univerzitet u niŠu prirodno-matematiČki fakultet · što su livade, pašnjaci, kamenjari, gornje...
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Aleksandra Z. Ristić
“Efekti različitih regulatora rastenja na regeneraciju
Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro”
Master rad
Niš, 2013
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
“Efekti različitih regulatora rastenja na regeneraciju
Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro”
Master rad
Student: Mentor:
Aleksandra Z. Ristić Dr Dragana D. Stojičić, vanredni profesor
Br. indeksa 17
Niš, 2013
UNIVERSITY OF NIS
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
“The effect of different growth regulators on the regeneration
Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro”
Master thesis
Student: Mentor:
Aleksandra Z. Ristić Dr Dragana D. Stojičić
No. of index: 17 Associate professor
Niš, 2013
Zahvaljujem se mojoj mentorki Dragani Stojičić na ukazanoj pomoći i
strpljenju tokom izrade mog master rada.
Iskreno se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći pri
izradi eksperimentalnog dela master rada. Ovaj master rad je deo doktorske
disertacije asistentkinje Svetlane Tošić i sadrži još uvek nepublikovane
rezultate. Za analizu je korišćen materijal sakupljan za potrebe izrade
disertacije.
Najveću zahvalnost dugujem mojim roditeljima i sestri koji su sve vreme mog
školovanja bili uz mene i pružali mi podršku, ljubav i verovali u mene.
Hvala svima što ste verovali i bili uz mene…
APSTRAKT
Micromeria croatica (Pers.) je endemična vrsta Dinarida, planinskog masiva u južnoj Evropi.
Na teritoriji Srbije zabeležena je na Mokroj Gori. Takođe rasprostranjena je u Hrvatskoj,
Bosni i Hercegovini i Crnoj Gori. Micromeria croatica je ugrožena vrsta na Crvenoj listi
vaskularne flore Srbije i Crne Gore. Prema dostupnoj literaturi ova biljna vrsta do sada nije
uvedena kulturu in vitro. Korišćenjem različitih regulatora rastenja ispitivana je mogućnost
regeneracije biljaka M. croatica putem indukcije aksilarnih pupoljaka na nodalnim
eksplantatima. Prema našim rezultatima najefikasnije kombinacije regulatora rastenja bile su:
1 μM Kin i 0,57 μM IAA, i 30 μM Kin i 0,57 μM IAA. Dobijeni aksilarni pupoljci su
izduživani na podlozi bez hormona a zatim i ožiljeni delovanjem auksina 0,1 μM NAA. Na
ovaj način je uspešno regenerisana Micromeria croatica u uslovima in vitro.
Ključne reči: Micromeria croatica, kinetin, aksilarni pupoljci.
ABSTRAKT
Micromeria croatica (Pers.) is endemic to The Dinaric Alps, a mountain range in Southern
Europe. In Serbia it can be found on Mokra Gora. It is also present in Croatia, Bosnia and
Herzegovina and Montenegro. Micromeria croatica is an endangered species and it is listed
on the Red List of Vascular Plants of Serbia and Montenegro. According to the existing
literature this species has not been introduced in vitro culture. Different regulators of growth
were used for examinations of the possibility of regeneration of Micromeria croatica through
induction of axillary buds on nodal explants. Our results show that the most effective
combinations of growth regulators were: 1 μM Kin and 0,57μM IAA, and 30 μM Kin and
0,57 μM IAA. The axillary buds developed this way were elongated on a hormone-free
surface. After that root initiation started due to the effects of auxin 0,1 μM NAA. In this way
Micromeria croatica was successfully regenerated in in vitro conditions.
Keywords: Micromeria croatica, kinetine, axillary buds.
SADRŽAJ:
1. UVOD 1
1. 1. Micromeria croatica (Pers.) Schott. 3
1.2. Kultura in vitro 4
1.3. Vegetativno razmnožavanje in vitro 4
1.4. Mikropropagacija 5
1.5. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro 6
2. CILJ RADA 9
3. MATERIJAL I METODE 11
3.1. Biljni material 12
3.2 Sterilizacija biljnog mterijala 12
3.3. Sterilizacija hranljivih podloga i pribora 12
3.4. Hranljive podloge – postupak pripremanja 12
3.4.1. Hranljiva podloga MS 13
3.4.2. Hranljive podloge za koje su korišćene indukciju aksilarnih pupoljaka
Micromeria croatica 14
3.4.3. Hranljive podloge koje su korišćene za razviće aksilarnih pupoljaka
Micromeria croatica 15
3.4.4. Hranljive podloge koje su korišćene za indukciju korenova na aksilarnim
izdancima Micromeria croatica 15
3.5. Statistička analiza 15
4. REZULTATI 16
4.1. Uspostavljenje kulture in vitro kod vrste M. croatica 17
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. croatica 17
4.3. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima Micromeria croatica 24
5. DISKUSIJA 26
6. ZAKLJUČAK 29
7. LITERATURA 31
SKRAĆENICE
Kinetin - 6-furfuril-aminopurin IAA - indol-3-sirćetna kiselina NAA – α - naftil- sirćetna kiselina
1
1. UVOD
2
Familija usnatica (Lamiaceae, Labiatae) obuhvata, prema različitim autorima, između 6900 i
7200 vrsta koje su grupisane u 233 do 263 roda. Predstavnici familije Lamiaceae su
kosmopolitskog rasprostranjenja, ali najveći broj vrsta naseljava Mediteransku oblast i
centralnu Aziju. Ovoj familiji pripadaju uglavnom zeljaste jednogodišnje ili višegodišnje
biljke, nešto ređe polužbunovi i žbunovi, a retko niske drvenaste vrste. Kod biljaka ove
familije žlezde na epidermisu su uglavnom dobro razvijene i sadrže etarska ulja (mešavinu
terpenoidnih jedinjenja) ili ugljene hidrate. Zbog karakteristično raspoređenog kolenhima,
stabljike ovih biljaka su na poprečnom preseku četvorouglaste. Listovi imaju unakrsan lisni
raspored što znači da su listovi naspramno postavljeni, a da su unakrsno raspoređeni. Kod
najvećeg broja predstavnika familije usnatica listovi su pokriveni mehaničkim dlakama,
žlezdanim dlakama i žlezdanim ljuspama. Listovi obično imaju dobro razvijenu lisnu dršku, a
obod liske može biti ceo, testerast, grubo ili samo donekle nazubljen, a poznati su i
predstavnici sa perasto usečenim obodima liski. Zalisci nisu razvijeni.
