untersuchungen über struktur, vermehrung und onkogene wirkung der hühner-leukose-sarkomatose-viren

Aus dem Max-Planck-lnstitut fiir Virusforschung, Tiibingen Biologisch-medizinische Abteilung

Untersuchungen uber Struktur, Vermehrung und onkogene Wirkung der Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren*)

Von

HEINZ BAUER:~.'~)

Mit 19 Abbildungen und 19 Tabellen

(Eingegangen a m 8 . l d i 1969)

A. Einleitung I. Tumorviren als Objekte der Krebsforschung

Der Streit um die Frage, ob Viren zur neoplastischen Transformation einer Zelle fuhren konnen, kann mangels ernsthafter Kontrahenten als beendet betrachtet werden. Argumente wie ,,Tumoren (sind) erfreulicherweise nicht alle zellfrei ubertragbar" (46) weisen jedenfalls darauf hin, dai3 in den letzten Jahren Zweifel an der cancerogenen Wirkung von Viren mehr von Emotionen als von rationalen Erwagungen getragen wurden. Es sol1 hier keineswegs der Virustheorie, d. h. der Theorie, dai3 alle bosartigen Tumoren letztlich durch Viren verursacht sind, das Wort geredet werden; dennoch sei erwahnt, dai3 GRAFFI und BIELKA am Ende ihrer ausfuhrlichen Monographie uber Probleme der experimentellen Krebsforschung sogar zu dem Schlui3 kommen, dai3 die bisherigen Kenntnisse uber die Entstehung eines Krebses am besten mit dieser Theorie in Einklang zu bringen sind (68) . Definitionen ahnlich der, da8 ,,Malignitat eine Eigenschaft der Zelle selbst und unabhangig vom Weiter- wirken des auslosenden Agens (sei)" (46), sind jedenfalls nicht haltbar. Sie fallen unter die Kritik PAUL EHRLICHS, der bereits 1909 bemerkte, dai3 ,,die Exklusivitat der Kardinalfehler aller bisher aufgestellten atiologischen Krebs- theorien ist" (55).

Solche engen Auffassungen uber die Krebsentstehung beruhten oft auf der Annahme, dai3 alle onkogenen Vorgange ahnlich sein muken, da verschiedene Faktoren zum gleichen Ziel, namlich einem Tumor, fuhren konnen. Es ist aber durchaus denkbar, dai3 Krebs auf qualitativ verschiedene Weise und uber verschiedene Initialgeschehnisse zustande kommt, die spater in denselben End- prozei3 einmunden, d. h. dai3 die Zelle vielleicht lediglich in einem letzten Schritt mit einer einheitlichen Reaktion auf sehr unterschiedliche Reize ant- wortet. Diese Moglichkeit 1ai3t es gerechtfertigt und sogar empfehlenswert __- -

'>) Teil der Habilitationsschrift, vorgelegt im September 1968. ::.'>) Herrn Professor Dr. W. SCHAFER bin ich fur seine Unterstutzung und sein stetes

Interesse an meiner Arbeit zu grogtern Dank verpflichtet.

Untersuchungen der Hiihner-Leukose-Sarkomatose-Viren 583

erscheinen, dai3 alle onkogenen Agentien, und damit auch die Vielzahl der heute bekannten Viren mit cancerogenen Eigenschaften, auf ihre Wirkungs- weise erforscht werden.

Unter den verschiedenen Zweigen der experimentellen Krebsforschung hat sich die Tumorvirologie in den letzten Jahren einen wichtigen Platz. erobert; es hat sogar den Anschein, als rucke sie mehr und mehr in den Mittel- punkt des allgemeinen Interesses. Die spate Blute dieser Forschungsrichtung mui3 etwas verwundern, wenn man bedenkt, dai3 die ersten Tumorviren seit 60 Jahren bekannt sind. Der Dornroschenschlaf wurde jedoch mit dem allgemeinen Aufschwung beendet, den die gesamte Virologie in den letzten 15-20 Jahren erlebte. Von dieser Entwicklung profitierte naturgemai3 auch die Tumorvirusforschung, so dai3 heute eine Reihe von Tumorvirussystemen z,ur Verfugung steht, die die besten Voraussetzungen fur die Anwendung moderner naturwissenschaftlicher Methoden erfullen.

