
REDDY, 2011).
Este tipo de câncer que não expressa nenhum destes receptores é
chamado "triplo-negativo", que corresponde a cerca de 20% de todos os
cânceres de mama e é caracterizado por alto índice mitótico, altas taxas de
metástases e pobre prognóstico por possuir opções terapêuticas reduzidas
(HAMUNYELA; SERAFIN; AKUDUGU, 2017; WALI et al., 2017).
Além do câncer de mama, o câncer cervical ou de colo de útero é o
quarto mais comum nas mulheres, e o sétimo geral, com o surgimento de 528
mil novos casos em 2012. A maioria (cerca de 86%, 453 mil casos) da carga
global ocorre em regiões menos desenvolvidas (América Latina, Caribe e
37
Ásia), onde representa quase 12% de todos os casos de câncer feminino.
Houve uma estimativa de 266 mil mortes por câncer cervical em todo o
mundo em 2012, representando 7,5% de todas as mortes por câncer nas
mulheres. Entretanto, quase nove em cada 10 (87%) mortes por câncer
cervical ocorrem em regiões menos desenvolvidas, sendo o risco médio de
morte por câncer cervical antes dos 75 anos três vezes maior nas regiões
menos desenvolvidas que nas regiões mais desenvolvidas (VACCARELLA et
al., 2017).
A busca por novos fármacos específicos para as células
neoplásicas, com toxicidade reduzida e índice terapêutico favorável tem sido
um desafio para indústria farmacêutica no mundo todo, a fim de reduzir os
efeitos colaterais resultantes do tratamento com quimioterápicos. Diante disto,
é importante que novas estratégias terapêuticas sejam desenvolvidas a fim
de eliminar a massa tumoral, protegendo as células normais e minimizando o
desconforto do paciente. Várias pesquisas vêm buscando novos alvos
terapêuticos contra o câncer e substâncias capazes de promover a morte de
células tumorais por mecanismos pouco imunogênicos para aumentar o
conforto e aceitabilidade do tratamento (ROBERTS et al., 2012; WEISS et al.,
2016).
1.4 Mecanismos de morte celular
A morte celular manifesta-se com alterações morfológicas.
Juntamente com os mecanismos pelos quais as células mortas e seus
fragmentos são descartados, esses morfotipos têm historicamente sido
empregados para classificar a morte celular em três formas diferentes,
apoptose, necrose e autofagia (GALLUZZI et al., 2018).
A apoptose ou morte celular de tipo I, exibe encolhimento
citoplasmático, exposição de resíduos de fosfatidilserina no folheto externo da
membrana plasmática, condensação de cromatina (picnose), fragmentação
nuclear e blebbing da membrana plasmática, culminando com a formação de
pequenas vesículas aparentemente intactas (comumente conhecidas como
corpos apoptóticos) que são retiradas de forma eficiente por células vizinhas
38
com atividade fagocítica e degradadas dentro de lisossomos (GALLUZZI et al.,
2018).
As células apoptóticas retêm a integridade da membrana plasmática
e a atividade metabólica à medida que o processo prossegue até a conclusão,
o que in vivo permite a depuração rápida por macrófagos ou outras células com
atividade fagocítica, que reconhecem a externalização da fosfatidilserina e
englobam a célula apoptótica (GREEN; OGUIN; MARTINEZ, 2016).
Apoptose pode ser ativada por duas vias, intrínseca e extrínseca. A
via intrínseca é uma forma de morte celular iniciada por uma variedade de
perturbações microambientais, incluindo retirada de fatores de crescimento,
danos ao DNA, estresse de retículo endoplasmático (ER), sobrecarga de
espécies reativas de oxigênio, estresse de replicação, alterações
microtubulares ou defeitos mitóticos (BRUMATTI; SALMANIDIS; EKERT, 2010;
PIHÁN; CARRERAS-SUREDA; HETZ, 2017; ROOS; THOMAS; KAINA, 2016).
Um evento chave da via intrínseca da apoptose é a permeabilização
da membrana externa mitocondrial (MOMP), amplamente considerado um
ponto de não retorno na progressão da morte celular apoptótica. Este evento é
estritamente controlado por uma complexa rede de interações entre membros
da família Bcl-2 (BIRKINSHAW; CZABOTAR, 2017).
As proteínas Bcl-2 são caracterizadas pela presença de domínios de
homologia Bcl-2 (domínios BH) e um domínio transmembranar (TMD)
carboxílico-terminal (C-terminal), presente em quase todos os membros da
família. De acordo com a sua função e o número de domínios de homologia
Bcl-2 (BH), eles são classificados em três grupos: as proteínas anti-apoptóticas
(Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 e Bcl-B); as proteínas pró-apoptóticas de
“sensor” BH3-apenas (Bad, Bid, Bim, BMF, Puma, Noxa); e os "executores"
pró-apoptóticos (Bax e Bak) (ANVEKAR et al., 2011).
Em células não estressadas, o Bax pró-apoptótico reside inativo no
citosol, com o domínio C-terminal sequestrado dentro de um sulco superficial
hidrofóbico (SUZUKI et al., 2000). Sob esta situação, as proteínas anti-
apoptóticas desempenham duas funções complementares de sobrevivência:
unir e neutralizar as proteínas sensoriais de BH3 e inibir as proteínas efetoras
de Bax e Bak.
39
Quando a célula sofre um estímulo pró-apoptótico, a regulação
positiva das proteínas BH3-apenas produz mudanças nos equilíbrios de
interação. Estudos estruturais demonstraram que a inserção de proteínas BH3
no sulco hidrofóbico formado pelos domínios BH1, BH2 e BH3 de membros
anti-apoptóticos (DAY et al., 2005; DENISOV et al., 2003; LIU et al., 2003;
SATTLER et al., 1997) diminui a quantidade de proteínas pró-sobrevivência
disponíveis para inibição de Bax/Bak. Além disso, as proteínas BH3 interagem
também diretamente com Bax e Bak para promover sua ativação (LETAI et al.,
2002).
Durante a ativação de Bax, o domínio hidrofóbico C-terminal é
liberado, interage com a membrana e promove a formação de poros
proteolipídeos Bax e Bak produzindo MOMP e a liberação de fatores
apoptogênicos, como o citocromo c para o citoplasma. Uma vez no citosol, o
citocromo c se liga ao fator 1 de ativação da protease apoptótica (Apaf-1) e
procaspase-9, em um complexo macromolecular conhecido como apoptosoma.
Neste complexo, procaspase-9 é ativada e, por sua vez, ativa a protease
efetora, a caspase-3 que finalmente destrói a célula (BIRKINSHAW;
CZABOTAR, 2017).
Essa família de proteínas Bcl-2 é alvo molecular de vários
medicamentos antitumorais que estão sendo lançados atualmente, como o
venetoclax e navitoclax, no intuito de promover a apoptose nas células
tumorais que possuem os membros anti-apoptóticas desta família super-
expressos, como as leucemias (ROBERTS et al., 2012; WEISS et al., 2016).
A apoptose extrínseca é uma via de morte celular iniciada por
perturbações do microambiente extracelular, recebendo e processando sinais
extracelulares indutores da morte. Os receptores de morte incluem: receptor de
morte de superfície celular de Fas (FAS, também conhecido como CD95 ou
APO-1) e membro de superfamília do receptor de TNF 1A (TNFRSF1A, mais
conhecido como TNFR1), 10a (TNFRSF10A, mais conhecido como TRAILR1
ou DR4) e 10b (TNFRSF10B, mais conhecido como TRAILR2 ou DR5)
(AGGARWAL; GUPTA; KIM, 2012; FLETEN et al., 2016; VON KARSTEDT;
MONTINARO; WALCZAK, 2017). Como regra geral, a ligação do receptor da
morte permite a montagem de um complexo multiprotetivo dinâmico na cauda
intracelular do receptor, como o chamado "complexo de sinalização indutor da
40
morte" (DISC), "complexo I" e "complexo II", Que funcionam como plataformas
moleculares para regular a ativação e funções de caspases, levando a célula à
morte (GALLUZZI et al., 2018).
Na ausência de fagócitos, como em estudos in vitro, apoptose pode
progredir para apoptose tardia, também conhecida como necrose secundária,
perdendo a integridade da membrana e liberando seu conteúdo intracelular
(VANDEN BERGHE et al., 2013).
A autofagia ou morte celular do tipo II, manifesta-se com
vacuolização citoplasmática extensa e culmina de forma semelhante da
apoptose, com a absorção fagocítica e consequente degradação lisossômica
(GALLUZZI et al., 2018). A autofagia é uma via rigorosamente regulada
envolvendo a degradação lisossômica de organelas citoplasmáticas ou
componentes citosólicos. Esta via pode ser estimulada por múltiplas formas de
estresse celular, incluindo privação de nutrientes ou fatores de crescimento,
hipoxia, espécies reativas de oxigênio (EROs), danos ao DNA, agregados
proteicos, organelas danificadas ou patógenos intracelulares (KROEMER;
MARIÑO; LEVINE, 2010).
Existem três tipos principais de autofagia que culminam com a
degradação mediada pelo lisossomo: macroautofagia que envolve a formação
de uma vesícula de membrana dupla (autofagosomo) para sequestro de
organelas e biomoléculas danificadas; micro-autofagia, pelo qual o material
citosólico é diretamente engulfado pelo lisossoma; e autofagia mediada por
chaperona (FILOMENI; DE ZIO; CECCONI, 2015). Atualmente, está bem
estabelecido que a autofagia é um processo muito sensível subjacente à
resposta celular induzida por quase todas as condições estressantes que
afetam a homeostase celular (KROEMER; MARIÑO; LEVINE, 2010). Através
da autofagia, as células coordenam a energia e os blocos de construção
exigidos para processos vitais (crescimento e proliferação) com os estímulos
extracelulares e disponibilidade de fonte de carbono, como aminoácidos e
glicose. Se eles não são suficientes para manter a taxa de síntese protéica, ou
para fornecer a quantidade necessária de ATP necessária para sustentar
reações metabólicas, as células ativam a autofagia para degradar rapidamente
os componentes antigos ou danificados e reutilizar o pool de biomoléculas
gerado (FILOMENI; DE ZIO; CECCONI, 2015).
41
Várias linhas de evidência indicam que EROs e espécies reativas de
nitrogênio (ERNs) são os moduladores da autofagia, provavelmente agindo em
vários níveis no processo. De acordo com essa suposição, EROs e ERNs
atuariam como as "moléculas de alarme" intracelulares da disponibilidade
extracelular de nutrientes (estímulos primitivos), sinalizando sua presença para
a maquinaria autofágica. Através de uma regulação de feedback negativo, a
autofagia poderia ser induzida a fornecer energia e blocos de construção para
restaurar a homeostase e, concomitantemente, remover o dano oxidativo.
Nesta perspectiva, a autofagia é necessária para que a célula supere
simultaneamente a falta de nutrientes e as condições de estresse oxidativo
(FILOMENI; DE ZIO; CECCONI, 2015; KROEMER; MARIÑO; LEVINE, 2010).
Entretanto, a autofagia é considerada tanto um mecanismo pró-
sobrevivência, quanto um tipo de morte celular. Muitas linhas de evidência
argumentam que a autofagia pode atrasar a morte das células apoptóticas
após o dano do DNA, sustentando a demanda de energia necessária para
suportar os processos de reparo do DNA (ABEDIN et al., 2007; YOON et al.,
2012). Um fenômeno que coincide com o desenvolvimento de mecanismos de
quimiorresistência em células cancerígenas (BORDIN et al., 2013).
Inversamente, em células onde o DNA não está compensado e a
apoptose é defeituosa, a autofagia induzida por danos ao DNA foi relatada
como mecanismo de morte celular, atuando como um supressor de tumor.
Quando o DNA é danificado por EROs e ERNs, as células ativam vários
caminhos para manter a integridade genômica, estando associados à resposta
ao dano do DNA. Diferentes classes de proteínas estão implicadas no dano do
DNA, entre os quais os sensores reconhecem especificamente as lesões ao
DNA, enquanto os mediadores e os efetores transduzem o sinal do núcleo para
o citosol, onde vários processos são ativados contextualmente para melhor
enfrentar condições adversas (CICCIA; ELLEDGE, 2010; ROOS; KAINA,
2013).
Por conseguinte, qualquer disfunção no mecanismo autofágico
revela-se envolvida no aparecimento de estados patológicos onde um papel
primário para o estresse oxidativo e/ou alterações na demanda metabólica
(como câncer) também foi relatado. Consequentemente, os defeitos genéticos
de genes autofágicos levam a uma produção aumentada de EROS e a
42
acumulação de organelas e DNA danificados, que, por sua vez, promovem a
reprogramação metabólica e induzem a tumorgênese (FILOMENI; DE ZIO;
CECCONI, 2015).
Por fim, a necrose ou morte celular de tipo III, não apresenta
características distintivas da morte celular de tipo I ou II e termina com a
disposição de restos celulares e ausência de comprometimento fagocítico e
lisossômico observável (GALLUZZI et al., 2018). A necrose é um processo de
morte celular de caráter degenerativo, decorrente de eventos como lesão
celular, infecção e ausência de fatores de crescimento, levando a alterações na
integridade de membrana citoplasmática, aumento do volume celular, colapso
da produção de ATP e perda das demais funções biológicas (VANDEN
BERGHE et al., 2013). Suas principais características morfológicas são
aumento do volume celular, agregação de cromatina, desorganização do
citoplasma, perda da integridade da membrana plasmática, lise celular precoce
com consequente liberação do conteúdo citoplasmático causando dano às
células vizinhas além de uma reação inflamatória local (ROOS; THOMAS;
KAINA, 2016).
O mecanismo de morte celular pode ser analisado por abordagens
farmacológicas/ transgênicas, fatores bioquímicos e alterações morfológicas
em células eucarióticas (VANDEN BERGHE et al., 2013). Entretanto,
algumas abordagens farmacológicas/transgênicas em protozoários ainda são
desconhecidas, como por exemplo, a expressão de caspases (MENNA-
BARRETO et al., 2009).
43
_______JUSTIFICATIVA
44
2. JUSTIFICATIVA
Endêmica em 21 países da América Latina, a doença de Chagas
mata mais pessoas nesta região a cada ano do que qualquer outra doença
parasitária. Aproximadamente 6-8 milhões de pessoas estão infectadas
atualmente, levando a cerca de 12.000 mortes por ano. Em 10% a 30% dos
pacientes infectados, desenvolve-se a doença sintomática crônica, que resulta
em megasíndromes gástricas ou cardiomiopatias. Essas comorbidades
resultam em deficiência significativa com grande impacto social e econômico,
incluindo desemprego e diminuição da capacidade de ganho (DNDI, 2018),
sendo a cardiomiopatia a pricipal causa de morte (MORILLO et al., 2015).
O único medicamento disponível no Brasil para o tratamento da
doença de Chagas é o benzonidazol, apesar de não ser efetivo na fase crônica,
possuir baixa seletividade ao parasito, causar efeitos colaterais severos e não
mostrar benefícios nas cardiomiopatias (MORILLA; ROMERO, 2015; MORILLO
et al., 2015; VIOTTI et al., 2009). Além disso, algumas cepas resistentes ao
benzonidazol emergiram, tornando ainda pior o prognóstico de alguns
pacientes, já que não possuem outra opção terapêutica (RODRIGUES et al.,
2014).
Além das doenças negligenciadas, uma das principais causas de
morte em países em desenvolvimento é o câncer. O câncer de mama é o
mais frequente entre as mulheres, sendo a causa de morte mais frequente
em regiões menos desenvolvidas (FERLAY et al., 2015). Outro tipo de câncer
que atinge principalmente as mulheres de países em desenvolvimento é o
câncer cervical ou de colo de útero, estimando-se que 86% dos casos
ocorrem nas regiões da América Latina, Caribe e Ásia. A maioria das mortes
por câncer cervical, cerca de 87%, também ocorrem nestas regiões
(VACCARELLA et al., 2017).
Nas últimas décadas, houveram avanços significativos na terapia
anticancerígena, porém o câncer continua a ser uma séria ameaça para a
sobrevivência humana (HASHIM et al., 2016). Os tumores são clones de
células que se dividem rapidamente não regulados por mecanismos normais
de supressão do crescimento. A quimioterapia visa interferir com este
processo descontrolado de divisão celular. No entanto, muitas drogas
45
cancerígenas geralmente não têm especificidade para as células
transformadas (LARSEN et al., 2008). Consequentemente, eles também
matam células saudáveis submetidas a uma rápida proliferação, resultando
em efeitos colaterais tóxicos. Outra limitação da quimioterapia é o
desenvolvimento de resistência por células tumorais (CHATTERJEE; DAMLE;
SHARMA, 2014).
O desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas eficazes e
de baixo custo para doença de Chagas e o câncer são de fundamental
importância para os países em desenvolvimento como o Brasil, por causa das
comorbidades provocadas por ambas e pelo número de óbitos que causam.
Os PAMs exibem atividade de amplo espectro contra bactérias com base em
interações eletrostáticas com lipídios carregados negativamente na superfície
bacteriana (DESLOUCHES; DI, 2017). Estes vêm sendo amplamente
estudados quanto às suas propriedades antiparasitárias (MCGWIRE;
KULKARNI, 2010) e antitumorais (ROUDI; SYN; ROUDBARY, 2017).
Devido às proporções aumentadas de fosfatidilserina (carregada
negativamente) na superfície das células cancerosas em comparação com
células normais, acredita-se que os peptídeos catiônicos anfipáticos podem
ser uma fonte eficaz de agentes anticancerígenos que são tanto seletivos
quanto refratários aos atuais mecanismos de resistência (DESLOUCHES; DI,
2017). As membranas do T. cruzi também possuem componentes
negativamente carregados, como glicoproteínas de ácido siálico e mucina
(DE SOUZA, WANDERLEY; DE CARVALHO; BARRIAS, 2010).
As dinoponeratoxinas são peptídeos anfipáticos carregados
positivamente (BANDEIRA LIMA et al., 2017), podendo assim, mostrar
propriedades antitumorais e antichagásicas seletivas. Além disso, estudos
prévios com o veneno de D. quadriceps demonstraram seu potencial
antichagásico contra uma cepa de Trypanosoma cruzi resistente ao
benzonidazol (LIMA, 2014). Assim, a investigação do efeito antitumoral das
dinoponeratoxinas, bem como do antichagásico do veneno de D. quadriceps
e dinoponeratoxinas foi motivada.