Predstavnici familije Lamiaceae naseljavaju najčešće svetla, sunčana i otvorena staništa kao
što su livade, pašnjaci, kamenjari, do gornje šumske granice. Javljaju se i u šumskim
ekosistemima, a poznate su i korovske, kao i rudimentalne vrste. Veći ekonomski značaj
imaju biljke koje sadrže aromatične sastojke koji se koriste u industriji parfema, medicini,
farmaciji, ili kao začinske biljke. Među najpoznatijim i najefikasnijim gajenim i divljim
lekovitim biljkama upravo su predstavnici familije usnatica poput nane, žalfije, miloduha,
origana, ruzmarina, lavande, majčine dušice, rtanjskog čaja, podubice i mnogih drugih.
Većina usnatica spada u kategoriju dobrih medonosnih biljaka. Ove biljke se intenzivno
istražuju u cilju korišćenja njihovih antimikrobnih aktivnosti (Tatić, Blečić, 1984).
Usnatice imaju značajnu primenu u narodnoj medicini, jer sadrže veliki broj aktivnih
sastojaka. Na prvom mestu one sadrže etarska ulja. Etarsko ulje privlači insekte oprašivače,
deluje toksično na insekte, ljutog je ukusa pa odbija životinje, toksično je i za bakterije i
gljivice. U tradicionalnoj medicini biljke sa etarskim uljima se upotrebljavaju protiv
infekcija, kod bolova u stomaku, da podstaknu iskašljavanje... Еtarsko ulje npr. vrste
Micromeria pulegium sadrži od 27 do 39 sastojaka, od kojih su najreprezetativniji kariofilen-
oksid i E-kariofilen (Slavkovska et al. 2005).
3
1. 1. Micromeria croatica (Pers.) Schott.
Carstvo: Plantae
Razdeo: Magnoliophyta
Klasa: Magnoliopsida
Red: Lamiales
Fam: Lamiaceae (Labiatae)
Rod: Micromeria
Micromeria croatica
Rod Micromeria je prvi opisao Bentham (1829), on pripada familiji Lamiaceae i sadrži 54
vrste, 32 podvrste i 13 sorti. Proširio se sa Makaronezijsko – Mediteranskog regiona u Južnu
Afriku, Indiju i Kinu (Brauchler i sar., 2008). Na osnovu morfoloških karakteristika i
filogenetskih odnosa, vrste roda Micromeria su podeljene u tri sekcije: Cymularia,
Eumicromeria i Pseudomelissa. Vrste ovog roda koje naseljavaju Srbiju pripadaju sekcijama
Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata i M. parviflora) i Pseudomelissa (M.
thymifolia, M. albanica, M. dalmatica i M. pulegium). Micromeria su uglavnom
kosmopolitskog rasprostranjenja, najveća raznolikost vrsta prisutna je u oblasti Mediterana,
Male i Centralne Azije. Micromeria croatica je endemična vrsta Ilirsko-Balkanskog regiona,
rasprostranjena u Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini, Crnoj Gori i zapadnoj Srbiji. U Srbiji
Micromeria croatica naseljava relativno mali areal na Mokroj Gori (Kremer et al. 2012).
Ovaj patuljasti žbun raste u pukotinama krečnjačkih stena na visinama od 150 do 2000 m.
4
Ugrožena je vrsta na Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore (Stevanović i sar.
2003).
1.2. Kultura in vitro
Kultura biljnog tkiva predstavlja vegetatvno razmnožavanje biljaka u laboratorijskim
uslovima in vitro. Naime, iz vegetativnih delova biljke (lista, stabla, korena), donetih iz
prirode, moguće je proizvesti na hiljade novih jedinki u laboratorijskim uslovima,
aklimatizovati i vratiti ih na prirodna staništa. Dakle, kultura in vitro je postupak koji
podrazumeva gajenje organa, malih delova tkiva ili izolovanih ćelija u aseptičnim odnosno
sterilnim uslovima. Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu
pojedine organe, ali i embrione ili kompletnu biljku je izraz njihove totipotencije
(sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele, i da regenerišu pojedine organe,
embrione ili, pak, celu biljku) i plastičnosti (sposobnost biljke da menja svoj program
rastenja, metabolizma i razvića u zavisnosti od uslova sredine.
1.3. Vegetativno razmnožavanje in vitro
Vegetativno razmnožavanje na klasičan način, u kome se dobija potomstvo genetički
identično majci biljci je: razmnožavanje putem reznica, krtola, lukovica, kao i pri
kalemljenju. Vegetativno razmnožavanje biljaka in vitro je metoda u kojoj odsečeni organi:
koren, stablo, list, čak i manji fragmenti mogu da izrastu u normalnu biljku. Po ovoj
sposobnosti se biljke razlikuju od životinja. Vegetativno potomstvo dobijeno na ovaj način je
genetički homogeno i identično početnom materijalu.
Vegetativna propagacija in vitro obuhvata nekoliko načina razmnožavanja, a to su:
1. Mikropropagacija - permanentna kultura pupoljaka;
2. Organogeneza - formiranje pupoljaka de novo;
3. Somatska embriogeneza - razviće embriona iz somatskih;
5
4. Androgeneza i ginogeneza - razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog
gametofita bez oplođenja
5. Somatska hibridizacija - somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne ćelije, i da
fuzijom daju novi organizam.
1.4. Mikropropagacija
U širem smislu mikropropagacija predstavlja razmnožavanje biljaka u kulturi in vitro. U
užem smislu označava razmnožavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih pupoljaka,
koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih primordija.