Interessanterweise bilden die Tumorviren nach den Kriterien der Systematik (Aufbau des Virion, Nucleinsauregehalt) nicht etwa eine bestimmte Klasse fur sich, sondern gehoren den unterschiedlichsten Virusgruppen an (85). So sind die Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren, die nach Struktur, Antigeni- tat, Vermehrungsmechanismus und Pathogenitat eine Gruppe relativ einheitlicher und nah verwandter Viren darstellen (21, 70, 156), den RNS-haltigen Viren mit helikaler Struktur und aui3erer Membran zuzuordnen. Einige Ver- treter dieser Tumorvirusgruppe, vor allem das Myeloblastose-Virus (AMV) und das Rous-Sarkom-Virus (RSV), werden seit einigen Jahren von unserer Arbeitsgruppe studiert. Uber die hierbei erzielten wichtigsten Ergebnisse sol1 in dieser Arbeit zusammenfassend berichtet werden. Dabei konnen Unter- suchungen anderer Autoren nur so weit diskutiert werden, wie sie zur Er- ganzung oder zum besseren Verstandnis der eigenen Daten beitragen. Ebenso wird die in den nachsten funf Kapiteln gegebene Obersicht uber diese Virus- gruppe im wesentlichen auf solche Ergebnisse beschrankt sein, die im Zu- sammenhang mit den eigenen Untersuchungen besonders interessieren. Ein Oberblick uber das gesamte Gebiet der Huhnertumorviren wurde den Rahmen dieser Arbeit sprengen. Es sei hierfur auf einige Obersichtsartikel der letzten Jahre verwiesen (21, 29, 70, 143, 156).

In letzter Zeit hat sich der Terminus Leukose-Virus immer mehr fur die Gruppe der Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren eingeburgert. Dieser Ter- minus wird auch in vorliegender Arbeit verwendet, wenn nicht gerade von speziellen Eigenschaften eines bestimmten Virustyps die Rede ist.

11. Zur Geschichte der Huhner-Leukose-Viren Die Geschichte der Hiihner-Leukose-Viren beginnt bereits mit dem ersten

zellfrei ubertragenen, Tumor-induzierenden Agens. ELLERMAN und BANG berichteten vor 60 Jahren, dai3 es ihnen gelungen sei, eine Leukamie des Huhnes zellfrei, d. h. wahrscheinlich durch eine Virusinfektion zu ubertragen (58). Es folgte 1911 der Bericht von Rous uber ahnliche Ergebnisse bei der Obertragung eines Huhnersarkoms (1 19). (Fibrosarkome, deren Atiologie auf ein Leukose-Virus zuruckgeht, werden seither ebenso als Rous-Sarkome be- zeichnet, wie auch die entsprechenden Viren Row-Sarkom-Viren (RSV) genannt werden.) Die zellfreie Ubertragung der beiden Tumoren wurde in der Folge in vielen Laboratorien reproduziert (21, 156), so dai3 die Anfeindun- gen, denen sich diese Pioniere der Tumorvirusforschung lange Zeit ausgesetzt sahen, seit spatestens Mitte der dreii3iger Jahre fast vollig verstummt sind. Dai3 die Bedeutung der fruhen grundlegenden Arbeiten aber erst in jungster

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Virusbezeichnung I Reprasentative Starnrne in Klamrnern)

Myeloblastose - Virus I B A I - A )

Erythroblastose - Virus I R I

Lyrnphomatose - Virus I R P L - 121

Rous assoziierte Viren IRAV 1 - 5 , 501

Rous - Sarkom -Viren I Bryan , Schmidt- Ruppin , Carr -Zi lber , Prag I

Zeit richtig erkannt wurde, mag man daraus ersehen, dai3 sie erst 1966 durch die Verleihung des Nobelpreises an Peyton Rous honoriert wurden.