46
_________OBJETIVOS
47
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar o veneno de Dinoponera quadriceps como fonte de
peptídeos bioativos tripanocidas e antitumorais.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar o efeito antiamastigota do veneno de D. quadriceps sobre cepa Y
de T. cruzi;
Avaliar a toxicidade do veneno de D. quadriceps sobre células hospedeiras
e índice de seletividade;
Elucidar o mecanismo de ação morte induzido pelo veneno de D.
quadriceps sobre formas epimastigotas de cepa Y de T. cruzi;
Avaliar o efeito das Dntxs sDq-3348, sDq-2561, sDq-1503, sDq-1319 e
sDq-2561[12-23] contra formas epimastigotas, tripomastigotas e
amastigotas de cepa Y de Trypanosoma cruzi;
Avaliar a toxicidade das dinoponeratoxinas sobre células hospedeiras e
índice de seletividade;
Investigar o mecanismo de morte induzido por dinoponeratoxinas sobre
formas epimastigotas de cepa Y de T. cruzi;
Avaliar o efeito antiproliferativo das dinoponeratoxinas sobre células de
câncer cervical (Hela) e células de câncer de mama (MCF-7, MDA-MB-231
e MDA-MB-468);
Investigar o mecanismo de morte induzido pelas dinoponeratoxinas sobre
as linhagens tumorais sensíveis;
Avaliar a toxicidade das dinoponeratoxinas sobre células normais de ovário
(MCF10A);
48
MATERIAIS
__________E MÉTODOS
49
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Obtenção do veneno
As formigas Dinoponera quadriceps foram coletadas na serra de
Maranguape-CE e na Reserva Natural Serra das Almas, Crateús-CE, com
autorização do IBAMA/SISBIO – licença Nº 28794-1. Após a identificação do
ninho, o mesmo foi escavado e todos os exemplares encontrados foram
coletados com auxílio de pinças e levados ao Laboratório de Biologia de
Insetos Sociais/UECE para criação, extração da peçonha e dissecção da
glândula de veneno sob a orientação do Prof. Yves Patric Quinet. Para coletar
o veneno, as formigas foram contidas na região do tórax com ajuda de uma
pinça e seu ferrão foi pressionado com um tubo capilar para induzir a secreção
de veneno. O veneno de Dinoponera quadriceps (DqV) foi então transferido
para tubos eppendorfs contendo tampão acetato de amônio (pH 6,8), liofilizado
e armazenado a -20 ºC.
4.2 Peptídeos e benzonidazol
As dinoponeratoxinas (sDq-3348, sDq-2561, sDq-1503 e sDq-1319;
Dntxs) são amidas C-terminal e foram obtidas como descrito por Bandeira Lima
et al., (2017). As sequências de aminoácidos foram analisadas com os
softwares "Peptide property calculator" (http://www.pepcalc.com), "Heliquest"
(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr) e/ou “Kael” (http://kael.net/helical.htm). O peptídeo
sDq-2561[12-23] ou M-PONTX-Dq3a[12-23], um fragmento C-terminal amidado
do peptídeo sDq-2561 complementar ao peptídeo sDq-1319, não foi
encontrado nos estudos de proteômica, mas seu estudo durante este trabalho
se tornou interessante, então também foi sintetizado no Centro de Investigación
Príncipe Felipe e testado. A nomeclatura dos peptídeos recebeu um “s” no
início para indicar que são peptídeos sintéticos e não isolados do veneno. As
sequências de aminoácidos destes peptídeos estão descritas na tabela 2.
Benzonidazol (Bz) (C12H12N4O3, PM = 260,249 g/mol) foi obtido do
Lafepe. As soluções de reserva dos peptídeos foram preparadas a 1mM (1000
µM) com PBS e mantidas a 4°C até serem utilizadas dentro de seis semanas.
50
Tabela 2. Estrutura primária de dinoponeratoxinas e sDq-2561[12-23]
Peptídeo Sequência de aminoácidos
sDq-2561 FWGTLAKWALKAIPAAMGMKQNK
sDq-1503 FWGTLAKWALKAI
sDq-1319 FWGTLAKWALK
sDq-2561[12-23] AIPAAMGMKQNK
sDq-3348 GLKDWWNKHKDKIVKVVKEMGKAGINAAGK
Fonte: Elaborada pelo autor.
4.3 Avaliação da atividade tripanocida in vitro em cepas Y de T. cruzi
A fim de investigar a atividade antiparasitária das substâncias,
ensaios foram realizados nas três principais formas do ciclo de vida do
parasito: epimastigotas, tripomastigotas e amastigota do Trypanosoma cruzi.
Os resultados foram comparados à droga de escolha para tratamento da
Doença de Chagas no Brasil, o Benzonidazol (BZ).
4.3.1 Ensaio em formas epimastigotas de T. cruzi
As formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT
(RODRIGUES et al., 2014), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF),
penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 µg/L) e mantidas em incubadora
BOD a 28 °C. Para avaliação do efeito anti-proliferativo das dinoponeratoxinas
nestas formas, foram utilizados parasitos provenientes da fase exponencial da
cultura inicial.
Formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) na fase log de
crescimento (ADADE et al., 2014), foram plaqueadas e incubadas em placas
de 96 poços com diferentes concentrações de Dntxs (1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25;
50 e 100 M), e de BZ (6; 12; 24; 48; 96; 192 e 384 M). Após os tempos de
24, 48 e 72 horas, foram realizadas as quantificações de células viáveis em
câmara de Neubauer (RODRIGUES et al., 2014). Células tratadas com PBS
estéril foram consideradas como controle negativo. O percentual de viabilidade
51
celular foi calculado em comparação com o grupo controle negativo. A IC50
(concentração capaz de inibir 50% do crescimento celular) foi determinada por
regressão não linear. Foram realizados três experimentos independentes em
triplicata.
4.3.2 Ensaio em formas tripomastigotas de T. cruzi
As formas tripomastigotas foram obtidas a partir da infecção de
cultura de células epiteliais de rim de macaco (LLC-MK2) cultivadas a 37 ºC e
5% de CO2 em meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s médium) enriquecido
com 2% de Soro Bovino Fetal (SBF). Após 5 a 8 dias de infecção, o
sobrenadante contendo as formas tripomastigotas que eclodiram, foram
centrifugadas e ressuspensas na concentração de 106 células/mL.
Posteriormente, os tripomastigotas foram incubados em placas de 96 poços
estéreis e tratados com diferentes concentrações de Dntxs (25; 12,5; 6,25;
3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,19; 0,09 e 0,04 µM) e BZ (6, 12, 24, 48, 96, 192 e 384
M). Neste ensaio consideramos como controle negativo células tratadas com
PBS estéril (pH 7.4) (MEIRA et al., 2015).
A viabilidade foi determinada após 24h de incubação em ambiente
com 5% CO2 e temperatura de 37°C por quantificação em câmara de
Neubauer. O percentual de viabilidade celular foi calculado em comparação
com o grupo controle negativo. A IC50 (concentração capaz de inibir 50% do
crescimento celular) foi determinada por regressão não linear. Foram
realizados três experimentos independentes em triplicata.
4.3.3 Ensaio em formas amastigotas de T. cruzi
Para avaliar o efeito das Dntxs e do veneno total na forma
amastigota, células LLC-MK2 foram incubadas (5,0 x 104/ml) em placas
estéreis com 24 poços contendo lamínulas circulares também estéreis em meio
DMEM e suplementação de SBF 10% em temperatura de 37°C e 5% de CO2.
Após 24 h, as culturas com células aderidas foram infectadas com as formas
tripomastigotas de T. cruzi na proporção de 20:1 e mantidas sob mesmas
condições em meio DMEM com suplementação de apenas 2% de SBF.
52
Para que houvesse internalização dos parasitos e transformação em
formas amastigotas intracelulares, aguardou-se um tempo de 48h. O
sobrenadante foi desprezado e as culturas foram então tratadas com Dntxs, BZ
ou DqV em suas respectivas IC50 e o dobro da IC50 das formas
tripomastigotas. PBS foi utilizado como tratamento do controle negativo. Em
seguida, as placas foram incubadas por períodos de 24 e 48h. Após estes
períodos, as lamínulas foram lavadas fixadas em solução de Bouin e coradas
com Giemsa para seguinte montagem em lâminas (ADADE et al., 2014).
Para determinar o número de amastigotas/100 células e o percentual
de células infectadas foi realizado contagem em microscópio óptico de um total
de 300 células em cada lamínula por experimento. Foram realizados três
experimentos independentes em triplicata (BANDEIRA et al., 2017).
4.4 Avaliação da toxicidade in vitro nas células hospedeiras e índice de
seletividade
A atividade citotóxica do veneno de D. quadriceps (DqV) e das Dntxs
sobre células de mamíferos foi realizada na linhagen LLC-MK2 (células
epiteliais renais de macaco), obtida do Banco de Células do Rio de Janeiro.
Para determinar a viabilidade celular, foi realizado o ensaio do MTT
(VANDEN BERGHE et al., 2013), que verifica a capacidade oxirredutiva das
células. As células foram cultivadas em placas estéreis de 96 poços na
concentração de 105 células/mL em meio DMEM a 10% de SBF, penicilina
(100 UI/mL) e estreptomicina (100 µg/L) a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2
por 24 horas. Em seguida, foram tratadas com diferentes concentrações de
Dntxs (1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 M), Benzonidazol (6, 12, 24, 48, 96,
192, 384 e 768 M) e DqV (1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 e 200 g/mL) e
incubadas a 37°C durante 24 horas. O MTT (5 mg/ml em PBS) foi adicionado a
cada poço e as placas foram deixadas em repouso por 4 h a 37°C. Finalmente,
os cristais de formazan formados foram solubilizados em 10% de dodecil
sulfato de sódio (SDS) em 0,01 N de HCl. Após 17 h, leu-se a absorvância a
570 nm num leitor de microplacas (Biochrom® ASYS Expert Plus). Foram
realizados três experimentos independentes em triplicata.
53
O percentual de viabilidade celular foi calculado em comparação
com o grupo controle de células não tratadas. A IC50 (concentração capaz de
inibir 50% do crescimento celular) foi determinada por regressão não linear. A
toxicidade das substâncias sobre as LLC-MK2 serviu como base para definir as
concentrações de trabalho dos ensaios in vitro e para estimar o índice de
seletividade (IS) das respectivas substâncias através da relação entre a
toxicidade na célula hospedeira e a toxicidade no parasito (NWAKA; HUDSON,
2006).
4.5 Avaliação do mecanismo de morte celular em cepa Y de T. cruzi
A fim de investigar o mecanismo de morte induzido por Dntxs e DqV
em T. cruzi, foram realizados os seguintes ensaios em formas epimastigotas
através de citometria de fluxo, microscopia confocal e microscopia eletrônica de
varredura.
4.5.1 Efeito necrótico e/ou apoptótico em formas epimastigotas de T. cruzi
Para identificar o potencial necrótico e/ou apoptótico das Dntxs sDq-
2561 e sDq-3348, foram utilizados o marcador de apoptose por externalização
da fosfatidilserina Anexina V-PE e o marcador de necrose por lesão de
membrana plasmática 7-AAD. Este experimento não foi realizado com o
veneno total, pois já havia sido realizado no trabalho de Lima (2014).
As formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) foram plaqueadas,
tratadas com a IC50 de sDq-3348 e com IC50 e o dobro de IC50 de sDq-2561
e incubadas por 24 horas em placa de 24 poços em estufa de BOD a 28 ºC.
Após esses períodos, as culturas foram lavadas e marcadas com um
conjugado de Anexina V-PE e 7-AAD, utilizando um kit comercial (Sigma-
Aldrich). Células tratadas com PBS foram utilizadas como controle negativo.
Após 15 minutos de incubação no escuro, os parasitos foram
analisados por citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton-Dickinson). Para cada
amostra foram considerados no mínimo dez mil eventos (BANDEIRA et al.,
2017).
54
4.5.2 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)
Para a avaliação de EROs, utilizou-se o marcador DCF para a
citometria de fluxo. Este marcador na presença de EROs, apresenta um alto
rendimento quântico de fluorescência. Dessa forma, a fluorescência observada
aumenta proporcionalmente à produção de EROs.
As formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) foram plaqueadas,
tratadas com a IC50 de sDq-3348 e com as respectivas IC50 e o dobro da IC50
de sDq-2561 e incubadas por 24h em placa de 24 poços em estufa de BOD a
28 ºC. Células tratadas com PBS foram utilizadas como controle negativo.
Após esse período as células foram lavadas e marcados com DCF (2',7'-
diclorofluoresceína) por 30 minutos no escuro.
Ao final, os parasitos foram lavados novamente e colhidos para
análise por citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton-Dickinson). Para cada
amostra foram considerados no mínimo dez mil eventos.
4.5.3 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm)
Para os ensaios de potencial transmembrânico mitocondrial foi
utilizado o marcador Rhodamina 123 (Sigma-Aldrich). A rodamina é um corante
catiônico que se acumula em mitocôndrias intactas livres de danos, emitindo
fluorescência vermelha. Alterações no potencial transmembrânico mitocondrial
causa redução do acúmulo do marcador (BARACCA et al., 2003).
4.5.3.1 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm)
por citometria de fluxo
As formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) foram plaqueadas,
tratadas com a IC50 de sDq-3348 e com as respectivas IC50 e o dobro da IC50
de sDq-2561 e DqV e incubadas por 24h em placa de 24 poços em estufa de
BOD a 28 ºC. Após esse período, as células foram lavadas e marcadas com
rodamina (Rho123) 10 µg/mL por 30 minutos no escuro. Células tratadas com
PBS foram utilizadas como controle negativo. Em seguida, as células lavadas
foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton-Dickinson).
55
Para cada amostra foram considerados no mínimo dez mil eventos (MELLO et
al., 2017).
4.5.3.2 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm)
por microscopia confocal
As formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) foram plaqueadas,
tratadas com a IC50 de sDq-3348 e com as respectivas IC50 e o dobro da IC50
de sDq-2561 e DqV e incubadas por 24h em placa de 24 poços em estufa de
BOD a 28 ºC. Após esse período, as células foram lavadas e marcadas com
rodamina (Rho123) 10 µg/mL por 30 minutos no escuro. Células tratadas com
PBS foram utilizadas como controle negativo. Em seguida, as células foram
lavadas e as lâminas foram montadas. Finalmente, as células foram analisadas
em microscópio confocal LSM 710 (Zeiss, Germany) (SANDES et al., 2014). As
imagens digitais foram adquiridas e armazenas em computador na Central
Analítica – UFC.
4.5.4 Avaliação de indução de autofagia
Para avaliar a morte celular autofágica, utilizou-se o marcador
laranja de acridina por citometria de fluxo. Este marcador permite a
visualização de organelas vesiculares ácidas, uma vez que é um marcador
acidotrópico. Ao penetrar na célula apresenta fluorescência verde e ao ficar
retido em organelas ácidas (característica de fagossomo) emite fluorescência
vermelha.
As formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) foram plaqueadas,
tratadas com a IC50 de sDq-3348 e com as respectivas IC50 e o dobro da IC50
de sDq-2561 e DqV e incubadas por 24h em placa de 24 poços em estufa de
BOD a 28 ºC. Após esse período, as células foram lavadas e marcadas com
laranja de acridina 5 µg/mL por 30 minutos no escuro. Células tratadas com
PBS foram utilizadas como controle negativo (SANDES et al., 2014). Em
seguida, as células lavadas foram analisadas por citometria de fluxo
(FACSCalibur, Becton-Dickinson). Para cada amostra foram considerados no
mínimo dez mil eventos.
56
4.5.5 Avaliação de alterações morfológicas ultraestruturais
Alterações na superfície dos parasitos foram observadas por
microscopia eletrônica de varredura (MEV). A técnica consiste em utilizar um
feixe de elétrons de pequeno diâmetro para explorar a superfície da amostra,
ponto a ponto, por linhas sucessivas e transmitir o sinal do detector a uma tela
catódica cuja varredura está perfeitamente sincronizada com aquela do feixe
incidente.
As formas epimastigotas (1 x 106 células/mL) foram incubadas com
IC50 de sDq-3348 e com as respectivas IC50 e o dobro da IC50 de sDq-2561 e
DqV e incubadas em placas de 24 poços por 12 horas em estufa de BOD a 28
ºC. Após a incubação, os parasitos foram fixados por 2 horas com 2,5% de
glutaraldeído (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Pennsylvania), lavados
duas vezes com PBS e duas vezes com água destilada centrifugando-se a
800g por 10 min. Em seguida, as amostras foram desidratadas e séries
crescentes de etanol (30-100%), colocadas em lamínulas de vidro, fixadas a
37ºC com 5% de CO2, cobertas com ouro e observadas em um microscópio
eletrônico de varredura FEG Quanta 450 (FEI, Oregon, USA) (MELLO et al.,
2017). As imagens digitais foram adquiridas e armazenas em computador na
Central Analítica – UFC utilizando o Software Nis 4.0.
4.6 Avaliação da atividade antitumoral in vitro
A fim de investigar a atividade antumoral das Dntxs (sDq-2561, sDq-
3348, sDq-1319 e sDq-1503), foram realizados testes contra várias linhagens
tumorais de câncer de mama e cervical.
4.6.1 Linhagens celulares e cultivo
As linhagens de mama utilizadas foram MCF-7, MBA-MB-231, MDA-
MB-468, enquanto que de câncer cervical foi utilizada HeLa. Utilizou-se
também uma linhagem normal de ovário, a MCF10A. As MCF-7, MBA-MB-231,
MDA-MB-468 e HeLa foram cultivadas em meio DMEM a 10% de SBF sem a
adição de antibióticos e antifúngicos. A linhagem MCF10A foi cultivada em
57
meio DMEM/F12 a 5% de soro equino e outros fatores (Fator de Crescimento
Epidérmico 20 ng/mL, hidrocortisona 0,5 mg/mL, toxina de cólera 100 ng/mL,
insulina 10 µg/mL, penicilina100 UI/mL e estreptomicina 100 µg/L). Todas as
linhagens foram mantidas a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2.
4.6.2 Avaliação do efeito antiproliferativo de células tumorais
O efeito antiproliferativo foi determinado utilizando o ensaio com
MTS (VANDEN BERGHE et al., 2013), que verifica a capacidade oxirredutiva
das células. As células foram plaqueadas (1 x 105 células/mL) e incubadas em
seu respectivo meio a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2 por 24 horas para
permitir sua adesão. Em seguida, foram tratadas com diferentes concentrações
de Dntxs (1, 5, 10, 25 e 50 µM) e incubadas por 24 horas. O MTS (0,33 mg/ml)
foi adicionado a cada poço e as placas foram deixadas em repouso de 2 a 4
horas a 37°C dependendo da velocidade de metabolismo da linhagem celular.
Finalmente, leu-se a absorvância a 570 nm num leitor de microplacas Victor 2
(Perkin Elmer Wallac 1420). A IC50 de cada Dntx sobre cada linhagem celular
foi calculada por regressão não linear e foi utilisada nos ensaios posteriores.
4.6.3 Análise de mecanismo de morte celular
A fim de investigar o mecanismo de morte celular das linhagens
sensíveis às Dntxs, foram realizados ensaios de microscopia de “time-lapse” e
de liberação de LDH.
4.6.3.1 Microscopia de “time-lapse”
A melhor abordagem para distinguir o mecanismmo de morte celular
entre necrose e apoptose é a microscopia de imagens em “time-lapse”. Esta
técnica permite que um processo biológico seja fotografado em intervalos
regulares durante um período, que pode durar de algumas horas a vários dias,
e pode ser aplicado a células em cultura ou in vivo (WALLBERG; TENEV;
MEIER, 2016). Para identificação do potencial necrótico e/ou apoptótico das
substâncias em estudo, as células tratadas serão submetidas à marcação com
58
Anexina V-PE, marcador de apoptose por externalização da fosfatidilserina, e
iodeto de propídeo (PI) marcador de necrose por lesão de membrana
plasmática.
As células sensíveis a sDq-2561 (MDA-MB-231 e HeLa) foram
investigadas quanto ao seu mecanismo de morte celular na microscopia de tim-
lapse. Este ensaio também foi realizado com as células MCF10A, linhagem de
ovário normal, em concentrações próximas às utilizadas nas linhagens
tumorais, já que esta linhagem não foi sensível a este peptídeo.