Regeneracija biljaka putem apikalnih i aksilarnih pupoljaka je postupak koji ima 4-5
karakterističnih faza što zavisi od osobina biljke koja se razmnožava. To su:
1. Inicijacija - uvođenje primarnih eksplantata u uslove in vitro. Vrh stabla se postavlja na
hranljivu podlogu (koja sadrži nutritivne elemente i relativno visoku dozu citokinina,
najčešće BA). Na ovoj podlozi se listovi izdužuju i formiraju lisnu rozetu, rastu i aksilarni
pupoljci, tako da se dobija vrlo razgranat žbun pupoljaka, koji se u sledećoj fazi razdvajaju i
prenose na novu podlogu;
2. Multiplikacija - umnožavanje izdanaka. Određenom kombinacijom hormona omogućava
se indukcija većeg broja bočnih pupoljaka (obično od jednog inokuluma dobija se 4-10
novih);
3. Izduživanje - razvoj i izduživanje pupoljaka u izdanke. Ovaj proces može da se desi
spontano, ili uz dodavanje giberelina;
4. Ožiljavanje - indukcija adventivnih korenova na eksplantatima koji su dostigli 1-2 cm, uz
pomoć auksina;
5. Aklimatizacija - presađivanje u zemlju i aklimatizacija. Ova faza obuhvata prenos biljaka
u nesterilne uslove i privikavanje na autotrofan način života.
Mikropropagacija se uspešno koristi za razmnožavanje sledećih grupa biljaka: lekovitih
biljaka u cilju obezbeđivanja sirovina za industrijsku preradu, elitnih primeraka šumskog
drveća čije su osobine visoko cenjene, dvodomih vrsta kada je za određivanje pola biljke
potrebno da prođe i nekoliko godina, podloga i plemki voćaka itd.
6
Vegetativno razmnožavanje in vitro ima niz prednosti: razmnožavanje in vitro je mnogo brže
od razmnožavanja in vivo; moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti in
vivo; mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže nego biljke koje rastu in vivo, jer su
oslobođene patogena i infekcija bakterijama i gljivama; in vitro omogućava razmnožavanje
samo zdravih biljaka; mikropropagacija ima veliki značaj u borbi za suzbijanje i eliminaciju
biljnih virusa obzirom da se ovim načinom razmnožavanja dobijaju bezvirusne biljke;
vegetativno razmnožavanje in vitro se može započeti sa vrlo malo biljnog materijala kao
početnog eksplantata; zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski
proizvodnju određenih kultura; veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti
ugroženih i retkih biljnih vrsta (Parić et al. 2011, Vinterhalter, Vinterhalter, 1996).
1.5. Faktori koji utiču na rastenje biljnih kultura in vitro
Nužni zahtevi pri kultivisanju biljnih kultura su:
- Odgovarajuće tkivo (neka tkiva su pogodnija za kultivaciju od drugih). Kultura tkiva
počinje iz delova biljke ili organa koji se nazivaju eksplantati. Koji delovi biljke (majka
biljka) će biti korišćeni kao eksplantati zavisi od: tipa kulture koji će biti iniciran; svrhe
predložene kulture i biljne vrste koja se koristi. Izbor eksplantata je vrlo važan korak kulture
in vitro, jer korektan izbor eksplantata znatno utiče na uspeh kulture. Izolacija eksplantata
započinje izolacijom početnog eksplantata (deo ili čitava biljka), koji se nakon sterilizacije
uvode u kulturu u sterilnim uslovima. Kao početni eksplantat može poslužiti bilo koji deo
biljke, ali se najčešće upotrebljavaju seme i meristemi. Eksplantati uzeti sa majke biljke u
različitom vremenu godine ne daje uvek dobre reproduktivne rezultate. Razlog može biti
varijacija u nivou eksternih kontaminanata ili sezonske promene u nivou endogenih (internih)
regulatora rasta kod stock biljaka.
- Pogodna podloga za gajenje, koja mora sadržati izvor energije i neorganskih soli u
koncentraciji koja je neophodna za normalno rastenje i razviće biljnih ćelija, organa i tkiva.
Uspešnost kulture ćelija, tkiva ili organa zavisi od sastava same podloge, koja bi trebalo da zadovolji
7
nutritivne i fiziološke potrebe ćelija u kulturi. Osnovni nutritivni zahtevi kulture biljnih ćelija su vrlo
slični onima kod biljaka koje rastu u prirodnom okruženju, ipak sastav podloge varira, što zavisi
od: tipa ćelija, tipa tkiva ili organa, porekla biljne vrste. Bez obzira na različitost hranljivih
podloga, zajedničko za sve je da one moraju da sadrže sledeće: vodu, agar, mineralne soli,
ugljene hidrate (najčešće saharozu), vitamine, aminokiseline, regulatore rastenja.
- Regulatori rastenja (za gajenje biljaka in vitro su najznačajniji auksini i citokinini). Biljni
hormoni su organski sastojci koje prirodno sintetišu više biljke, koji primenjeni u relativno
malim količinama utiču na rastenje i razviće biljaka. Pored ovih prirodnih sastojaka
sintetisane su i sintetičke komponente, koje po funkciji odgovaraju prirodnim hormonima.
Sintetički hormoni se nazivaju regulatori rastenja. Auksini: Indol-3-sirćetna kiselina (IAA)
indol-buterna kiselina (IBA), naftil-sirćetna kiselina (NAA) ili 2,4-dihlor-fenoksisirćetna
kiselina (2,4-D) se često dodaju hranljivim podlogama. Prouzrokuju izduživanje ćelija i
bubrenje tkiva, ćelijsku deobu (obrazovanje kalusa) i obrazovanje adventivnih korenova,
inhibiciju obrazovanja adventivnih i bočnih izdanaka, a često i embriogenezu u suspenzionim
kulturama. Citokinini se često koriste za stimulaciju rastenja i razvića. Najviše se koriste
kinetin, 6-benzil-aminopurin (BA) i 2-izopentiladenin (2iP). Oni obično pokreću deobu
ćelija, naročito ako se dodaju zajedno sa auksinima. U većim koncentracijama (1-10 mg/l)
mogu indukovati obrazovanje adventivnih izdanaka, ali se obrazovanje korenova u tom
slučaju zaustavlja. Citokinini pokreću obrazovanje pomoćnih (bočnih) izdanaka uz smanjenje
apikalne dominacije, a usporavaju i starenje.