In den ersten 30-40 Jahren, die der Tumorvirus-Isolierung von ELLER- MANN und BANG folgten, beschaftigte man sich aus technischen Grunden uberwiegend mit in vivo Experimenten. Die einzelnen Virusstamme, deren Anzahl durch weitere Isolierungen rasch zunahm, wurden hinsichtlich Pathogenese, morphologischer Variabilitat der ubertragbaren Tumoren, Obertragbarkeit auf homologe und heterologe Tiere, Epidemiologie und immunologische Phanomene verglichen (21, 29). Fur zahlreiche der dabei gemachten Beob- achtungen konnte man erst in den letzten 10 Jahren eine zufriedenstellende Erklarung finden. In Tabelle 1 wird ein Oberblick uber die zur Zeit wichtigsten Virusstamme, die empfanglichen Tiere und die am haufigsten beobachteten Tumoren gegeben.

Tabelle I Bezeihnung, Wirtsspektrurn und Tumortyp

der wichtigsten Hiihner-Leukose-Viren

Onkogen fur

Huhn

Huhn

Huhn

Huhn

Huhn , Truthahn , Fasan , Japan. Wachtel , Ente , Taube. Ratte , Maus, Hamster . Meerschweinchen , Kaninchen , Hund , Affe

Tumor Typ

Myeloblastose , Nephroblastorn , Lymphornatose , Osteopetrose

Erythroblastose , Lyrnphornatose

Lymphornatose . Erythroblastose , Osteopetrose , Hamangiom

Lyrnphomatose

Sarkom I Lymphomatose , Hamorrhagische Cysten , Fibrorne

111. Pathogenese und Wirtsbereich Rous machte bereits die Feststellung, dai3 der erste von ihm untersuchte Tumor zunachst nur in Huhnern des gleichen Stammes passagiert werden konnte, aus dem er ursprunglich isoliert worden war. Erst spater war er auch auf Hiihner anderer Stamme ubertragbar (1 19). Eine sokhe ,,naturliche" Resistenz wurde in der Folge sehr haufig beobachtet und kann auf Grund neuerer Untersuchun- gen mit einer Interferenz durch ein latentes Virus derselben Gruppe (120) oder aber mit einer genetischen Resistenz der Hiihner erklart werden (37). Die genetische Empfanglichkeit gegenuber einem Leukose-Virus wird bei Huhnern durch ein einzelnes dominantes Gen bestimmt (37, 39, 106, 110).

Die naturliche Obertragung der Huhnertumorviren, deren Mechanismus erst vor nicht allzu langer Zeit geklart wurde, erfolgt vor allem auf dem vertikalen Weg (32, 156). Hierbei kann das Virus offenbar nur uber das Ei, nicht jedoch durch das Sperma ubertragen werden.

Eine bis heute noch nicht endgultig geklarte Frage betrifft die Multi- potenz der verschiedenen onkogenen Viren im Huhn (9,33,34). ELLERMAN vermutete z. B., dai3 Myeloblastose, Erythroblastose und Lymphomatose von ein und demselben Virus produziert wurden (57). Es mui3 jedoch heute angenommen werden, dai3 mindestens ein Teil solcher multipotenten Effekte auf Virusgemische zuruckzufiihren ist (1 89), wahrend andere durch unterschied-

Untersuchungen der Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren 585

liche genetische Empfanglichkeit der Huhner bedingt sein mogen. Nach CRITTENDEN et al. kann namlich sogar das genetische Verhalten gegenuber neoplastischer Transformation und Virusvermehrung verschieden sein (38).

Der natiirliche Wirt fur die Leukose-Viren ist das Huhn; in den dreii3iger Jahren gelangen aber bereits die ersten Obertragungen auf Enten. In der Folge erwiesen sich verschiedene Leukose-Virusstamme pathogen fur Fasan, Trut- hahn, Taube und japanische Wachtel(l56).