MDA-MB-231, HeLa e MCF10A (1 x 105 células/mL) foram
plaqueadas e incubadas durante 24 horas a 37ºC e 5% de CO2 para sua
adesão. Em seguida, o meio das células foi trocado por DMEM 10% sem
indicador de pH e as células MDA-MB-231 e HeLa foram tratadas com as
respectivas IC50 de sDq-2561 e de doxorrubicina para controle positivo.
MCF10A foi tratada com 10 µM de sDq-2561 e 4 µM de doxorrubicina,
concentrações semelhantes às utilizadas nas outras linhagens. Células
tratadas com PBS foram utilizadas como controle negativo. Então, foram
adicionados os marcadores Anexina V-PE (5 μL/mL em 2,5 mM CaCl2 no
meio) e 1,5 μM de PI. Por fim, a placa foi adaptada em um Microscopio
Invertido de investigação totalmente automático Leica DMI6000 B, que foi
programado para bater fotos de cada condição a cada meia hora durante 6
horas. As fotos obtidas foram transpostas com a fluorescencia e analisadas.
4.6.3.2 Ensaio da atividade da enzima Lactato Desidrogenase
Para investigar se o tratamento com sDq-2561 causou lise e
liberação do conteúdo celular, foi realizada a dosagem da atividade da enzima
lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante de poços tratados (VANDEN
BERGHE et al., 2013).
MDA-MB-231 e HeLa (1 x 105 células/mL) foram plaqueadas e
incubadas durante 24 horas a 37ºC e 5% de CO2 para sua adesão. Em
seguida, foram tratadas com suas respectivas IC50 e metade da IC50 de sDq-
2561. Também foram feitos grupos controle negativo com células tratadas com
PBS e controle positivo com células tratadas com Triton X-100 1% v/v. Após 1
e 2 horas de incubação, 50 µL do sobrenadante dos grupos tratados e controle
59
foram retirados e incubados com o reagente de determinação de LDH
(Promega) em placa de 96 poços negra em temperatura ambiente por 30
minutos no escuro. Por fim, a leitura da fluorescência (Ex/Em = 530-570/590-
600 nm) foi medida no leitor de microplacas Victor 2. Os valores de
citotoxicidade foram calculados utilizando os resultados de controle negativo
como liberação basal de LDH, e os resultados de controle positivo, como 100%
de liberação da enzima.
4.7 Análise de dados
Os ensaios foram realizados em triplicada de três experimentos
independentes e os resultados obtidos expressos em média ± erro padrão da
média e os valores de IC50 determinadas por regressão não linear com intervalo
de confiança 95%. Comparações estatísticas foram analisadas utilizando
ANOVA com Bonferroni’s post-test no programa GraphPad Prism 5.
60
________RESULTADOS
61
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação da atividade tripanocida in vitro em cepas Y de T. cruzi
5.1.1 Ensaio em formas epimastigotas de T. cruzi
A citotoxicidade das dinoponeratoxinas sDq-2561, sDq-1319, sDq-
1503, sDq-2561[12-23] e sDq-3348 foi avaliada em formas epimastigotas de T.
cruzi após 24, 48 e 72 horas de exposição a diferentes concentrações (em μM:
100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78). A percentagem de viabilidade celular
foi calculada em relação ao controle, cuja quantificação foi considerada 100%.
Para controle positivo foi utilizado o benzonidazol. As respectivas IC50
encontadas estão dispostas na tabela 3.
Tabela 3. Efeito das dinoponeratoxinas sobre formas epimastigotas de cepa Y de
T. cruzi.
sDq-3348 sDq-2561 sDq-1503 sDq-1319 sDq-2561
[12-23]
Bz
IC50/24 h 23,5±3 4,7±1 48,8±5 - - 218,0±15
IC50/48 h 11,0±3 3,6±0,5 45,9±7 - - 61,1±3
IC50/72 h 8,3±3 2,4±0,4 39,3±10 - - 16,5±1
Fonte: Elaborada pelo autor.
Legenda: Valores de IC50 são expressos em μM. Dados são espressos por média ±
erro padrão da média de 3 experimentos independentes. (-) Significa ausência de
efeito em todas as concentrações testadas. Bz: Benzonidazol.
sDq-2561 demonstrou a menor IC50 de todos os peptídeos e não
demonstrou uma alteração significativa das IC50 entre os tempos de 24 e 48
horas. A IC50 de 72 horas foi a menor encontrada, mas ainda muito próxima
das de 24 e 48 horas (Apêndice A; Figura 29). sDq-1503 não demonstrou
diferenças significativas entre as IC50 dos 3 tempos, sugerindo efeito tempo
independente (Apêndice A; Figura 31). sDq-1319 e sDq-2561[12-23] não
62
mostraram efeito sobre formas epimastigotas em nenhuma das concentrações
testadas (Apêndice A; Figura 32 e 33). sDq-3348 mostrou a segunda menor
IC50 de 24 horas dentre os peptídeos testados, que caiu significativamente à
metade para o tempo de 48 horas, não sendo visível alteração significante
entre os tempos de 48 e 72 horas (Apêndice A; Figura 30). O controle positivo
BZ mostrou IC50s maiores do que de sDq-2561 e sDq-3348 nos 3 tempos de
incubação, sendo maior, no período de 24 horas, em 46 e 9 vezes
respectivamente.
5.1.2 Ensaio em formas tripomastigotas de T. cruzi
A citotoxicidade das dinoponeratoxinas sDq-2561, sDq-1319, sDq-
1503, sDq-2561[12-23] e sDq-3348 foi avaliada em formas tripomastigotas de
T. cruzi após 24 horas de exposição a diferentes concentrações (em μM: 100;
50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,19; 0,097). A viabilidade celular foi
calculada em relação ao controle, cuja quantificação foi considerada 100%. O
benzonidazol foi utilizado como controle positivo. As IC50 encontradas estão
descritas na tabela 4.
Tabela 4. Efeito das dinoponeratoxinas sobre formas tripomastigotas de cepa Y
de T. cruzi após 24 horas de incubação.
sDq-3348 sDq-2561 sDq-1503 sDq-1319 sDq-2561
[12-23]
Bz
4,7±0,3 0,32±0,03 7,4±0,6 34,8±5 - 282±20
Fonte: Elaborada pelo autor.
Legenda: Valores de IC50 são expressos em μM. Dados são espressos por média ±
erro padrão da média de 3 experimentos independentes. (-) Significa ausência de
efeito em todas as concentrações testadas. Bz: Benzonidazol.
sDq-2561 demonstrou a menor IC50 de todos os peptídeos
(Apêndice A; Figura 34), mostrando uma concentração necessária para inibir
50% da viabilidade celular 880 vezes menor que do BZ. sDq-1503 (Apêndice
A; Figura 36) e sDq-1319 (Apêndice A; Figura 37) mostraram IC50 de 7,4 e
63
34,8 µM, ainda 38 e 8 vezes menores que a do Bz, mas bem maiores que sDq-
2561. sDq-2561[12-23] não demonstrou nenhum efeito contra formas
tripomastigotas de T. cruzi (Apêndice A; Figura 38). sDq-3348 mostrou a
segunda menor IC50 dentre os peptídeos testados (Apêndice A; Figura 35),
sendo 60 vezes menor que do Bz.
5.1.3 Efeito em formas amastigotas de T. cruzi
As dinoponeratoxinas que demonstraram efeito em formas
tripomastigotas (sDq-2561, sDq-1319, sDq-1503 e sDq-3348) e o veneno de
Dinoponera quadriceps, foram testados em ensaios de formas amastigotas.
Foram realizados ensaios em 24h e 48h, utilizando a IC50 e dobro da IC50 das
formas tripomastigotas. Os parâmetros avaliados foram o percentual de células
infectadas e o número de amastigotas por 100 células.
O veneno de D. quadriceps demonstrou diminuição no número de
amastigotas/100 células nos tempos de 24 e 48 horas (Figura 5A) e no
percentual de células infectadas também nos dois períodos (Figura 5B). As
dinoponeratoxinas sDq-1319 e sDq-1503 não mostraram nenhum efeito em
nenhum dos parâmetros avaliados nos dois períodos de tempo. Já as
dinoponeratoxinas sDq-2561 e sDq-3348 mostraram efeito nos dois
parâmetros. sDq-2651 foi capaz de diminuir o número de amastigotas/100
células nos dois períodos testados, nas duas concentrações sem diferenças
significativas entre as concentrações testadas (Figura 5C), já no percentual de
células infectadas diminuiu no tempo de 24 horas nas duas concentrações sem
diferença significativa entre elas, mas não mostrou efeito no tempo de 48 horas
em nenhuma concentração (Figura 5D). sDq-3348 foi capaz de reduzir o
número de amastigotas/100 células nas duas concentrações sem diferenças
entre elas nos dois períodos de tempo (Figura 5E), mas no percentual de
células infectadas, não mostrou efeito no tempo de 24 horas em nenhuma
concentração, mostrando nas duas concentrações no tempo de 48 horas
(Figura 5F). Estes resultados indicam complementariedade entre os efeitos do
sDq-2561 e o sDq-3348 para o efeito do veneno de D. quadriceps, onde sDq-
3348 exerce um efeito melhor em tempos maiores e o sDq-2561 exerce um
efeito melhor em tempos menores.
64
Figura 5 - Efeito do veneno de D. quadriceps e de dinoponeratoxinas sobre
células LLC-MK2 infectadas com a forma amastigota intracelular de cepa Y de
T. cruzi.
CT 1,98 3,960
100
200
300
400
50024 h
48 h
**
*
*
DqV (g/mL)
Am
astigota
s/
100 c
élu
las
A
CT 1,98 3,960
20
40
60
80
10024 h
48 h
* * * *
B
DqV (g/mL)
Célu
las infe
cta
das (
%)
CT 0,34 0,680
500
1000
150024 h
48 h
**
*
*
sDq-2561 (M)
Am
astigota
s/
100 c
élu
las
C
CT 0,34 0,680
20
40
60
80
10024 h
48 h
* *
sDq-2561 (M)
Célu
las infe
cta
das (
%)
D
CT 4,7 9,40
500
1000
150024 h
48 h
* * **
E
sDq-3348 (M)
Am
astigota
s/
100 c
élu
las
CT 4,7 9,40
20
40
60
80
10024 h
48 h
*
*
F
sDq-3348 (M)
Célu
las infe
cta
das (
%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Amastigotas por 100 células em células tratadas com veneno de D. quadriceps (A), sDq-2561 (C) ou sDq-3348 (E) após 24 e 48 h de incubação e percentual de células infectadas em células tratadas com veneno de D. quadriceps (B), sDq-2561 (D) ou sDq-3348 (F) após 24 h e 48 h de incubação. O gráfico representa a média ± E.P.M, de experimentos independentes (n= 3). Análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste de Bonferroni, com *p˂0,05.
65
5.2 Avaliação da toxicidade in vitro nas células hospedeiras e índice de
seletividade
A citotoxicidade do veneno total e das dinoponeratoxinas sDq-2561,
sDq-1319, sDq-1503, sDq-2561[12-23] e sDq-3348 foi avaliada em células
hospedeiras LLC-MK2 após 24 horas de exposição a diferentes concentrações
em μM (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78) para dinoponeratoxinas e em
μg/mL (200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56) para o veneno total (Apêndice
A; Figura 39-44). No ensaio com o MTT, o qual detecta viabilidade celular com
base no metabolismo oxidativo, foi possível calcular as IC50 dos peptídeos
testados através da viabilidade celular, que foi calculada em relação ao
controle negativo, cuja absorbância foi considerada 100%. Estes resultados
estão dispostos na tabela 5.
A partir do valor de IC50 obtido de formas tripomastigotas e células
LLC-MK2 foi possível calcular o Índice de Seletividade (IS), que representa a
seletividade da substância ao parasito em relação à célula de mamífero. Este
índice foi calculado pela razão IC50 de LLC-MK2/IC50 de tripomastigotas. Os
resultados também estão dispostos na tabela 5.
Tabela 5. Efeito das dinoponeratoxinas sobre LLC-MK2 e índice de seletividade
sDq-
3348
sDq-
2561
sDq-
1503
sDq-
1319
sDq-
2561
[12-23]
DqV Bz
LLC-
MK2
16,7±2 25,7±2 144±75 >100 >100 222±30 614,8+30
IS 3,5 80,3 19,4 >2,9 - 112,12 2,18
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Valores de IC50 são expressos em μM para dinoponeratoxinas e para
veneno de D. quadriceps (DqV) em μg/mL. Dados são espressos por média ± erro
padrão da média de 3 experimentos independentes. (-) Significa ausência de efeito em
todas as concentrações testadas. IS.: Índice de Seletividade. Bz: Benzonidazol.
66
sDq-2561 mostrou ser o peptídeo mais seletivo e todos os peptídeos
testados se mostraram mais seletivos que o BZ. O veneno total mostrou o
índice de seletividade mais alto de todas as substancias testadas (IS=112).
sDq-2561 (IS=80) foi o peptídeo que demonstrou a seletividade mais próxima
do veneno total. O índice de seletividade de sDq-2561[12-23] não pode ser
calculado por falta de efeito contra formas tripomastigotas nas concentrações
testadas.
5.3 Avaliação do mecanismo de morte celular em cepa Y de T. cruzi
5.3.1 Efeito necrótico e/ou apoptótico em formas epimastigotas de T. cruzi
Com o objetivo de identificar alterações celulares indicativas de
necrose e/ou apoptose induzidas por Dinoponeratoxinas sDq-2561 e sDq-3348,
as células tratadas por 24 horas foram submetidas ao protocolo de marcação
por 7AAD e anexina V -FITC.
No ensaio, os resultados encontrados indicam a ocorrência de
eventos necróticos e apoptóticos da sDq-2561, caracterizados por dupla
marcação no quadrante de cima da direita (8,7%) e células necróticas
caracterizadas por marcação de 7-AAD no quadrante de cima à esquerda
(15,3%) na concentração de duas vezes a IC50 (9,4 µM), conforme
demonstrado na Figura 6A-B.
Entretanto, os resultados encontrados nas células tratadas com sDq-
3348 indicam a ocorrência de apoptose tardia, caracterizada por dupla
marcação no quadrante de cima da direita (11,2%), conforme demonstrado na
figura 7A-B.
67
Figura 6A. Perfil de morte em formas epimastigotas de T. cruzi após 24 h de
incubação com sDq-2561.
7AAd-/AX- 7AAd+/AX- 7AAD-/AX+ 7AAd+/AX+0
20
40
60
80
100
120
CT
4,7 M
9,4 M
*
*
**
Eve
nto
s %
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Perfil de morte em formas epimastigotas após 24 h de incubação com IC50
e dobro da IC50 de sDq-2561. Os dados foram expressos como percentual de eventos
± EPM de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA
e pós-teste de Bonferroni (*p< 0,05 vs. grupo controle). 7AAD-/AX- : células não
marcadas; 7AAD+/AX- : marcado com 7-amino actinomicina D; 7AAD-/Ax+ : marcados
com anexina V; 7AAD+/AX+ : marcado com 7-AAD e Anexina V-PE). CT: Controle.
Figura 6B. Gráficos Density-plot de distribuição das populações celulares submetidas ao ensaio de investigação de mecanismo de morte celular por citometria de fluxo.
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Representação da marcação de Anexina V-PE e 7-AAD. Quadrante inferior esquerdo: células viáveis (não-marcadas); quadrante inferior direito: células marcadas com Anexina V; quadrante superior esquerdo: células marcadas apenas com 7-AAD; quadrante superior direito: células marcadas duplamente com 7-AAD e Anexina V-PE. CT: Controle.
68
Figura 7A. Perfil de morte em formas epimastigotas de T. cruzi após 24 h de
incubação com sDq-3348.
7AAd-/AX- 7AAd+/AX- 7AAd-/AX+ 7AAd+/AX+0
20
40
60
80
100
120CT
23,5 M*
*
Eve
nto
s %
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Perfil de morte em formas epimastigotas após 24 h de incubação com IC50
de sDq-3348. Os dados foram expressos como percentual de eventos ± EPM de três
experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA e pós-teste de
Bonferroni (*p<0,05 vs. grupo controle). 7AAD-/AX- : células não marcadas;
7AAD+/AX- : marcado com 7-amino actinomicina D; 7AAD-/Ax+ : marcados com
anexina V; 7AAD+/AX+ : marcado com 7-AAD e Anexina V-PE). CT: Controle.
Figura 7B. Gráficos Density-plot de distribuição das populações celulares submetidas ao ensaio de investigação de mecanismo de morte celular por citometria de fluxo.
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Representação da marcação de Anexina V-PE e 7-AAD. Quadrante inferior esquerdo: células viáveis (não-marcadas); quadrante inferior direito: células marcadas com Anexina V; quadrante superior esquerdo: células marcadas apenas com 7-AAD; quadrante superior direito: células marcadas duplamente com 7-AAD e Anexina V-PE. CT: Controle.
69
5.3.2 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)
Com o intuito de investigar o envolvimento das espécies reativas de
oxigênio (EROs) no processo de morte celular, formas epimastigotas foram
incubadas com 2´-7´ diclorodihidrofluoesceína diacetato (DCF-DA), que é
permeável à membrana celular e não-fluorescente. Na presença de ROS, este
composto é oxidado no interior da célula e produz um composto fluorescente,
2´, 7´- diclorofluoresceína (DCF), que permanece no meio intracelular (CHEN et
al., 2010).
A análise da produção de EROs foi analisada após 24 horas de
incubação de formas epimastigotas com as dinoponeratoxinas sDq-2561 e
sDq-3348. Nas duas dinoponeratoxinas foi observado um deslocamento à
direita da população tratada com a droga em relação ao grupo controle, as
formas epimastigotas tratadas com sDq-2561 na sua IC50 demonstraram um
aumento de 20% de EROs, enquanto que as tratadas com 2 vezes sua IC50
demonstraram um aumento de quase 900% (Figura 8A-B). Os epimastigotas
tratados com a IC50 de sDq-3348 aumentaram ROS em 600% (Figura 9A-B).
70
Figura 8A - Análise de espécies reativas de oxigênio em epimastigotas
tratados com sDq-2561 por citometria de fluxo.
CT 4,7 9,40
2
4
6
8
10
12
*
*
sDq-2561 (M)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L1)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Valores de fluorescência relativa de formas epimastigotas de T. cruzi tratados com IC50 e o dobro da IC50 de sDq-2561 por 24 horas. Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio (EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle). CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
Figura 8B – Histograma representativo do sinal fluorescente de DCF.
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
71
Figura 9A: Análise de espécies reativas de oxigênio em epimastigotas tratados
com sDq-3348 por citometria de fluxo.
CT 23,340
3
6
9
*
sDq-3348 (M)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L1)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Valores de fluorescência relativa de formas epimastigotas de T. cruzi tratados com IC50 e o dobro da IC50 de sDq-3348 por 24 horas. Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio (EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle). CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
Figura 9B – Histograma representativo do sinal fluorescente de DCF.
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
72
5.3.3 Determinação do potencial transmembrânico mitocondrial (ΔΨm)
Nesse ensaio, o parasito na sua forma epimastigota foi incubado
com rodamina 123 (Rho 123), corante fluorescente específico que se acumula
no espaço intermembrana mitocondrial de células viáveis. Dano no potencial
transmembrânico mitocondrial causa redução do acúmulo de Rho123.