- Svetlost i temperatura kao spoljašnji faktori koji utiču na rast biljnih kultura in vitro.
Svetlost je važan faktor jer reguliše rastenje biljnih kultura in vitro na više načina, i to preko
dužine dana, intenziteta zračenja kao i spektralnog sastava. Obično se bira dužina dana od 16
ili 8h, mada se koristi i neprekidno osvetljenje. U posebnim slučajevima, rastenje se dešava u
neprekidnoj tami (tamu zahtevaju sitna semena). Temperatura se obično održava na
konstantnoj vrednosti 24-26 °C, zavisno od eksperimentalnih vrsta. Niža temperatura se
koristi za lukovičaste vrste (oko 18 °C), a viša za tropske vrste (28-29 °C).
8
- Aseptični (sterilni) uslovi rada. Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima,
kako ne bi došlo do razvoja gljiva i bakterija koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.
- Česta subkultivacija (pasažiranje). Pasažiranje je prenošenje kultura (eksplantata) sa
prethodne, istrošene podloge na svežu. Izvodi se, takođe, u sterilnim uslovima.
Subkultivacija je neophodna iz više razloga: iscrpljenost hranljive podloge; isušivanje
hranljive podloge (što vodi suviše visokoj koncentraciji soli i šećera); naraslost materijala do
ispunjavanja posude za gajenje kulture; potreba da se materijal dalje razmnožava; pojava
mrke ili crne boje u agaru (biljna tkiva ponekad otpuštaju toksične supstance u toku prvih
nedelja kultivacije, koje prodiru u agar ili tečnu podlogu);
9
2. CILJ RADA
10
Cilj ovog rada bio je ispitivanje efekata različitih regulatora rastenja na regeneraciju
Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro. Indukcija aksilarnih pupoljaka, njihova
multiplikacija i izduživanje je stimulisana korišćenjem različitih regulatora rastenja iz grupe
citokinina i auksina a ožiljavanje dobijenih izdanaka i formiranje kompletne biljke
korišćenjem auksina u različitim koncentracijama.
11
3. MATERIJAL I METODE
12
3.1 Biljni materijal
Za potrebe ovog eksperimentalnog rada biljke Micromeria croatica prikupljene su na Mokroj
Gori. Korišćen je biljni materijal Micromeria croatica iz vegetativne faze. U eksperimentu su
korišćeni nodalni eksplantati. Na svaku podlogu postavljano je po 30 nodalnih eksplantata.
Vršni pupoljak se nije koristio za eksplantat.
3.2 Sterilizacija biljnog mterijala
Sterilizacija nodalnih segmenata (u daljem tekstu eksplantat) Micromeria croatica obavljena
je 25% - nim rastvorom varikine (komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa 60 g
aktivnog hlora/l) u trajanju od 25 minuta. Nakon sterilizacije eksplantati su isprani sterilnom
destilovanom vodom tri puta. U cilju eliminacije gljivične infekcije eksplantati su 24 časa
potapani u sterilni rastvor nistatina (5%), a zatim isprani sterilnom destilovanom vodom tri
puta. Ovako pripremljeni eksplantati su u aseptičnim uslovima postavljani na odgovarajuće
hranljive podloge.
3.3. Sterilizacija hranljivih podloga i pribora
Hranljive podloge su sterilisane u autoklavu na temperaturi 120 °C i pritisku od 1 Bar.
Dužina autoklaviranja podloge na ovoj temperaturi iznosi 25 minuta. Sterilizacija
instrumenata se započinje iskuvavanjem u destilovanoj vodi u trajanju od 30 minuta.
Iskuvani instrumenti se vade pomoću pincete i prebacuju u čašu sa 70-95% alkoholom. Pre
upotrebe opaljivanjem na plamenu špiritusne lampe instrumenti se dodatno sterilišu.
3.4. Hranljive podloge – postupak pripremanja Odmeriti menzurom vodu za pripremu podloge i presuti je u lonac za kuvanje. Uključiti
grejanje na najjače i u mlaku vodu dodati agar uz mešanje. Količina vode za podlogu
13
određuje se tako što se od finalne zapremine odbije zapremina nešto malo veća od zapremine
stoka makro soli. Uz povremeno mešanje sačekati da voda sa agarom provri. Lonac skinuti sa
vatre i dodati redom: saharozu, inozitol, makro soli, mikro soli, rastvor gvožđa, vitamine i
hormone. Zakuvana podloga vraća se u menzuru da bi se doterala zapremina dodavanjem
destilovane vode. Pre razlivanja u posude proverava se pH vrednost podloge koji treba da
bude 5,8 uz pomoć 0,1N NaOH ili 0,1N HCl.
3.4.1. Hranljiva podloga MS Hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu bila je Murashige, T. and Skoog, F. (1962)
– MS podloga. Ova hranljiva podloga ima određeni sastav makro, mikro mineralnih soli i
organskih dodataka. Sastav je prikazan u sledećim tabelama:
Makro mineralne soli MS (mg/l)
NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 × 2H2O 440 MgSO4 × 7H2O 370 KH2PO4 170
Mikro mineralne soli
MS (mg/l)
Mn SO4 × 4H2O 22.3 Zn SO4 × 7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KJ 0.83 NaMoO4 × 2H2O 0.25 CuSO4 × 5 H2O 0.025 CoCl2 × 6 H2O 0.025 FeSO4 × 7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3
14
Osim makro i mikro mineralnih soli hranljivim podlogama se dodaju i organski dodaci:
Organski dodaci
MS (mg/l)
vitamin B1 0.4 vitamin B6 0.5 nikotinska kiselina 0.5 Glicin 2.0
(g/l) Mioinozitol 0,15 Saharoza 45,0 Agar 10,5
3.4.2. Hranljive podloge koje su korišćene za indukciju aksilarnih pupoljaka
Micromeria croatica
Ispitivanje uticaja regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka je vršeno na podlozi
MS:
Hranljiva podloga
1 2 3 4 5 6 7 8
Kinetin (μM)
0 0 0,1 0,3 1,0 3,0 10,0 30,0
IAA (μM) 0
0,57
0,57 0,57 0,57 0,57 0,57 0,57
Eksplantati su postavljani u staklene teglice (5×5×12 cm). Svaka od pripremljenih hranljivih
podloga je razlivena u po 3 teglice. U svaku teglicu postavljeno je po 10 eksplantata, na taj
način je na svaki tretman postavljeno po 30 eksplantata. Uslovi za gajenje kulture bili su:
temperatura 21 ± 2 °C, fotoperiod od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka. Četiri nedelje nakon
postavljanja eksplantata na različite hranljive podloge utvrđen je broj aksilarnih pupoljaka po
eksplantatu i njihova dužina.