Ganz besonderes Interesse erregten die ersten Obertragungen auf Sauge- tiere, uber die erstmals 1957 und 1958 aus mehreren Laboratorien berichtet wurde (130, 140, 167). Unter Verwendung verschiedener Rous-Virus-Stamme kann man heute Rous-Sarkome in Hamstern, Mausen, Meerschweinchen, Ratten, Kaninchen, Hunden und Affen erzeugen (3,41,90, 104, 112, 144, 166, 168). Im Reagenzglas gelang sogar die morphologische Transformation von Zellkulturen menschlichen Ursprungs (90,99, 13 8). Rous-Tumoren in Sauge- tieren sind deshalb ein besonders interessantes Studienobjekt, weil in zellfreien Extrakten solcher Tumoren mit wenigen Ausnahmen (94, 131, 139) kein Virion nachgewiesen werden kann (87,125,142,180). Durch Kontakt von Saugertumorzellen mit empfanglichen Huhnerzellen wird jedoch eine Virus- produktion bewirkt, was beweist, dai3 das komplette Virusgenom in solchen Saugerzellen vorhanden ist (125,133, 141).

IV. In vitro Vermehrung Die Tumorvirusforschung erlebte eine explosionsartige Entwicklung, als

man - gestiitzt auf Erfahrungen mit cytociden Viren - lernte, auch die Tumorviren in vitro zu vermehren. Den entscheidenden Anstof3 fur die Huhner-Leukose-Viren gab dabei die Entdeckung der in vitro Transformation von Huhnerfibroblasten durch RSV (100). Damit konnte man von den kost- spieligen, umstandlichen und in ihrer Anwendung begrenzten Tierversuchen auf besser kontrollierbare und manipulierbare Systeme ubergehen, die ein rascheres und genaueres Arbeiten, vor allem aber die Anwendung biochemi- scher Methoden ermoglichten und in relativ kurzer Zeit die Kenntnisse iiber diese Viren betrachtlich erweiterten.

Ein entscheidender Fortschritt gelang im RuBIN’schen Labor, wo man, ausgehend von fruheren Beobachtungen anderer Untersucher (1 00), einen sog. Focustest fur das RSV ausarbeitete, der darin besteht, da8 man Herde von transformierten Zeilen (Foci) durch Oberschichten der infizierten Zellen rnit Agar erzeugt (1 51). Bei geeigneter Virusverdiinnung, die die Unterscheidung der einzelnen Foci erlaubt, gibt deren Anzahl ein Mafi fur die infektiosen RSV-Einheiten.

Im gleichen Labor wurde wenig spater ein in vitro Test fur diejenigen Huhnertumorviren entwickelt, die Huhnerfibroblasten in vitro nicht transformieren konnen. RUBIN und Mitarbeiter hatten beobachtet, dai3 in manchen Versuchen die Anzahl der RSV-Foci nicht der erwarteten Anzahl entsprach. Dies fuhrte zur Isolierung eines latent in diesen Huhnerzellen vorhandenen Virus, das rnit dem RSV interferierte. Wegen dieser Eigenschaft wurde es auch RIF (Rous interferierender Faktor) genannt (120). Die gleichen Autoren priiften diesen Effekt auch mit anderen Hiihner-Leukose-Viren und fanden, dai3 diese ebenfalls mit dem RSV interferieren konnen. Der heute weitver- breitete RIF-Test besteht darin, daf3 man Huhnerzellen mit einer Ver- dunnungsreihe eines fraglichen Leukose-Virus infiziert und die Virus- vcrdiinnung als Virustiter angibt, die gerade noch eine Interferenz gegenuber dem superinfizierenden RSV bewirkt (121).

Zbl. Vet. Med., Reihe B, Bd. 17, Heft 5 38

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V. Klassifizierung Die von zahlreichen Autoren in vivo beobachtete genetische Resistenz

persistiert auch in vitro (37, 106). Die Selektivitat dieser Resistenz gegenuber den verschiedenen Viren fiihrte zunachst zur Unterscheidung der Virus- untergruppen A und B (72, 157, 159), d. h. die genetisch bedingte Zellresistenz kann selektiv gegen die eine oder andere Gruppe gerichtet sein. Kurzlich hat man auch Huhner gefunden, die gegen eine dritte bzw. vierte Virusgruppe C bzw. D genetisch resistent sind (179, 186). Die Empfanglichkeit der Zellen gegeniiber den einzelnen Virusgruppen scheint - in Obereinstimmung mit den in vivo Ergebnissen - durch ein einzelnes dominants, zumindest fur die Gruppen A und B verschieden lokalisiertes Gen bestimmt zu sein (39, 40, 108, 122).