As formas epimastigotas do parasito foram tratadas com o veneno
de D. quadriceps (IC50 e 2xIC50), sDq-2561 (IC50 e 2xIC50) ou sDq-3348
(IC50) e incubados por 24 horas. Após incubação foram analisadas através de
citometria e microscopia confocal. A figura 10 mostra uma diminuição gradual
da emissão de fluorescência em células tratadas com DqV, de 20% em células
tratadas com IC50 e em 75% em células tratadas com 2 x IC50, bem como as
figuras 13B (IC50) e 13C (2 x IC50) comparadas com o controle (Figura 13A).
A figura 11 mostra uma diminuição gradual da emissão de fluorescência em
células tratadas com sDq-2561, de 20% em células tratadas com IC50 e em
80% em células tratadas com 2 x IC50, bem como as figuras 13E (IC50) e 13F
(2 x IC50) comparadas com o controle (Figura 13A). A figura 12 mostra uma
diminuição da emissão de fluorescência em células tratadas com sDq-3348 de
50% em células tratadas com IC50, bem como a figura 13D (IC50) comparada
com o controle (Figura 13A).
Estes dados sugerem que há um dano mitocondrial nesses
parasitos tratados com o veneno e os 2 peptídeos, uma vez que a rodamina se
acumula apenas em mitocôndrias intactas. Estes dados também sugerem o
efeito do sDq-2561 muito semelhante com o efeito do veneno total neste
ensaio.
73
Figura 10: Análise do ΔΨm de epimastigotas tratados com veneno de D.
quadriceps por citometria de fluxo
CT 28,32 56,640.0
0.5
1.0
1.5
*
*
DqV (g/mL)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L2)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Valores de fluorescência relativa de formas epimastigotas de T. cruzi tratados com IC50 e o dobro da IC50 de veneno de D. quadriceps por 24 horas. Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio (EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle). CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
Figura 11: Análise do ΔΨm de epimastigotas tratados com sDq-2561 por
citometria de fluxo
CT 4,7 9,40.0
0.5
1.0
1.5
*
*
sDq-2561 (M)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L2)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Valores de fluorescência relativa de formas epimastigotas de T. cruzi tratados com IC50 e o dobro da IC50 de sDq-2561 por 24 horas. CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas). Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio (EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle).
74
Figura 12: Análise do ΔΨm de epimastigotas tratados com sDq-3348 por
citometria de fluxo
CT 23,340.0
0.5
1.0
1.5
*
sDq-3348 (M)
Rela
tive
flu
ore
scense (
FL2)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Valores de fluorescência relativa de formas epimastigotas de T. cruzi tratados com IC50 e o dobro da IC50 de sDq-3348 por 24 horas. Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio (EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle). CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
75
Figura 13: Fotomicrografia de microscopia confocal de formas
epimastigotas tratadas com veneno de D. quadriceps, sDq-2561 ou sDq-
3348 e marcadas com rodamina.
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Formas epimastigotas de T. cruzi não tratadas (A; controle), tratados com IC50 (B) e o dobro da IC50 (C) de veneno de D. quadriceps ou tratados com IC50 (D) de sDq-3348 ou tratados com IC50 (E) e o dobro da IC50 (F) de sDq-2561 por 24 horas.
76
5.3.4 Avaliação de indução de autofagia
A autofagia (ou autofagocitose) é um processo fisiológico catabólico
celular que dá origem à degradação de componentes da própria célula
utilizando os lisossomos. É um processo estreitamente regulado que
desempenha uma função normal no crescimento celular, diferenciação, e na
homeostase, e ajuda a manter um equilíbrio entre a síntese, a degradação e o
reciclado dos produtos celulares. Consiste também num dos principais
mecanismos para manutenção da homeostase celular em condições adversas
como privação de nutrientes, presença de patógenos e toxinas, sendo um
processo de recuperação celular (FILOMENI; DE ZIO; CECCONI,
2015).
O processo autofágico induz a formação de fagossomos, que são
vesículas ácidas. Assim, pode-se utilizar o corante fluorogênico acidotrópico
laranja de acridina para marcar especificamente esses ambientes celulares,
onde o marcador se deposita.
Neste ensaio, as formas epimastigotas foram tratadas com DqV,
sDq-2561 ou sDq-3348 e após 24 horas de incubação, marcadas com laranja
de acridina. Os resultados não evidenciaram processo autofágico induzido nem
pelo veneno total (Figura 14A-B; IC50 e 2 x IC50), nem por sDq-2561 (Figura
15A-B; IC50 e 2 x IC50) ou sDq-3348 (Figura 16A-B; IC50), uma vez que não
houve diferença significativa na emissão de fluorescência do grupo tratado em
comparação ao não tratado.
77
Figura 14A. Fluorescência relativa de formas epimastigotas tratadas com
veneno de D. quadriceps marcadas com Laranja de Acridina.
CT 28,32 56,640.6
0.8
1.0
1.2
DqV (g/mL)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L3)
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Valores de fluorescência relativa em formas epimastigotas de T. cruzi
tratados com a com IC50 e o dobro da IC50 de veneno de D. quadriceps por 24 horas.
CT:Controle. Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro
padrão médio (EPM) de três experimentos independentes e analisados
estatisticamente por ANOVA e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle).
Figura 14B – Histograma representativo do sinal fluorescente de laranja de
acridina.
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
78
Figura 15A. Fluorescência relativa de formas epimastigotas tratadas com sDq-
2561 marcadas com Laranja de Acridina.
CT 4,7 9,40.7
0.8
0.9
1.0
1.1
sDq-2561 (M)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L3)
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Valores de fluorescência relativa em formas epimastigotas de T. cruzi
tratados com a com IC50 e o dobro da IC50 de sDq-2561 por 24 horas. CT:Controle.
Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio
(EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA
e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle).
Figura 15B – Histograma representativo do sinal fluorescente de laranja de
acridina
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
79
Figura 16A. Fluorescência relativa de formas epimastigotas tratas com sDq-
3348 marcadas com Laranja de Acridina
CT 23,340.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
sDq-3348 (M)
Flu
ore
scência
rela
tiva
(F
L3)
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Valores de fluorescência relativa em formas epimastigotas de T. cruzi
tratados com a com IC50 e o dobro da IC50 de sDq-3348 por 24 horas. CT:Controle.
Os dados foram expressos como intensidade de fluorescência ± erro padrão médio
(EPM) de três experimentos independentes e analisados estatisticamente por ANOVA
e pós-teste de Bonferroni (p< 0,05 vs. grupo controle).
Figura 16B – Histograma representativo do sinal fluorescente de laranja de
acridina
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: CT: Controle (formas epimastigotas não tratadas).
80
5.3.5 Avaliação de alterações morfológicas ultraestruturais
As análises por microscopia eletrônica de varredura em formas
epimastigotas não tratadas e tratadas com veneno de D. quadriceps, sDq-2561
ou sDq-3348 durante 12h de incubação evidenciaram alterações morfológicos
provocados por estes ao parasito, confirmando envolvimentos de processo de
necrose e apoptose no mecanismo de morte do T.cruzi. A figura 17 mostra que
o grupo controle não tratado apresenta parasitos intactos com membranas bem
preservadas. Os parasitos tratados com o veneno de D. quadriceps (Figura 18)
apresentam alterações visíveis de formação de poro na membrana celular e
extravasamento do conteúdo celular, caracterizando necrose (Figura 18 A-B) e
encolhimento celular, caracterizando apoptose (Figura 18 C e D).
Similarmente, os parasitos tratados com sDq-2561 mostraram a formação de
poros na membrana do parasito (Figura 19 A, B e C) com extravasamento de
material celular, bem como encolhimento celular (Figura 19 D e E),
caracterizando o envolvimento necrótico e apoptótico, assim como o veneno
total. Entretanto, os parasitos tratados com sDq-3348 apenas mostraram
encolhimento celular (Figura 20 A, B e C) indicando predominância de
apoptose.Também foi observada a formação de poro em uma célula
previamente encolhida (Figura 20C), indicando apoptose tardia.
81
Figura 17. Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T. cruzi não tratadas.
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Observam-se parasitos com comprimento adequado, corpos alongados
típicos (A) e intactos morfologicamente (B). Barra de escala: 3 e 5 µm.
Figura 18. Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T. cruzi após 12 h de incubação com DqV.
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Observa-se a formação de poro na membrana do parasito com
extravasamento de material celular (A e B), bem como o encolhimento celular (C e D)
após 12 h de incubação com a IC50 (A e C) e o dobro da IC50 (B e D) do veneno de
D. quadriceps de formas epimastigotas de T. cruzi. Barra de escala: 4 e 5 µm.
A B
C D
A B
82
Figura 19. Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T. cruzi após 12h de incubação com sDq-2561.
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Observa-se a formação de poro na membrana do parasito (A, B e C) com
extravasamento de material celular, bem como encolhimento celular (D e E) após 12 h
de incubação com IC50 (A, D e E) e o dobro da IC50 (B e C) de sDq-2561 em formas
epimastigotas de T. cruzi. Barra de escala: 5, 3 e 2 µm.
A B C
D E
83
Figura 20. Fotomicrografia de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de
formas epimastigotas de T.cruzi após 12h de incubação com a sDq-3348.
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Observa-se o encolhimento celular (A, B e C), bem como formação de poro (C) após 12 h de incubação com IC50 de sDq-3348 com formas epimastigotas de T. cruzi. Barra de escala: 5,3 e 2 µm.
A B
D
C
84
5.4 Avaliação da atividade antitumoral in vitro
5.4.1 Avaliação do efeito antiproliferativo de células tumorais
A citotoxicidade das dinoponeratoxinas sDq-2561, sDq-1319, sDq-
1503 e sDq-3348 foi avaliada em células tumorais MDA-MB-231, MDA-MB-468,
MCF7 e HeLa após 24 horas de exposição a diferentes concentrações em (μM:
50; 25; 10; 5; 2,5; 1). Os mesmos peptídeos nas mesmas concentrações foram
testados na célula não tumoral MCF10A. A citotoxicidade foi avaliada no ensaio
com o MTS, onde foi possível calcular as IC50 dos peptídeos testados através
da viabilidade celular, que foi calculada em relação ao controle negativo, cuja
absorvância foi considerada 100%. Estes resultados estão dispostos na tabela
6.
Tabela 6. Efeito de dinoponeratoxinas contra linhagens de câncer de mama e
cervical e linhagem normal de ovário
IC50/24h sDq-2561 sDq-1503 sDq-1319 sDq-3348
MDA-MB-231
8,5±0,9 nr nr nr
MDA-MB-468 - - - 25,0±3
MCF7 - - - -
HeLa 6,9±0,5 - - 22,2±1,5
MCF10A - - - -
Fonte: Elaborada pelo autor.
Legenda: Valores de IC50 são expressos em μM. Dados são espressos por média ±
erro padrão da média de 3 experimentos independentes. MDA-MB-231, MDA-MB-468
e MCF7: linhagens tumorais de mama; HeLa: linhagem tumoral cervical; MCF10A:
linhagem ovariana normal. (-) Significa ausência de efeito em todas as concentrações
testadas; (nr) significa ensaio não realizado.
85
A dinoponeratoxina mais promissora foi a sDq-2561 que mostrou
efeito após 24 horas de incubação com as linhagens tumorais MDA-MB-231 e
HeLa, não mostrando nenhuma toxicidade contra a MCF10A, célula ovariana
saudável.
sDq-3348 também não demonstrou toxicidade na MCF10A,
possuindo efeito contra MDA-MB-468. As outras duas dinoponeratoxinas não
demonstraram efeito contra nenhuma das linhagens testadas e a linhagem
MDA-MB-231 só foi testada contra a sDq-2561, a dinoponeratoxina mais
promissora.
5.4.2 Microscopia de “time-lapse”
O mecanismo de ação da dinoponeratoxina sDq-2561 foi avaliado
através do efeito do tempo na morfologia das células e da marcação por
anexina-V e iodeto de propídeo (PI). Células MBA-MB-231 e Hela foram
incubadas, tratadas com sDq-2561 ou doxorrubicina com suas respectivas
IC50 e marcadas com anexina-V e PI. Em seguida, foram avaliadas em um
equipamento de “Time-Lapse”, onde foram batidas fotos a cada 1 hora.
Os resultados observados com a marcação e a morfologia das
células sugerem que sDq-2561 provoca lise da membrana, confirmada pela
marcação dos núcleos com PI após 1 e 2 horas de incubação em células HeLa
(Figuras 21B e 22B) e MDA-MB-231 (Figuras 23B e 24B), não mostrando
diferença nos tempos posteriores. Células MCF10A foram tratadas com sDq-
2561 em concentrações semelhantes das células tumorais e marcadas, não
mostrando alterações em sua morfologia ou marcação com anexina-V ou PI
nos períodos de incubação testados (Figuras 25B e 26B). Doxorrubicina foi
testada em sua IC50 em células HeLa (Figuras 21B e 22B) e MDA-MB-231
(Figuras 23C e 24C) como controle apoptótico, mas não mostrou efeito na
morfologia ou na marcação com qualquer um dos marcadores. MCF10A
também foi testada com concentrações de 4 µM de doxorrubicina, mas
tampouco mostrou alterações na morfologia ou marcação da célula (Figuras
25C e 26C).
86
Figura 21: Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células HeLa
após 1h de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Células HeLa marcadas por anexina e iodeto de propídeo sem tratamento
(A), tratadas com sDq-2561 (6,9 µM) (B) e tratadas com doxorrubicina (2 µM) (C)
após 1 hora de incubação. Quadrante esquerdo: fotomicrografia sem fluorescência;
Quadrante direito: fotomicrografia com fluorescência. Barra de escala: 75 µm.
A
B
C
87
Figura 22: Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células HeLa
após 2h de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Células HeLa marcadas por anexina e iodeto de propídeo sem tratamento
(A), tratadas com sDq-2561 (6,9 µM) (B) e tratadas com doxorrubicina (2 µM) (C)
após 2 horas de incubação. Quadrante esquerdo: fotomicrografia sem fluorescência;
Quadrante direito: fotomicrografia com fluorescência. Barra de escala: 75 µm.
A
C
B
88
Figura 23: Fotomicrografia de microscopia de time-lapse de células MDA-MB-
231 após 1h de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Células MDA-MB-231 marcadas por anexina e iodeto de propídeo sem
tratamento (A), tratadas com sDq-2561 (8,5 µM) (B) e tratadas com doxorrubicina (4
µM) (C) após 1 hora de incubação. Quadrante esquerdo: fotomicrografia sem
fluorescência; Quadrante direito: fotomicrografia com fluorescência. Barra de escala:
75 µm.
A
B
C
89
Figura 24: Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células MDA-MB-
231 após 2h de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Células MDA-MB-231 marcadas por anexina e iodeto de propídeo sem
tratamento (A), tratadas com sDq-2561 (8,5 µM) (B) e tratadas com doxorrubicina (4
µM) (C) após 2 horas de incubação. Quadrante esquerdo: fotomicrografia sem
fluorescência; Quadrante direito: fotomicrografia com fluorescência. Barra de escala:
75 µm.
A
C
B
90
Figura 25: Fotomicrografia de microscopia de time-lapse de células MCF10A
após 1h de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Células MCF10A marcadas por anexina e iodeto de propídeo sem
tratamento (A), tratadas com sDq-2561 (10 µM) (B) e tratadas com doxorrubicina (4
µM) (C) após 1 hora de incubação. Quadrante esquerdo: fotomicrografia sem
fluorescência; Quadrante direito: fotomicrografia com fluorescência. Barra de escala:
75 µm.
B
C
A
91
Figura 26: Fotomicrografia de microscopia de “time-lapse” de células MCF10A
após 2h de incubação
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Células MCF10A marcadas por anexina e iodeto de propídeo sem
tratamento (A), tratadas com sDq-2561 (10 µM) (B) e tratadas com doxorrubicina (4
µM) (C) após 2 hora de incubação. Quadrante esquerdo: fotomicrografia sem
fluorescência; Quadrante direito: fotomicrografia com fluorescência. Barra de escala:
75 µm.
B
A
C
92
5.4.3 Ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH)
Neste ensaio foi avaliado a liberação da enzima LDH por células
HeLa e MDA-MB-231 tratadas com suas respectivas IC50 de sDq-2561, um
indicativo de morte por necrose. Baseados em resultados anteriores foram
avaliados 2 períodos de tempo de incubação, 1 e 2 horas.
HeLa demonstrou liberação de LDH correspondente a 70% de lise
nas células tratadas com a IC50 de sDq-2561 no período de 1 hora (Figura
27A) e correspondente a 60% de lise nas mesmas condições no período de 2
horas de incubação. Nas células tratadas com metade da IC50 observou-se
aumento significante de liberação de LDH apenas após 2 horas de incubação
(Figura 27B).
Figura 27: Liberação de LDH por células HeLa após 1 e 2 horas de incubação
C+ C- 3,45 6,90
20
40
60
80
100
120
*
A
sDq-2561 (M)
Lib
era
ção d
e L
DH
(%
)
C+ C- 3,45 6,90
20
40
60
80
100
120
*
*
B
sDq-2561 (M)
Lib
era
ção d
e L
DH
(%
)
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Percentual de liberação de LDH de células HeLa tratadas com sDq-2561
(3,45 e 6,9 µM) após uma (A) e duas (B) horas de incubação. O gráfico representa a
média ± E.P.M, de experimentos independentes (n= 3). C+ significa 100% de liberação
de LDH; C- significa liberação de LDH de células não tratadas.
93
MDA-MB-231 demonstrou liberação de LDH correspondente a 40%
de lise nas células tratadas com a IC50 de sDq-2561 no período de 1 hora
(Figura 28A) e correspondente a 50% de lise nas mesmas condições em no
período de 2 horas de incubação (Figura 28B), indicando um efeito máximo no
tempo de 2 horas.
Figura 28: Liberação de LDH por células MDA-MB-231 após 1 e 2 horas de
incubação
C+ C- 4,25 8,50
20
40
60
80
100
120
**
A
sDq-2561 (M)
Lib
era
çã
o d
e L
DH
(%
)
C+ C- 4,25 8,50
20
40
60
80
100
120
*
*
B
sDq-2561 (M)
Lib
era
çã
o d
e L
DH
(%
)
Fonte: Elaborada pelo autor
Legenda: Percentual de liberação de LDH de células HeLa tradadas com sDq-2561
(4,25 e 8,5 µM) após uma (A) e duas (B) horas de incubação. O gráfico representa a
média ± E.P.M, de experimentos independentes (n= 3). C+ significa 100% de liberação
de LDH; C- significa liberação de LDH de células não tratadas.
94
_________DISCUSSÃO
95
6. DISCUSSÃO
Seis a oito milhões de pessoas na América Latina estão infectadas
com o parasito protozoário Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença
de Chagas (BERN, CARYN, 2015; HASHIMOTO; YOSHIOKA, 2012). A doença
de Chagas também está se tornando um problema de saúde pública global,
com números de casos sintomáticos agora detectados dentro das populações
migrantes, particularmente no EUA e Europa, onde as estimativas desses
infectados são 300.000 e 100.000, respectivamente (BERN, CARYN, 2015;
PÉREZ-MOLINA; NORMAN; LÓPEZ-VÉLEZ, 2012; REQUENA-MÉNDEZ et al.,
2015).