15
3.4.3. Hranljive podloge koje su korišćene za razviće aksilarnih pupoljaka Micromeria
croatica
U cilju izduživanja aksilarnih pupoljaka korišćena je podloga MS bez regulatora rastenja. Na
ovoj podlozi izdanci su gajeni 4 nedelje a nakon toga su preneti na podloge za ožiljavanje.
3.4.4. Hranljive podloge koje su korišćene za indukciju korenova na aksilarnim
izdancima Micromeria croatica
Za ožiljavanje korišćeni su izdanci dužine ne manje od 10 mm. Hranljiva podloga korišćena
tokom ožiljavanja izdanaka sadržala je MS mineralni rastvor koja je dopunjena sa α-naftil-
sirćetna kiselina (NAA) u koncentracijama od 0,1 do 1μM. Vrednost pH hranljive podloge se
podešava na 5,8 pre autoklaviranja na temperaturi od 120 ºC i pritisku od 1 atm tokom 30
minuta. Ožiljavanje izdanaka obavljeno je u staklenim teglama (5×5×12 cm), koje su
sadržale po 70 ml hranljive podloge. Eksplantati su gajeni na fotoperiodu od 8 sati mraka i 16
sati svetlosti na temperaturi od 21°C. Nakon tri nedelje evidentiran je broj formiranih
korenova na bazalnom kraju eksplantata.
3.5. Statistička analiza
Obrada podataka je urađena statističko-grafičkim paketom Statgraphics, procedura ANOVA i
test LCD na nivou značajnosti p<0,05. Statistička analiza je urađena za svaki parametar i u
tabelama je predstavljena slovima. Statistički značajne razlike predstavljene su različitim
slovima, ista slova označavaju da tih razlika nije bilo.
16
4. REZULTATI
17
4.1. Uspostavljenje kulture in vitro kod vrste M. croatica
Prema podacima iz literature M. croatica do sada nije uvedena u kulturu in vitro. Nodalni
eksplantati su u sterilnim uslovima postavljeni na hranljivu podlogu MS bez regulatora
rastenja. Na ovoj podlozi eksplantati su proveli 4 nedelje i tokom trajanja ove faze
eliminisani su eksplantati koji su zaraženi bakterijskom ili gljivičnom infekcijom, kao i oni
koji su bili zahvaćeni nekrozom. Nakon 4 nedelje zdrav i nezaražen materijal je prenet na
svežu hranljivu podlogu. Ovaj biljni materijal je primarni eksplantat koji je korišćen za
indukciju aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima M. croatica.
4.2. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. croatica
Radi indukcije aksilarnih pupoljaka eksplantati M. croatica su gajeni na hranljivoj podlozi
MS sa različitim koncentracijama citokinina kinetina u rasponu od 0 – 30,0 μM i auksina
indol-3-sirćetnom kiselinom u koncentraciji od 0,57 μM. Nodalni eksplantati su bili
postavljeni i na kontrolnu hranljivu podlogu MS bez hormona. Dve nedelje nakon
postavljanja eksplantata na MS hranljivu podlogu sa regulatorima rastenja različitih
koncentracija uočava se uspešno razviće nodalnih eksplantata u uslovima in vitro. Bez obzira
na koncentraciju korišćenih regulatora rastenja tokom prvih nedelja došlo je od pojave
aksilarnih pupoljaka na gotovo svim nodalnim eksplantatima bez obzira na kojoj su
induktivnoj podlozi gajeni (Slika 1).
U tabeli 1. prikazan je procenat eksplantata sa formiranim aksilarnim pupoljcima, prosečan
broj i prosečna dužina aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima. Na podlogama sa
niskim koncentracijama kinetina prosečan broj pupoljaka po eksplantatu je manji nego kod
eksplantata koji su gajeni na podlozi bez regulatora rastenja (Tab. 1). Veći broj pupoljaka
nego na kontrolnim eksplantatima zabeležen je kod eksplanatata gajenih na podlozi sa 1 μM
kinetina i 0,57 μM IAA odnosno 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA, što pokazuje i statistička
analiza (Tab. 1). Prosečna dužina pupoljaka bila je najveća na eksplantatima koji su gajeni na
podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA odnosno 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA. Ove
18
visoke koncentracije kinetina dovele su do povećanja dužine pupoljaka u odnosu na
eksplantate gajene na podlozi bez regulatora rastenja (Tab. 1).
Tabela 1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria croatica
Tretman Eksplanati sa aksilarnim
pupoljcima (%)
Prosečan broj pupoljaka
po eksplantatu
Prosečna dužina pupoljaka (mm)
1 Bez hormona 100 8,21± 1,05abc 7,16 ± 0,44bc 2 0 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 6,32 ± 0,78a 6,95 ± 0,46bc 3 0,1 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 6,00 ± 0,67a 5,25 ± 0,42a 4 0,3 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 6,56 ± 0,76a 6,26 ± 0,43ab 5 1 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 9,81 ± 1,03c 6,81 ± 0,36b 6 3 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 7,50 ± 0,79ab 6,68 ± 0,37b 7 10 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 7,93 ± 0,76abc 8,16 ± 0,44c 8 30 μM Kin + 0,57 μM IAA 100 9,94 ± 1,33c 8,04 ± 0,53c
Višestruki test intervala - vrednosti označene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou značajnosti p<0.05
Biljke Micromeria croatica uspešno su rasle na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja
(Slika 1). Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu na ovoj podlozi, koja služi kao kontrolna
podloga, bio 8,21 pupoljaka po eksplantatu, a prosečna dužina pupoljaka bila je 7,16 mm
(Tab. 1).