In eingehenden Untersuchungen fanden VOGT und HANAFUSA, dai3 diese Gruppierung auch fur die interferierende Fahigkeit Giiltigkeit hat, d. h. es interferieren nur Viren miteinander, die derselben Gruppe angehoren (72, 160, 179). Sowohl der Wirtsbereich wie auch die interferierende Kapazitat scheinen durch das Hull-(V)-Antigen der Viren bestimmt zu werden, da man eine mehr oder weniger ausgesprochene Kreuzneutralisation zwar innerhalb derselben Virusgruppe, nicht jedoch zwischen Viren VerschiedenerGruppen findet (89, 161). Eine gewisse Ausnahme von dieser Regel machen die Viren der Gruppe

Tabelle 2 Priifung von Hiihner-Leukose-Viren sowie einigen Kontrollviren auf gruppenspezifisches

(gs) komplementbindendes Leultose-Virus-Antigen mit gs-Kaninchen-Antiserum.

Virusstarnm

BH-RSV IRAV- 1 1 I1

BH-RSV IAMV)

BH-RSV IRAV-4 )

BH-RSV IFAV- 1 I SR-RSV- 1

BH-RSV iRAV-21

BH-RSV I A M V - 2 )

MAV - B

MC - 29 - B

SR- RSV

RAV - 50

B -17

Prag - RSV

C Z - RSV

SR-RSV-D

AMV-BAI -A

MC- 29

K P - Virus'

Friend-Virusc

Rauscher-Virus

erhalten von

P. M. Biggs

H. Hanafusa

II

P. K. Vogt

I1

I1

P. M. Biggs

P. K. Vogt

lsoliert aus BAl- A-Vi rus

lsoliert aus MC-29 I T . Graf l

H. Hanafusa

II

P. K . Vogt

II

I1

lsoliert aus einern Hamster - Rous- Sarkom

J. W. Beard

H

Rostock- Starnrn

K. Kohler

F. Rauscher

Subgruppe

A

A

A ?

A

A

A

B B

B

B

C I D ? ]

C I D ? )

C

C D

D

A + B

A + B

Influenza

Mause- Leukarnie- Virus

I1

leaktion rnit is-Kaninchen -Serum

* a

t

t

t

t

b b

@

B

"KBR (Komplementbindung) rnit gereinigtem Virus positiv hKBR rnit gereinigtem Virus negativ c Die drei Kontrollviren reagierten in der gleichen Konzentration positiv mit entsprechenden Immunxeren

Untersuchungen der Hiihner-Leukose-Sarkomarose-Viren 587

D (1 72, 179). Sie zeigen eine partielle Kreuz-Interferenz und Neutralisation mit Viren der Gruppe B, obwohl sie einen anderen Wirtsbereich haben. Wir erklaren dies mit der Existenz zweier antigener Spezifitaten in der Virus- hulle (1 72).

Als Hauptkriterium fur die Zugehorigkeit eines Virus zu den Leukose- Viren wurde bisher neben der morphologischen khnlichkeit die Fahigkeit angesehen, mit einem der bekannten Leukose-Viren zu interferieren. Da inzwischen jedoch Leukose-Viren bekannt sind, die nach den oben beschriebe- lien Kriterien nicht mit Sicherheit in eine der vier Gruppen A, By C oder D einzuordnen sind (158, 185), und da durchaus mit der Entdeckung weiterer solcher Viren gerechnet werden mu& ist ein negatives Ergebnis im RIF-Test nur mit Vorbehalt zu werten.

Neben der Ultrastruktur scheint zur Zeit der Nachweis von gruppenspezifischem komplementbindendem Leukose-Virus Antigen in einem unbekannten Virus das beste Kriterium fur dessen Zugehorigkeit zu den Leukose-Viren zu sein (Tabelle 2).