Existe uma necessidade urgente de descobrir novos fármacos contra
o T. cruzi devido ao pequeno arsenal terapêutico disponível para tratar a
doença de Chagas. A terapia anti-chagásica no Brasil consiste exclusivamente
em um fármaco, o benzonidazol, que causa efeitos adversos severos. Além
disso, cepas de parasitos resistentes a estes fármacos já são relatadas
(RODRIGUES et al., 2014). Fontes de prospecção de novos produtos
farmacêuticos anti-chagásicos são venenos animais, cujos componentes ou
biotoxinas já foram usados como modelos para desenvolver medicamentos
promissores (HARVEY, 2014).
Algumas biotoxinas demonstraram efeito tripanocida contra todas as
formas morfológicas com alta seletividade para T. cruzi, como a melitina do
veneno de Apis mellifera (ADADE et al., 2013), temporizina e temporizina-1 da
secreção cutânea de anfíbios (SOUZA, ANDRÉ L. A. et al., 2016).
Recentemente, o veneno total da formiga gigante Dinoponera quadripeps foi
avaliado quanto à atividade anti-chagásica contra formas epimastigotas e
tripomastigota de T. cruzi, bem como investigação de mecanismo de ação em
formas epimastigotas, demonstrando envolvimentos necróticos e apoptóticos
(LIMA, 2014). No presente estudo, avaliamos o efeito deste veneno contra as
formas amastigotas de T. cruzi e descobrimos que concentrações de 1,98
µg/mL de veneno eram capazes de reduzir o percentual de células infectadas e
o número de amastigotas/100 células nos períodos de 24 e 48 horas de
incubação, enquanto o benzonidazol mostrou efeito semelhante em
concentrações de 73,4 e 146,8 µg/mL.
96
As formas amastigotas são as responsáveis pela manutenção da
infecção por T. cruzi e o único fármaco utilizado no Brasil contra doença de
Chagas, o benzonidazol, tem baixa penetrabilidade à membrana plasmática,
sendo necessárias altas concentrações do fármaco para atingir os amastigotas
citoplasmáticos. Estas altas doses de benzonidazol não são possíveis, pois
este medicamento tem alta toxicidade e estes fatores contribuem para a falha
do seu tratamento. Portanto, na busca de novas substancias antichagásicas,
além do efeito anti-amastigota, também é necessário um alto índice de
seletividade ao T. cruzi (MORILLA; ROMERO, 2015). O veneno total de D.
quadriceps mostrou um índice de seletividade acima de 100 ao T. cruzi,
tornando-o promissor para pesquisas mais aprofundadas.
Continuamos o trabalho com o DqV, investigando seu mecanismo de
ação. As vias de morte celular em parasitas podem ser analisadas por
abordagens características bioquímicas e alterações morfológicas (ADADE et
al., 2013). Portanto, neste trabalho avaliamos através de citometria de fluxo,
microscopia confocal e microscopia eletrônica de varredura. O efeito necrótico
e apoptótico do DqV que havia sido sugerido por Lima (2014), foi confirmado
através da constatação da diminuição do potencial transmembrânico
mitocondrial e as alterações morfológicas, como encolhimento celular
característico de apoptose e perda da integridade da membrana, característico
de necrose. Uma via de resistência celular, previamente evidenciada em
venenos de insetos com atividade tripanocida (ADADE; CHAGAS; SOUTO-
PADRÓN, 2012), a autofagia, também foi avaliada neste trabalho por citometria
de fluxo e não foi constatada, tornando o veneno de D. quadriceps ainda mais
atrativo para estudos posteriores.
Este veneno já havia sido descrito por suas propriedades
antimicrobianas e efeito em membranas biológicas (LIMA et al., 2014),
chamando atenção para sua composição majoritária de dinoponeratoxinas
(TORRES et al., 2014) Estes peptídeos também já haviam sido avaliados
quanto ao seu efeito antibacteriano, sendo confirmado por Cologna et al.
(2013). Peptídeos antimicrobianos também já foram descritos quanto ao seu
efeito antiparasitário (MCGWIRE; KULKARNI, 2010), tornando as
dinoponeratoxinas atraentes como objeto de estudo.
Então, começamos a buscar quais dinoponeratoxinas poderiam reter
97
a atividade anti-tripanossoma do veneno total de D. quadriceps. A pesquisa
começou tomando informações do trabalho anterior que descreveu o
transcriptoma da glândula de veneno D. quadriceps (TORRES et al., 2014) e
nossa análise preliminar de peptidoma do veneno bruto da formiga (BANDEIRA
LIMA et al., 2017). As dinoponeratoxinas, M-PONTX-Dq4e (Dq-3348), M-
PONTX-Dq3a (Dq-2561) e seus peptídeos maduros derivados, -Dq3b (Dq-
1503) e -Dq3c (Dq-1319), foram selecionados para síntese e análise biológica.
As DnTxs foram testadas contra as formas evolutivas mais
relevantes do ciclo de T. cruzi: epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas.
Contra o epimastigotas, sDq-2561 e sDq-3348, que têm pesos moleculares e
cargas líquidas mais altas do que sDq-1319 e sDq-1503, apresentaram
melhores atividades (IC50s inferiores) do que esses peptídeos curtos. Além
disso, a IC50 de sDq-2561 contra os epimastigotas após 24 h de tratamento foi
mais de 46 vezes menor do que a do tratamento padrão benzonidazol, o qual
não teve atividade melhor do que sDq-2561 comparando as IC50s mesmo
após 72 h de incubação.
Os peptídeos também foram testados contra as formas
tripomastigota e amastigota. Estas formas de desenvolvimento posteriores
foram obtidas após incubação dos tripomastigotas com as células hospedeiras
LLC-MK2, que foram utilizadas como modelo celular para infecção por T. cruzi
(ANDREWS; COLLI, 1982; ZINGALES et al., 1997). Curiosamente, após 24 h
de tratamento, enquanto as IC50s contra tripomastigotas e epimastigotas em
benzonidazol eram basicamente as mesmas, a concentração de sDq-2561
capaz de matar 50% dos tripomastigotas foi mais do que dez vezes inferior à
IC50 contra os epimastigotas. A susceptibilidade aumentada dos
tripomastigotas aos peptídeos pode estar relacionada à sobre-expressão de
componentes negativamente carregados da membrana celular de T. cruzi,
como glicoproteínas de ácido siálico e mucina (DE SOUZA, WANDERLEY; DE
CARVALHO; BARRIAS, 2010), que facilitam a interação hospedeiro-parasito,
mas também pode atrair peptídeos antimicrobianos catiônicos para a
membrana do parasito. sDq-3348, sDq-1503 e sDq-1319 também
demonstraram IC50s contra os tripomastigotas inferiores as dos epimastigotas.
No entanto, estes pequenos fragmentos de peptídeos DnTx
novamente apresentaram desempenho inferior a sDq-2561 e sDq-3348 contra
98
T. cruzi. Uma explicação para tal variação na atividade anti-T.cruzi depende da
estrutura e características físico-químicas de sDq-2561 e sDq-3348 que são
menos hidrofóbicos, mas mais positivamente carregados do que sDq-1503 e
sDq-1319.
Apesar de todos os DnTxs formarem hélices de diferentes
comprimentos, os peptídeos mais curtos sDq-1503 e sDq-1319 exibem altos
valores de hidrofobicidade e momento hidrofóbico, mas cargas líquidas mais
baixas, que parecia ser crítico para a interação com as membranas carregadas
negativamente do parasito. Além disso, sabe-se que grandes valores do
momento hidrofóbico (μH) de peptídeos são indicativos da formação da hélice
anfifílica e dos momentos helicoidais altos e grandes hidrofobicidades médias
são indicativas de peptídeos que são membranolíticos (EISENBERG; WEISS;
TERWILLIGER, 1982).
Contra os amastigotas, sDq-2561 e sDq-3348 em suas respectivas
IC50s ou 2 x IC50s de tripomastigotas reduziram significativamente o número
de parasitos por 100 células após 24 ou 48 h de tratamento. Entretanto, o
parâmetro de percentual de células infectadas, sDq-2561 mostrou efeito
apenas no período de 24 horas e sDq-3348 só mostrou efeito no período de 48
horas. O DqV mostrou efeito nos dois parâmetros e em ambos os tempos, o
que sugere que estes dois peptídeos são os responsáveis pelo efeito do
veneno total, sDq-2561 mostrando-se mais efetivo em tempos curtos e sDq-
3348 em tempos mais longos nesta forma proliferativa.
sDq-2561 demonstrou IC50 inferiores ao sDq-3348 contra
epimastigotas e tripomastigotas, sugerindo que uma maior hidrofobicidade
tornou o sDq-2561 mais ativo contra T. cruzi do que o sDq-3348, mesmo que o
primeiro peptídeo tivesse a menor propensão a adotar estruturas em α-hélice
(μH mais baixas). Tais achados estão de acordo com estudos que relataram
peptídeos pouco estruturados com atividades antimicrobianas (FALCAO et al.,
2015; PAPO et al., 2002; YACOUB et al., 2016).
sDq-2561 foi o único peptídeo testado enquadrado em dois critérios
importantes estabelecidos pelas diretrizes da OMS/TDR para um candidato
antichagásico ser considerado um sucesso (NWAKA; HUDSON, 2006): índice
de seletividade acima de 50 (IS = 80,3) e IC50 em formas tripomastigotas
abaixo de 1 μg/mL (0,32 μM, isto é, ≈ 0,82 μg/mL). Curiosamente, esses
99
valores de sDq-2561 (IS e IC50 em tripomastigotas) foram próximos dos
resultados obtidos em veneno total de D. quadriceps (SI = 100 e IC50=1,98
μg/mL), com a óbvia vantagem de ser um composto puro derivado de veneno,
sem o coquetel potencialmente tóxico de substâncias que são nocivas para
células e organismos eucariotos saudáveis.
Assim, o mecanismo de ação de sDq-2561 também foi avaliado em
formas epimastigotas. Estas formas são proliferativas, bem como as
amastigotas, e não exigem células hospedeiras para se desenvolverem, sendo
mais fáceis de manter que as tripomastigotas. Foram realizados os mesmos
ensaios que no veneno total, análises de citometria de fluxo e microscopia
eletrônica de varredura. A citometria mostrou que os epimastigotas tratados
com 2 x IC50 de sDq-2561 apresentou um aumento significativo na entrada do
marcador de DNA 7-AAD, impermeável em células intactas, comparado com
parasitos não tratados, indicando que a membrana da célula de T. cruzi foi
danificada. Além disso, após o tratamento com sDq-2561 na sua IC50 ou 2 x
IC50, promoveu o aumento de EROs intracelular, como evidenciado pelo
reagente DCF e distúrbio do potencial transmembrânico mitocondrial,
fornecendo evidências bioquímicas de que a principal via de morte celular
induzida por este peptídeo em T. cruzi é necrose. Finalmente, imagens de MEV
confirmaram que a morte celular foi predominantemente necrótica, mostrando
ruptura da integridade da membrana de epimatigotas com a presença de poros
e poucas evidências de apoptose (encolhimento celular). Novamente, sDq-
2561 simula em parte o efeito antichagásico do veneno total de D. quadriceps,
que mostrou necrose e apoptose em seu mecanismo de ação.
sDq-2561 mostrou alguns pontos de clivagem, na posição do
aminoácido 13, gerando o peptídeo sDq-1503 e na posição do aminoácido 11,
gerando o peptídeo sDq-1319. sDq-1503 demonstrou baixo efeito tripanocida
sobre formas epimastigotas (IC50/24h= 48,8 µM) e em tripomastigotas (IC50=
7,4 µM). sDq-1319 demonstrou uma baixa ação tripanocida em formas
tripomastigotas (IC50= 34,8 µM) e nenhum efeito sobre formas epimastigotas
nas concentrações testadas. Assim surgiu a dúvida se o fragmento
complementar a sDq-1319 poderia ser o responsável pelo efeito do peptídeo
parental. Este fragmento C-terminal foi sintetizado e nomeado sDq-2561[12-
23], mas não demonstrou nenhum efeito em formas tripomastigota e
100
epimastigotas. Isto poderia explicar porque o efeito do sDq-2561 em
amastigotas é melhor em tempos mais curtos do que longos. Este peptídeo
pode ser inativado por clivagem dentro das células após 24 horas, e como seus
pedaços possuem pouco ou nenhum efeito, em 48 horas pode ocorrer uma
recuperação, sendo necessária a adição de peptídeo novo a cada 24 horas.
Estes fragmentos, embora não tenham efeito tripanocida, têm menor toxicidade
do que o peptídeo original, sugerindo segurança quanto a seus produtos de
clivagem.
A via da morte celular mediada por necrose também tem sido
observada com o benzonidazol (BANDEIRA et al., 2017) e com outros
peptídeos, incluindo batroxicidina (MELLO et al., 2017) e crotalicidina
(BANDEIRA et al., 2017), mas diferentes mecanismos, como a apoptose e
autofagia, podem ocorrer em biotoxinas, como no caso da melitina de veneno
de abelha (ADADE et al., 2013).
Embora sDq-2561 possua a melhor potência e índice de
seletividade, também avaliamos o mecanismo de ação do sDq-3348, já que
ainda assim possui um índice de seletividade maior que o benzonidazol e
demonstrou contra as duas formas proliferativas de T. cruzi (epimastigotas e
amastigotas) um efeito melhor com períodos mais longos de exposição,
indicando uma via de ação lenta.
A apoptose é um mecanismo lento de morte celular, caracterizado
por externalização de fosfatidilserina, encolhimento celular, blebbing, formação
de corpos apoptóticos e condensação e fragmentação nuclear (VANDEN
BERGHE et al., 2013). Então, através de análise de citometria de fluxo e
microscopia eletrônica de varredura também avaliamos o mecanismo de morte
de sDq-3348.
Neste estudo, o aumento da marcação de formas epimastigotas
com 7AAD e AX por citometria de fluxo indicou necrose secundária ou
apoptose tardia. A via apoptótica in vitro tem sido relacionada ao aumento da
produção de EROs e diminuição nos níveis de potencial transmembrana
mitocondrial (JIANG et al., 2013). Essas duas alterações também foram
demonstradas neste estudo. Para elucidar o mecanismo de ação, realizou-se
a análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura, que mostrou
encolhimento celular em todas as imagens e, em alguns, presença de poros
101
após 12 horas de incubação. Estes dados indicam uma via apoptótica, que
evolui para a necrose secundária.
Na ausência de fagocitose, as células apoptóticas acabam por
perder a integridade da membrana plasmática e avançar para a necrose
secundária, caracterizada por inchaço osmótico e permeabilização da
membrana plasmática. Nos organismos vivos, as células apoptóticas são
rapidamente fagocitadas por células vizinhas, principalmente macrófagos, e em
um ambiente saudável essa ação pode acontecer tão rapidamente que ocorre
antes da fragmentação em corpos apoptóticos. A fagocitose resulta na
remoção da célula alvo, degradando o material resultante. A membrana
plasmática é mantida durante a apoptose e, portanto, os conteúdos celulares
degradantes são encapsulados e a liberação de citocinas é evitada, resultando
em uma resposta imune mínima ao evento (VANDEN BERGHE et al., 2013).
Em contraste, a membrana plasmática é rompida em outros tipos de
morte celular, causando a liberação de padrões moleculares associados ao
dano, resultando em inflamação e uma forte resposta imune (NAGATA;
HANAYAMA; KAWANE, 2010). A tolerância imunológica diferencia ainda a
apoptose e outros processos de morte celular, tornando-se a via apoptótica
ideal para novos agentes quimioterápicos.
O aumento das vesículas ácidas pode estar relacionado ao
mecanismo autofágico (KESSLER et al., 2013). Autofagia é um processo
catabólico voltado para a reciclagem de componentes celulares e organelas
danificadas em resposta a diversas condições de estresse. A autofagia pode
representar um mecanismo de resistência ao estresse oxidativo induzido por
drogas quimioterapêuticas (FILOMENI; DE ZIO; CECCONI, 2015). O sDq-3348
provoca estresse oxidativo, mas não provoca aumento nas vesículas ácidas
(autofagia) avaliadas por citometria de fluxo, não mostrando evidência de
resistência parasitária.
Em conjunto, as DnTxs foram avaliadas para encontrar os peptídeos
que poderiam reproduzir o efeitos antichagásicos de veneno total de D.
quadriceps. O peptídeo sDq-2561 foi o mais promissor em relação ao índice de
seletividade e IC50 em formas tripomastigotas, possuindo mecanismo de ação
semelhante ao do benzonidazol, fármaco utilizado como tratamento padrão no
Brasil. Entretanto, sDq-3348 mostrou o mecanismo de ação mais promissor,
102
embora possua baixo índice de seletividade. Estes dois peptídeos foram
capazes de inibir todas as formas evolutivas de T. cruzi, incluindo amastigotas
intracelulares. Assim, sDq-2561 e sDq-3348 demonstram potencial como
modelo para o desenvolvimento de novos medicamentos ou adjuvantes para o
arsenal quimioterapêutico e estratégias clínicas para tratar a doença de
Chagas.
Mesmo as Dntxs possuindo um efeito muito promissor contra
doenca de Chagas, contra o câncer não mostraram grandes vantagens nas
linhagens tumorais testadas neste trabalho. Os PAMs mostram diferenças na
especificidade e atividade em membranas celulares. Os mecanismos de
remodelação da membrana mediada por este tipo de peptídeos dependem
dos tipos de lipídios que compõem a bicamada, uma vez que tais
mecanismos podem variar com a carga do grupo lipídico polar e com o
comprimento de suas cadeias de acila, possuindo propriedades diferentes
nos diferentes tipos de células, por estas possuirem diferentes composições
(SEELIG, 2004). As diferentes composições das membranas dos parasitos e
das células tumorais poderia explicar a alta seletividade ao T. cruzi e a baixa
seletividade as linhagens tumorais testadas.
Embora o peptídeo sDq-3348 tenha mostrado efeito apoptótico em
parasitos, este não se mostrou seletivo às linhagens tumorais testadas, com
IC50s acima de 20 µM em duas das quatro linhagens celulares testadas,
enquanto que em células LLC-MK2 sua IC50 foi abaixo de 20 µM. Os
peptídeos sDq-1319 e sDq-1503 não mostraram efeito antiproliferativo em
nenhuma concentração testada em nenhuma linhagem tumoral utilizada. O
único que se mostrou promissor foi o sDq-2561 que demonstrou efeito em duas
linhagens tumorais com IC50s abaixo de 10 µM. Assim, estudamos o
mecanismo de morte deste peptídeo nas linhagens sensíveis.
sDq-2561 mostrou efeito em células de câncer de mama (MDA-MB-
231) e de câncer cervical (HeLa). Entretanto, o mecanismo de ação envolvido
em seu efeito mostrou ampla marcação com iodeto de propídeo e liberação
máxima da enzima LDH em períodos curtos de incubação (1 e 2 horas).
Estes resultados indicam necrose (VANDEN BERGHE et al., 2013), um
mecanismo que não é ideal para um agente quimioterápico contra o câncer
(HANAHAN, DOUGLAS; WEINBERG, 2011).