Slika 1. M. croatica na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja
19
Na hranljivoj podlozi MS sa 0,57 μM IAA prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je
6,32, što je značajno manje nego na eksplantatima sa kontrolne podloge (Tab.1). Niska
koncentracija auksina u podlozi dovela je do skraćivanja internodija, pa ove biljke imaju
žbunastu, nisku formu (Slika 2). Takođe, prosečna dužina pupoljaka je manja nego prosečna
dužina pupoljaka na kontrolnim eksplantatima i iznosi 6,95 mm (Tab.1).
Slika 2. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,57 μM IAA
Na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM kinetina i 0,57 μM IAA je zabeležen najmanji prosečan
broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu koji iznosi 6.0 i najmanja prosečna dužina pupoljaka
od 5.25 mm (Tab.1). Niske koncentracije citokinina i auksina dovele su do značajnog
smanjenja broja formiranih pupoljaka na eksplantatima u poređenju sa kontrolnim
eksplantatima gajenim bez regulatora rastenja, takođe uticale su i da pupoljci imaju manju
dužinu (Tab.1). Na ovoj podlozi primećena je najveća raznolikost u izgledu i dužini
eksplantata, tako se mogu uočiti kratke izrazito žbunaste forme ali i one sa znatno izduženim
internodijama (Slika 3).
20
Slika 3. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM Kin i 0,57 μM IAA
Gajenjem M. pulegium na hranljivoj podlozi sa 0,3 μM kinetina i 0,57 μM IAA na
eksplantatima je formirano prosečno 6,56 aksilarnih pupoljaka čija je prosečna dužina bila
6.26 mm (Tab.1). Eksplantati gajeni na niskim koncentracijama auksina nisu se morfološki
razlikovali (Slika 4).
Slika 4. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,3 μM kinetina i 0,57 μM IAA
21
Na MS hranljivoj podlozi sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA došlo je do znatnog povećanja
prosečnog broja pupoljaka po eksplantatu koji je iznosio je 9,81 (Tab.1). Ipak, prosečna
dužina pupoljaka od 6,81 mm još uvek je manja nego kod kontrolnih eksplantata. Biljke
gajene na podlozi sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA su razgranate, zelene boje sa izduženim
internodijama (Slika 5, 6).
Slika 5. M. croatica na podlozi MS sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Slika 6. Eksplantati M. croatica na podlozi MS sa 1 μM kinetina i 0,57 μM IAA
22
Na eksplantatima M. croatica gajenim na MS hranljivoj podlozi sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA
posečan broj formiranih aksilarnih pupoljaka bio je 7,50 a njihova prosečna dužina 6,68 mm
(Tab. 1). Eksplantati na ovoj podlozi su se razlikovali od biljaka koje su gajene na kontrolnoj
podlozi, biljke su kratke, žbunaste, skraćenih internodija (Sl. 7).
Slika 7. M. croatica na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA
Na podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA na eksplantatima je prosečno formirano 7, 93
aksilarnih pupoljaka, što je manje nego kod kontrole a prosečna dužina pupoljaka bila je 8,16
mm što je veća dužina nego kod kontrolnih eksplantata (Tab. 1). Eksplantati su vitalni,
razgranati, zelene boje, ali kratkih internodija (Sl. 8).
23
Slika 8. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA
Na podlozi sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA došlo je do formiranja najvećeg prosečnog
broja pupoljka, 9,94, čija je prosečna dužina bila najveća 8,04 mm (Tab. 1). U poređenju sa
eksplantatima gajenim bez egzogeno dodatih regulatora rastenja ova podloga je i statistički
značajno uspešnija. Eksplantati su razgranati i vitalni sa izduženim internodijama (Sl. 9).
Slika 9. M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 30 μM kinetina i 0,57 μM IAA
24
Dobijeni rezultati predstavljeni su u histogramu 1. gde se vidi odnos između koncentracije
korišćenih regulatora rastenja i broja formiranih aksilarnih pupoljaka kao i njihove dužine.
Histogram1. Uticaj hranljive podloge i regulatora rastenja na indukciju aksilarnih pupoljaka
M. croatica
4.3. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima Micromeria croatica Za indukciju rizogeneze korišćeni su izdanci Micromeria croatica dužine oko 10 mm koji su
dobijeni procesom indukcije aksilarnih pupoljaka. Hranljiva podloga za indukciju korenova
bila je MS sa četiri različite koncentracije auksina α - naftil sirćetne kiseline NAA (0,1 μM;
0,2 μM i 0,3 μM i 1 μM). Nakon tri nedelje došlo je do formiranja korenova na izdancima M.
croatica. Koren se uglavnom formirao na bazalnom kraju izdanka ili na nodusu stabla (slika
10).
0
2
4
6
8
10
12
kontrola 0,57 IAA 0,1 kin 0,57 IAA
0,3 kin 0,57 IAA
1 kin 0,57 IAA
3 kin 0,57 IAA
10 kin 0,57 IAA
30 kin 0,57 IAA
Prosečan broj pupoljaka po eksplantatuProsečna dužina pupoljaka (mm)
25
Slika 10. Ožiljavanje M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 0,1 μM NAA
Na hranljivoj podlozi sa 0,1μM IAA ožiljeno je 80 % postavljenih izdanaka, (Tab. 2) dok je
sa povećanjem korišćene koncentracije auksina procenat ožiljenih izdanaka bio manji.
Tabela 2. Indukcija korenova na aksilarnim izdancima M. croatica
Podloga
Procenat ukorenjenih izdanaka
NAA 0,1 mg/l 80,0 % NAA 0,2 mg/l 63,3 % NAA 0,3 mg/l 43,3 % NAA 1 mg/l 63,3 %
26
5. DISKUSIJA
27
Vegetativno razmnožavanje biljaka M. croatica nodalnim eksplantatima in vitro je bilo
uspešno. Na osnovu urađenog eksperimenta definisani su uslovi pod kojima dolazi do
indukcije aksilarnih pupoljaka, njihovog izduživanja i ožiljavanja izdanaka M. croatica.
Gajenjem eksplantata M. croatica na hranljivoj podlozi MS bez regulatora rastenja došlo je
do formiranja prosečno 8,21 aksilarnih pupoljaka po eksplantatu. Indukcija aksilarnih
pupoljaka bez egzogeno dodatih regulatora rastenja zabelešena je kod Micromeria pulegium
(Tošić et al. 2013) i kod Salvia brachyodon (Mišić et al. 2006).
Dodavanje auksina u hranljivu podlogu dovelo je do smanjenog broja formiranih aksilarnih
pupoljaka po eksplantatu, suprotno rezultatima Sujana i Naidu (2011), koji su ustanovili
stimulativni efekat auksina na indukciju aksilarnih pupoljaka kod Mentha piperita. Takođe,
kombinacija auksina i niskih koncentracija kinetina indukuje manji broj aksilarnih pupoljaka
na eksplantatima u poređenju sa podlogom bez regulatora rastenja. Isti, inhibitorni efekat ima
kombinacija auksina i kinetina na dužinu aksilarnih pupoljaka.
Najveći broj aksilarnih pupoljaka formiran je na eksplantatima gajenim na podlogama kojima
je osim auksina dodat 1 μM kin ili 30 μM kin. U odnosu na kontrolu ove kombinacije
hormona su pokazale stimulativni efekat na indukciju aksilarnih pupoljaka. Niske
koncentracije auksina i različitih koncentracija citokinina imale su pozitivan uticaj na
indukciju aksilarnih pupoljaka kod Salvia (Cuenca et al. 2000), Calendulla (Çöçü et al.
2004), Cataranthus (Yuan et al. 1994). Kinetin u kombinaciji sa auksinom je pozitivno
delovao na indukciju pupoljaka kod Mentha piperita (Venkatramalingam and Ebbie, 2011).
Stimulativni efekat na dužinu pupoljaka imale su podloge sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA i
30 μM kinetina i 0,57 μM IAA, ostale korišćene podloge delovale su inhibitorno. Ovakvi
rezultati su suprotni od rezultata dobijenih kod Ocimum sanctum (Singh and Sehgal 1999),
Nepeta rtanjensis (Mišić et al. 2005) kod kojih su pupoljci eksplantata gajenih na podlozi bez
regulatora rastenja bili najduži.
28
Promene koje su uočene na izdancima koji su postavljeni na hranljive podloge za ožiljavanje
primećene su tokom treće nedelje. Začeci korena formiraju se u bazi izdanka i na prvom
nodusu stabla. Za stimulisanje ožiljavanja izdanaka M. croatica korišćena je α-naftil sirćetna
kiselina (NAA). Na podlozi sa najnižom koncentracijom NAA (0,1 μM) ožiljeno je 80%
izdanaka, sa povećanjem koncentracije NAA u podlozi procenat ukorenjenih biljaka bio je
manji, pa je na podlozi sa NAA 0,2 μM ožiljeno 63,3% izdanaka a na podlozi sa NAA 0,3
μM ožiljeno 43,3% i sa 1 μM ožiljeno je 63,3% izdanaka. Stimulativni uticaj različitih
koncentracija NAA na ožiljavanje zabeležen je kod izdanaka Salvia brachyodon (Mišić et al.
2006), kao i kod Salvia fruticosa (Arikat et al. 2004).
29
6. ZAKLJUČAK
30
Micromeria croatica je uspešno uvedena u kulturu in vitro. Najveći broj aksilarnih pupoljaka
9,94 dobijen je gajenjem nodalnih eksplantata M. croatica na MS hranljivoj podlozi sa 30
μM kinetina i 0,57 μM IAA. Najveća dužina pupoljaka (8,16 mm) dobijena je na
eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 10 μM kinetina i 0,57 μM IAA.
Izdanci M. croatica dobijeni indukcijom su nakon izduživanja postavljani na podloge za
ožiljavanje. Ožiljavanje na podlogama sa NAA je bilo uspešno. Najniža korišćena
koncentracija NAA (0,1 μM) dovela je do ožiljavanja čak 80% eksplanata, a sa povećanjem
koncentracije NAA procenat ukorenjenih izdanaka bio je manji. Ožiljavanjem izdanaka
postignuta je kompletna regeneracija biljaka M. croatica.
Dobijeni rezultati pokazuju da je korišćenjem metode mikropropagacije moguće dobiti veliki
broj biljaka Micromeria croatica od početno male količine biljnog materijala.
31
7. LITERATURA
32
1. Arikat, N.A.; Jawad, F.M.; Karam, N.S. and Shibli, R.A. (2004): Micropropagation
and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). Scientia Hort. 100,
193-202.
2. Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria
(Lamiaceae), a synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.
3. Bentham G (1829). Micromeria Bot Reg 15: t. 1282.
4. Çöçü, S., Uranbey, S., İpek, A., Khawar, K.M., Sarihan, E.O., Kaya, M.D.,
Parmaksiz, İ., Özcan, S.: Adventitious shoot regeneration and micropropagation in
Calendulla officinalis L. - Biol. Plant. 48: 449-451, 2004.
5. Cuenca, S. and Amo-Marco, J.B. (2000): In vitro propagation of two Spanish
endemic species of Salvia through bud proliferation. In Vitro cell. Dev. Biol. Plant 36,
225-229.
6. Kremer D, Stabentheiner E, Dunkić V, Müller ID, Vujić L, Kosalec I, Ballian D,
Bogunić F, Bezić N. Chem Biodivers. (2012): Micromorphological and
chemotaxonomical traits of Micromeria croatica (Pers.) Schott. 9 (4): 755-680.
7. Mišić, D.; Grubišić, D.; Konjević, R. (2006): Micropropagation of Salvia
brachyodon through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476(4).