VI. Defektivitat des Row-Sarkom-Virus Ein Befund von groi3er praktischer Bedeutung war die Entdeckung, dai3

der hochtitrige Bryan (BH) Stamm des RSV defekt ist, und zwar in dem Sinne, dai3 er offenbar nicht die Fahigkeit besitzt, die Synthese eines eigenen Hullantigens zu induzieren (71, 74, 146). Es ist aber ein Charakteristikum aller Huhner-Leukose-Viren, dai3 sie diesem defekten RSV mit ihrer eigenen Hu lk aushelfen konnen, weshalb man auch von Helferviren spricht. Die Schreib- weise ist seither - entsprechend dem Vorschlag von Vogt (159) - so, dai3 das Helfervirus in Klammern hinter der Bezeichnung des RSV steht, z. B. BH- RSV (RIF).

Wird ein Huhnerfibroblast lediglich von einem defekten RSV-Partikel infiziert, dann entsteht die sogenannte NP- (nicht-Virus-produzierende) Zelle, die zwar transformiert ist, aber kein Virus produziert. Nach Oberinfektion rnit einem Helfervirus wird neben diesem jetzt auch RSV mit der Hulle des Helfers ausgeschleust (75). Diese fruheren Befunde von HANAFUSA und RUBIN mui3ten kurzlich insoweit revidiert werden, als die NP-Zellen keine echten NP-Zellen sind, sondern wenigstens in geringer Menge ein Virus ausschleusen (44, 117, 163, 181,), das VOGT RSV (0) nannte, da es keinen Helfer zu benotigen scheint (158). Die entsprechenden Zellen werden jetzt L-R (Leukosis virus negative Row-Zellen) genannt (181). Das RSV (0) nimmt eine Sonder- stellung ein, da es auf Grund fehlender interferierender Fahigkeit und eines ungewohnlichen Wirtsspektrums nicht nach der bisherigen Gruppierung einzuordnen ist (158, 194, 195). Man unterscheidet zur Zeit zwei Arten von RSV (0 ) Teilchen: die p-Partikel sind infektios fur Zellkulturen von Japanischen Wachteln bzw. Huhnern, wahrend fur a-Teilchen bisher keine Infektiositat nachgewiesen werden konnte (181 ,194).

VII. Problemstellung Das Studium der Synthese von Virusantigenen in der Zelle hat in vielen

Virussystemen aufschlui3reiche Ergebnisse uber die Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtszelle erbracht. Da zudem die virusspezifischen Antigene i n Tumorzellen von immer groi3erem Interesse werden, stellten wir uns zur Auf- gabe, die virusabhangigen antigenen Veranderungen in infizierten und transformierten Zellen zu untersuchen.

Da bei Beginn unserer Untersuchungen die Voraussetzungen fur solche Studien - namlich die Kenntnis der virusspezifischen Strukturbestandteile der

38*

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Viren - nicht gegeben waren, bedeutete dies, dai3 wir zunachst versuchen muaten, diese zu isolieren und zu charakterisieren. Hieruber wird im ersten Abschnitt des experimentellen Teiles berichtet. Von elektronenmikroskopischen Untersuchungen ist bekannt, dat3 die einzelnen Virustypen der Leukose-Viren sehr ahnlich aufgebaut sind (21, 23,45). Wir wahlten daher fur die Struktur- untersuchungen zunachst ein Virus als Modell, und zwar das Myeloblastose- Virus. Dies bietet den besonderen Vorteil, dai3 es im Blut von Myeloblastose- kranken Kiiken in einer ungewohnlich hohen Konzentration von optimal 10" Viruspartikeln/ml vorkommt (102). - Der Nachteil des AMV gegenuber dem RSV als Modellvirus bestand darin, dai3 fur jenes kein ahnlich einfaches in vitro Nachweisverfahren bekannt war wie der Focustest fur das RSV. Es konnte aber ein Test entwickelt werden, der auf dem serologischen Nach- weis des neusynthetisierten Virus beruht und den Vorteil hat, dai3 er fur jedes Leukose-Virus angewendet werden kann. Oberdies ist er geeignet, eine latente Leukose-Virus-Infektion von ,,normalen" Huhnerfibroblasten zu entdecken. Dieser Test und die darauf basierenden Untersuchungen uber den Ver- mehrungsmechanismus der Leukose-Viren werden Inhalt des zweiten Abschnit- tes des experimentellen Teils sein. - Fur das Studium der Virusonkogenese bieten Saugertumoren eine Reihe von Vorteilen gegenuber den Tumoren im naturlichen Wirt, dem Huhn. Die Haltung und Handhabung kleinerer Tiere wie Hamster, Ratten und Mause ist billiger und einfacher. Letztere eignen sich vor allem fur Transplantationsversuche, da von ihnen eine groi3e Anzahl von Inzuchtstammen existiert. D a RSV-transformierte Saugerzellen in der Regel kein reifes Virus produzieren, bedeutet dies wahrscheinlich, dai3 einige Genfunktionen des Virus nicht ausgedruckt werden, woraus man schliei3en konnte, dai3 diese inaktiven Genfunktionen fur die Persistenz der neoplastischen Transformation keine Rolle spielen. Auf der Suche nach den fur die Onkogenese verantwortlichen Virusfunktionen werden also einige offenbar unwesentliche Gene bereits ausgeschlossen. Sauger-Rous-Tumoren scheinen daher besonders geeignet fur die Untersuchungen, die darauf abzielen, den Kreis um die fur die Transformation wichtigen Virusfunktionen noch enger zu ziehen. Uber entsprechende Versuche wird im dritten experimentellen Abschnitt berichtet.