103
A morte celular necrótica libera sinais pró-inflamatórios no
microambiente do tecido circundante ao tumor, ao contrário da apoptose e
autofagia. Como consequência, células necróticas podem recrutar células
inflamatórias do sistema imunológico, cuja função é examinar a extensão dos
danos nos tecidos e remover os restos associados à necrose. No contexto da
neoplasia, no entanto, múltiplas linhas de evidência indicam que as células
inflamatórias imunes podem agir ativando a progressão de tumores, uma vez
que tais células são capazes de promover a angiogênese. Além disso,
células necróticas podem liberar fatores regulatórios bioativos, como IL-1a,
que podem estimular diretamente células viáveis vizinhas a proliferar, com o
potencial, mais uma vez, de facilitar a progressão neoplásica
(GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010). Consequentemente, a morte
celular necrótica, que aparentemente é benéfica em contrabalançar a
hiperproliferação associada ao câncer pode, em última análise, pode ser
mais prejudicial do que benéfica (HANAHAN, DOUGLAS; WEINBERG,
2011).
Contudo, sDq-2561 e sDq-3348 demonstraram grande potencial
biotecnológico como peptídeos bioativos e mesmo não mostrando grandes
vantagens contra as linhagens de câncer mama e cervical testadas, estes
peptídeos podem apresentar efeitos contra linhagens de outros tipos de
câncer com mecanismos e seletividades diferentes. Além disso, análises
racionais podem melhorar a seletividade e diminuir a toxicidade destas
moléculas, abrindo novas possibilidades (DRIN; ANTONNY, 2010).
104
_________CONCLUSÃO
105
7. CONCLUSÃO
O veneno de Dinoponera quadriceps inibiu as formas amastigotas de
cepa Y de T. cruzi com alto índice de seletividade (112), por mecanismos
necróticos e apoptótocos envolvendo aumento de espécies reativas de
oxigênio, perda de potencial transmembrânico mitocondrial.
As dinoponeratoxinas sDq-2561 e sDq-3348 apresentaram efeito
contra as três formas avaliadas de T. cruzi. sDq-1319, sDq-1503 não
demonstraram efeitos contra as formas amastigotas e sDq-2561[12-23] não
demonstrou toxicidade em nenhuma forma testada.
A dinoponeratoxina sDq-2561 demonstrou o efeito mais semelhante
ao do veneno total, com alto índice de seletividade (80) e mecanismo de morte
predominantemente necrótico.
A dinoponeratoxina sDq-3348 não demonstrou alta seletividade, mas
demonstrou um mecanismo de morte apoptótico sem indícios de autofagia.
No efeito antitumoral, sDq-2561 e sDq-3348 mostraram efeito em
linhagens de câncer de mama e cervical.
sDq-3348 não mostrou seletividade às linhagens tumorais testadas,
enquanto sDq-2561 mostrou seletividade e mecanismo de morte necrótico nas
linhagens sensíveis.
Os peptídeos sDq-1319 e sDq-1503 não mostraram efeitos
antitumorais nas linhagens de câncer de mama e cervical estudadas neste
trabalho.
106
________REFERÊNCIAS
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126
__________APÊNDICE A
127
Figura 29. Efeito citotóxico da sDq-2561 sobre a forma epimastigota de T.cruzi.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
****
*
A
sDq-2561 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
**
* *
B
sDq-2561 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
*
*
* * *
C
sDq-2561 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24(A), 48(B), e 72h(C) de tratamento com sDq-2561.
Análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com
*p˂0,05.
128
Figura 30: Efeito citotóxico da sDq-3348 sobre a forma epimastigota de T.cruzi.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
*
A
sDq-3348 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
**
* **
*
B
sDq-3348 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
* *
*
*
C
sDq-3348 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24(A), 48(B), e 72h(C) de tratamento com sDq-3348.
Análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com
*p˂0,05.
129
Figura 31: Efeito citotóxico da sDq-1503 sobre a forma epimastigota de T.cruzi.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
* *
A
sDq-1503 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
B
sDq-1503 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
C
sDq-1503 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24(A), 48(B), e 72h(C) de tratamento com sDq-1503.
Análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com
*p˂0,05.
130
Figura 32: Efeito citotóxico da sDq-1319 sobre a forma epimastigota de T.cruzi.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
A
sDq-1319 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
B
sDq-1319 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
C
sDq-1319 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24(A), 48(B), e 72h(C) de tratamento com sDq-1319.
Análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com
*p˂0,05.
131
Figura 33: Efeito citotóxico da sDq-2561[12-23] sobre a forma epimastigota de
T.cruzi.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
A
sDq-2561[12-23] (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
B
sDq-2561[12-23] (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
C
sDq-2561[12-23] (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24(A), 48(B), e 72h(C) de tratamento com sDq-2561[12-
23]. Análise estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com
*p˂0,05.
132
Figura 34: Efeito citotóxico da sDq-2561 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.
CT 0,097 0,19 0,39 0,78 1,56 3,120
20
40
60
80
100
120
***
*
*
sDq-2561 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-2561. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
Figura 35: Efeito citotóxico da sDq-3348 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.
CT 0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 250
20
40
60
80
100
120
*
*
*
*
sDq-3348 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-3348. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
133
Figura 36: Efeito citotóxico da sDq-1503 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.
CT 0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 250
20
40
60
80
100
120
*
*
*
sDq-1503 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-1503. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
Figura 37: Efeito citotóxico da sDq-1319 sobre a forma tripomastigota de
T.cruzi.
CT 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
*
*
sDq-1319 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-1319. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
134
Figura 38: Efeito citotóxico da sDq-2561[12-23] sobre a forma tripomastigota
de T.cruzi.
CT 0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 250
20
40
60
80
100
120
*
*
*
sDq-1503 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-2561[12-23]. Análise
estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
Figura 39: Efeito citotóxico de DqV sobre LLC-MK2.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 100 2000
20
40
60
80
100
120
*
DqV (g/mL)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com DqV. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
135
Figura 40: Efeito citotóxico da sDq-2561 sobre LLC-MK2.
CT 0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 25 500
20
40
60
80
100
120
*
*
sDq-2561 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-2561. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
Figura 41: Efeito citotóxico da sDq-3348 sobre LLC-MK2.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
**
*
sDq-3348 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-3348. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
136
Figura 42: Efeito citotóxico da sDq-1503 sobre LLC-MK2.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
*
sDq-1503 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-1503. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
Figura 43: Efeito citotóxico da sDq-1319 sobre LLC-MK2.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
sDq-1319 (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-1319. Análise estatística foi
realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
137
Figura 44: Efeito citotóxico da sDq-2561[12-23] sobre LLC-MK2.
CT 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 1000
20
40
60
80
100
120
sDq-2561[12-23] (M)
Via
bili
dade c
elu
lar
(%)
Fonte: Elaborada pelo autor Legenda: Os dados foram expresso em média ± E.P.M, de experimentos
independentes (n= 3), após 24h de tratamento com sDq-2561[12-23]. Análise
estatística foi realizada por ANOVA, seguida por teste Bonferroni, com *p˂0,05.
138
__________APÊNDICE B
lable at ScienceDirect
Toxicon 120 (2016) 128e132
Contents lists avai
Toxicon
journal homepage: www.elsevier .com/locate/ toxicon
Short communication
Antiparasitic effect of Dinoponera quadriceps giant ant venom
Danya Bandeira Lima a, Paloma Le~ao Sousa a, Alba Fabíola Costa Torres a,Klinger Antonio da França Rodrigues b, Clarissa Perdig~ao Mello a,Ramon R�oseo Paula Pessoa Bezerra de Menezes c, Louise Donadello Tessarolo a,Yves Patric Quinet d, M�arcia Rosa de Oliveira e, Alice Maria Costa Martins a, *
a Department of Clinical and Toxicological Analysis, Faculty of Pharmacy, Federal University of Ceara, Fortaleza, Ceara, Brazilb Post-graduate Program in Natural Products and Synthetic Bioactives, Health Sciences Center, Federal University of Paraíba, Joao Pessoa, Paraíba, Brazilc Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal University of Ceara, Fortaleza, Ceara, Brazild Institute of Biomedical Sciences, State University of Ceara, Fortaleza, Ceara, Brazile Department of Molecular Biology, Center of Exact Sciences and of the Nature, Federal University of Paraiba, Jo~ao Pessoa, Paraíba, Brazil
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 23 June 2016Received in revised form10 August 2016Accepted 11 August 2016Available online 13 August 2016
Keywords:Dinoponera quadricepsTrypanosoma cruziLeshmania amazonensisVenom
* Corresponding author.E-mail address: [email protected] (A.M.C. M
http://dx.doi.org/10.1016/j.toxicon.2016.08.0080041-0101/© 2016 Elsevier Ltd. All rights reserved.
a b s t r a c t
Neglected tropical diseases (NTD) are treated with toxic therapy of limited efficacy. Previously, westudied the antimicrobial effect of Dinoponera quadriceps venom (DqV) against bacteria. To continue thestudy, we report in this short communication the antimicrobial effect of DqV against Leishmania ama-zonensis and Trypanosoma cruzi. DqV inhibits the promastigote forms of L. amazonensis and all T. cruzidevelopmental forms, with low toxicity in host cells. DqV causes cell death in T. cruzi through necroticand apoptotic mechanisms observed by staining the cells with annexin V-FITC (AX) and propidium io-dide (PI), loss of mitochondrial membrane potential by flow cytometry analyses and confocal microscopyand morphological alterations, such as loss of membrane integrity and cell shrinkage by scanningelectron microscopy (SEM). In conclusion, we suggest there is an antimicrobial effect also on parasites.
© 2016 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
The World Health Organization (WHO) estimates that theNeglected Tropical Diseases (NTDs) affect proximally 37% of theworld's poorest individuals (WHO, 2010b; Berkowitz et al., 2015).The NTDs cause significant disfigurement, morbidity and mortality,accounting for 1% of the global burden of disability-adjusted lifeyears lost in 2010 (Hotez et al., 2014).
Chagas disease and Leishmaniosis are the first and third mostprevalent NTDs in the world, respectively. It is estimated that 7 to 8million people are infected with T. cruzi and 1.3 million are infectedwith Leishmania (WHO, 2010b; WHO, 2013). The treatment ofparasitic diseases is of limited effectiveness and has severe collat-eral effects (WHO, 2010a; Murcia et al., 2012; Silva et al., 2014).Therefore, several studies have sought to discover novel antipara-sitic substances from natural sources (Passero et al., 2007; Adadeet al., 2011, 2013; 2014).
Recently, our group produced a Dinoponera quadriceps venom
artins).
gland cDNA library to investigate the toxin repertoire present in thevenom used in this study. This venom has 30% of dinoponeratoxinsin its composition and has high homology with ponericins, anti-microbial peptides (Torres et al., 2014). Antimicrobial peptides fromvenoms of many organisms have shown antiparasitic effect onLeishmania and Trypanosoma genera (Mcgwire and Kulkarni,2010). Recently, we demonstrated the antimicrobial action of D.quadriceps venom against bacteria (Lima et al., 2014). To continuethe study of the antimicrobial effect of D. quadriceps venom (DqV),we report in this short communication its action on Trypanosomacruzi and Leishmania amazonensis.
2. Material and methods
2.1. Venom
D. quadriceps venom (DqV) was obtained as described by Sousaet al. (2012). For the experimental assays, final concentrations of200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56 and 0.78 mg/mL were utilized,with Sterile PBS being used as negative control (pH 7.4).
D.B. Lima et al. / Toxicon 120 (2016) 128e132 129
2.2. Effect of D. quadriceps venom on promastigote forms of L.amazonensis
Promastigote forms of L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) werecultivated in NNN/Schneider medium (SigmaeAldrich™, St. Louis,USA) supplemented with 20% of fetal bovine serum (FBS) and an-tibiotics with different concentrations of DqV and amphotericin B(Crist�alia, S~ao Paulo, Brazil) at 26 �C for 72 h. Parasite growth in-hibitionwas quantified in a Neubauer chamber (Torres et al., 2010).
2.3. Effect of D. quadriceps venom on epimastigote forms of T. cruzi
Epimastigote forms of T. cruzi strain Y were plated in LiverInfusion Tryptose medium supplemented with antibiotics and 10%of FBS with different concentrations of DqV and Benznidazole (Bz),incubated at 28 �C for 24 and 48 h. Parasite growth inhibition wasquantified in a Neubauer chamber (Abe et al., 2002; Gonçalveset al., 2002).
2.4. Effect of D. quadriceps venom on trypomastigote forms of T.cruzi
The trypomastigote forms of T. cruzi obtained by infectingLLCMK2 cells, were incubated at 37 �C in an atmosphere with 5%CO2 in DMEM medium (Vitrocell, S~ao Paulo, Brazil) supplementedwith antibiotics and 2% of FBS (Aparicio et al., 2004). Cells wereincubated with different concentrations of DqV and Bz for 24 h.Parasite growth inhibition was quantified in a Neubauer chamber(Abe et al., 2002; Gonçalves et al., 2002).
2.5. Cytotoxicity to mammalian cells (MTT assay)
Cell viability was also measured using a standard MTT assay(Mosmann, 1983). LLC-MK2 cells were plated in the DMEM me-dium, treated with different concentrations of DqV and incubatedat 37 �C for 24 h. MTT (Amresco, Ohio, USA; 5 mg/mL) was addedand the cells were incubated for 4 h, when 10% Sodium dodecylsulphate (SDS; Vetec, S~ao Paulo, Brazil) was added to solubilize theformazan product. Cell viability measurements were performed at570 nm on a microplate reader (Biochrom® Asys Expert Plus).Selectivity index (SI) was calculated by the ratio of cytotoxic/try-panocidal activity (Gall�e et al., 2013).
2.6. Effect of D. quadriceps venom on amastigote forms of T. cruzi
LLC-MK2 cells were seeded in 24-well plates containing glasscoverslips (13-mm diameter) cultivated in DMEM supplementedwith 10% FCS, and maintained at 37 �C in a 5% CO2 atmosphere for24 h. Cells were infected with trypomastigote forms (parasite: hostcell ratio of 20:1) in DMEMmedium containing 2% FCS. After 48 h ofinfection, the non-internalized parasites were removed and thecells were cultivated in 2% FCS DMEMmediumwith or without DqV(1.98 and 3.96 mg/mL) and Bz (73.4 and 146.8 mg/mL). The coverslipswere collected up to 24 h and 48 h, washed with PBS, fixed inBouin's solution and stained with Giemsa (Adade et al., 2011). Thepercentage of infected cells and the number of intracellular amas-tigotes per 100 cells was determined by counting 300 cells intriplicate.
2.7. Cytometry flow analysis
Epimastigote forms treated with IC50 of DqV (28.32 mg/mL)incubated for 24 h were stained with FITC-conjugated to annexinV/propidium iodide according to the manufacturer's instructions (BDPharmigen, California, USA). The population of AX-PI viable cells
was evaluated. Mitochondrial transmembrane potential andswelling of reservosomes were also determined. Epimastigoteforms were treated with IC50 (28.32 mg/mL) and 2 x IC50 (56.64 mg/mL) of DqV for 24 h and stained with Rhodamine 123 (10 mg/mL)and Acridine Orange (5 mg/mL) according to the manufacturer'sinstructions (SigmaeAldrich™, St. Louis, USA). The results wereestablished by determining the fold change (treated/non-treatedcell ratio) of the geometric mean of fluorescence. At the end of eachincubation period, the cells were washed and submitted tocytometry flow analysis. All data were collected in a FACSCalibursystem and analyzed using the Cell Quest software (Becton-Dick-inson, California, USA).
2.8. Confocal microscopy
Epimastigote forms were incubated with IC50 (28.32 mg/mL)and 2 x IC50 (56.64 mg/mL) of DqV for 24 h at 28 �C. The parasiteswere washed and labeled with Rhodamine 123 (10 mg/mL) toobserve the mitochondrial transmembrane potential. At the end ofthe incubation time, the cells were washed and the slides weremounted. The cells were analyzed under a LSM 710 confocal laserscanning microscope (Zeiss, Germany).
2.9. Scanning electron microscopy (SEM)
Epimastigotes forms were treated with IC50 (28.32 mg/mL) and2 x IC50 (56.64 mg/mL) of DqV for 12 h. After incubation, the par-asites were fixed for 2 h with 2.5% glutaraldehyde (Electron Mi-croscopy Sciences, Hatfield, Pennsylvania) washed, dehydrated,dried with CO2, coated with gold and observed in a FEG Quanta 450scanning electron microscope (FEI, Oregon, USA). Digital imageswere acquired and stored in a computer.
2.10. Statistical analysis
All tests were performed in triplicate. The statistical analysiswas performed using the GraphPad Prism 5 program (GraphPadSoftware, San Diego, CA, USA). IC50 values were determined bynonlinear regression. Datawere analyzed using one-way analysis ofvariance (ANOVA) followed by Dunnett's post-test. Significancewasdefined as *p < 0.05.
3. Results and discussion
Venom components are of great biotechnological interest, asthey are useful to identify new therapeutic targets and establishmolecular models for the development of new drugs, withimproved efficacy and less toxicity (Harvey, 2014).
Benznidazole and nifurtimox are the only drugs currently beingused to treat Chagas' disease; both are highly toxic and rarelybeneficial during the chronic phase, with a cure rate of approxi-mately 20% (Urbina and Docampo, 2003). Meglumine antimoniate,sodium stibogluconate, amphotericin B, pentamidine, and milte-fosine are the current therapeutic options used to treat Leish-maniasis, which are also highly toxic (D'Annessa et al., 2015).
Leishmanicidal activity by animal venom has been demon-strated (Passero et al., 2007; Pinto et al., 2014). In this study, thegrowth of promastigote forms of L. amazonensis was inhibited byDqVwith IC50 of 63.76 ± 20 mg/mL whereas IC50 of amphotericin Bwas 0.18 ± 0.2 mg/mL after 72 h of incubation.
The treatment of T. cruzi epimastigotes with DqV resulted indose-dependent growth inhibition, with an IC50/24 h treatment of28.32± 5 mg/mL and IC50/48 h of 20.82 ± 5 mg/mL, while BZ showedIC50/24 h treatment of 56.76 ± 15 mg/mL and IC50/48 h of15.91 ± 3 mg/mL. Treatment of trypomastigote forms also resulted
Fig. 1. Cytotoxicity effect of Dinoponera quadriceps venom on LLC-MK2 cells in MTT assay (A). Effect of D. quadriceps venom on intracellular amastigotes in amastigote/100 cells at24 and 48 h of incubation (B). Effect of D. quadriceps venom on intracellular amastigotes in a percentage of infected cells at 24 and 48 h of incubation (C). Evaluation of the cell deathpathway of epimastigote forms treated with D. quadriceps venom measured by annexin V (AX) and propidium iodide (PI) staining and detected by flow cytometry (FL1) (D).Evaluation of mitochondrial transmembrane potential (DJm) of epimastigote forms treated with D. quadriceps venom measured by Rhodamine 123 staining with flow cytometryanalysis (FL2) (E). Evaluation of mitochondrial transmembrane potential (DJm) of epimastigote forms treated with D. quadriceps venommeasured by Rhodamine 123 staining witha confocal laser scanning microscope (FL2); Control (F); Cells treated with IC50 of DqV (28.32 mg/mL) (G); Cells treated with 2xIC50 of DqV (56.64 mg/mL) (H). The data represent themean ± S.E.M of at least three independent experiments. *Significantly different from the control group (One-way analysis of variance and Dunnett's post-test, *p < 0.05).
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in dose-dependent growth inhibition, with an IC50 of DqV of1.98 ± 0.23 mg/mL whereas the IC50 of BZ was 73.40 ± 20 mg/mL.Considering these results, we continued the experiments with T.cruzi, the most sensitive parasite.
Venoms from hymenopteran insects have also been reported asshowing trypanocidal activity (Adade et al., 2012, 2013). In thepresent study, D. quadriceps venom was able to kill all T. cruzidevelopmental forms and the toxicity evaluated in LLC-MK2 cellsshowed IC50 of 222 ± 30 mg/mL (Fig. 1A), resulting in an SI of 112.12for trypomastigotes forms. When the SI is > 50, it means that thevenom meets the criteria required by the WHO/TDR for T. cruzi tobe considered a hit (Nwaka and Hudson, 2006).
The effect of the DqV on the amastigote forms showed reductionin the percentage of infected cells and number of amastigotes/100 cells with 1.98 and 3.96 mg/mL of DqV at 24 and 48 h, as well asBz with 73.4 and 146.8 mg/mL (Fig. 1B; 1C). Similar results wereobserved with Apis mellifera venom (Adade et al., 2012) andmelittin (Adade et al., 2013), showing a reduction in intracellularamastigotes in both periods.
Recently, we demonstrated that DqV showed antimicrobialproperties causing membrane damage in bacteria (Lima et al.,2014). To identify the cell death mechanism induced by DqVtreatment in T. cruzi, flow cytometry and confocal microscopy wereperformed. In this study, DqV treatment caused an increase in thenumber of AX-/PI þ cells, indicating rupture of plasma membrane,AXþ/PI- cells indicating phosphatidylserine exposure and AXþ/PI þ cells (Fig. 1D), suggesting involvement of necrotic and
Fig. 2. Scanning electron microscopy of control epimastigotes (AeB) and treated epimastigoobserved, such pores in membrane were observed (C and E) and abnormal conformation o
apoptotic pathways.These results show the involvement of both types of cell death
in the DqV-treated epimastigote forms. Adade et al. (2012)demonstrated that autophagy and apoptosis are the mostfrequently observed pathways with A. mellifera venom. In thepresent study, acridine orange staining was used to analyzeswelling of reservosomes, a characteristic of autophagic cell death,but no evidence of autophagy was observed.
Alterations in mitochondrial membrane potential can beobserved in both types of cell death, necrosis and apoptosis (Kryskoet al., 2008). In this study, loss of mitochondrial membrane po-tential was observed with flow cytometry and confocal microscopyin IC50 and 2 x IC50 of DqV, being more expressive with the higherconcentration in both methods (Fig. 1EeH).
Epimastigote forms treated with DqV showed morphologicalalterations that were observed by SEM. The parasites showed lossof membrane integrity with the presence of pores (Fig. 2C; 2E) andcell shrinkage (Fig. 2D; 2F), also showing characteristics ofapoptosis and necrosis at both concentrations.
The most important findings of the present study were the ac-tivity of DqV against the intracellular amastigote form and the highselective index. Amastigotes develop and maintain the infectionsby T. cruzi and significantly lower DqV concentrations, whencompared to those required to cause damage to host cells, inhibitamastigote proliferation.
In conclusion, D. quadriceps venom was be able to inhibit thepromastigote form of L. amazonensis and the epimastigote,
tes with IC50 of DqV (CeD) and 2 x IC50 of DqV (EeF). Morphological alterations weref the cell body with cell shrinkage (D and F). Scale bars: 3 mm.
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trypomastigote and amastigote forms of T. cruzi, strain Y, with theinvolvement of necrotic and apoptotic mechanisms. Therefore, DqVand its components can offer potential tools for the development ofnew drug candidates against neglected diseases.
Acknowledgements
We thank Analytic Centre - UFC/CT - INFRA/Pro e EquipmentCAPES. We thank National Council of Technological and ScientificDevelopment (CNPq), Cearense Foundation for the Support of Sci-entific and Technological Development (Funcap) and Coordinationfor Enhancement of Higher Education Personnel (CAPES) for theirfinancial support.
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Founded in 1877 by Felix Hoppe-Seyler asZeitschrift für Physiologische Chemie
Felix Hoppe-Seyler (1825–1895) was a pioneer of biochemistry, remembered not only for his discovery of hemoglobin and his contributions to the chemical characterization of many other biological compounds and processes but also for having been the mentor of Friedrich Miescher and Albrecht Kossel. In his preface to the first issue of Zeitschrift für Physiologische Chemie, Felix Hoppe-Seyler coined the term Bio chemistry (‘Biochemie’) for the then newly emerging discipline.
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CovEr illustrationThe venom gland of the giant ant Dinoponera quadriceps (pictured on the cover) produces several biologically active anti-infective peptides with tripanomicidal properties. In their study presented on pp. 187–196 in this issue, Bandeira Lima et al. investigated some of the venom–derived components regarding their activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Four dinoponeratoxins were tested against epimastigote, trypomastigote and amastigote forms of the benznidazole-resistant Y strain of T. cruzi and in mammalian host cells. The results indicate that one particular polypeptide from the D. quadriceps venom (M-PONTX-Dq3a) might be a promising candidate for the development of active compounds against Chagas disease.Image courtesy of Gandhi Rádis-Baptista, Fortaleza, Brazil.
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Biological Chemistry 2018 | Volume 399 | Issue 2
Contents
Reviews
Anja Matena, Edisa Rehic, Dana Hönig, Bianca Kamba and Peter BayerStructure and function of the human parvulins Pin1 and Par14/17 101
Sonja LorenzStructural mechanisms of HECT-type ubiquitin ligases 127
Jessica A. Williams and Wen-Xing DingMechanisms, pathophysiological roles and methods for analyzing mitophagy – recent insights 147
Minireview
Esther Barreiro and Joaquim GeaPARP-1 and PARP-2 activity in cancer-induced cachexia: potential therapeutic implications 179
Research Articles/Short Communications
Protein Structure and Function
Dânya Bandeira Lima, Clarissa Perdigão Mello, Izabel Cristina Justino Bandeira, Ramon Róseo Paula Pessoa Bezerra de Menezes, Tiago Lima Sampaio, Cláudio Borges Falcão, Jean-Étienne R.L. Morlighem, Gandhi Rádis-Baptista and Alice Maria Costa MartinsThe dinoponeratoxin peptides from the giant ant Dinoponera quadriceps display in vitro antitrypanosomal activity 187
Salvatore Nesci, Fabiana Trombetti, Vittoria Ventrella, Maurizio Pirini and Alessandra PagliaraniThe inhibition of the mitochondrial F1FO-ATPase activity when activated by Ca2+ opens new regulatory roles for NAD+ 197
UnauthenticatedDownload Date | 1/12/18 12:23 PM
Biol. Chem. 2018; 399(2): 187–196
Dânya Bandeira Lima, Clarissa Perdigão Mello, Izabel Cristina Justino Bandeira, Ramon Róseo Paula Pessoa Bezerra de Menezes, Tiago Lima Sampaio, Cláudio Borges Falcão, Jean-Étienne R.L. Morlighem, Gandhi Rádis-Baptista* and Alice Maria Costa Martins*
The dinoponeratoxin peptides from the giant ant Dinoponera quadriceps display in vitro antitrypanosomal activityhttps://doi.org/10.1515/hsz-2017-0198Received July 13, 2017; accepted September 12, 2017; previously published online September 27, 2017
Abstract: The crude venom of the giant ant Dinoponera quadriceps is a cocktail of polypeptides and organic com-pounds that shows antiparasitic effects against Trypano-soma cruzi, the causative agent of Chagas disease. In order to investigate the venom-derived components responsible for such antitrypanosomal activity, four dinoponeratoxins (DnTxs) were identified, namely M-PONTX-Dq3a, -Dq3b, -Dq3c and -Dq4e, that are diverse in size, net charge, hydrophobicity and propensity to interact with eukary-ote cell membranes. These peptides were tested against epimastigote, trypomastigote and amastigote forms of benznidazole (Bz)-resistant Y strain of T. cruzi and in mammalian host cells. The M-PONTX-Dq3a and -Dq4e inhibited all developmental forms of T. cruzi, including amastigotes, the responsible form for the maintenance of infection on chronic phase of the disease. The M-PONTX-Dq3a showed the highest selectivity index (SI) (80) and
caused morphological alterations in T. cruzi, as observed by scanning electron microscopy (SEM), and induced cell death through necrosis, as seen by multiparametric flow cytometry analysis with specific biochemical mark-ers. Altogether, the D. quadriceps venom appears as a source for the prospection of trypanocidal peptides and the M-PONTX-Dq3a arises as a candidate among the dino-poneratoxin-related peptides in the development of com-pounds against Chagas disease.
Keywords: ant venom; antitrypanosomal agents; Dino-ponera quadriceps; dinoponeratoxins; tropical disease; Trypanosoma cruzi; venom peptides.
IntroductionThe venom gland transcriptome of the New World giant ant Dinoponera quadriceps was previously reported and revealed a toxin repertoire that comprises dinoponeratoxins
*Corresponding authors: Gandhi Rádis-Baptista, Program of Post-Graduation in Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, Brazil; Northeast Biotechnology Network (RENORBIO), Post-Graduation Program in Biotechnology, Federal University of Ceará, Av. da Universidade 2853, 60020-180 Fortaleza/CE, Brazil; and Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Institute for Marine Sciences, Federal University of Ceará, Av. da Abolição 3207, 60165-081 Fortaleza/CE, Brazil, e-mail: [email protected]. http://orcid.org/0000-0001-9210-092X; and Alice Maria Costa Martins, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, Brazil; and Program of Post-Graduation in Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, Brazil, e-mail: [email protected]ânya Bandeira Lima, Clarissa Perdigão Mello and Izabel Cristina Justino Bandeira: Faculty of Pharmacy, Department of Clinical and Toxicological Analysis, Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, Brazil; and Program of Post-Graduation in Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy,
Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, BrazilRamon Róseo Paula Pessoa Bezerra de Menezes: Program of Post-Graduation in Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, BrazilTiago Lima Sampaio: Faculty of Medicine, Department of Pharmacology, Federal University of Ceará, Rua Coronel Nunes de Melo 1127, 60430-275 Fortaleza/CE, BrazilCláudio Borges Falcão: Program of Post-Graduation in Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Federal University of Ceará, Rua Capitão Francisco Pedro 1210, 60430-372 Fortaleza/CE, Brazil; and Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Institute for Marine Sciences, Federal University of Ceará, Av. da Abolição 3207, 60165-081 Fortaleza/CE, BrazilJean-Étienne R.L. Morlighem: Northeast Biotechnology Network (RENORBIO), Post-Graduation Program in Biotechnology, Federal University of Ceará, Av. da Universidade 2853, 60020-180 Fortaleza/CE, Brazil; and Laboratory of Biochemistry and Biotechnology, Institute for Marine Sciences, Federal University of Ceará, Av. da Abolição 3207, 60165-081 Fortaleza/CE, Brazil
188 D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins
(DnTxs), pilosulin-like toxins, ICK-folded toxins, allergen proteins, esterases (phospholipases and carboxylester-ases), and lethal-like toxins (Torres et al., 2014). Such findings pave the way for the functional and pharmaco-logical investigations of novel predicted polypeptides from giant ant venom. Among these transcriptional prod-ucts, two full-length DnTx precursors were proportion-ally the most expressed transcripts, accounting for up to 5% of the predicted venom-related peptides. These DnTx transcripts code for long pre-propeptides that are prone to post-translational modification in the venom gland, by which several peptide fragments can be released in the venom, as detected, respectively, by some of us in the venom peptidomes of D. quadriceps and by others (Johnson et al., 2010), in Dinoponera australis venom. The mature DnTxs share variable primary sequence similari-ties with antimicrobial peptides from ponerine ants, like ponericin G2 and G3, and from vertebrates, like frog der-maseptin-H65, in case of long DnTxs, and ponericin W3, frog Gaegurin-5 and Brevinin-1PTa, in case of short DnTxs (Johnson et al., 2010; Cologna et al., 2013; Torres et al., 2014). Both the crude venom of D. quadriceps and DnTx-related peptides were shown to display antimicrobial activity against a wide range of microorganisms (Cologna et al., 2013), including methicillin-resistant Staphylococ-cus aureus (Lima et al., 2014). Additionally, the antipara-sitic (antiChagasic) activity of D. quadriceps crude venom was demonstrated against all the main forms of Trypa-nosoma cruzi with high selectivity to the parasite (Lima et al., 2016). This latter disclosure is important, as T. cruzi is the causative agent of the American trypanosomiasis, a highly disabling parasitic infection, responsible for car-diomyopathies and digestive tract pathologies in approxi-mately 30% of chronically infected individuals (Morilla and Romero, 2015; Chatelain, 2017). American trypanoso-miasis or Chagas disease is a neglected tropical disease, caused by the protozoan T. cruzi that is transmitted by a triatominiae insect. The Chagas disease cycle involves three developmental forms of T. cruzi: epimastigote (the proliferative insect vector-borne stage), trypomastigote (non-proliferative, bloodstream and infective form) and amastigote (intracellular proliferative form). It is endemic in Latin America, but it can also be found in Europe, North America, Japan and Australia, as a consequence of human and environmental changes. Around 6 million people are affected worldwide and approximately 7000 deaths occur annually (Chatelain, 2017; WHO, 2017). The only two drugs currently being used to treat Chagas disease are benznida-zole (Bz) and nifurtimox. These are highly toxic and rarely beneficial during the chronic phase of the disease, have a low percentage of cure (Urbina and Docampo, 2003), and
consequently the discovery of more selective and effective antiChagasic agents are demanding.
Therefore, based on the aforementioned facts, in the present study, we evaluated and compared the in vitro antitrypanosomal (antiChagasic) activity of four DnTxs from D. quadriceps and the drug-of-choice Bz, against all morphological forms of T. cruzi, and investigated the main mechanism by which DnTxs trigger parasite cell death.
Results
Dinoponeratoxin peptide structures and physicochemical properties
Based on the transcriptome (Torres et al., 2014) and the peptidome (unpublished) data, four dinoponeratoxin sequences were selected for synthesis and these are pres-ently named M-PONTX-Dq3a, -Dq3b, -Dq3c and -Dq4e, from which structures and some of their physicochemical properties are presented in Table 1. The peptides M-PONTX-Dq3b and -Dq3c are fragments of M-PONTX-Dq3a, which appear to be cleaved between Ile/Pro or Lys/Ala residues and amidated at their carboxyl terminal by post-transla-tion modifications in the giant ant venom gland. These short mature peptides have relatively low net charges (+3), higher hydrophobicities “H” (H = 0.781 and 0.823, respectively) and hydrophobic moments “μH” (a ten-dency to adopt α-helical structures in solution), compared to its parental M-PONTX-Dq3a, despite them all having a high pI value (pI = 14). In contrast, M-PONTX-Dq4e is the longest DnTx-related predicted peptide expressed in the venom gland, with 30 amino acid residues, a net charge of +6, a H value of 0.148 and a μH = 0.458 (Table 1).
Antitrypanosomal activity of DnTxs
The four DnTxs were tested in vitro against the three devel-opmental forms of T. cruzi. Against the epimastigotes, the peptide with best trypanocidal activity was M-PONTX-Dq3a that only needed 4.7 μm to kill 50% of the parasites after 24 h. That concentration essentially did not change up to 72 h of treatment. M-PONTX-Dq4e also displayed similar IC50 values as M-PONTX-Dq3a against the epimas-tigotes, but only after 48 h. In contrast, Bz does not have comparable activity in low micromolar concentrations even after 72 h of treatment (Table 2).
Against the trypomastigotes, M-PONTX-Dq3a also showed better activity (lowest IC50) than the other peptides
D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins 189
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190 D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins
and Bz. In addition, M-PONTX-Dq3a concentration to kill 50% of healthy LLC-MK2 cells (without the parasites) was relatively low (25.7 μm), compared to its fragments -Dq3b and -Dq3c and Bz. In consequence, M-PONTX-Dq3a dis-played the highest selectivity index (SI) among the tested drugs (Table 3), and, thus, was selected for subsequent analysis. Furthermore, the peptides M-PONTX-Dq3a and -Dq4e were evaluated against intracellular amastigotes infecting LLC-MK2 cells.
According to Figure 1, after 24 or 48 h of treatment, both peptides were able to significantly reduce the number of intracellular parasites at their respective con-centrations to kill 50% of the T. cruzi trypomastigote forms compared to untreated infected cells.
The T. cruzi cell death pathway triggered by DnTxs
Considering these results, the T. cruzi cell death pathway triggered by DnTxs was studied with the most promising peptide, M-PONTX-Dq3a, and the epimastigote forms. This study involved two methodologies of analysis: (i) multipar-ametric flow cytometry, based on the use of biochemical markers, such as annexin V-FITC (AX), 7-aminoactinomy-cin D (7-AAD), rhodamine 123 (Rho123), 2′,7′-dichlorofluo-rescin diacetate (DCFDA) and acridine orange (AO); (ii) ultrastructural analysis using scanning electron micro-scopy (SEM). Epimastigotes treated with M-PONTX-Dq3a,
for 24 h, at its twice the IC50 (2 × IC50) exhibited a signifi-cant increase of 7-AAD+/AX- labeled cells (15.3%) and of 7-AAD+/AX+ labeled cells (8.7%), compared to the control group, which indicates T. cruzi death mainly by necrosis (Figure 2).
To confirm these findings, additional flow cytom-etry experiments were then performed, in which the gen-eration of reactive oxygen species (ROS) and the loss of mitochondrial transmembrane potential were measured. Utilizing the DCFDA fluorescence as a readout, after 24 h of treatment, M-PONTX-Dq3a at its IC50 and 2 × IC50 induced an increase in intracellular ROS (fluorescence shift to the right) by 18–20% and 80%, respectively, com-pared to untreated cells (Figure 3A). When Rho123 was employed as a biochemical marker, epimastigotes treated with M-PONTX-Dq3a exhibited gradual decreases (shift to the left) in Rho123 fluorescence emission, compared to the control group, by 20–23% with IC50 and 72–76% with 2 × IC50, which suggested an alteration in the mitochon-drial transmembrane potential in parasites treated with M-PONTX-Dq3a (Figure 3B). The potential autophagic mechanism of parasite death was also investigated by utilizing AO staining that labels acidic vesicles, such as swelled acidic compartments. The treatment of T. cruzi epimastigotes with M-PONTX-Dq3a did not show any sig-nificant increase of AO fluorescence in any tested concen-trations (Supplementary Figure S1).
Finally, the morphological alterations of the T. cruzi epimastigote treated for 24 h with the IC50 (Figure 4B–D)
Table 2: Effect of dinoponeratoxin peptides against epimastigote forms of T. cruzi Y strain.
sDq-2561 (M-PONTX-Dq3a)
sDq-1503 (M-PONTX-Dq3b)
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IC50 and LC50 values are expressed in μm. Data are expressed as means ± standard deviation (SD) of three independent experiments. (–) No effect at all tested concentrations (0.10–100 μm).
Table 3: Effect of dinoponeratoxin peptides against trypomastigote forms of T. cruzi Y strain, cytotoxicity toward LLC-MK2 mammalian cells and respective selectivity index.
sDq-2561 (M-PONTX-Dq3a)
sDq-1503 (M-PONTX-Dq3b)
sDq-1319 (M-PONTX-Dq3c)
sDq-3348 (M-PONTX-Dq4e)
Bz
Trypomastigote (LC50) 0.32 ± 0.03 7.4 ± 0.6 34.8 ± 5 4.7 ± 0.3 282 ± 20LLC-MK2 (IC50) 25.7 ± 2 144 ± 75 >100 16.7 ± 2 614.8 + 30 SI 80.3 19.4 – 3.5 2.18
IC50 and LC50 values are expressed in μm. Data are expressed as means ± SD of three independent experiments (SI, selectivity index).
D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins 191
and 2 × IC50 for M-PONTX-Dq3a (Figure 4E, F), compared with untreated parasites (Figure 4A) showed cell shrinkage (Figure 4B, C) and disruption of the membrane integrity of the parasite (Figure 4D, E) that include the formation and presence of pores (Figure 4E). In combination with flow cytometry data, these morphological changes confirmed that in T. cruzi the main cell death pathway triggered by M-PONTX-Dq3a involves necrosis.
DiscussionIt is agreeable that there is an urgent need to discover new anti-T. cruzi compounds due to the very few medica-tions available to treat Chagas disease. The antiChagasic therapy relies exclusively on Bz and nifurtimox, which cause severe adverse effects. Moreover, parasite strains that are resistant to these drugs have already surged
(Rodrigues et al., 2014). Possible sources for prospection of new antiChagasic pharmaceuticals are animal venoms, whose components or biotoxins have been used as tem-plates to develop promising medicines (Harvey, 2014). Some biotoxins have demonstrated trypanocidal effect against all morphological forms with high selectivity to T. cruzi (Adade et al., 2013; Souza et al., 2016).
Recently, the crude venom of the giant ant D. quadri-ceps was showed to possess an antiChagasic activity against all T. cruzi developmental forms (Lima et al., 2016). In the present report, we searched for and evaluated the dinoponeratoxin-related peptides that could retain the antitrypanosomal activity of D. quadriceps crude venom. The search started by taking into account the previous work that described the transcriptome of the D. quadri-ceps venom gland (Torres et al., 2014), our preliminary peptidome analysis of the giant ant’s crude venom, and the venom peptidomes of other D. quadriceps population (Cologna et al., 2013) and Dinoponera species (Johnson et al., 2010). A molecular weight of 3500 Da was estab-lished as a threshold to ease the chemical synthesis, and we noticed that the DnTxs, M-PONTX-Dq4e (Dq-3348), M-PONTX-Dq3a (Dq-2561) and their derived mature pep-tides, -Dq3b (Dq-1503) and -Dq3c (Dq-1319), fell within this limit; thus, these peptides were selected for synthesis and biological analysis. Herein, the current normalized nomen-clature of D. quadriceps (Dq) DnTxs was adopted, based on the denomination rationally proposed for ant toxins, according to previous reports (Touchard et al., 2016).
The DnTxs were tested against all T. cruzi morpho-logical forms. Against the epimastigotes, M-PONTX-Dq3a and -Dq4e, which have higher molecular weights and net charges than -Dq3b and -Dq3c (Table 1), showed better activities (lower IC50s) than these short peptides (Table 2). Similar results were also found against T. cruzi with the use of the vipericin batroxicidin (BatxC), a cathelicidin-related peptide from the venom gland of Bothrops atrox snakes (Falcao et al., 2014; Mello et al., 2017). Moreover, M-PONTX-Dq3a IC50 against the epimastigotes after 24 h of treatment was more than 45-fold lower than the stand-ard drug Bz, which did not perform a close activity com-pared to M-PONTX-Dq3a IC50s even after 72 h of incubation (Table 2).
The peptides were also tested against the trypomas-tigote and amastigote forms. These later developmental forms were obtained after incubation with LLC-MK2 host mammalian cells, which have been used as cellular model for T. cruzi infection (Andrews and Colli, 1982; Zingales et al., 1997). Interestingly, after 24 h of treatment, while Bz IC50s against trypomastigote and epimastigotes were basically the same, the concentration of M-PONTX-Dq3a
Figure 1: The effect of dinoponeratoxin peptides against intracel-lular amastigotes of T. cruzi.The in vitro activity of M-PONTX-Dq3a (Dq-2561) (A) and M-PONTX-Dq4e (Dq-3348) (B) against T. cruzi amastigotes. Reduction of intra-cellular parasites within the host LLC-MK2 cells (amastigotes/100 cells), at 24 and 48 h of incubation.
192 D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins
to kill 50% of the trypomastigotes was more than an order of magnitude lower than its IC50 against the epimastigotes (Tables 2 and 3). The increased susceptibility of trypomas-tigote to the peptides might be related to the over-expres-sion of negatively charged components of the T. cruzi cell membrane, such as sialic acid and mucin glycoproteins (de Souza et al., 2010), which facilitate host-parasite inter-action but also can attract cationic antimicrobial peptides to the parasite membrane. The lower IC50s against the try-pomastigotes than the epimastigotes were also observed with M-PONTX-Dq3a and -Dq4e fragments, i.e. M-PONTX-Dq3b and -Dq3c (Tables 2 and 3). Nevertheless, these short DnTx peptide fragments again underperformed M-PONTX-Dq3a and -Dq4e against T. cruzi.
One explanation for such variation in the anti-T. cruzi activity relies on the structural and physicochemi-cal characteristics of M-PONTX-Dq3a and -Dq4e that are less hydrophobic but more positively-charged than -Dq3b and -Dq3c. Despite that all DnTxs form helices of different lengths, the shortest peptides M-PONTX-Dq3b and -Dq3c display high values of hydrophobicity and hydrophobic moment, but have lower net charges, which appeared to be critical for interaction with negative-charged membranes of the parasite. Indeed, large values of the hydrophobic
moment (μH) of peptides are indicative of the formation of amphiphilic helix, while high helical moments and large mean hydrophobicities are indicative of peptides that are membranolytic or membrane-active/membrane-interact-ing helices (Eisenberg et al., 1982), in addition, however, peptide net positive-charges seem to be critical for the anti-infectivity effect. In light of the contrastive difference in the structure-activity relationship of DnTxs, the remain-ing experimental evaluation of antitrypanosomal activity was carried out with only the more active M-PONTX-Dq3a and -Dq4e peptides.
Against the amastigotes, both M-PONTX-Dq3a and -Dq4eat their respective IC50s or 2 × IC50s significantly reduced the number of parasites inside LLC-MK2 cells after 24 or 48 h of treatment (Figure 1). However, as both peptides had the same toxicity to healthy LLC-MK2 cells, additional analysis was performed with only M-PONTX-Dq3a due to the lower IC50s than M-PONTX-Dq4e against epimastigotes and trypomastigotes (Tables 2 and 3). Therefore, it is suggestive that a higher hydrophobicity made M-PONTX-Dq3a more active against T. cruzi than M-PONTX-Dq4e, even though the former peptide had the lowest propensity to adopt α-helical structures (lowest μH) (Table 1). Such findings are in agreement with studies
Figure 2: Representative flow cytometry scattering plots of T. cruzi epimastigotes treated with M-PONTX-Dq3a (Dq-2561) at 4.7 and 9.4 μm for 24 h.Percentage values are averages of 10 000 live events from three independent experiments.
D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins 193
that have reported poorly structured peptides with anti-microbial activities (Papo et al., 2002; Falcao et al., 2015; Yacoub et al., 2016). Moreover, M-PONTX-Dq3a was the only tested peptide that met two important criteria set by the WHO/TDR guidelines for a prospective drug candidate to be considered as a hit against T. cruzi: SI = 80.3 above 50 and trypomastigote IC50 (0.32 μm, i.e. ≈0.82 μg/ml) below 1 μg/ml (Nwaka and Hudson, 2006). Interestingly, these M-PONTX-Dq3a values (SI and trypomastigote IC50) were close to those results obtained from D. quadriceps crude venom (SI = 100 and IC50 = 2 μg/ml) (Lima et al., 2016), with the obvious advantage to be an isolated venom-derived compound, without the potentially toxic cocktail of substances that are noxious to healthy eukaryotic cells and organisms.
Although M-PONTX-Dq3a IC50s against the trypomas-tigote and amastigote forms were lower than against the epimastigotes, the studies that determined T. cruzi death pathway(s) triggered by the peptide were evaluated with
the later forms. Because epimastigotes do not require host cells to develop, they are straightforward to maintain and test in vitro than trypomastigote and amastigote, the eval-uation of antytripanosmal activity of DnTxs was contin-ued with that parasite life form of T. cruzi.
The flow cytometry analysis showed that epimastig-otes treated with M-PONTX-Dq3a at its 2 × IC50 displayed a significant increase in the entrance of the impermeable nucleic acid dye 7-AAD, compared to untreated parasites, indicating that T. cruzi cell membrane was damaged (Figure 2). In addition, after M-PONTX-Dq3a treatment at its IC50 or 2 × IC50, the increase in intracellular ROS, as evidenced by the cell permeant reagent DCFDA and by the disturbance of mitochondrial transmembrane poten-tial (Figure 3), provided biochemical evidences that the major T. cruzi cell death pathway taking place was necrosis. Finally, SEM images showed and confirmed the necrotic cell death due to cell swelling and disruption of epimastigote membrane integrity with the presence of
100
100 101 102 103 104
0
0
20
40
60
80
100
120
140
10
Dq-2561 (IC50)
CT
A
B
CT
Dq-2561 (2 × IC50)
Dq-2561 (2 × IC50)
Dq-2561 (IC50)
20
30
40
Rel
ativ
e flu
ores
cens
e (F
L1)
Rel
ativ
e flu
ores
cens
e (F
L2)
50
60
70
80
90
0CT 4.7
*
*
*
*
9.4
CT0.0
0.5
1.0
1.5
4.7 9.4
Dq-2561 (µM)
Dq-2561 (µM)
2
4
6
8
10
12
101 102
FL1-DCF-DA
FL2-Rho123
103 104
Figure 3: Flow cytometry analysis of ROS production and mitochondrial transmembrane potential changes in T. cruzi exposed to M-PONTX-Dq3a (Dq-2561) peptide.Representative histograms of DCFDA (A) and Rho123 (B) fluorescence signal and respective relative fluorescence values from experiments with T. cruzi epimastigotes that were treated with M-PONTX-Dq3a at 4.7 μm and 9.4 μm for 24 h. All measurements involved three independ-ent experiments.
194 D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins
pores (Figure 4). Again, M-PONTX-Dq3a alone mimics the antiChagasic activity of the whole D. quadriceps crude venom, eliciting T. cruzi cell death by necrosis. Although the cell death pathway mediated by necrosis was observed with peptides other than DnTxs, like BatxC from snake venom gland (Mello et al., 2017), different mechanisms, such as apoptosis and autophagy, might operate in the case of other venom-derived peptides as, for example, mellitin from the bee venom (Adade et al., 2013).
Taken together, DnTxs were evaluated to find pep-tides that could reproduce the antiChagasic effects of the D. quadriceps crude venom. The peptide M-PONTX-Dq3a was found to be the most promising DnTx because it could inhibit all T. cruzi morphological forms, including intra-cellular amastigotes. Moreover, it showed a similar IC50 and high SI. M-PONTX-Dq3a induced the same cell death pathway as the crude venom, with the clear advantage of being a single, pure substance from the complex toxin
cocktail of giant ant venom. Thus, M-PONTX-Dq3a figures as a potential lead and peptide template in the development of alternative drugs or adjuvants for the chemotherapeutic arsenal and clinical strategies to treat Chagas disease.
Materials and methodsDnTxs and Bz
The four DnTxs sequences were retrieved from converging data of the venom gland transcriptome of D. quadriceps and the peptidome of crude venom; these DnTx peptides, named by taking into account their theoretical or experimental molecular weight and by a nor-malized nomenclature were: Dq-2561 (M-PONTX-Dq3a), Dq-1503 (M-PONTX-Dq3b), Dq-1503 (M-PONTX-Dq3c) and Dq-3348 (M-PONTX-Dq4e). The peptides were commercially prepared by solid phase syn-thesis (China Peptides Co. Ltd., Shanghai, China), with over 95% of purity and the quality control ascertained by high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry analysis. Their pri-mary structures were analyzed with the following software: “Peptide property calculator” (http://www.pepcalc.com), “PEP-FOLD 2 server” (http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD/), “Heli-quest” (http://heliquest.ipmc.cnrs.fr) and “Helical wheel” (http://kael.net/helical.htm) to obtain data about some physicochemical properties. Peptide stock solutions were prepared at 1 mm with ster-ile phosphate-buffered saline (PBS) as required and kept in aliquots at −20°C until use. Bz(C12H12N4O3; MW = 260.249 g/mol) was obtained from Roche® (Basel, Switzerland) and stock solutions were prepared at 1 mm with PBS and maintained at 4°C up to 6 weeks.
Antitrypanosomal in vitro assays with epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi
The epimastigote forms of T. cruzi Y strain (Bz resistant) were a gift from Prof. Dr. Maria Júlia Manso Alves, Laboratory of Parasite Bio-chemistry, University of São Paulo, São Paulo, Brazil. These epimas-tigotes (1 × 106 parasites ml−1) were seeded in 96-well plates in Liver Infusion Tryptose medium supplemented with 1% antibiotics and 10% fetal bovine serum (FBS) and, then, treated with two-fold serial dilutions of either DnTxs or Bz at 28°C for 24, 48 and 72 h ( Rodrigues et al., 2014). Final peptide and Bz concentration ranges were 0.10–100 μm and 10–1000 μm, respectively. The trypomastigote forms of T. cruzi, obtained by infecting LLC-MK2 cells (American Type Culture Collection – ATCC, Manassas, VA, USA), were incubated at 37°C in an atmosphere with 5% CO2 in Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) medium (Vitrocell, São Paulo, SP, Brazil) supplemented with 1% antibiotics and 2% FBS. Later, trypomastigotes were seeded in 96-well plates and treated with either DnTxs or Bz for 24 h at the same final concentration ranges used against the epimastigote forms. After their respective treatments, epimastigote and trypomastigote densi-ties were separately quantified in a Neubauer chamber (Adade et al., 2014). Relative cell viabilities were calculated with parasites treated with only sterile PBS in the medium as negative controls and experi-ments were carried out in triplicate.
Figure 4: Scanning electron microscopy of T. cruzi epimastigotes treated with M-PONTX-Dq3a (Dq-2561).Untreated control (A) and treated with peptide IC50 (B–D) and 2 × IC50 (E, F). Morphological alterations are observed, such cell shrinkage (B, C) and loss of integrity of parasite membrane (D–F) with the pres-ence of pores (F). Scale bars: 1 μm.
D.B. Lima et al.: Antitrypanosomal activity of giant ant dinoponeratoxins 195
Evaluation of cytotoxicity in mammalian cells (MTT assay)
LLC-MK2 cell viability without the parasites was also measured using a standard 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide (MTT) assay (Vanden Berghe et al., 2013). These cells were seeded in the DMEM medium in 96-well plates, treated with two-fold serial dilutions of DnTxs or Bz and incubated at 37°C for 24 h. The final concentration ranged from 0.19 to 100 μm DnTxs and 15.6 to 1000 μm Bz. MTT (Amresco, Solon, OH, USA; 5 mg/ml) was then added and the cells were incubated for additional 4 h, when 10% sodium dode-cyl sulfate (SDS) was added to dissolve the purple-colored formazan product. The absorbance values were obtained at 570 nm with a microplate reader (Biochrom® Asys Expert Plus Microplate Reader, Biochrom Ltd., Holliston, MA, USA). Relative cell viability was calcu-lated with cells treated with only sterile PBS in the medium as nega-tive controls and experiments were carried out in triplicate. SI was calculated by the ratio of cytotoxic/trypanocidal activity (Nwaka and Hudson, 2006).
Antitrypanosomal in vitro assay with amastigote forms of T. cruzi
LLC-MK2 cells were seeded in 24-well plates containing glass cover-slips (13-mm diameter), cultivated in DMEM supplemented with 10% FBS, and maintained at 37°C in a 5% CO2 atmosphere for 24 h. Next, these cells were infected with trypomastigote forms (parasite: host cell ratio of 20:1) in DMEM medium containing 2% FBS. After 48 h of infection, the non-internalized parasites were removed and the cells were cultivated in 2% FBS DMEM medium with either DnTxs or Bz at their respective IC50s or 2 × IC50. The coverslips were collected after 24 h or 48 h, washed with PBS, fixed in Bouin’s solution and stained with Giemsa (Lima et al., 2016). Non-treated infected LLC-MK2 cells were used as controls. The number of intracellular amastigotes per 100 cells was determined by counting 300 cells in triplicate.
Multiparametric flow cytometry analysis to assess the mechanism of parasite death
Epimastigote forms were treated with DnTxs at their IC50 or 2 × IC50 concentrations for 24 h of exposure, at 28°C. Next, these cells were washed and stained with FITC-labeled annexin V and 7-aminoac-tinomycin D, according to the manufacturer’s instructions (BD Pharmigen, CA, USA) with the aim of identifying cell death mech-anisms either by apoptosis or necrosis, respectively. In separate experiments, the loss of mitochondrial transmembrane potential, the outburst of ROS and the acidic compartments were also inves-tigated. Epimastigote forms were treated with DnTxs (IC50 or 2 × IC50) for 24 h and stained with either Rhodamine 123 (10 μg/ml), DCFDA (20 mm) or AO (5 μg/ml), according to the established protocols and manufacturer’s instructions (Sigma-Aldrich™, St. Louis, MO, USA). At the end of each incubation period, the cells were washed and run in a FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Ten thousand live events were analyzed using the Cell Quest software and the results were established by determining the fold change (treated/non-treated cell ratio) of the geometric mean of
fluorescence. Epimastigotes without treatment with DnTxs were used as controls and experiments were carried out in triplicate.
SEM of T. cruzi morphologies
Epimastigote forms were treated with DnTxs at 2 × IC50 for 24 h. After incubation, the parasites were fixed for 2 h with 2.5% glutaraldehyde (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) solution, washed, dehydrated, dried with CO2, coated with gold and observed with a Quanta FEG 450 scanning electron microscope (ThermoFisher Scien-tific, Hillsboro, OR, USA). Digital images of SEM were acquired and stored as previously described (Lima et al., 2016).
Statistical analysis of experimental data
All experiments were performed in triplicate. The statistical analy-sis was performed using the GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). The IC50 values were determined by nonlinear regression. Data were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s post-test. Significance was achieved if p < 0.05.
Acknowledgments: The authors are grateful for the fund-ing agencies, the Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), the Ministry of Science, Technology and Innovation (MCTI) and the Coor-dination for the Improvement of Higher Education Person-nel (CAPES), the Ministry of Education and Culture, both of the Federal Government of Brazil, for the financial support of the project development and the fellowships of gradu-ate students, respectively. We are also thankful to the Ana-lytical Center Core Facility of the Federal University of Ceará for the technical support on Electron Microscopy studies. Our deepest thanks to Professor Katsuhiro Konno, Institute of Natural Medicine, University of Toyama, Toyama, Japan, and Dr. André J. Zaharenko and Dr. Álvaro Rossan B. Prieto-da-Silva, Laboratory of Genetics, Institute Butantan, São Paulo, Brazil, for the preliminary proteomic and peptidome analysis of D. quadriceps crude venom.
Conflict of interest statement: Authors declare no conflict of interest.
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Supplemental Material: The online version of this article offers supplementary material (https://doi.org/10.1515/hsz-2017-0198).