8. Mišić, D., Ghalawenji, N.A., Grubišić, D., Konjević, R.: Micropropagation and
reintroduction of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević, an endemic and critically
endangered perennial of Serbia. - Phyton 45: 9-20, 2005.
9. Murashige T. and Skoog F. (1962): A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobaco tissue cultures. Phisiol. Plant. 15: 473-497.
10. Parić, A., Pustahija, F., Karalija E. (2011): Propagacija biljaka kulturom in vitro.
Prirodno – Matematički fakultet, Sarajevo. 65 – 95.
11. Singh, N.K., Sehgal, C.B.: Micropropagation of ‘Holy Basil’ (Ocimum sanctum
Linn.) from young inflorescences of mature plants. - Plant Growth Regul. 29: 161-166,
1999.
12. Slavkovska V. , Couladis M., Bojovic S., Tzakou O., Pavlovic M., Lakusic B., and
Jancic R. (2005): Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria
Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst. Evol. 255: 1–15.
33
13. Stevanović V. et al. (1999): Crvena knjiga flore Srbije. 1, Isčezli i krajnje
ugroženi taksoni Ministarstvo za životnu sredinu republike Srbije, Beograd; Biološki
fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd; Zavod za zaštitu prirode Republike Srbije,
Beograd, 380-382.
14. Sujana, P., Naidu, C.V., (2011): Impact of Different Carbohydrates on High
Frequency Plant Regeneration from Axillary Buds of Mentha piperita (L.) – An
Important Multipurpose Medicinal Plant. Journal of Phytology 2011, 3(5): 14-18.
15. Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka. Univerzitetski
udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 314 - 316.
16. Tošić, S., Stojičić, D., Zlatković, B., Mitrović, T., Stamenković, S., Spasić, J., Šelmić,
N. (2013): Micropropagation of Micromeria pulegium. 11th Symposium on the Flora of
Southeastern Serbia and Neighbouring Regions, Vlasina Lake, p.p. 76.
17. Venkatramalingam, K., Ebbie M.G. (2011): An efficient in vitro culture method of
shoot regeneration for a medicinary important plant Mentha piperita.
18. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija
biljaka. Axial, P.O., Beograd (15-54).
19. Yuan, Y.J., Hu, T.T., Yang, Y.M. (1994): Effects of auxins and cytokinins on
formation of Cataranthus roseus G. Don multiple shoots. - Plant Cell Tissue Organ Cult.
37: 193- 196,.
34
Biografija kandidata
Aleksandra Ristić rođena je 12. Marta 1988. godine u Leskovcu. Završila je osnovnu školu
,,Đura Jakšić” u Turekovcu (Leskovac), a nakon toga 2003. godine upisuje srednju
medicinsku školu, odsek laboratorijski tehničar.
Nakon završene srednje škole, 2007. godine, započinje osnovne akademske studije na
Prirodno-matematičkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i
ekologiju, koje završava 2010. godine sa zvanjem ,,biolog”. Iste godine upisuje master
akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju, smer Biologija, koje završava
2013.
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: master thesis
Author, AU: Aleksandra Ristić
Mentor, MN: Dragana Stojičić
Title, TI: “The effect of different growth regulators on the regeneration Micromeria croatica
(Pers.) Schott in vitro”
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2013
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
34 p. ; 10 figures, 2 tables, 1histogram
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Biology
Subject/Key words, S/KW: Micromeria croatica, kinetinе, axillary buds.
UC 581.143.5+581.143:582.929
Holding data, HD: Library
Note, N:
Abstract, AB: Micromeriacroatica (Pers.) is endemic to The Dinaric Alps, a mountain range in Southern
Europe. In Serbia it can be found on Mokra Gora. It is also present in Croatia, Bosnia and
Herzegovina and Montenegro. Micromeria croatica is an endangered species and it is
listed on the Red List of Vascular Plants of Serbia and Montenegro. According to the
existing literature this species has not been introduced in vitro culture. Different regulators
of growth were used for examinations of the possibility of regeneration of Micromeria
croatica through induction of axillary buds on nodal explants. Our results show that the
most effective combinations of growth regulators were: 1 μM Kin and 0,57μM IAA, and
30 μM Kin and 0,57 μM IAA. The axillary buds developed this way were elongated on a
hormone-free surface. After that root initiation started due to the effects of auxin 0,1 μM
NAA. In this way Micromeria croatica was successfully regenerated in in vitro conditions.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: Монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Александра Ристић
Ментор, МН: Драгана Стојичић
Наслов рада, НР: “Ефекти различитих регулатора растењa на регенерацију Micromeria croatica
(Pers.) Schott in vitro”
Језик публикације, ЈП: Српски
Језик извода, ЈИ: Енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2013.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
34 стр. ; 10 слика, 2 табеле, 1 хистограм
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Биологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria croatica, кинетин, аксиларни пупољци.
УДК 581.143.5+581.143:582.929
Чува се, ЧУ: Библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Micromeria croatica (Pers.) je endemična vrsta Dinarida, planinskog masiva u južnoj
Evropi. Na teritoriji Srbije zabeležena je na Mokroj Gori. Takođe rasprostranjena je u
Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini i Crnoj Gori. Micromeria croatica je ugrožena vrsta na
Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore. Prema dostupnoj literaturi ova biljna vrsta
do sada nije uvedena kulturu in vitro. Korišćenjem različitih regulatora rastenja ispitivana
je mogućnost regeneracije biljaka M. croatica putem indukcije aksilarnih pupoljaka na
nodalnim eksplantatima. Prema našim rezultatima najefikasnije kombinacije regulatora
rastenja bile su: 1 μM Kin i 0,57 μM IAA, i 30 μM Kin i 0,57 μM IAA. Dobijeni aksilarni
pupoljci su izduživani na podlozi bez hormona a zatim i ožiljeni delovanjem auksina 0,1
μM NAA. Na ovaj način je uspešno regenerisana Micromeria croatica u uslovima in vitro.
Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:
Образац Q4.09.13 - Издање 1