B. Material und Methoden Die Herkunft der verwendeten Virusstamme sowie die Mehrzahl der

angewendeten Techniken sind in fruheren Veroffentlichungen ausfuhrlich beschrieben worden. Es werden hier nur die wichtigsten Daten wiedergegeben. Fur weitere Einzelheiten sei auf die entsprechenden Originalarbeiten verw i esen .

I. Virusstamme a) Den hauptsachlich verwendeten BAI-A-Stamm des Myeloblastose-

Virus (AMV) erhielten wir ursprunglich von J. W .BEARD, Durham, USA. Er enthalt Viren der Typen A und B und transformiert keine Huhnerfibro- blasten in vitro (16).

b) Die fur die Induktion der Tumoren RVA, RVP und RVB benutzten RSV-Stamme SCHMIDT-RUPPIN (SR-RSV), Prag (P-RSV) und BRYAN (BS- RSV) waren die im Prager Institut fur Experimentelle Biologie und Genetik verwendeten Standardstamme (31).

c) Der SR-A Tumor wurde mit einem von AHLSTROM, Lund, Schweden, erhaltenen SCHMIDT-RuPPIN-Stamm des RSV hervorgerufen.


d) SR-RSV-D wurde nach Injektion eines RSV-Hamster-Tumors ins Huhn aus diesem isoliert und als Virus der neuen Untergruppe D klassifiziert (1 72).

e) MAV-B wurde als Begleitvirus der Subgruppe B durch Endpunkt- verdunnung aus dem BAI-A-Virus isoliert (1 72).

f ) Fur die Transformation von Huhnerfibroblasten bzw. den Focustest wurden die von Dr. P. K. VOGT erhaltenen Stamme SR-RSV-1 der Gruppe A bzw. BH-RSV (AMV-2) der Gruppe B verwendet (159).

g) Fur vergleichende Versuche wurde der Rostock-Stamm des Virus der Klassischen Geflugelpest (KP-Virus) und der Beaudette-Stamm des Newcastle disease Virus (NDV) verwendet, die beide zu den Myxoviren gehoren (126), sowie die Mause-Leukamie-Viren vom Typ Friend und Rauscher (129). Die Reinigung dieser Viren erfolgte ahnlich wie die der Leukose-Viren.

11. Gewebe und Versuchstiere Fur Gewebekulturversuche und in vivo Vermehrung der Viren benutzten

wir anfangs Eier von genetisch nicht einheitlichen weiflen Leghorn-Huhnern, die uberdies nicht frei von latentem Virus waren (Huhnerfarm Ammerhof, Tubingen). Seit 1966 wurden jedoch fur Gewerbekulturversuche ausschliefllich cmbryonierte Eier der Linie 15 verwendet. Dies ist ein Huhnerstamm vom genetischen Typ C/O und C/A, der von Burmester, East Lansing, USA, stammt, und in dem wir, seitdem die Herde von uns gehalten wird, kein latentes Leukose-Virus entdecken konnten. