univerzitet u niŠu prirodno matematiČki fakultet … · lečenje biljem ima dugu tradiciju u...

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jelena Ristić

UTICAJ ETARSKOG ULJA BOSILJKA (OCIMUM BASILICUM L.) NA

RAST SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERITIDIS U MESU

MASTER RAD

Niš, 2015.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj etarskog ulja bosiljka (Ocimum basilicum L.) na rast

Salmonella enterica subsp. enteritidis u mesu

MASTER RAD

Niš, 2015.

Mentor:

Dr Zorica Stojanović-Radić

Kandidat:

Jelena Ristić 118

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

EFFECT OF BASIL ESSENTIAL OIL (OCIMUM BASILICUM L.) TO THE

GROWTH OF SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERITIDIS IN MEAT

Master thesis

Niš, 2015.

Mentor:

PhD Zorica Stojanović-Radić

Candidate:

Jelena Ristić 118

ZAHVALNICA

Prvenstveno želim da izrazim ogromnu zahvalnost i poštovanje svom mentoru,

dr Zorici Stojanović-Radić, na velikoj profesionalnosti, dragocenim savetima i

ukazanom poverenju.

Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, a posebno svome ocu i majci,

kojima i posvećujem ovaj rad. Hvala vam za nesebičnu i neizmernu ljubav,

podršku, razumevanje i što ste verovali u mene svih ovih godina.

Hvala!

BIOGRAFIJA

Jelena Ristić rođena je 16. avgusta 1990. u Nišu, gde 2005. godine završava osnovnu

školu „Ćele-kula“. Iste godine upisuje srednju medicinsku školu u Nišu „Dr Milenko

Hadžić”, smer fizioterapeutski tehničar.

Nakon srednje škole, 2009. godine upisuje Prirodno-matematički fakultet u Nišu, na

Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2013. godine sa

zvanjem „biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije, smer Biologija, na istom

fakultetu.

SAŽETAK

Patogeni organizmi iz roda Salmonella pripadaju grupi najčešćih uzročnika trovanja

hranom. Bosiljak (Ocimum basilicum L.) je biljka koja se pored značajnih lekovitih svojstava

koristi i kao začin u ishrani. Brojnim istraživanjima je dokazana antimikrobna aktivnost

etarskog ulja bosiljka, ali u isto vreme nema radova na temu njegovog efekta kao

konzervansa u različitim tipovima hrane.

Pošto se često koristi kao začinska biljka za pripremu mesa, a posebno piletine, cilj

master rada bio je da se istraži efikasnost etarskog ulja bosiljka u sprečavanju kvarenja

upravo ove vrste mesa. Pošto se bakterija Salmonella enterica subsp. enteritidis često može

izolovati iz piletine, testiranje efikasnosti ovog ulja je ispitano na ovoj bakteriji u modelu

hrane. Etarsko ulje je izolovano iz suvog biljnog materijala hidrodestilacijom u aparaturi po

Klevendžeru. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja ispitana je određivanjem minimalne

inhibitorne koncentracije (MIK) mikrodilucionom metodom, dok je njegov efekat na rast

ispitivane bakterije testiran na kuvanom pilećem mesu kao modelu hrane. Ispitivanje je

vršeno na sobnoj temperaturi pri različitim periodima inkubacije. Zaključeno je da i nakon

ukupnog perioda inkubacije od 72 časa, etarsko ulje bosiljka nije značajno redukovalo broj

ćelija i da se samim tim ne može očekivati prezervativni efekat ulja bosiljka u ovoj vrsti

hrane.

Ključne reči: etarsko ulje, bosiljak (Ocimum basilicum L.), antimikrobna aktivnost,

Salmonella Enteritidis

ABSTRACT

Many pathogens from the Salmonella genus belong to the group of the most common

food poisoning causative agents. Basil (Ocimum basilicum L.) is a herb, which along with

significant medicinal properties has very intensive application as a spice. There are numerous

studies which demonstrated antimicrobial activity of the basil essential oil, but at the same

time, there are no studies about its preservative effect in different types of food.

Since basil is often used as a spice for meat preparation, esspecially chicken meat, the

aim of the present master thesis was to investigate efficacy of the basil essential oil for

spoilage prevention of the precisely this type of meat. Since the bacteria Salmonella enterica

subsp. enteritidis is a common contaminant of chicken meat, the efficiency of the oil was

assayed against this bacteria in a food model. The oil was isolated from dry plant material by

hydrodestilation in a Clevenger apparatus. Antimicrobial activity of the essential oil was

investigated by determining the minimum inhibitory concentracion (MIC) using

microdilution method, while the effect of essential oil to the bacterial growth was tested using

cooked chicken meat as a food model. The test was performed at the room temperature and

different incubation periods. It was concluded that after a total incubation period of 72 hours,

basil essential oil did not significantly reduced the number of cells. Therefore, the

preservative effect of basil oil in this type of food cannot be expected.

Keywords: essential oil, basil (Ocimum basilicum L.), antimicrobial activity,

Salmonella Enteritidis

SADRŽAJ

1. UVOD ......................................................................................................................................... 1

1.1. Začinske biljke i njihova upotreba ....................................................................................... 2

1.1.1. Etarska ulja začinskih biljaka kao značajni antimikrobni biljni sekundarni

metaboliti ................................................................................................................................ 2

1.1.2. Opšti sastav etarskih ulja .............................................................................................. 3

1.1.3. Biološke funkcije etarskih ulja...................................................................................... 4

1.1.4. Primena etarskih ulja..................................................................................................... 4

1.1.5. Etarska ulja kao antimikrobni agensi ............................................................................ 5

1.1.6. Osetljivost Gram-negativnih i Gram-pozitivnih sojeva prema začinskim biljkama i

njihovim etarskim uljima ........................................................................................................ 7

1.2. Opšte karakteristike roda Ocimum. ...................................................................................... 8

1.2.1. Opšte karakteristike bosiljka (Ocimum basilicum L.)................................................... 8

1.2.2. Primena bosiljka (Ocimum basilicum L.) ................................................................... 10

1.2.3. Pregled istraživanja hemijskog sastava etarskog ulja bosiljka ................................... 11

1.2.3.1. Hemijski sastav bosiljka sa teritorije Srbije ......................................................... 13

1.2.4. Pregled istraživanja antimikrobnog efekta etarskog ulja bosiljka (Ocimum

basilicum L.) ......................................................................................................................... 14

1.3. Opšte karakteristike roda Salmonella ................................................................................ 18

1.3.1. Istorijat ........................................................................................................................ 18

1.3.2. Morfološke osobine .................................................................................................... 18

1.3.3. Taksonomija ................................................................................................................ 19

1.3.4. Kulturelne osobine i identifikacija salmonela ............................................................. 21

1.3.5. Antigenska građa ........................................................................................................ 22

1.3.6. Fiziološko-biohemijske osobine ................................................................................. 23

1.3.7. Otpornost..................................................................................................................... 23

1.3.8. Toksičnost ................................................................................................................... 24

1.3.9. Faktori virulencije i mehanizam patogenog dejstva ................................................... 24

1.3.10. Salmoneloze .............................................................................................................. 25

1.3.11. Patogenost ................................................................................................................. 27

1.3.12. Salmonella enterica subsp. enterica serotip Enteritidis (Salmonella Enteritidis-

SE)......................................................................................................................................... 29

2. CILJEVI RADA ...................................................................................................................... 30

3. MATERIJALI I METODE .................................................................................................... 31

3.1. Rastvori i podloge .............................................................................................................. 31

3.2. Biljni materijal ................................................................................................................... 31

3.3. Izolacija etarskog ulja bosiljka........................................................................................... 32

3.4. Određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja bosiljka (Ocimum basilicum L.) ....... 33

3.4.1. Kultura mikroorganizama ........................................................................................... 33

3.4.2. Mikrodiluciona metoda ............................................................................................... 33

3.4.3. Određivanje minimalne baktericidne koncentracije (MBK)....................................... 34

3.5. Utvrđivanje efekta etarskog ulja bosiljka u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji na

rast i razmnožavanje ćelija bakterije S. Enteritidis na modelu hrane. ...................................... 35

3.6. Statistička analiza dobijenih podataka ............................................................................... 36

4. REZULTATI I DISKUSIJA .................................................................................................. 37

4.1. Prinos etarskog ulja ............................................................................................................ 37

4.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste O. basilicum........................................ 38

4.3. Efekat etarskog ulja bosiljka na rast vrste Salmonella Enteritidis u modelu hrane ........... 38

5. ZAKLJUČAK ......................................................................................................................... 39

6. LITERATURA ........................................................................................................................ 39

MASTER RAD

1

Lečenje biljem ima dugu tradiciju u narodnoj medicini. Mnoge lekovite biljke su

proučavane, kako u pogledu svog sastava, tako i u pogledu njihovog terapeutskog delovanja

(Bisenić & Veljković, 1988). Na osnovu podataka Svetske zdravstvene organizacije,

lekovitim biljem se leči oko 80% čovečanstva. Danas je poznato da veliki broj biljaka sadrži

metabolite koji ispoljavaju specifična farmakološka delovanja u organizmu čoveka i životinja

(Jančić & Stojanović, 2008). Etarska ulja predstavljaju sekundarne metabolite koji se

sintetišu u sekretornim strukturama aromatičnih biljaka (Kostić et al., 2012). Upotreba začina

i etarskih ulja, kao prirodnih komponenti u konzerviranju hrane, usmerena je ka produženju

održivosti namirnica, smanjenju ili eliminisanju broja bakterija i povećanju kvaliteta samog

proizvoda (Tajkarimi et al., 2010). Sigurnost i bezbednost hrane je osnovna briga kako

potrošača tako i proizvođača. Povećan je interes za hranom koja će imati duži rok trajanja uz

što manju upotrebu hemijskih antimikrobnih agenasa, zbog negativnih (toksičnih ili čak

kancerogenih) efekata koje mogu imati po zdravlje ljudi (Witkowska et al., 2013).

Salmonella Enteritidis je patogen koji može dovesti do salmoneloze, bolesti koja se javlja kao

crevno oboljenje nakon konzumiranja zaražene namirnice. Važni izvori ovih infekcija

predstavljaju meso i proizvodi od mesa kontaminirani ovim alimentarnim patogenima

(Nastasijević, 2009). Sa zdravstvenog aspekta, sve veći problem u proizvodnji mesa, pored

hemijskih aditiva i upotrebe soli koja može dovesti do hipertenzije i kardiovaskularnih

oboljenja, predstavljaju i patogeni koji se nalaze u hrani (Bošković et al., 2013).

Mnoge aromatične biljke se koriste kao dodatak jelima u vidu začina. Etarska ulja

začinskih biljaka često predstavljaju prirodne antimikrobne supstance. Zahvaljujući

antibakterijskim svojstvima, etarska ulja mogu biti potencijalni konzervansi hrane kao

alternativa sintetičkim konzervansima. Jedna od začinskih biljaka koja se širom sveta koristi

u ishrani je bosiljak. Brojnim istraživanjima je dokazana antimikrobna aktivnost etarskog ulja

bosiljka, ali njegov potencijal kao konzervansa hrane do sada nije ispitan.

1. UVOD

MASTER RAD

2

1.1. Začinske biljke i njihova upotreba

Začini biljnog porekla predstavljaju cele, izmrvljene ili sprašene biljne organe ili

njihove delove koji uglavnom sadrže jake mirisne ili aromatične supstance, a koriste se za

oplemenjivanje hrane. To su sveži ili sušeni korenovi, kora, listovi, cvetovi, plodovi ili

semena. Svoj karakterističan miris i ukus većina začina duguje isparljivim etarskim uljima

(Jančić & Stojanović, 2008).

Veliki broj začina je pokazao antimikrobno dejstvo protiv različitih tipova

mikroorganizama (Škrinjar & Nemet, 2009). Pored toga što doprinose poboljšanju ukusa i

arome hrane, mogu delovati i protiv brojnih patogena. Zahvaljujući aktivnim komponentama

(fenolima, alkoholima, aldehidima, ketonima), etarska ulja mogu poboljšati stabilnost i

sigurnost očuvanja hrane, pa se u prehrambenoj industriji koriste kako bi sprečili njeno

kvarenje i produžili održivost namirnica (Tajkarimi et al., 2010).

Lekovita svojstva ima veliki broj začinskih biljaka. Naše podneblje je bogato

aromatičnim biljkama koje se koriste kao začini i istovremeno blagotvorno deluju na

probavu, disanje ili cirkulaciju. Iz porodice usnatica (Lamiaceae) poznate su sledeće začinske

vrste: timijan, majčina dušica, bosiljak, ruzmarin, žalfija, nana, origano, majoran, matičnjak

(Jančić & Stojanović, 2008). Jestive lekovite biljke koje se koriste kao začini (ruzmarin,

origano, timijan, bosiljak, beli luk, karanfilić, đumbir) uspešno se koriste pojedinačno ili u

kombinaciji sa drugim metodama čuvanja hrane. Njihova efikasnost zavisna je od pH,

temperature skladištenja, količine kiseonika i koncentracije komponenti etarskih ulja tih

biljaka (Tajkarimi et al., 2010).

1.1.1. Etarska ulja začinskih biljaka kao značajni antimikrobni biljni

sekundarni metaboliti

Upotreba biljaka je stara koliko i čovečanstvo. Do početka XX veka skoro 90%

lekova bilo je na bazi prirodnih preparata. Danas je poznato oko 18000 aromatičnih i oko

60000 lekovitih biljaka.

Sekretorne strukture (pojedinačne ćelije ili tkiva) biljaka mogu produkovati različite

sekrete koji mogu imati odgovarajuće fiziološke i ekološke funkcije. U njima se kod

aromatičnih biljaka sintetišu brojni sekundarni metaboliti među kojima dominiraju etarska

MASTER RAD

3

ulja (Kostić et al., 2012). Sekundarni metaboliti nisu podjednako zastupljeni u biljnom

organizmu (Jančić & Stojanović, 2008). Etarska ulja (eterična ili esencijalna) predstavljaju

lako isparljive tečnosti različite konzistencije (Kitić, 2010), a dobijaju se iz aromatičnih

biljaka postupcima destilacije. Etarska ulja najčešće predstavljaju bistre, lako pokretljive

tečnosti i u zavisnosti od sastava, mogu imati različitu boju. Najbolje se rastvaraju u

apsolutnom etanolu, hloroformu, etru i masnim uljima, dok su u vodi nerastvorna (Pecarski,

2014).

1.1.2. Opšti sastav etarskih ulja

U narodnoj medicini se koriste mnoge aromatične biljne vrste koje sadrže etarska ulja,

a koja se sastoje od hemijske smeše nekoliko desetina ili stotina različitih vrsta jedinjenja (De

Sousa, 2011). U jednom etarskom ulju se može čak naći 800 jedinjenja (Kitić, 2010).

Etarska ulja se sastoje iz hemijskih jedinjenja koja, kao osnovne gradivne jedinice,

sadrže ugljenik, vodonik i kiseonik. Ova jedinjenja se dalje mogu podeliti na ugljovodonike

(koji su sastavljeni iz terpena) i na oksigenovana jedinjenja (aldehidi, ketoni, estri, alkoholi,

fenoli) čija zastupljenost može biti različita (Baser & Buchbauer, 2009; Kostić et al., 2012).

Terpenoidi su glavni i osnovni sastojci koji značajno utiču na miris ulja (Kostić et al., 2012).

Terpeni se klasifikuju u zavisnosti od broja izoprenskih jedinica – C5 (izoprena) kao

hemiterpeni, monoterpeni (C10), seskviterpeni (C15), diterpeni, triterpeni, tetraterpeni itd. Od

terpenoida u etarskim uljima su najčešći monoterpeni (koji čine čak 90% ulja) i seskviterpeni.

Ostala jedinjenja koja ulaze u hemijski sastav ulja prisutna su u manjoj količini (De Sousa,

2011).

Do različitosti u sadržaju i sastavu aktivnih biljnih komponenti može doći zbog

različitog geografskog biljnog porekla, zbog uslova rasta, sušenja (Witkowska et al., 2013),

vremena sakupljanja uzoraka (sezone berbe), korišćenih metoda za ekstrakciju ulja

(Hyldgaard et al., 2012; Beatović, 2013), biljnog organa iz kojeg se ekstrahuju i faze ciklusa

u kojoj se biljka nalazi. Etarska ulja ekstrahovana iz biljaka tokom ili odmah nakon cvetanja

ispoljavaju najjači antimikrobni potencijal (Burt, 2004; Bošković et al., 2013). U zavisnosti

od vremena oprašivanja određene biljne vrste, menja se produkcija etarskog ulja u toku dana.

Tako je produkcija mirisa najveća u podne kod biljaka koje se oprašuju danju, jer su tada

insekti najaktivniji (Kitić, 2010).

MASTER RAD

4

1.1.3. Biološke funkcije etarskih ulja

Etarska ulja su značajna za metabolizam biljke (fiziološka funkcija) i biohemijske

interakcije biljaka sa životnom sredinom, odnosno interakcije biljaka sa abiotičkim i

biotičkim sredinskim faktorima (ekološka funkcija) (Kostić et al., 2012).

U količini i sastavu etarskih ulja može doći do varijacija koje predstavljaju reakciju

biljke na varijabilnost ekoloških uslova životne sredine (Kitić, 2010). Delimično je

prihvaćena teorija da biljke stvaraju specifičnu mikroklimu pomoću svojih isparljivih

produkata i da se na taj način štite od prekomerne transpiracije u stresnim, nepovoljnim

uslovima (Ranđelović et al., 2012). Različite komponente ulja mogu delovati privlačno ili

odbojno na druge organizme, što utiče na uspostavljanje različitih odnosa izmedju biljke sa

drugim živim bićima. Ulja pojedinih biljnih vrsta deluju fitotoksično što inhibira klijanje

semena ili rast drugih vrsta (Kitić, 2010) i ova se pojava naziva autopatija (Ranđelović et al.,

2012). Miris biljke učestvuje u privlačenju insekta oprašivača, za šta su odgovorni hemijski

atraktanti prisutni u ulju. Pored navedenih, imaju i odbrambenu ulogu koja se zasniva

prvenstveno na njihovim baktericidnim i fungicidnim osobinama, a kojom štite biljke od

patogenih mikroorganizama. Nakon oštećenja od strane insekata, glodara ili ljudi, biljka luči

etarska ulja koja svojom antimikrobnom aktivnošću sprečavaju dalji prodor patogena (Kitić,

2010). Pored ovoga, sastav etarskih ulja može davati specifičan ukus biljkama i tako ih štititi

od preživara i drugih herbivora.

1.1.4. Primena etarskih ulja

Prirodni antimikrobni agensi dobijeni iz biljnih ulja su vekovima korišćeni u

konzervaciji hrane u različitim državama Azije (Kina, Indija). Etarska ulja i začine su koristili

i rani Egipćani (Tajkarimi et al., 2010). Primena etarskih ulja može biti raznovrsna. Koriste se

u kozmetičkoj industriji, dodaju se kao sastojci parfemima, u prehrambenoj industriji se

aplikuju kao aromatični sastojci koji hrani daju poseban ukus. Primenjuju se i u

farmaceutskoj industriji u vidu aktivnih komponenti lekova, kao antibakterijska i

antimikrobna jedinjenja i u aromaterapiji (Chamorro et al., 2012). Našla su primenu i u

industriji cigareta, a u poslednje vreme se koriste i kao biocidi i repelentne supstance protiv

insekata (Baser & Buchbauer, 2009).

MASTER RAD

5

1.1.5. Etarska ulja kao antimikrobni agensi

Efekat antimikrobne aktivnosti zavisi od hemijskog sastava i koncentracije etarskih

ulja začinskih biljaka (vrste začina), vrste namirnica i mikroorganizama na koje se primenjuje

(Škrinjar & Nemet, 2009). Bioaktivne komponente svoj antimikrobni efekat ispoljavaju na

različite načine: degradacijom ćelijskog zida, oštećenjem ćelijske membrane, gubljenjem

ćelijskih komponenti, kao i promenama u sintezi DNK i RNK (Witkowska et al., 2013).

Važna karakteristika etarskih ulja i komponenata koje ulaze u njihov sastav je hidrofobnost,

koja povećava permeabilnost bakterijske ćelijske membrane i na taj način olakšava prolazak

aktivnih komponenti kroz njen lipidni sloj. Antimikrobno dejstvo etarskih ulja ogleda se

prvenstveno u promeni propustljivosti ćelijske membrane, koje je obično praćeno gubitkom

osmotske kontrole ćelije (Stanković et al., 2011).

Antimikrobna aktivnost zavisi od niza faktora kao što su metoda ekstrakcije etarskih

ulja iz biljnog materijala, količina inokuluma, faza rasta, podloga koja se koristi, svojstva

hrane (pH, sadržaj masti, sadržaj proteina, vode), vreme inkubacije, način pakovanja i fizička

struktura hrane. Visok sadržaj masti u hrani (meso, proizvodi od mesa) utiče na potencijal

etarskog ulja tako što ga umanjuje (Tajkarimi et al., 2010). Prema Burt (2004) etarska ulja

deluju slabije u masnoj hrani jer se rastvaraju u lipidnoj fazi hrane (lipidima hrane) i samim

tim imaju slabiju sposobnost, tj. nižu koncentraciju kojom napadaju bakterije (Mejlholm &

Dalgaard, 2002; Burt, 2004).

Do poteškoća u tačnom utvrđivanju antimikrobne aktivnosti može doći zbog

korišćenja različitih metoda kojima se ispitije antimikrobna aktivnost. Ne postoji standardni

način za određivanje antibakterijske aktivnosti potencijalnih antimikrobnih komponenti, zbog

čega rezultati nekih istraživanja mogu biti neuporedivi (Beatović, 2013). Ulja ispoljavaju

bakteriostatičku ili baktericidnu aktivnost (Stanković et al., 2011). Rad Gutierrez et al. (2009)

je pokazao da etarska ulja mogu biti efikasna protiv patogena i bakterija koje dovode do

kvarenja hrane onda, kada se primenjuju na hrani koja sadrži visok nivo proteina, pri kiseloj

pH vrednosti i umerenom nivou prostih šećera.

Kako bi aplikacija etarskih ulja u različitim prehrambenim proizvodima bila uspešna,

neophodno je odrediti interakciju između aktivnih komponenti ulja i komponenata hrane.

Aktivnost određenih antimikrobnih agensa može biti umanjena zbog uticaja neke

komponente koja je prisutna u hrani (Gutierrez et al., 2009; Škrinjar & Nemet, 2009).

MASTER RAD

6

Pokazano je da su neki biljni ekstrakti znatno redukovali patogene nekih prehrambenih

proizvoda, dok su drugi imali nizak ili uopšte nisu imali antimikrobni efekat (Škrinjar &

Nemet, 2009). Fizički uslovi koji poboljšavaju efekat etarskih ulja su niska vrednost pH,

niska temperatura i nizak nivo kiseonika. Pri niskoj pH raste hidrofobnost etarskih ulja što

mu omogućava lakše i brže rastvaranje u lipidima ćelijske membrane ciljnih bakterija (Burt,

2004). Uticaj etarskih ulja na bakterije koje dovode do kvarenja hrane podrazumeva procenu

njegove efikasnosti u prehrambenim proizvodima ili modelima sistema koji sadrže sličan

sastav hranljivih komponenti. Interakcija komponenata hrane i komponenata etarskih ulja

može se istražiti merenjem porasta broja mikroorganizama u medijumu za kulturu koji će

sadržati različite koncentracije masti, proteina, skroba i onih antimikrobnih jedinjenja čija se

aktivnost ispituje. Ovakvi eksperimenti se vrše na takozvanim modelima hrane (Gutierrez et

al., 2009; Hyldgaard et al., 2012).

Tokom interakcije kombinacije dva ili više antimikrobna agensa tj. komponenti

etarskog ulja, može doći do tri tipa ishoda:

- sinergističkog,

- aditivnog ili

- antagonističkog.

Sinergija predstavlja bolju i jaču antimikrobnu aktivnost pri istovremenom delovanju

dveju antimikrobnih komponenti, nego u slučaju njihovih pojedinačnih efekata (kombinovani

efekat veći je od zbira efekata pojedinačnih jedinjenja). Mogućnost nastanka sinergističkog

efekta se dešava kada antimikrobni agensi imaju različita mesta delovanja tj. kada napadaju

različita mesta na ćeliji ili u njoj (Burt, 2004; Hyldgaard et al., 2012). Kombinacijom

različitih etarskih ulja mogu se postići sinergistički efekti. Sinha & Gulati (1990) su pokazali

da je kombinacijom etarskih ulja dobijenih iz biljkaka Ocimum basilicum i Ocimum sanctum

u odnosu 1:1 postignut sinergistički efekat, koji je bio efikasniji nego kada bi se svako od

ovih ulja pojedinačno upotrebilo.

Aditivni uticaj se postiže kada se kombinacijom antimikrobnih agensa dobije

kombinovani efekat jednak zbiru efekata pojedinačnih jedinjenja.

Pod antagonizmom se podrazumeva pojava kada zajednički efekat mešavine

antimikrobnih jedinjenja ima slabije dejstvo nego kada se te supstance aplikuju zasebno

(Burt, 2004; Hyldgaard et al., 2012).

MASTER RAD

7

1.1.6. Osetljivost Gram-negativnih i Gram-pozitivnih sojeva prema

začinskim biljkama i njihovim etarskim uljima

Gram-pozitivni sojevi su osetljiviji na tretmane biljnim i začinskim ekstraktima, što se

verovatno dešava zbog razlika u strukturi ćelijskog zida između Gram-pozitivnih i Gram-

negativnih bakterija (Witkowska, et al., 2013).

Ćelijski zid Gram-negativnih bakterija je u odnosu na ćelijski zid Gram-pozitivnih

bakterija tanji, manje kompaktan ali znatno kompleksnijeg sastava. Izgrađen je iz dvoslojne

spoljašnje membrane. Ispod nje se nalazi unutrašnja membrana odnosno tanak sloj

peptidoglikana. Spoljašnju membranu čine lipoproteini, fosfolipidi, porini, neporinski

proteini, lipopolisaharid (LPS) (Arsenijević et al., 1999). Lipopolisaharidni sloj Gram-

negativnih bakterija predstavlja barijeru za prolazak brojnih makromolekula. Spoljašnja

membrana ipak nije u potpunosti nepropustljiva jer proteini porini, koji su prisutni u ovom

sloju, mogu da kreiraju velike kanale i da omoguće prolaz nekim molekulima i prodiranje u

periplazmatični prostor i citoplazmatičnu membranu (Witkowska et al., 2013). U bakterijsku

ćeliju kroz kanale proteinskih porina ulaze šećeri, aminokiseline, vitamini kao i mnogi

antimikrobni lekovi, npr. penicilin. Pošto kroz njih teško prolaze veliki molekuli, oni mogu

da doprinesu relativno visokoj rezistenciji Gram-negativnih bakterija na antimikrobne agense

(Arsenijević et al., 1999).

Dakle, spoljašnja membrana Gram-negativnih bakterija sadrži hidrofilne

lipopolisaharide (LPS) što predstavlja barijeru za makromolekule i hidrofobne komponente,

čime se postiže veća tolerancija Gram-negativnih bakterija na hidrofobne antimikrobne

sastojke kakvi su prisutni u etarskim uljima (Hyldgaard et al., 2012).

MASTER RAD

8

1.2. Opšte karakteristike roda Ocimum.

Rod Ocimum obuhvata 50-60 vrsta koje se mogu naći u suptropskoj zoni Azije i

Afrike, a sa znatno manjom zastupljenošću i u Americi (Gajić et al., 1974). Vrste roda

Ocimum su u suštini tropske vrste i neophodna im je toplota za razviće (Hiltunen & Holm,

2003). U Srbiji se gaji samo jedna vrsta (Gajić et al., 1974).

Hemotipska klasifikacija Ocimum vrsta je definisana na osnovu procentualne

zastupljenosti dominantnih komponenti etarskog ulja. Ona komponenta koja se nalazi u većoj

količini od 20% određuje hemotipsku pripadnost (Beatović, 2013).

Morfološka raznolikost unutar vrsta je naglašena vekovima zbog varijacija u

pigmentaciji, obliku i veličini lista. Taksonomija se dodatno komplikuje postojanjem

hemotipova i hemijskih razlika u okviru vrsta koje se ne razlikuju značajno po morfologiji

(Simon et al., 1990). Postoji veći broj varijeteta u okviru vrste Ocimum basilicum L. kako na

osnovu morfološke građe tako i na osnovu hemijskog sastava etarskog ulja. Prema

hemijskom sastavu se određuje hemotipska pripadnost i od njega zavisi antimikrobna

aktivnost (Jelačić et al., 2011).

Na osnovu sastojaka koji dominiraju u etarskom ulju bosiljka i prema geografskom

poreklu može se klasifikovati u četiri glavna hemotipa (Beatović, 2013):

Evropski hemotip sa visokim sadržajem linalola (35-50%) i metil kavikola (15-25%)

Reunion hemotip kojeg karakteriše metil kavikol kao glavna komponenta s

zastupljenošću od 80% i više

Tropski (cimet bosiljak) sa dominantnom komponentom metil cinamat

Eugenolni hemotip gde je karaterističan visok sadržaj eugenola

1.2.1. Opšte karakteristike bosiljka (Ocimum basilicum L.)

Ocimum basilicum L., poznat kao običan ili slatki bosiljak, pripada familiji

Lamiaceae. Poreklom je iz Indo-Malajskog regiona (Shafique et al., 2011). Bosiljak je

jednogodišnja biljka, prijatnog mirisa. Stabljike su uspravne 20-45 cm, busenasto razgranate i

gole. Listovi su rombični, celog ili nazubljenog oboda, na dršci, dugački 3-5 cm, široki 2-5

cm. Cvetovi imaju kratku cvetnu dršku, po 6 je složeno u pršljenove koji su na vrhu stabljike

MASTER RAD

9

približeni. Orašice su jajaste, tamnomrke do crne boje, dugačke 1.5-2 mm. Cveta od juna do

oktobra. Seku se izdanci, vezuju u kite i suše na promaji. Sveži listovi bosiljka su veoma

aromatični, ljuti, osvežavajući. Dodaju se salatama, čorbama, varivima, ribi, mesu, siru, kao

dodatak soku od paradajza (Gajić et al., 1974; Jančić & Stojanović, 2008).

Bosiljak uspeva i u predelima sa umerenom klimom, pa je područje Mediterana

pogodno za njegov razvoj. Najveći sadržaj etarskog ulja bosiljak ima u periodu neposredno

pre cvetanja (sadržaj je u rasponu 0.1-0.8%), pa se u tom periodu najčešće bere.

Koncentracija etarskog ulja se u biljnom materijalu povećava nakon branja i sušenja (Jančić

et al., 1995; Karan et al., 2008). Na našem podneblju i klimatskim uslovima, gaji se na

otvorenom polju od maja do kraja septembra (Jelačić et al., 2005). Za gajenje bosiljka

najpovoljnija su humusna i sunčana zemljišta, zaklonjena od vetra zbog veoma velike

osetljivosti na hladnoću. Bere se nadzemni deo biljke (Basilici herba) na jakom podnevnom

suncu. Biljka se potom suši u hladu, na promajnom mestu, nakon čega se čuva u dobro

zatvorenim kutijama kako ne bi došao u dodir sa vazduhom i izgubio svoja lekovita svojstva

(Bisenić & Veljković, 1988).

Carstvo Plantae

Razdeo Magnoliophyta

Klasa Magnoliopsida

Red Lamiales

Familija Lamiaceae

Rod Ocimum

Vrsta Ocimum basilicum

Slika 1: Ocimum basilicum L.

http://agroplus.rs/serijal-lekovito-

bilje-140/

http://www.mdidea.com/products/

proper/proper08603.html

Tabela 1: Sistematika Ocimum basilicum L.

http://agroplus.rs/serijal-lekovito-bilje-140/

http://agroplus.rs/serijal-lekovito-bilje-140/

MASTER RAD

10

Slika 2: Ocimum basilicum L.

http://www.missouriplants.com/Whiteopp/Ocimum_basilicum_plant.jpg

1.2.2. Primena bosiljka (Ocimum basilicum L.)

Naziv potiče od grčke reči “basilikon” što u prevodu znači kraljevski (Karan et al.,

2008). Naziva se “kraljem biljaka”, koji sadrži obilje fitohemikalija sa značajnim hranljivim,

antioksidativnim i drugim svojstvima koja pozitivno deluju na zdravlje. Uzgaja se radi

proizvodnje etarskih ulja, u kulinarstvu gde se suvo lišće dodaje kao začin jelima ili kao

ukrasna biljka. Koristi se kao sastojak u pripremanju hrane, posebno u Mediteranskoj kuhinji.

Etarsko ulje bosiljka, dobijeno iz lišća, ima sposobnost inhibicije nekoliko vrsta patogenih

bakterija koje su postale otporne na često korišćene antibiotike. Zbog ispoljavanja širokog

spektra aktivnosti (antimikrobne, insekticidne, antioksidativne), bosiljak se primenjuje u

prehrambenoj, farmaceutskoj, kozmetičkoj industriji i zbog veoma prijatnog mirisa u

aromaterapiji (Shafique et al., 2011). Basilici herba i Basilici aethroleum, odnosno nadzemni

zeljasti deo biljke i etarsko ulje bosiljka se koriste u lekovite svrhe (Beatović, 2013).

Listovi i delovi cveta bosiljka (Ocimum basilicum L.) se tradicionalno koriste kao

antispazmolitici (sredstva protiv grčeva), aromatični agensi, karminativi (sredstva protiv

nadimanja), digestivi (pomaže varenje) i tonici. Koristi se i kao narodni lek protiv raznih

http://www.missouriplants.com/Whiteopp/Ocimum_basilicum_plant.jpg

MASTER RAD

11

bolesti kao što su: groznica, loše varenje, mučnine, grčevi u stomaku, gastroenteritisi,

migrena, nesanica, depresija, gonoreja, dizenterija. Takođe se primenjuju kao tretmani protiv

akni, protiv anosmije, uboda insekata, ujeda zmija i kožnih infekcija (Adigüzel et al., 2005).

1.2.3. Pregled istraživanja hemijskog sastava etarskog ulja bosiljka

Charls & Simon (1990) su poredili uticaje tri tipa ekstrakcije na sadržaje etarskih ulja

i sastav različitih delova biljaka Ocimum spp. Etarska ulja su ekstrahovana iz listova, cvetova

i stabljike vrsta Ocimum basilicum, O. kilimandscharicum i O. micranthum organskim

rastvaračima, hidrodestilacijom i parnom destilacijom. Veći prinos ulja je dobijen parnom

destilacijom nego hidrodestilacijom, ali je putem obe destilacije dobijen sličan broj

komponenti i glavni sastojci su bili relativno sličnih koncentracija. Osnovni sadržaj i sastav

ulja je varirao u zavisnosti od biljne vrste i biljnih delova koji su korišćeni. Kod vrste

Ocimum basilicum sadržaj etarskog ulja je najviši u cvetovima. Sastav etarskog ulja može

varirati u zavisnosti od metode ekstrakcije. Ekstrakcijom organskim rastvaračima je bilo

manje sastojaka u ulju (oko 22 komponente) i relativni procenat glavnih komponenti je bio

različit u odnosu na hidro i parnu destilaciju (gde je dobijeno 32-33 sastojka). Slični rezultati

su dobijeni i za druge dve vrste bosiljka. Od tri metode ekstrakcije, hidrodestilacija je

rezultirala najvećim brojem sastojaka. Hidrodestilacijom je sadržaj etarskog ulja vrste

Ocimum basilicum bio veći u cvetovima (67%) nego u listovima (32%). Kod ove biljne vrste

linalol, glavni sastojak, je bio najzastupljeniji (73.9) u cvetovima, dok je u listovima bio

prisutan sa 48.2%, a u stabljici sa 30.4%. Metil-kavikola je najviše bilo u listovima (31.6%),

u cvetovima (11.5%), a u stabljici (12.6%).

U radu Simon et al. (1990), dominantne komponente etarskog ulja vrste Ocimum

basilicum bile su linalol, metil-kavikol, zatim eugenol i 1.8-cineol.

Őzcan & Chalchat (2002) su ispitivali sastav etarskih ulja vrsta Ocimum basilicum L.

i Ocimum minimum L. iz Turske. Glavna komponenta vrste O. basilicum je bila metil eugenol

sa 78.02% a vrste O. minimum geranil acetat sa 69.48% što ukazuje na veliku različitost

njihovog hemijskog sastava.

Cilj rada Carvalho et al. (2006) je bio da se ispita uticaj vremena berbe, temperature i

perioda sušenja na prinos i hemijski sastav etarskog ulja O. basilicum. Uzorci koji su

sakupljani u 08:00 i 12:00 h imali su veći prinos etarskog ulja. Nakon pet dana sušenja,

koncentracija linalola se povećala sa 45.18% do 86.80%. Na osnovu ovih rezultata, najbolje

MASTER RAD

12

je da se O. basilicum sakuplja ujutru, a sušenjem na 40 °C pet dana se dobija etarsko ulje

bogatije linalolom.

Hussain et al. (2008) su istraživali hemijski sastav, antioksidantnu i antimikrobnu

aktivnost etarskih ulja nadzemnih delova bosiljka (O. basilicum L.) čiji je rast bio izložen

uticaju četiri godišnja doba (leto, jesen, zima, proleće). Prinos etarskih ulja dobijenih

hidrodestilacijom kretao se od 0.5-0.8%. Maksimalan iznos je zabeležen u zimskom periodu,

a minimalan u letnjem. Uzorci koji su sakupljeni zimi bili su bogatiji oksigenovanim

monoterpenima (68.9%) dok uzorci koji su prikupljani leti bili bogatiji seskviterpenskim

ugljovodonicima (24.3%). Etarska ulja bosiljka se razlikuju u sastavu hemijskih jedinjenja,

što zavisi od varijacija u hemotipu, listovima, cvetovima i poreklu biljke. Ulja dobijena iz

zimskih i jesenjih uzoraka imaju veću antimikrobnu aktivnost što se može pripisati većem

sadržaju linalola i drugih oksidovanih jedinjenja u ovim uzorcima. Sezona rasta i razvoja

biljaka utiče na različit hemijski sastav, antioksidantnu i antimikrobnu aktivnost etarskih ulja

bosiljka. Ove razlike mogu da se pripišu sezonskim promenama u temperaturi i vlažnosti kao

i različitim fazama biljnog metabolizma.

Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn (2010) su određivali antimikrobnu aktivnost

etarskog ulja bosiljka sa Tajlanda (Bangkok), gde je u svrhu ekstrakcije korišćeno lišće

bosiljka. Prinos ulja je bio 1.86% (v/w), a analizom njegovog hemijskog sastava utvrdili su

najveći sadržaj linalola (64.35%) kao glavne komponente, zatim 1.8-cineola (12.28%) i

eugenola (3.21%).

Ananda et al. (2011) su uporedili hemijski sastav etarskih ulja tri vrste roda Ocimum

gajenih u Indiji: O. basilicum, O. klimandscharicum i O. gratissimum dobijenih sa nadzemnih

delova biljke. U sva tri etarska ulja je pronađeno ukupno 30 komponenti. Glavna komponenta

ulja vrste O. basilicum je metil-kavikol (70.04%) kojeg prati linalil acetat (22.54%), ulja O.

klimandscharicum je kamfor (56.07%) a ulja O. gratissimum eugenol (53.89%) i cis-ocimen

(23.29%).

Hanif et al. (2011) su analizirali komponente etarskog ulja Ocimum basilicum u

Omanu. Prinos ulja je bio 0.17%. Identifikovano je 75 komponenti u ulju sa linalolom kao

najzastupljenijom komponentom (69.9%).

Ružičić et al. (2011) su analizirali uticaj agrotehničkih mera na prinos etarskog ulja

Ocimum basilicum L. i na njegov sastav. Na osnovu rezultata, zaključeno je da se

povećanjem dubine oranja povećava prinos i sadržaj etarskog ulja kod proizvodnje bosiljka.

MASTER RAD

13

Pri dubini oranja od 20 cm, sadržaj etarskog ulja kretao se od 0.40 do 0.60%, a pri dubini

oranja od 40 cm kretao se od 0.63 do 0.87%.

1.2.3.1. Hemijski sastav bosiljka sa teritorije Srbije

Soković et al. (2010) su proučavajući sastav etarskog ulja O. basilicum iz Srbije,

dobijenim metodom hidrodestilacije, utvrdili da je glavna komponenta bila linalol sa

zastupljenošću 69.3%, zatim metil-kavikol (2.4%), pa limonen (1.0%), a nakon njega 1.8-

cineol (0.8%). Prinos ulja je 0.5% (v/w).

Jelačić et al (2011) su vršili ispitivanje hemijskog sastava deset populacija bosiljka

Ocimum basilicum L. koje se gaje na prostorima Republike Srbije. Prinos etarskog ulja u

suvoj herbi je iznosio od 0.87 do 1.84%. Uzorci herbe su sakupljani u fazi cvetanja biljke, a

rezultati su ukazali da ispitivane populacije pripadaju evropskom hemotipu. Glavna

komponenta svih deset analiziranih ulja je bila monoterpen linalol sa opsegom zastupljenosti

od 51.52% do 74.73% za kojim sledi fenilpropanoid metil-kavikol sa opsegom od 2.49% do

18.97%. Naredna komponenta je bila 1.8-cineol sa zastupljnošću od 1.36 do 4.44%, a nakon

njega germakren D sa rangom zastupljnosti od 2.17 do 4.30%. Komparacijom hemijskog

sastava proučavanih etarskih ulja bosiljka, dominantne komponente se mogu podeliti na:

monoterpene, seskviterpene i fenilpropanoide. Od ukupno 33 komponenti koje su

identifikovane, 51.51% pripadalo je monoterpenima, 42.42% seskviterpenima a ostatak

fenilpropanoidima.

Beatović et al. (2015) su istraživali hemijski sastav dvanaest sorti Ocimum basilicum

L. koje rastu u Srbiji. Prinos ulja kretao se u opsegu od 0.65 do 1.90%. Ukupno je

identifikovano 75 komponenti. Analizama je utvrđeno da većina sorti bosiljka koje rastu u

Srbiji pripada ”linalolnom hemotipu” što je u skladu sa hemotaksonomskom klasifikacijom

bosiljka koja se bazira na osnovu geografskog porekla, gde su glavne komponente evropskih

sorti (tipova) bosiljka linalol i metil kavikol. Oksigenovani monoterpeni sa linalolom kao

glavnim sastojkom bili su dominantni kod osam sorti bosiljka. Zastupljenost linalola se

kretala u opsegu od 30.3% - 58.6%. Prisustvo metil-kavikola u etarskom ulju devet sorti

bosiljka kretala se od 0.1 do 16.3%. Njegovo postojanje nije identifikovano u etarskom ulju

Holanđanin i Compact sorti bosiljka, dok je kod sorte Siam Queen prisutan sa 83.6%.

MASTER RAD

14

1.2.4. Pregled istraživanja antimikrobnog efekta etarskog ulja bosiljka

(Ocimum basilicum L.)

Insekticidno, fungicidno, antimikrobno dejstvo etarskih ulja dobijenih iz vrsta

Ocimum je pretežno povezano sa njihovim glavnim komponentama linalolom i metil-

kavikolom (Simon et al., 1990).

Istraživanje koje su vršili Reuveni et al. (1984) je pokazalo da etarska ulja različitih

vrsti Ocimum basilicum i njihovih komponenti imaju različite inhibitorne efekte protiv

Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum i Rhizopus nigricans. Ova različita antifungalna

aktivnost je uglavnom povezana sa procentom zastupljenosti glavnih komponenti: cineol,

linalol, metil-kavikol i eugenol.

Lachowichz et al. (1998) su istraživali antimikrobnu aktivnost etarskih ulja

ekstrahovanih hidrodestilacijom iz pet različitih sorti bosiljka Ocimum basilicum L. protiv

Gram-pozitivnih i Gram-negativnih patogenih bakterija u hrani, kvasaca i plesni. Agar

dilucionom metodom (agar well method) utvrđeno je da je većina (29 od 33 sojeva) testiranih

organizama je bilo osetljivo na svih pet etarskih ulja. Mucor piriformis je pokazao najveću

osetljivost, dok su Flavimonas oryzihabitans, Pseudomonas aeruginosa, Ps. fluorescens i Ps.

putida bili rezistentni.

Opalcheova & Obreshkova (2003) su ekstrahovali etarsko ulje iz nadzemnih delova

Ocimum basilicum L., čija je glavna komponenta bila linalol (54.95%) i analizirali njegovu

aktivnost na veoma rezistentne kliničke izolate roda Staphylococcus, Enterococcus i

Pseudomonas. Bosiljak je pokazao snažan inhibitorni efekat na testirane bakterije.

Sartoratto et al. (2004) su proučavali etarska ulja dobijena sa nadzemnih delova

brojnih biljaka Mentha piperita, M. spicata, Thymus vulgaris, Origanum vulgare, O. applii,

Aloysia triphylla, Ocimum gratissimum, O. basilicum, gde je većina proučavanih etarskih ulja

bila efikasna protiv Enterococcus faecium i Salmonella choleraesuis. Umereno inhibitorno

dejstvo na Staphylococcus aureus su imali A. triphylla i O. basilicum.

Adigüzel et al. (2005) su ispitivali in vitro antimikrobna svojstva etanolnog,

metanolnog i heksanskog ekstrakta bosiljka Ocimum basilicum L. Ukupno je proučavano 146

mikroorganizama, u okviru kojih je bilo 56 bakterija, četiri vrsta gljiva i jedna vrsta kvasca i

to disk-difuzionom metodom i metodom mikrodilucije. Rezultati su pokazali da nijedan od

testiranih ekstrakta ne poseduje antigljivičnu aktivnost. Heksanski i metanolni ekstrakt su

inhibirali tri izolata od 23 ispitivana sojeva kvasca Candida albicans. Heksanski ekstrakt je

MASTER RAD

15

pokazao jači i širi spektar antibakterijske aktivnosti, zatim metanolni ekstrakt 10.9% i

etanolni ekstrakt koji je inhibirao 6% od 146 testiranih bakterijskih sojeva. Minimalna

inhibitorna zona heksanskog ekstrakta se kretala od 125 do 250 μl/ml, metanolnog 62.50 do

500 μl/ml i etanolnog ekstrakta se kretala od 125 do 250 μl/ml. Rezultati su pokazali da

etanolni ekstrakt O. basilicum ima antimikrobno dejstvo na devet sojeva iz rodova Bacillus,

Escherichia i Staphylococcus. Metanolni i heksanski ekstrakt su pokazali antibakterijsko

dejstvo protiv 11 i 13 sojeva šest bakterijskih rodova uključujući Acinetobacter, Bacillus,

Brucella, Escherichia, Micrococcus i Staphylococcus i antikandidalno dejstvo protiv tri

izolata C. albicans. Na osnovu ovih rezultata, heksanski ekstrakt ima širu i jaču

antibakterijsku aktivnost u poređenju sa druga dva ekstrakta. Ova studija je pokazala da

ekstrakti Ocimum basilicum sadrže komponente sa antimikrobnim dejstvom protiv C.

albicans i nekih bakterijskih patogena (Adigüzel et al., 2005).

Neodorostova et al. (2009) su procenjivali antibakterijska svojstva 27 etarskih ulja na

pet vrsta bakterija koje su patogeni hrane: Escherichia coli, Listeria monocytogenes,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis i Staphylococcus aureus pomoću metode

evaporacije diska (disk volatilisation method). Od 27 etarskih ulja, 13 je bilo aktivno protiv

najmanje jednog bakterijskog soja sa koncentracijama koje su se kretale od 0.0083-0.53

μl/cm3. U ovoj studiji, među analiziranim uljima koja se mogu koristiti u kontroli bakterijskih

patogena hrane nalazio se i bosiljak.

Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn (2010) su u svom istraživanju proučavali

antimikrobnu aktivnost devet etarskih ulja protiv jedne referentne i pet kliničkih sojeva

Salmonella Enteritidis, gde je ulje bosiljka na osnovu veličine zone inhibicije i minimalne

inhibitorne koncentracije pokazalo najjaču aktivnost protiv svih testiranih bakterija, a S.

Enteritidis SE3 (klinički soj) je bila najosetljivija na sva testirana ulja. Ulje je aplikovano na

tradicionalnu nham (kobasicu) u različitim koncentracijama od 50, 100 i 150 ppm. Hranljivi

uzorci su pripremani mešanjem mlevenog svinjskog mesa (62.5%), iseckanih i prokuvanih

svinjskih kožica (27.5%), dodavanjem soli (2.5%), šećera (2.5%) i mlevenog prženog pirinča

(10%), a koji su eksperimentalno zaraženi bakterijskim sojem SE3 i skladišteni na 4 °C

tokom 5 dana. Kada je ulje bosiljka dodato u eksperimentalno inokulisane hranljive uzorke

sojem SE3 i uskladišteno na 4 °C 5 dana, odgovor inokulisanih ćelija je varirao u zavisnosti

od koncentracije ulja koje je dodato. U kontrolnom uzorku, kojem nije dodavano ulje, broj

bakterija je bio 5 log CFU/g nakon 5 dana. U uzorku sa 50 ppm ulja bosiljka, broj bakterija je

brzo opao na 2 log CFU/g. U uzorcima koji su tretirani uljem bosiljka u većim

MASTER RAD

16

koncentracijama broj bakterija je bio manji od 1 log CFU/g. Korišćena je i kontrola na kojoj

ulje nije aplikovano. Rezultati koji su dobijeni tokom ovog rada ukazuju na to da se ulje

bosiljka može koristiti kao antimikrobni agens za kontrolu S. Enteritidis u ovoj vrsti hrane.

Ananda et al. (2011) su testirali antimikrobni uticaj tri etarska ulja vrsta O. basilicum,

O. klimandscharicum i O. gratissimum na Gram (+) bakterije (Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecalis), na Gram (-) bakterije (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) i

na gljivu Candida albicans. Protiv svih testiranih mikroorganizama najaktivnije je bilo ulje

vrste O. gratissimum, a najosetljivije su bile Candida albicans i Gram (+) bakterije. Ulje

vrste O. basilicum je imalo najjači uticaj na Candida albicans. Najslabije efikasnosti je bilo

ulje vrste O. klimandscharicum.

Hanif et al. (2011) su disk difuzionom metodom određivali antibakterijsku aktivnost

bosiljka u Omanu koji je najjaču aktivnost pokazao protiv Streptococcus pneumoniae,

Hemophilus influenzae, Candida albicans, Aspergillus niger, a rezistentne su bile

Pseudomonas putida i Pseudomonas aeruginosa.

Lv et al. (2011) su imali za cilj da istraže antimikrobnu efikasnost kombinacije

etarskih ulja određenih biljaka protiv nekih mikroorganizama u hrani. Na osnovu razmotrene

antimikrobne aktivnosti, organoleptičkih uticaja i troškova odabrali su četiri kombinacije

etarskih ulja: kombinacija ulja origana-bosiljka (0.313-0.313 μl/ml) za E. coli, bosiljka-

bergamota (0.313- 0.156 μl/ml) za S. aureus.

Shafique et al. (2011) su određivali antimikrobnu aktivnost etarskog ulja bosiljka na

Gram-pozitivne (Bacillus subtilis ATCC 6333, Enterococcus faecalis, Staphylococcus

aureus) i Gram-negativne (Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Escherichia

coli) bakterije zajedno sa dejstvom antibiotika kao kontrole, gde je etarsko ulje bilo efikasno

protiv svih testiranih bakterija.

Silveira et al. (2012) su analizirali antimikrobnu aktivnost etarskih ulja određenih

biljaka protiv protiv 12 bakterijskih sojeva u hrani agar disk-difuzionom metodom. U ovoj

studiji, etarsko ulje bosiljka je pokazalo snažno inhibitorno dejstvo protiv Gram-pozitivnih

bakterija, a naročito snažno je delovalo protiv Y. enterocolitica, P. vulgaris i E. coli. Takođe

je pokazalo jaku do umerenu inhibiciju testiranih mikroorganizama upotrebom

mikrodilucione metode.

Sharafati Chaleshtorni et al. (2015) su proučavali antibakterijski efekat etarskog ulja

bosiljka na produktu od govedine. Glavna komponenta etarskog ulja je bila metil-kavikol

(85.19%). Uzorci hrane su tretirani različitim koncentracijama ulja 0.00-kontrola, 0.062.

MASTER RAD

17

0.125 i 0.25%, koji su skladišteni na temperaturi od 4 °C ±1 °C tokom 12 dana. Etarsko ulje

je uticalo na smanjenje stope rasta vrste Staphylococcus aureus.

MASTER RAD

18

1.3. Opšte karakteristike roda Salmonella

Mnogobrojni pripadnici roda salmonela predstavljaju bakterije patogene za čoveka, a

mnoge su patogene i za životinje. Istraživač Salmon je dao značajan doprinos na polju

izolacije ovih uzročnika i u njegovu čast su nazvane salmonelama. Članovi ovog roda

izazivaju oboljenja koja se označavaju terminom salmoneloze. Nazivaju se TPE grupom

prema početnim slovima oboljenja koja izazivaju (tifus, paratifus, enteritis) (Radulović,

2004). Većina salmonela može zaraziti brojne životinjske vrste, ali neki serotipovi su

prilagođeni određenim domaćinima (S. Enteritidis PT4, S. Pullorum i S. Gallinarum u živini,

S. Cholerae-suis u svinjama) (Adams & Moss, 2008).

1.3.1. Istorijat

Prva salmonela, uzročnik tifusa, pronađena je u slezini i mezenterijalnim limfnim

žlezdama čoveka koji je umro od crevnog tifusa od strane Eberth-a 1880. godine. Pet godina

kasnije su Salmon i Smit izolovali drugu bakteriju iz svinja koje su bolovale od svinjske

kolere. Gartner je 1888. god. pronašao salmonelu u slezini čoveka koji je umro od teškog

enterokolitisa (Salmonella enteritidis). Löffler je 1892. god. izolovao S. typhimurium, a

Schottmüler je 1900. god. izolovao S. paratyphi A i S. paratyphi B. Nakon toga je izolovan i

opisan veliki broj sličnih bakterija koje su po Salmonu dobile zajednički naziv Salmonella

(Karakašević, 1987).

1.3.2. Morfološke osobine

Rod Salmonella pripada porodici Enterobacteriae. Članovi ovog roda su Gram-

negativni, fakultativno anaerobni bacili koji ne formiraju spore. Većina poseduje peritrihalne

flagele tj. imaju sposobnost aktivnog kretanja (Adams & Moss, 2008), izuzev Salmonella

pulorum i Salmonella galinarum. Ne poseduju kapsulu i nemaju karakterističan raspored

(Berger-Jekić et al., 1997).

MASTER RAD

19

1.3.3. Taksonomija

Taksonomska nomenklatura roda Salmonella je znatno drugačija od nomenklature

drugih rodova. Osnova za klasifikaciju u okviru roda Salmonela je Kauffman-White-ova

serotipska šema (serološka tipizacija) koja opisuje organizme na osnovu njihovih somatskih

(O), flagelarnih (H) i kapsularnih (Vi) antigena (Adams & Moss, 2008).

Na samom početku, salmonele su bile podeljene u vrste prema rezultatima

serotipizacije, tj. serološke identifikacije na O – somatske i H – flagelarne antigene na osnovu

koncepta “jedan serotip - jedna vrsta” koji je predložio Kauffman. Svaki serotip je smatran

posebnom vrstom i davani su im nazivi prema Lineovoj binominalnoj nomenklaturi (S.

paratyphi, S. enteritidis). (Kozoderović, 2012; Brenner et al. 2000).

Do razvoja u taksonomiji roda Salmonella je došlo tek 1973. godine kada su Crosa i

saradnici demonstrirali pomoću DNK-DNK hibridizacije da su svi serotipovi salmonela

veoma srodni i da su pripadali jednoj vrsti. Jedini izuzetak je Salmonella bongori za koju je

pomoću DNK-DNK hibridizacije zaključeno da pripada različitoj vrsti (Brenner et al. 2000).

Nakon ovih genetičkih dokaza, bilo je neminovno da se koncept vrste kod salmonela mora

redefinisati. Le Minor i Popoff su 1987. god. predložili Komisiji Međunarodnog Komiteta za

sistematsku bakteriologiju da se prihvati predlog Edwards-a i Kauffmann-a iz 1952. god. i da

se vrsta nazove Salmonella enterica (Kozoderović, 2012).

Slika 3: Morfologija ćelije Salmonella enterica

http://picturespider.com/i-microscopic-picture-of-

salmonella.php?pagenum=2&ad=off

http://picturespider.com/i-microscopic-picture-of-salmonella.php?pagenum=2&ad=off

http://picturespider.com/i-microscopic-picture-of-salmonella.php?pagenum=2&ad=off

MASTER RAD

20

Danas je prihvaćeno da se rod Salmonella se sastoji iz dve vrste: Salmonella enterica i

S.bongori. (Forshell & Wierup, 2006).

Vrsta S. enterica je dalje podeljena na šest podvrsta:

Podvrsta I - Salmonella enterica subsp. enterica,

Podvrsta II - Salmonella enterica subsp. salamae,

Podvrsta IIIa - Salmonella enterica subsp. arizonae,

Podvrsta IIIb - Salmonella enterica subsp. diarizonae,

Podvrsta IV - Salmonella enterica subsp. houtenae,

Podvrsta V - Salmonella enterica subsp. indica. (Forshell & Wierup, 2006)

Podvrste se dalje mogu klasifikovati kao serotipovi. Poznato je preko 2400

serotipova. Serotipovi su opisivani tako što su im davana imena na osnovu bolesti koje

izazivaju kod ljudi (S. typhi, S. paratyphi A i B) ili kod životinja (S. typhimurium, S.

cholerae-suis ili S. abortus-ovis) ili na osnovu geografske lokacije gde su prvi put izolovani

(S. dublin, S. montevideo, S. minneapolis) (Adams & Moss, 2008; Forshell & Wierup, 2006).

Većina serotipova koji su patogeni za ljude nalaze se u okviru vrste S. enterica.

Prilikom imenovanja salmonela, često se izostavlja naziv vrste i samo se navode serotipovi.

Primer je naziv Salmonella Typhimurium koji se često koristi umesto zvaničnog naziva,

„Salmonella enterica subsp. enterica serotip Typhimurium“ (Crum-Cianflone, 2008). Ime

serotipa ostaje glavna taksonomska definicija izolata salmonela, čak i sa promenama u

taksonomiji. Dakle, umesto Salmonella enterica subsp. enterica serotip Enteritidis, u upotrebi

je naziv Salmonella Enteritidis (gde Enteritidis predstavlja oznaku serotipa, a ne vrste)

(Kozoderović, 2012).

MASTER RAD

21

1.3.4. Kulturelne osobine i identifikacija salmonela

Salmonele su fakultativni anaerobi, pa se dobro razmnožavaju i rastu na svim opštim

hranljivim podlogama, u aerobnim i anaerobnim uslovima. Na površini hranljivog agara,

nakon inkubacije od 24-48 h, javljaju se okrugle, glatke i sjajne kolonije, prečnika 2-3 mm.

Za izolaciju salmonela iz bolesničkog materijala (izmeta, mokraće, krvi) koriste se selektivne

i diferencijalne podloge za kultivisanje enterobakterija. Od njih su najčešće u upotrebi SS

agar (Salmonella-Shigella-agar). Na SS agaru, salmonele nakon 18-24 h inkubacije stvaraju

bezbojne ili plavičaste, laktoza negativne kolonije. Od selektivnih podloga se takođe koristi

dezoksiholatsko-citratni agar (DCA), na kojem formiraju slične kolonije. Kao specijalna

podloga koristi se Wilson-Blairov agar na kojem rastu u vidu smeđih ili crnih kolonija sa

metalnim sjajem. U upotrebi su i tečne podloge (selenit-F-bujon i Kauffmann-Mülerov

tetrationatski bujon), koje se koriste za razmnožavanje salmonela i sa kojih se vrši

presejavanje na čvrstu podlogu. Radi izolacije ovih bakterija iz krvi, koristi se sterilna goveđa

žuč ili dekstrozni bujon (Karakašević, 1987; Berger-Jekić et al., 1997).

Salmonele se mogu identifikovati brojnim biohemijskim testovima i testom

aglutinacije na pločici kojim se dokazuju specifični somatski i flagelarni antigeni. Na taj

Slika 4: Salmonella sp. nakon 24h rasta

na XLD agaru

http://textbookofbacteriology.net/salmon

ella_3.html

Slika 5: Salmonella enterica serotip

enteritidis na LA (Luria agar)

http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/076-1.jpg

http://textbookofbacteriology.net/salmonella_3.html

http://textbookofbacteriology.net/salmonella_3.html

http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/076-1.jpg

MASTER RAD

22

način se definiše o kom je serotipu reč. U serološkoj identifikaciji koristi se Kauffmann-

White-ova šema. Prema ovoj šemi, salmonele su podeljene na osnovu somatskih antigena na

67 O grupa, a uzročnici salmonelarnih infekcija kod ljudi pripadaju grupama A, B, C1, C2, D

i E. Dalje se serotipovi dele na H ili flagelarne antigene faze 1 i faze 2 (Kozoderović, 2012).

1.3.5. Antigenska građa

Poseduju tri glavna antigena:

H ili flagelarni antigen,

O ili somatski antigen,

Vi-antigen ili ovojni antigen.

Somatski ili O-antigen je termostabilan. To je lipopolisaharid koji se nalazi u

ćelijskom zidu. On je ujedno endotoksin značajan u patogenezi oboljenja koja su izazvana

ovim bakterijama.

Flagelarni ili H-antigen je tipski specifičan antigen salmonela, koji je po hemijskom

sastavu protein, zbog čega je i termolabilan. Sastoji se iz specifičnih H-antigena ili H-

antigena faze 1 i iz nespecifičnih H-antigena ili H-antigena faze 2. Neki serotipovi su

Slika 6: Antigenska građa Salmonella

http://wiki.ubc.ca/Course:PATH417/Case_

2/Student_8

http://wiki.ubc.ca/Course:PATH417/Case_2/Student_8

http://wiki.ubc.ca/Course:PATH417/Case_2/Student_8

MASTER RAD

23

monofazni i tada imaju samo antigene faze 1. Ostali serotipovi imaju H-antigene obe faze i

oni su u većini.

Vi-antigen ili ovojni antigen je površni jer se nalazi na površini bakterijske ćelije i

obavija O-antigen. Naziv je dobio po tome što su Felix i Pitt smatrali da su salmonele sa ovim

antigenom virulentne. Nalazi se samo kod S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B i S.

Paratyphi C. Nalazi se kod bakterija koje su sveže izolovane iz bolesnika (Karakašević, 1987;

Berger-Jekić et al., 1997).

1.3.6. Fiziološko-biohemijske osobine

Imaju sposobnost redukcije nitrata, ne proizvode citohrom oksidazu. Ne vrše hidrolizu

uree. Prilikom fermentacije ugljenih hidrata (glukoze) proizvode gas, izuzev S. Typhi. To je

jedini serotip koji ne produkuje gas prilikom razgradnje šećera. Ne fermentišu laktozu,

adonitol, saharozu, salicin i 2-ketoglukonat. Sve produkuju H2S iz tiosulfata (Kozoderović,

2012).

1.3.7. Otpornost

Otpornost salmonela u celini nije velika, ali i pored toga, one dugo mogu ostati žive u

organski zagađenim vodama i zemljištu. U čistoj vodi ostaju žive oko 7 dana, u ledu tokom

cele zime, u izmetu nekoliko dana. U mleku i drugim mlečnim namirnicama se mogu

intenzivno razmnožavati (Radulović, 2004). Osetljive su na toplotu, a temperatura

pasterizacije ih u potpunosti uništava (Adams & Moss, 2008). Ukoliko su ekološki uslovi:

temperatura, humiditet i pH povoljni, mogu nedeljama da prežive u vodi i godinama u

zemljištu. Optimalna temperatura za rast i razviće salmonela je 35-37 °C. Bez obzira na

optimalnu temperaturu, mogu da rastu i na znatno nižoj (2 °C) ili višoj (54 °C) temperaturi.

Optimalna pH vrednost za rast salmonela kreće se u rangu od 6.5 do 7.5. Međutim,

rast je zapažen i na pH nivoima između 3.8 i 9.5. Niska aktivnost vode predstavlja barijeru za

rast brojnih patogena uključujući i vrste roda Salmonella. Najniža vrednost aktivnosti vode u

namirnicama (aw vrednost) za njihov rast je 0.94 (Podolak, 2010).

MASTER RAD

24

1.3.8. Toksičnost

Endotoksin je sastavni deo ćelijskog zida Gram-negativnih bakterija, koji se oslobađa

prilikom lize ćelija i delom tokom rasta. To je lipopolisaharid (LPS) čija je sinteza kodirana

genima bakterijskog hromozoma. U poređenju sa egzotoksinom, endotoksin je slabo

toksičan, slab je antigen, ne može se konvertovati u toksoid. Endotoksini svih bakterija deluju

slično tj. dovode do groznice i endotoksičnog šoka (Arsenijević, 1999).

Endotoksin se sastoji iz tri komponente: spoljašnjeg O-polisaharidnog lanca,

srednjeg proteinskog dela (R) i unutrašnjeg lipida A koji je odgovoran za toksičnost. Sama

priroda ugljeno-hidratnih jedinica koje su prisutne u spoljašnjem O-polisaharidnom lancu je

odgovorna za O - antigensku specifičnost, pa se naziva još i O-antigen i takođe može da

pomogne u određivanju virulentnosti organizma (Baron, 1996).

1.3.9. Faktori virulencije i mehanizam patogenog dejstva

Faktori virulencije ovog roda su raznovrsni: adhezini, toksini, plazmidi virulencije,

lipopolisaharid ćelijskog zida. Adhezini - flagele nisu neophodne da bi se izvršila

kolonizacija gastrointestinalnog trakta, ali su značajne za preživljavanje i razmnožavanje u

slezini i jetri. Proučavanjem sojeva koji su posedovali plazmid virulencije, sojeva kod kojih

je plazmid veštački uklonjen i sojeva bez plazmida, zaključeno je da kod miša ovaj plazmid

doprinosi širenju infekcije iz tankog creva u mezenterijalne limfne žlezde, jetru, slezinu.

Sojevi sa veštački uklonjenim plazmidom i sojevi koji ne poseduju plazmid virulencije su

manje virulentni za miša (Miljković-Selimović et al., 2010). Od toksina je karakterističan

prethodno opisan endotoksin koji je po strukturi lipopolisaharid (LPS) (Arsenijević, 1999).

Da bi bile u potpunosti patogene, Salmonella vrste treba da poseduju sposobnost da

napadnu ćelije, kompletan lipopolisaharidni O-antigen, sposobnost da se intracelularno

replikuju i sposobnost da proizvode toksin. Nakon što se oralno unesu u organizam,

salmonele kolonizuju tj. naseljavaju ileum i debelo crevo, napadaju i razmnožavaju se unutar

epitela. Prvo se vežu za specifične receptore koji se nalaze na površini epitelnih ćelija, nakon

čega sledi invazija epitela. Potom se umnožavaju u crevnom epitelu i mezenterijalnim

limfnim žlezdama. Odatle dospevaju u krvotok i putem sistemske cirkulacije se šire po celom

telu i dospevaju do ćelija retikulo-endotelnog sistema koje ograničavaju i kontrolišu širenje

MASTER RAD

25

bakterija. U zavisnosti od serotipa i od odbrambene sposobnosti domaćina neke vrste mogu

inficirati jetru, slezinu, žučnu kesu, kosti i druge organe. Većina serotipova ipak biva uništena

u ekstraintestinalnim prostorima, a najčešća ljudska infekcija salmonelama je gastroenteritis i

ograničena je na creva. Nakon invazije epitelnih ćelija creva većina serotipova salmonela

izaziva akutni inflamatorni odgovor, što može dovesti do ulceracije. Takođe mogu da

proizvode citotoksine koji inhibiraju sintezu proteina. Invazija sluznice dovodi do toga da

epitelne ćelije sintetišu i otpuštaju razne proinflamatorne citokine koji dovode do akutne

upalne reakcije koja može biti odgovorna za oštećenje creva (Baron, 1996).

Različiti vidovi odbrane domaćina su veoma važni u pružanju otpora kolonizaciji

creva i invaziji od salmonela. Niska pH vrednost, tj. normalna kiselost želuca (pH<3.5) je

pogubna za salmonele. Uspešno su izložene i jakom antimikrobnom efektu žuči, smanjenju

kiseonika, normalnoj crevnoj mikroflori i crevnoj peristaltici (Forshell & Wierup, 2006).

1.3.10. Salmoneloze

Salmoneloze su kosmopolitska oboljenja koja predstavljaju veliki epidemiološki

problem. Širenju raznih tipova salmonela doprinosi međunarodna trgovina životnim

namirnicama zbog mogućeg unosa novih “egzotičnih” tipova salmonela u zemlju. Javljaju se

tokom cele godine, ali su češće u letnjim mesecima (Bošković et al., 1994). Sva životinjska

hrana je podložna infekciji salmonelama, koja može ali i ne mora da dovede do salmoneloze

(Ekperigin & Nagaraja, 1998). Salmoneloze predstavljaju zoonotske infekcije gde su glavni

izvori zaraze inficirane životinje (Adams & Moss, 2008) sa kojih se infekcija prenosi na ljude

(Nastasijević, 2009). Postoje brojni životinjski rezervoari i putevi prenošenja salmonela koji

dovode do ljudskih infekcija (Pires et al., 2014). Izvor zaraze mogu biti razne životinje:

svinje, goveda, ovce, mačke, psi, glodari, ptice, pilići, ćurke i divlje životinje i dr.

Transmisija se vrši fekalno-oralnim putem kada se crevni sadržaj zaražene životinje unese

zajedno sa vodom i hranom (Adams & Moss, 2008) tj. ingestijom kontaminirane hrane i vode

(Nastasijević, 2009). Čovek može biti izvor zaraze i to kao bolesnik ili nosilac patogena

(Bošković et al., 1994).

Kontaminirana hrana je glavni način prenošenja netifoidnih salmonela. Zbog

sposobnosti salmonela da prežive u mesu i drugim proizvodima životinjskog porekla koja

nisu dovoljno kuvana, životinjski proizvodi (mleko, mlečni proizvodi, meso, jaja) su glavno

sredstvo prenosa (Baron, 1996). Pored glavnog puta prenošenja salmonela namirnicama,

MASTER RAD

26

salmonele se mogu preneti i preko kontakta sa zaraženim predmetom, vode zaražene

salmonelom, a nekad i vazdušno-kapljičnim putem. Hrana takođe može biti kontaminirana

dodirivanjem zaraženim rukama tj. unakrsnom kontaminacijom (Bošković et al., 1994;

Kunwar et al., 2013).

Izolacija salmonela se vrši iz stolice, mokraće, krvi zaražene osobe. Profilaksa

salmoneloznih infekcija se sastoji u ranom otkriću izvora zaraze i presecanju puteva

prenošenja:

- veterinarsko-sanitarni nadzor nad klanjem stoke, obradom, transportom

- čuvanje namirnica od kontaminacije, pravilna i potpuna termička obrada hrane

- higijenski režim u objektima za proizvodnju hrane

- higijenski režim u objektima društvene ishrane (školske kuhinje, restorani,

poslastičarnice, studentski domovi, starački domovi)

- stalna kontrola bakteriološke ispravnosti životnih namirnica

- zdravstveni nadzor nad licima koji rade u proizvodnji životnih namirnica (ne smeju

raditi osobe koje su nosioci salmonela)

- sprovođenje mera za pravilno rukovanje hranom (Bošković et al., 1994).

Slika 7: Hrana koja je potencijalni izvor salmonela

http://www.planetazdravlja.com/sta-uzrokuje-trovanje-hranom-

salmonela/

http://www.planetazdravlja.com/sta-uzrokuje-trovanje-hranom-salmonela/

http://www.planetazdravlja.com/sta-uzrokuje-trovanje-hranom-salmonela/

MASTER RAD

27

1.3.11. Patogenost

Salmoneloze se najčešće javljaju u vidu crevnih oboljenja (enteritisi), opštih cikličnih

oboljenja (crevni tifus, paratifus) i alimentarnih toksikoinfekcija. Mogu izazvati kliničku

sliku osteomijelitisa, pneumonije, meningitisa ali se to ređe dešava. Ustanovljeno je da svaka

salmonela može dovesti do svakog oblika salmoneloznnog oboljenja (Radulović, 2004).

Članovi Salmonella enterica subsp. enterica mogu izazvati čak više od 99% bolesti kod

čoveka (Smith, 2005). Kako će se bolest manifestovati zavisi od stepena osetljivosti

domaćina i od serotipa vrste S. enterica (Coburn et al., 2007).

Tifus ili enterična (crevna) groznica je sistematska infekcija izazvana isključivo

serotipovima koji su adaptirani na ljude. Najčešći uzročnik je S. enterica serotip Typhi,

Paratyphi A, Paratyphi B i Paratyphi C. Inkubacija traje 5-9 dana nakon čega se razvijaju prvi

simptomi bolesti (Smith, 2005). Enterična groznica predstavlja teške sistemske forme

salmoneloze. Simptomi započinju nakon inkubacionog perioda. Enteričnoj groznici moze da

prethodi gastroenteritis. Simptomi su nespecifični i ubrajaju groznicu, anoreksiju, glavobolju,

mijalgije, zatvor (Baron, 1996). Crevni tifus je septičko oboljenje jer iz lumena creva prodire

u krv. Salmonele i njihovi endotoksini se dalje raznose po celom telu putem krvi čime dovode

do oštećenja raznih organa i tkiva. Nakon ozdravljenja oko 3% osoba ostaju doživotne

kliconoše koje ove patogene izlučuju izmetom i mokraćom (Radulović, 2004). Ovo je

ozbiljna infekcija i moze biti fatalna ukoliko se antibiotska terapija odmah ne primeni (Baron,

1996). Paratifusi su oboljenja slična crevnom tifusu. Razlikuju se u znatno blažim

simptomima i kraćim vremenskim trajanjem. Najčešći uzročnici su Salmonella Paratyphi A,

Paratyphi B i Paratyphi C, ređe i neke druge. Rezervoar crevnog tifusa je jedino čovek ( i

kada je bolesnik i kada je kliconoša). Prenosi se kontaktom sa raznovrsnim predmetima,

preko kontaminirane vode, hrane i ruku. U kontaminaciji životnih namirnica veliki udeo

imaju muve, bubašvabe i razni glodari. (Karakašević, 1987; Radulović, 2004).

Enterokolitis (gastroenteritis) je lokalna infekcija koju može izazvati veliki broj

Salmonella serotipova. Međutim, najčešći izazivači su S. Typhimurium i S. Enteritidis.

Enterokolitis karakteriše mučnina, povraćanje i dijareja od 12-72 h nakon infekcije (Smith,

2005). Prvi simptomi bolesti su uočljivi 6-48 h nakon ingestije kontaminirane hrane i vode.

Kao simptomi najčešće se javlja bol u abdominalnom predelu, mučnina, povraćanje, dijareja.

Prateći simptomi su mialgije (bolovima u mišićima), glavobolja i groznica (38-39 °C).

MASTER RAD

28

(Baron, 1996). Bolest nastaje uglavnom nakon ingestije kontaminirane hrane ili vode koja

sadrži preko 50 000 bakterija (Coburn et al., 2007). Infektivna doza salmonela je visoka

(~106 ćelija), koja može varirati u zavisnosti od niza faktora kao što je virulentnost serotipa,

osetljivost tj. zdravstveno stanje pojedinca itd. (Adams & Moss, 2008).

Alimentarne toksikoinfekcije su zarazna oboljenja, koja nose ovakav naziv jer

nastaju konzumiranjem namirnica koje su kontaminirane salmonelama. Manifestuju se

kratkom inkubacijom od nekoliko časova, nakon čega sledi naglo i burno povraćanje, prolivi

i drugi gastrointestinalni poremećaji. Počinju kao intoksikacije zbog toga što se u hrani,

kontaminiranoj bakterijama, nalaze njihovi endotoksini. Najčešći uzročnici su Salmonella

Enteritidis, S. Typhimurium, S. Cholerasuis, S. Thompson, S. Anatum itd. Uzročnici nakon

intoksikacije često izazivaju infekcije. Rezervoari zaraze su inficirane domaće životinje,

svinje, živina, goveda ali i čovek. Izvori zaraze su mleko, meso, jaja inficiranih životinja pa

upotrebom ovih namirnica najčešće dolazi do oboljenja (Karakašević, 1987).

MASTER RAD

29

1.3.12. Salmonella enterica subsp. enterica serotip Enteritidis (Salmonella

Enteritidis-SE)

Ovaj serotip je važan ljudski patogen koji može dovesti do nastanka salmoneloza.

Uglavnom se prenosi konzumiranjem kontaminiranog živinskog mesa, zaražene vode ili

konzumacijom sirovih ili delimično kuvanih jaja (Wisner et al., 2010). Čest je uzročnik

alimentarnih toksikoinfekcija u različitim delovima sveta čijem širenju doprinose

globalizacija saobraćaja, trgovine i drugih društveno-ekoloških procesa. S. Enteritidis, kao i

drugi serotipovi salmonela, ima plazmid virulencije koji joj omogućava da opstane i da se

održava unutar retikuloendotelnih ćelija, za razliku od sojeva bez plazmida koji se brzo

eliminišu (Miljković-Selimović et al., 2010).

U poslednje vreme primećeno je da je Salmonella enterica subsp. enterica serotip

Enteritidis jedan od najzastupljenijih serotipova uzročnik enterokolitisa. S. Enteritidis može

opstati i u svežem voću, povrću, zemljištu što takođe utiče na epidemiologiju ovog patogena.

U ljudskom domaćinu kolonizuje tanko crevo i najčešće dovodi do lokalnog gastroenteritisa

(enterokolitisa) nego do sistemskih oboljenja. To je bio glavni uzročnik bolesti izazvane

hranom u Urugvaju tokom 1990-ih, sa izraženim periodom epidemije između 1995. i 2004.

godine, a slična se situacija desila u SAD-u i Evropi deceniju ranije (Yim et al., 2010).

Slika 8: Izgled Salmonella Enteritidis

http://www.foodqualitynews.com/Food-

Outbreaks/Salmonella-illnesses-from-single-

source-yet-to-be-identified

http://www.foodqualitynews.com/Food-Outbreaks/Salmonella-illnesses-from-single-source-yet-to-be-identified



MASTER RAD

30

Izolovanje etarskog ulja iz nadzemnog dela bosiljka (Ocimum basilicum L.) metodom

hidrodestilacije.

Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja iz nadzemnog dela bosiljka na vrstu

Salmonella enterica subspecies enteritidis u in vitro uslovima.

Utvrđivanje uticaja etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji (MIK) na

rast i razmnožavanje ćelija bakterije Salmonella enterica subspecies enteritidis na

pilećem mesu kao modelu hrane.

Procena potencijala etarskog ulja bosiljka kao dodatka hrani za prevenciju kvarenja

pilećeg mesa uzrokovanog bakterijskom vrstom Salmonella enterica subspecies

enteritidis.

2. CILJEVI RADA

MASTER RAD

31

3.1. Rastvori i podloge

Fiziološki rastvor je 0.9% (m/V) rastvor natrijum hlorida (NaCl) u destilovanoj

sterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.9 g NaCl u 100 ml destilovane vode.

Miler Hinton bujon (Müeller Hinton Broth, HiMedia, M391) je podloga

namenjena za određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIK) antimikrobnih

agenasa metodom dilucije u bujonu. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: mesni ekstrakt

30.00 g, kazein hidrolizat 17.50 g, štirak 1.50 g (konačna pH vrednost 7.4 ± 0.2 na 25 °C).

Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem 21.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane

vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog

rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20 minuta na 121

°C.

Hranljivi agar (Torlak) je podloga namenjena za kultivisanje širokog spektra

mikroorganizama. Sastav ove podloge na 1000 ml je sledeći: pepton 15.00 g, mesni ekstrakt

3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat 0.30 g, agar-agar 18.00 g (konačna pH

vrednost 7.3 na 25 °C). Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem 38.00 g suve

podloge u 1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na

rešou radi potpunog rastvaranja, vršeno je razlivanje podloge i autoklaviranje u trajanju od 20

minuta na 121 °C.

3.2. Biljni materijal

Biljni materijal, korišćen u ovom radu, je kupljen u lokalnoj biljnoj apoteci „Herba

bilje“ u Nišu. Za izolaciju etarskog ulja korišćen je suvi biljni materijal bosiljka. Ceo

nadzemni deo bosiljka (stabljika, cvast, seme i listovi) je sitno iseckan i ustinjen.

3. MATERIJALI I METODE

MASTER RAD

32

3.3. Izolacija etarskog ulja bosiljka

Hidrodestilacija predstavlja odličnu metodu za ekstrakciju etarskog ulja bosiljka jer je

jednostavna, brza i rezultira dobrim prinosom ulja (Charls & Simon, 1990). Iz tog razloga je,

za potrebe ovog rada, etarsko ulje bosiljka izolovano metodom hidrodestilacije koja je vršena

aparaturom po Klevendžeru (Clevenger, 1928).

Odmeren i usitnjen suvi biljni materijal stavljen je u balon za destilaciju i napunjen

određenom količinom vode. Balon se zagreva do tačke ključanja vode koja se nalazi u njemu,

nakon čega dolazi do izdvajanja vodene pare u kondenzor zajedno sa etarskim uljem. Zatim

se tu vodena para prevodi u tečno stanje i vraća u balon za destilaciju, dok ulje ostaje u cevi.

Iz usitnjenog suvog biljnog materijala izolovano je etarsko ulje bosiljka (Ocimum

basilicum L.). Ceo proces hidrodestilacije trajao je oko 3 h. U levku za odvajanje, ulje je od

vodene faze odvajano (ekstrahovano) pomoću etra. Zatim je dodat anhidrovani magnezijum-

sulfat (MgSO4) radi sušenja tj. radi sakupljanja viška vode u ulju, nakon čega je iz ulja

uklonjen filtriranjem. Smeša dobijena ovim postupkom je zatim uparena do potpunog

uklanjanja rastvarača.

Masa čistog etarskog ulja je izračunata merenjem na analitičkoj vagici. Ulje je

ostavljeno u staklenoj bočici u frižideru do dalje upotrebe.

Slika 9: Aparatura po Klevendžeru

http://www.clker.com/clipart-23487.html

http://www.clker.com/clipart-23487.html

MASTER RAD

33

3.4. Određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja bosiljka (Ocimum

basilicum L.)

3.4.1. Kultura mikroorganizama

Za analiziranje antimikrobnog dejstva etarskog ulja bosiljka korišćen je jedan

referentni soj S. Enteritidis ATCC (American Type Culture Collection) 13076.

3.4.2. Mikrodiluciona metoda

Radi ispitivanja antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korišćena je mikrodiluciona

metoda na mikrotitarskim pločama. Određivana je minimalna inhibitorna koncentracija

(MIK) serijskim razređivanjem etarskog ulja.

MIK predstavlja najmanju kocentraciju potrebnu za kompletnu ihibiciju testiranih

mikroorgaizama nakon 24h, najnižu koncentraciju koja vidljivo inhibira rast testiranih

mikroorganizama i koja dovodi do značajnog smanjenja vijabilnosti inokuluma (>90%).

Od prekonoćne kulture S. Enteritidis napravljena je bakterijska suspenzija u sterilnom

fiziološkom rastvoru. Turbiditet suspenzije je podešen tako da odgovara turbiditetu 0.5

McFarland-a koji odgovara koncentraciji bakterija od 1.5 x 108 CFU/ml (Colony Forming

Units - CFU - jedinica za formiranje kolonija) ili 1.5 x 108 ćelija/ml. McFarland densitometar

(DEN-1, Biosan) je korišćen za podešavanje turbiditeta suspenzije. Mikrotitarske ploče

sadrže 96 bunarčića i koriste se za izvođenje mikrodilucionog testa. Ploče se sastoje iz 12

kolona (obeležene brojevima) i 8 redova (obeleženi latiničnim slovima od A do H).

Slika 10: Mikrotitarska ploča

http://www.phenixresearch.com/products/mpu-8117-

microplate-96well-u-bottom.asp

http://www.phenixresearch.com/products/mpu-8117-microplate-96well-u-bottom.asp

http://www.phenixresearch.com/products/mpu-8117-microplate-96well-u-bottom.asp

MASTER RAD

34

Test mikrodilucije je rađen u Miler Hinton bujonu. Pomoću suspenzije prethodno

podešenog turbiditeta je vršeno zasejavanje bujona. Nakon pravljenja suspenzije,

mikrotitarske ploče su punjene sa po 100 μl Miler Hinton bujona zasejanog odgovarajućim

volumenom suspenzije turbiditeta McFarland u cilju dobijanja finalne koncentracije ćelija od

~ 106 CFU/ml. Početni rastvor etarskog ulja, čija je inicijalna koncentracija bila 20 mg/ml

rastvoren je u Tween 80 (0.05% v/v). Bočica sa Tween-om i etarskim uljem stavljena je u

ultrazvučno kupatilo radi potpunog rastvaranja. Nakon toga, 100 μl početnog rastvora ulja u

Tween-u je dodato u prvu kolonu mikrotitar ploče i vršena je serijska dilucija u ploči tj.

pravljena su dupla razređenja početnog rastvora ulja.

Ovako pripremljena mikrotitar ploča sa etarskim uljem u opadajućim koncentracijama

stavljena je na inkubiranje 24 h na 37 °C. Nakon perioda inkubacije očitavani su rezultati na

kojima je MIK predstavljao najnižu koncentraciju etarskog ulja na kojoj nije zapažen vidljiv

rast bakterija.

3.4.3. Određivanje minimalne baktericidne koncentracije (MBK)

Minimalna baktericidna koncentracija (MBK) je najniža koncentracija antimikrobnog

agensa (u ovom slučaju etarskog ulja) koja usmrti 99.9% bakterijskih ćelija.

MBK je određen tako što je sadržaj iz svih bunarčića mikrotitar ploče (koju smo

prethodno koristili za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije) na kojima nije

identifikovan rast mikroorganizama prenet na svežu podlogu - Hranljivi agar, koji je zatim

ostavljen na inkubaciju u trajanju od 24 h na 37 °C. Po završetku perioda inkubacije, očitavan

je MBK, koji predstavlja najnižu koncentraciju na kojoj nije uočljiv rast bakterija.

MASTER RAD

35

3.5. Utvrđivanje efekta etarskog ulja bosiljka u minimalnoj inhibitornoj

koncentraciji na rast i razmnožavanje ćelija bakterije S. Enteritidis na

modelu hrane.

Model hrane koji je korišćen u radu za ispitivanje efekta etarskog ulja bosiljka bilo je

pileće meso kupljeno u lokalnoj mesari „Biftek” u Nišu.

Prekonoćna kultura S. Enteritidis (ATCC 13076) je korišćena za pravljenje

bakterijske suspenzije koja odgovara koncentraciji 107 ćelija /ml. Parčići mesa (24 komada,

svaki komad težine po 5 g) su stavljani u posebne Petri šolje i autoklavirani. Nakon

autoklaviranja stavljeni su u prethodno pripremljenu bakterijsku suspenziju (107 ćelija /ml) u

trajanju od 15 min. Zatim je svaki komad mesa u otvorenim Petri šoljama ostavljen na

sušenje u blizini plamenika u trajanju od 30 min.

Eksperiment je rađen na 0 h, 24 h, 48 h i 72 h u triplikatu. Dvanaest inokulisanih

komada mesa, koja su predstavljala kontrolu rasta, ostavljena su sa strane i nisu potapana u

prethodno pripremljen rastvor etarskog ulja. Ostalih 12 inokulisanih parčića mesa su

potapana u 30 ml rastvora ulja u Tween-u (koji je prethodno homogenizovan u ultrazvučnom

kupatilu radi potpunog rastvaranja) u kojem su stajali 15 min i nakon toga ponovo bivali

sušeni uz plamenik 15 min.

I dan: Eksperiment je rađen svakog dana sa po 6 parčeta mesa (3 kontrola, 3 bosiljak), a

ostali parčići su ostavljeni na sobnoj temperaturi. U svaku sterilnu posudu sa po 50 ml

fiziološkog rastvora ubačeno je po jedno parče mesa koje je zatim homogenizovano, a zatim

je iz njih pravljena serija razređenja u rasponu od 10-1 do 10-6. Supernatant iz posude (100 μl)

se koristi za seriju razređenja u ependorficama koje su prethodno napunjene sa 900 μl

fiziološkog rastvora. Drop count metodom (metodom kapi) je iz svakog razblaženja

(uključujući i nerazblaženi uzorak) zasejano po 10 μl (u triplikatu) na Petrijeve posude sa

hranljivim agarom i inkubirano 24 h na 37 °C. Po završetku perioda inkubacije izvršeno je

vijabilno brojanje kolonija i preračunavanje broja ćelija po ml. Broj ćelija u osnovnom

uzorku (broj ćelija/ml) je preračunavan po sledećoj formuli:

N = broj kolonija x faktor korekcije do 1ml x razblaženje

MASTER RAD

36

II dan: Ponovljen je ceo postupak na isti način, s’ tim što su razređenja pravljena do

10-9, a zasejavanje vršeno sa razređenjima 10-4 do 10-9. Zatim sledi inkubacija 24 h na 37 °C,

a potom su brojane kolonije.

III dan: Serija razređenja je pravljena do 10-12, a ’drop count’ metodom u triplikatu

zasejavano je na hranljivom agaru iz razređenja 10-4 do 10-12.

IV dan: Ponovljen je ceo postupak kao prethodnog dana, a zasejavanje je vršeno iz

razređenja 10-3 do 10-12.

Zbog zanemarljivog efekta etarskog ulja postignutog upotrebom minimalne

inhibitorne koncentracije, eksperiment je ponovljen sa 8 puta jačom koncentracijom (8 x

MIK), pri čemu je eksperimentalni model bio u potpunosti isti, jedino se razlikovao u tome

što su parčići mesa u rastvoru ulja ovog puta stajali duže (30 min).

3.6. Statistička analiza dobijenih podataka

Statistička analiza podataka rađena je u programskom paketu Origin 7. Dobijeni

rezultati su obrađeni analizom varijanse (ANOVA). Tom prilikom je rađeno poređenje

srednjih vrednosti i računanje standardnih devijacija.

MASTER RAD

37

4.1. Prinos etarskog ulja

Dobijeno etarsko ulje iz suvog biljnog materijala vrste Ocimum basilicum L.

procesom hidrodestilacije imalo je prinos od 0.63%. Imalo je svetlo-žutu boju sa jakim i

karakterističan mirisom.

Biljni

materijal

Metoda

destilacije ulja

Prinos u

%

(v/w)

Linalol (%)

Metil

kavikol

(%)

Ocimum

basilicum

(Soković et al.,

2010)

Nadzemni

deo bosiljka

Hidrodestilacija

0.5

69.3

2.4

Ocimum

basilicum

(Jelačić et al.,

2011)

Suva herba

bosiljka

Hidrodestilacija

0.87-1.84

51.52-74.73

2.49-18.97

Ocumum

basilicum

(Beatović et

al., 2015)

Nadzemni

deo (suv)

Hidrodestilacija

0.65-1.90

30.3-58.6

0.1-16.3

Rezultatima dobijenim ispitivanjem hemijskog sastava deset populacija bosiljka na

prostorima Republike Srbije utvrđeno je da pripadaju evropskom hemotipu (Jelačić et al.,

Tabela 2: Sadržaj glavnih komponenti etarskog ulja bosiljka, gajenog na teritoriji Srbije, na

osnovu dosadašnjih istraživanja i njihovo poređenje

4. REZULTATI I DISKUSIJA

MASTER RAD

38

2011). Analizama je utvrđeno da većina sorti bosiljka koje rastu u Srbiji pripada ”linalolnom

hemotipu” što je u skladu sa hemotaksonomskom klasifikacijom bosiljka koja se bazira na

osnovu geografskog porekla, gde su glavne komponente evropskih sorti (tipova) bosiljka

linalol i metil-kavikol (Beatović et al., 2015).

4.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste O. basilicum

U mnogim radovima (Lachowichz et al., 1998; Opalcheova & Obreshkova, 2003;

Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn, 2010; Hanif et al., 2011; Shafique et al., 2011,

Sharafati Chaleshtorni et al., 2015) je dokazano antimikrobno svojstvo biljne vrste Ocimum

basilicum L. Na osnovu ovih znanja i upotrebe date biljne vrste u kulinarstvu kao začinske

biljne vrste, istraživanje je imalo za cilj analizu inhibitornog uticaja njenog etarskog ulja na

bakterijsku vrstu koja je u hrani čest patogen. Mikrodilucionom metodom je utvrđeno da je

najniža koncentracija na kojoj je inhibiran rast bakterije bila 2.5 mg/ml, pa je samim tim ovo

minimalna inhibitorna koncentracija.

Sadržaj iz svih bunarčića mikrotitar ploče na kojima nije identifikovan vidljiv rast

mikroorganizama prenet je na svežu podlogu-Hranljivi agar i ostavljen na inkubaciju u

trajanju od 24 h na 37 °C. Po završetku perioda inkubacije, zaključeno da je minimalna

inhibitorna koncentracija (MIK) jednaka minimalnoj baktericidnoj koncentraciji (MBK).

4.3. Efekat etarskog ulja bosiljka na rast vrste Salmonella Enteritidis u

modelu hrane

Efekat etarskog ulja bosiljka je testiran na vrstu Salmonella Enteritidis (ATCC 13076)

na modelu hrane, kako bi se utvrdio njegov potencijal kao konzervansa i kako bi se utvrdio

uticaj perioda inkubacije na njegovu aktivnost. Model hrane je bilo pileće meso. Na Grafiku

1. prikazana je kriva rasta S. enteritidis tokom ukupnog perioda inkubacije od 72 h u

prisustvu etarskog ulja bosiljka u minimalnoj i 8 puta jačoj koncentraciji u odnosu na

kontrolu.

MASTER RAD

39

Na osnovu grafika se može zapaziti da je u kontroli rasta na 0 h inkubacije bila dosta

veća brojnost ćelija (~107) u odnosu na rast kultura kojima je dodato etrasko ulje bosiljka (u

MIK-i i 8xMIK-i) gde je brojnost ćelija po mililitru (ćel/ml) iznosila približno između 103 i

104. Možemo zaključiti da je etarsko ulje u samom startu (trenutno) delovalo baktericidno (na

0 h) i uništilo tj. značajno redukovalo broj bakterija (1000 x manje). Dakle, u samom startu je

došlo do značajnog pada brojnosti ćelija. Kultura se nakon inicijalnog delovanja etarskog ulja

oporavlja i njena brojnost raste do samog završetka perioda inkubacije od 48 h.

Preživele bakterije tokom narednih 24 h inkubacije su se delile tj. razmnožavale (na

krivi se zapaža uzlazna linija eksponencijalnog rasta bakterija). Nakon 24 h inkubacije,

brojnost ćelija rasta kontrole se uvećala sa ~ 107 do ~ 1010. Brojnost kulture na koju je

delovalo etarsko ulje u MIK-i se povećala od ~ 104 do 108, a brojnost ćelijske kulture na koje

je delovalo ulje u koncentraciji 8xMIK se povećala ~ 107.

Ovaj trend se nastavlja i nakon 48 h inkubacije gde se bakterije i dalje razmnožavaju,

njihov broj se uvećava ali sporije u odnosu na period inkubacije od 0 h do 24 h (što se može

zapaziti slabijim usponom krive u ovom inkubacionom periodu). Broj ćelijske kulture na koju

je delovalo etarsko ulje u 8xMIK broj bakterija se uvećao od ~ 107 do 108 ćel/ml, dok je u

slučaju erlenmajera u kome je ulje delovalo u MIK došlo do suprotne situacije tj. do opadanja

brojnosti sa vrednosti ~ 108 do vrednosti ~ 107 ćel/ml.

Grafik 1: Efekat etarskog ulja bosiljka u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji i 8 x jačoj

koncentraciji (8 x MIK) na rast bakterijskog soja Salmonella Enteritidis u pilećem mesu

tokom različitih inkubacionih perioda (0 h, 24 h, 48 h i 72 h)

MASTER RAD

40

Nakon 72 h inkubacije, rast bakterijske populacije je zaustavljen tj. ćelije se nalaze u

stacionarnoj fazi. U slučaju kontrole na krivi rasta se može zapaziti sasvim blagi pad

brojnosti tj. došlo je do izvesnog uginuća. U kulturama na kojima je delovalo etarsko ulje sa 8

x MIK može primetiti da je bakterijska populacija ušla u stacionarnu fazu (ravna,

horizontalna linija) u kojoj je rast zaustavljen. U slučaju kulture sa MIK ulja dešava se

ponovo suprotna situacija, gde nakon 72 h dolazi do povećanja bojnosti ćelija u koncentraciji

približnoj od 107 do 108. Nakon ukupnog perioda inkubacije (72 h) broj ćelija po mililitru je

bio i ostao veći u odnosu na početni inokulum i u slučaju kontrole i u slučaju kultura koje su

bile izložene dejstvu etarskog ulja.

Na osnovu ovih rezultata, etarsko ulje bosiljka je delovalo u samom startu, pri čemu je

mikrobicidnim efektom redukovalo znatan broj bakterija, nakon čega dolazi do oporavka

kulture i preživele bakterije nastavljaju svoju deobu do maksimalne vredosti koja se može

zapaziti nakon 48 h inkubacije, kada je bakterijska populacija ušla u stacionarnu fazu. Uslovi

za rast i razmnožavanje su tokom 24 h inkubacije bili optimalni, pa je došlo do porasta

brojnosti ćelija. Verovatno je zbog intenzivnog razmnožavanja u prethodnoj eksponencijalnoj

fazi došlo do smanjenja neophodnih hranljivih sastojaka u podlozi i nagomilavanja toksičnih

produkata metabolizma, što je uticalo na usporeno razmnožavanje bakterija.

Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn (2010) su u svojoj studiji proučavali

antimikrobnu aktivnost devet etarskih ulja protiv jedne referentne i pet kliničkih sojeva

Salmonella Enteritidis, gde je ulje bosiljka pokazalo najjaču aktivnost protiv svih testiranih

bakterija, a S. Enteritidis SE3 (klinički soj) je bila najosetljivija. Ulje je aplikovano na

tradicionalnu nham (kobasicu) u različitim koncentracijama od 50, 100 i 150 ppm. U

kontrolnom uzorku broj bakterija je bio 5 log CFU/g nakon 5 dana. U uzorku sa 50 ppm ulja

bosiljka, broj bakterija je brzo opao na 2 log CFU/g. U uzorcima koji su tretirani uljem

bosiljka u većim koncentracijama broj bakterija je bio manji od 1 log CFU/g. Rezultati

postignuti ovim radom ukazuju na to da se ulje bosiljka može koristiti kao antimikrobni agens

za kontrolu S. Enteritidis u ovoj vrsti hrane.

Zbog nedostataka rezultata vezanih za antimikrobnu aktivnost bosiljka na pilećem

mesu kao modelu hrane, poređenje rezultata je nemoguće. Takođe, rezultati postignuti ovim

radom ukazuju na zanemarljiv efekat etarskog ulja kada se aplikuje na pilećem mesu. Na

kraju, sama činjenica da se u većini hranljivih namirnica ne može naći 107 ćelija (koliko smo

mi koristili za zaražavanje komada mesa), ukazuje da bi u manjem inokulumu ulje verovatno

MASTER RAD

41

pokazalo znatno bolji efekat. Nedostatak ovog ulja, pored postignutog zanemarljivog efekta,

je mali prinos, što takođe predstavlja jedan od problema za razmatranje ovakve njegove

aplikacije. Neophodno je izvršiti dodatna istraživanja vezana za antimikrobnu aktivnost

bosiljka protiv ostalih patogena hrane, kako bismo došli do zaključaka vezanih za njegovu

upotrebu u prevenciji njenog kvarenja.

MASTER RAD

42

Na osnovu postignutih i prezentovanih rezultata mogu se proizvesti sledeći zaključci:

1. Etarsko ulje dobijeno metodom hidrodestilacije iz nadzemnog dela bosiljka imalo

je prinos 0.63%. Bilo je svetložućkaste boje, sa izraženim i karakterističnim

mirisom.

2. Mikrodilucionom metodom je određen antimikrobni potencijal i aktivnost ovog

etarskog ulja. Na osnovu ove metode ukazano nam je da etarsko ulje, dobijeno iz

biljne vrste Ocimum basilicum pokazuje antimikrobnu aktivnost na Salmonella

enterica subspecies enteritidis ATCC 13076 pri minimalnoj inhibitornoj

koncentraciji (MIK) koja iznosi 2.5 mg/ml. To je ujedno bila i minimalna

baktericidna koncentracija (MBK).

3. U pilećem mesu kao modelu hrane, najveći inhibitorni uticaj je zapažen na samom

startu (na 0 h inkubacije) kontakta ulja i bakterijskih ćelija. Uzimajući u obzir da

je startni inokulum predstavljao jako kontaminiranu hranu (107) etarsko ulje je

redukovalo statistički značajan broj bakterija na samom početku. Međutim, tokom

narednih 72 h inkubacije, postignut je zanemarljiv efekat inhibicije rasta bakterije,

zbog čega je etarsko ulje pokazalo slabu antimikrobnu aktivnost.

4. Iz navedenog zaključujemo da se etarsko ulje bosiljka ne može koristiti kao

prirodni konzervans protiv razvoja salmonele u pilećem mesu..

5. ZAKLJUČAK

MASTER RAD

43

Adams, M. R., Moss, M. O., 2008: Food Microbiology (Third Edition). University of

Surrey, Guildford, UK

Adigüzel, A., Güllüce, M., & Şengül, M., 2005: Antimicrobial effects of Ocimum

basilicum (Labiatae) extract. - Turkish Journal of Biology 29(3): 155-160.

Ananda, A. K., Mohan, M., Haider, S. Z., & Sharma, A., 2011: Essential oil composition

and antimicrobial activity of three Ocimum species from Uttarakhand (India). -

International Jour nal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 3: 223-225.

Arsenijević, N., Berger-Jekić, O., Jovanović, M., Kocić, B., Kulauzov, M., Nedeljković,

M., Otašević, M., Pecić, J., Ranin, L., Savić, B., Stepanović, S., & Švabić-Vlahović, M.,

1999: Opšta bakteriologija, udžbenik za studente medicine, str. 21-103, Beograd.

Baron, S., 1996: Medical Microbiology, 4th ed. The University of Texas Medical Branch,

Galveston, TX.

Baser, K. H. C., & Buchbauer, G. (Eds.)., 2009: Handbook of essential oils: science,

technology, and applications. - CRC Press.

Beatović, V. D., 2013: Evaluacija genotipova bosiljka (Ocimum spp.) gajenih u Srbiji,

Poljoprivredni fakultet, Beograd.

Beatović, D., Krstić-Milosević, D., Trifunović, S., Šiljegović, J., Glamočlija, J., Ristić,

M., & Jelačić, S., 2015: Chemical Composition, antioxidant and antimicrobial activities

of the essential oils of twelve Ocimum basilicum L. cultivars grown in Serbia. - Rec Nat

Prod 9: 62-75.

Berger-Jekić, O., Jovanović, M., Kocić, B., Kulauzov, M., Nedeljković, R. M., Otašević,

M., Pecić, J., & Švabić-Vlahović, M., 1997: Specijalna bakteriologija. Udžbenik za

studente medicine, str. 80-87, Beograd.

Bisenić, Lj. & Veljković, S., 1988: Lekovito biljke za zdravlje, u kulinarstvu, za lepotu. –

Dečje novine, str. 5-51.

6. LITERATURA

MASTER RAD

44

Bošković, Ž., Drezgić, Lj., Perošević, Z., & Spasić, M., 1994: Epidemiologija u praksi II

deo (Osnovna praktična epidemiološka znanja o zaraznim bolestima koje podležu

obaveznom prijavljivanju), Prvo izdanje, str. 125-128, Niš.

Brenner, F. W., Villar, R. G., Angulo, F. J., Tauxe, R., & Swaminathan, B., 2000:

Salmonella nomenclature. - Journal of clinical microbiology 38(7): 2465-2467.

Burt, S., 2004: Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in

foods—a review. - International journal of food microbiology 94(3): 223-253.

Carvalho Filho, J. L. S., Blank, A. F., Alves, P. B., Ehlert, P. A., Melo, A. S., Cavalcanti,

S. C., Arrigoni-Blank, M. & Silva-Mann, R., 2006: Influence of the harvesting time,

temperature and drying period on basil (Ocimum basilicum L.) essential oil. - Revista

Brasileira de Farmacognosia 16(1): 24-30.

Chamorro, E. R., Zambón, S. N., Morales, W. G., Sequeira, A. F., & Velasco, G. A.,

2012: Study of the chemical composition of Essential oils by Gas Chromatography. - Nat.

Tech University, Argentina 15: 307-324.

Charles, D. J., & Simon, J. E., 1990: Comparison of extraction methods for the rapid

determination of essential oil content and composition of basil. - Journal of the American

Society for Horticultural Science 115(3): 458-462.

Coburn, B., Grassl, G. A., & Finlay, B. B., 2007: Salmonella, the host and disease: a brief

review. - Immunology and cell biology 85(2): 112-118.

Cogan, T. A., & Humphrey, T. J., 2003: The rise and fall of Salmonella Enteritidis in the

UK. - Journal of applied microbiology 94(s1): 114-119.

Crum-Cianflone, N. F., 2008: Salmonellosis and the gastrointestinal tract: more than just

peanut butter. - Current gastroenterology reports 10(4): 424-431.

De Sousa, D. P., 2011: Analgesic-like activity of essential oils constituents. – Molecules

16(3): 2233-2252.

Ekperigin, H. E., & Nagaraja, K. V., 1998: Microbial food borne pathogens.

Salmonella. The Veterinary clinics of North America. - Food animal practice 14(1): 17-

29.

Forshell, L. P., & Wierup, M., 2006: Salmonella contamination: a significant challenge to

the global marketing of animal food products. - Rev. sci. tech. Off. int. Epiz 25(2): 541-

554.

Gajić, M., Diklić, N., Janković M., Jovanović – Dunjić R., Kojić M., Nikolić V.,

Obradović M., Paravućski S., Stjepanović L., Tucović A., Cincović T., 1974: Flora SR

MASTER RAD

45

Srbije VI. – Srpska akademija nauka i umetnosti, odeljenje prirodno – matematičkih

nauka, str. 509-510, Beograd.

Gill, A.O., Delaquis, P., Russo, P., Holley, R.A., 2002: Evaluation of antilisterial action

of cilantro oil on vacuum packed ham. - International Journal of Food Microbiology 73:

83 – 92.

Gutierrez, J., Barry-Ryan, C., & Bourke, P., 2009: Antimicrobial activity of plant

essential oils using food model media: efficacy, synergistic potential and interactions with

food components. - Food microbiology 26(2): 142-150.

Hanif, M. A., Yahya, M., Al-Maskari, A., Al-Shukaili, A., Yahya, A., & Al-Sabahi, J. N.,

2011: Essential oil composition, antimicrobial and antioxidant activities of unexplored

Omani basil. – Journal of Medicinal Plants Research 5(5): 751-757.

Hiltunen, R., & Holm, Y. (Eds.)., 2003: Basil: the genus Ocimum. - CRC Press.

Hussain, A. I., Anwar, F., Sherazi, S. T. H., & Przybylski, R., 2008: Chemical

composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum)

essential oils depends on seasonal variations. - Food Chemistry 108(3): 986-995.

Hyldgaard, M., Mygind, T., & Meyer, R. L., 2012: Essential oils in food preservation:

mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. - Frontiers in

Microbiology, 3.

Jančić, R., Stišić, D., Mimica-Dikić, N., & Lakušić, B., 1995: Aromatične biljke Srbije,

Beograd.

Jančić, R. & Stojanović, D., 2008: Ekonomska botanika:korisne biljke I njihovi proizvodi

(Prvo izdanje). – Zavod za udzbenike, Beograd.

Jelačić, S., Lakić, N. S., Beatović, D., & Vujošević, A., 2005: Effects of different

substrates on basil seedlings quality (Ocimum basilicum L.). - Journal of Agricultural

Sciences, Belgrade 50(2): 107-115.

Jelačić, S. Ć., Beatović, D. V., Prodanović, S. A., Tasić, S. R., Moravčević, Đ. Ž.,

Vujošević, A. M., & Vučković, S. M., 2011: Hemijski sastav etarskog ulja bosiljka

(Ocimum basilicum L. Lamiaceae). - Hem. Ind 65(4): 465-471.

Karakašević, B., 1987: Mikrobiologija i parazitologija. – Medicinska knjiga, str. 565-578,

Beograd – Zagreb.

Karan, D., Saičić, S., Vesković-Moračanin, S., Lilić, S., & Okanović, Đ., 2008: Uticaj

bosiljka na kvalitet i oksidativne promene lipida tokom skladištenja hrenovki. –

Tehnologija mesa 49(3-4): 117-121.

MASTER RAD

46

Kitić, D., 2010: Etarska ulja. – Studentski Medicinski Glasnik 1(1): 149-156.

Kostić, I., Marković, T., & Krnjajić, S., 2012: Sekretorne strukture aromatičnih biljaka sa

posebnim osvrtom na strukture sa etarskim uljima, mesta sinteze ulja i njihove važnije

funkcije. – Lek. Sirov. 32(32): 3-25.

Kozoderović, G., 2012: Analiza prirode rezistencije na hinolone i milekularna tipizacija

odabranih serotipova Salmonella enterica subspecies enterica. Doktorska disertacija,

Biološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

Kunwar, R., Singh, H., Mangla, V., & Hiremath, R., 2013: Outbreak investigation:

Salmonella food poisoning. - Medical journal armed forces india 69(4): 388-391.

Lachowicz, K. J., Jones, G. P., Briggs, D. R., Bienvenu, F. E., Wan, J., Wilcock, A., &

Coventry, M. J., 1998: The synergistic preservative effects of the essential oils of sweet

basil (Ocimum basilicum L.) against acid-tolerant food microflora. - Letters in Applied

Microbiology 26(3): 209-214.

Lv, F., Liang, H., Yuan, Q., & Li, C., 2011: In vitro antimicrobial effects and mechanism

of action of selected plant essential oil combinations against four food-related

microorganisms. - Food Research International 44(9): 3057-3064.

Mejlholm, O., Dalgaard, P., 2002: Antimicrobial effect of essential oils on the seafood

spoilage micro-organism Photobacterium phosphoreum in liquid media and fish products.

- Letters in Applied Microbiology 34: 27 – 31.

Miljković-Selimović, B., Babić, T., & Stojanović, P., 2010: Salmonella enterica

subspecies enterica serotip Enteritidis – aktuelnost i značaj. – Acta Medica Medianae

49(3): 71-75.

Nastasijević, I., 2009: Integrisani monitoring zoonotskih alimentarnih patogena u lancu

mesa – Tehnologija mesa 50(1-2): 75-89.

Nedorostova, L., Kloucek, P., Kokoska, L., Stolcova, M., & Pulkrabek, J., 2009:

Antimicrobial properties of selected essential oils in vapour phase against foodborne

bacteria. - Food control 20(2): 157-160.

Opalchenova, G., & Obreshkova, D., 2003: Comparative studies on the activity of basil—

an essential oil from Ocimum basilicum L.—against multidrug resistant clinical isolates

of the genera Staphylococcus, Enterococcus and Pseudomonas by using different test

methods. - Journal of Microbiological methods 54(1): 105-110.

Özcan, M., & Chalchat, J. C., 2002: Essential oil composition of Ocimum basilicum L.

and Ocimum minimum L. in Turkey. - Czech journal of food sciences 20(6): 223-228.

MASTER RAD

47

Pecarski, D., 2014: Antimikrobno dejstvo etarskih ulja nekih vrsta familija Apiaceae i

Lamiaceae na bakterije i gljivice uzročnike vulvo-vaginalnih infekcija žena u

reproduktivnom periodu. Doktorska disertacija, Fakultet medicinskih nauka, Kragujevac.

Pires, S. M., Vieira, A. R., Hald, T., & Cole, D., 2014: Source attribution of human

salmonellosis: An overview of methods and estimates. - Foodborne pathogens and

disease 11(9): 667-676.

Podolak, R., Enache, E., Stone, W., Black, D. G., & Elliott, P. H., 2010: Sources and risk

factors for contamination, survival, persistence, and heat resistance of Salmonella in low-

moisture foods. - Journal of Food Protection 73(10): 1919-1936.

Radulović, Š., 2004: Mikrobiologija sa epidemiologijom (za II razred medicinske škole),

str. 151-154, Beograd.

Ranđelović, V., Matejić, J., & Mitić, Z., 2012: Praktikum iz sistematike i ekologije

lekovitih biljaka. Univerzitet u Nišu, Niš.

Rattanachaikunsopon, P., & Phumkhachorn, P., 2010: Antimicrobial activity of basil

(Ocimum basilicum) oil against Salmonella enteritidis in vitro and in food. - Bioscience,

biotechnology, and biochemistry 74(6): 1200-1204.

Reuveni, A. F., & Putievsky, E., 1984: Fungistatic activity of essential oils from Ocimum

basilicum chemotypes. - Journal of Phytopathology 110(1): 20-22.

Ružičić, L., Kostadinović, L., & Jevđović, R., 2011: Uticaj agrotehničkih mera na prinos i

sadržaj etarskog ulja kod bosiljka. - Poljoprivredna tehnika 36(2): 53-59.

Sartoratto, A., Machado, A. L. M., Delarmelina, C., Figueira, G. M., Duarte, M. C. T., &

Rehder, V. L. G., 2004: Composition and antimicrobial activity of essential oils from

aromatic plants used in Brazil. - Brazilian Journal of Microbiology 35(4): 275-280.

Shafique, M., Khan, S. J., & Khan, N. H., 2011: Study of antioxidant and antimicrobial

activity of sweet basil (ocimum basilicum) essential oil. - Pharmacology online 1: 105-

111.

Sharafati Chaleshtori, R., Rokni, N., Rafieian-Kopaei, M., Drees, F., & Salehi, E., 2015:

Antioxidant and Antibacterial Activity of Basil (Ocimum basilicum L.) Essential Oil in

Beef Burger. - Journal of Agricultural Science and Technology 17(4): 817-826.

Silveira, S. M. D., Cunha Júnior, A., Scheuermann, G. N., Secchi, F. L., & Vieira, C. R.

W., 2012: Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from selected

herbs cultivated in the South of Brazil against food spoilage and foodborne pathogens. -

Ciência Rural 42(7): 1300-1306.

MASTER RAD

48

Simon, J. E., Quinn, J., & Murray, R. G., 1990: Basil: a source of essential oils. -

Advances in new crops: 484-489.

Sinha, G. K., & Gulati, B. C., 1990: Antibacterial and antifungal study of some essential

oils and some of their constituents. - Indian perfumer 34(2): 126-129.

Smith, J. L., 2005: Foodborne pathogens: microbiology and molecular biology. Horizon

Scientific Press, str. 327-329.

Soković, M., Glamočlija, J., Marin, P. D., Brkić, D., & van Griensven, L. J., 2010:

Antibacterial effects of the essential oils of commonly consumed medicinal herbs using

an in vitro model. – Molecules 15(11): 7532-7546.

Stanković, N. S., Čomić, Lj. R., Kocić, B. D., Nikolić, D. M., Mihajilov-Krstev, T. M.,

Ilić, B. S., & Miladinović, D. L., 2011: Odnos antibakterijske aktivnosti i hemijskog

sastava etarskih ulja gajenih biljaka iz Srbije. - Hem. ind 65(5): 583-589.

Škrinjar, M. M., & Nemet, N. T., 2009: Antimicrobial effects of spices and herbs

essential oils. - Acta periodica technologica 40: 195-209.

Tajkarimi, M. M., Ibrahim, S. A., & Cliver, D. O., 2010: Antimicrobial herb and spice

compounds in food. - Food control 21(9): 1199-1218.

Wisner, A. L., Desin, T. S., Koch, B., Lam, P. K. S., Berberov, E. M., Mickael, C. S., ...

& Köster, W., 2010: Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteritidis

Salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system: role in intestinal colonization

of chickens and systemic spread. – Microbiology 156(9): 2770-2781.

Witkowska, A. M., Hickey, D. K., Alonso-Gomez, M., & Wilkinson, M., 2013:

Evaluation of antimicrobial activities of commercial herb and spice extracts against

selected food-borne bacteria. - Journal of Food Research 2(4): p37.

Yim, L., Betancor, L., Martinez, A., Giossa, G., Bryant, C., Maskell, D., & Chabalgoity,

J. A., 2010: Differential phenotypic diversity among epidemic-spanning Salmonella

enterica serovar Enteritidis isolates from humans or animals. - Applied and environmental

microbiology 76(20): 6812-6820.

49

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Датум одбране, ДО: Чланови комисије,

КО:

Председник

:

Др Татјана Михајилов-Крстев

Члан: Др Славиша Стаменковић

Члан,

ментор:

Др Зорица Стојановић-Радић

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Ристић

Ментор, МН: Зорица Стојановић-Радић

Наслов рада, НР: Утицај етарског уља босиљка (Ocimum basilicum L.) на раст Salmonella enterica

subsp. enteritidis у месу

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2015.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

50 стране, 2 табеле, 10 слика, 1 графикон

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Микробиологија

Предметна одредница/Кључне речи,

ПО:

Етарско уље, босиљак (Ocimum basilicum L.), антимикробна активност, Salmonella

Enteritidis

УДК 547.913:582.929.4+616.98:641.12

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Циљ мастер рада био је да се истражи ефикасност етарског уља босиљка у

спречавању кварења пилећег меса. Пошто се бактерија Salmonella Enteritidis често

може изоловати из ове врсте меса тестирање ефикасности овог уља је испитано

на овој бактерији. Етарско уље је изоловано из сувог биљног материјала

хидродестилацијом. Антимикробна активност је испитана одређивањем минималне

инхибиторне концентрације микродилуционом методом, док је његов ефекат на

раст испитиване бактерије тестиран на куваном пилећем месу. Испитивање је

вршено на собној температури при различитим периодима инкубације.

Датум прихватања теме, ДП: 09.09.2015.

50

Accession number, ANO:

Identification number, INO: Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Jelena Ristić

Mentor, MN: Zorica Stojanović-Radić

Title, TI: Effect of basil essential oil (Ocimum basilicum L.) to the growth of Salmonella

enterica subsp. enteritidis in meat

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2015.

Publisher, PB: Author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

50 pages, 2 tables, 10 pictures, 1 graph

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Microbiology

Subject/Key words, S/KW: Essential oil, basil (Ocimum basilicum L.), antimicrobial activity, Salmonella

Enteritidis

UC 547.913:582.929.4+616.98:641.12

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB: The aim off the master thesis was to investigate efficacy of the basil essential oil

for spoilage prevention of chicken meat. Since the bacteria Salmonella Enteritidis

is a common contaminant of this type of meat, the efficiency of the oil was assayed

against this bacteria. Essential oil was isolated from dry plant material by

hydrodestilation. Antimicrobial activity was investigated by determining the

minimum inhibitory concentracion using microdilution method, while the effect of

essential oil to the bacterial growth was tested using cooked chicken meat. The

test was performed at the room temperature and different incubation periods.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 09.09.2015.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihajilov-Krstev

Member: PhD Slaviša Stamenković

Member,

Mentor:

PhD Zorica Stojanović-Radić

Образац Q4.09.13 - Издање 1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

univerzitet u niŠu prirodno matematiČki fakultet … · lečenje biljem ima dugu tradiciju u...

Documents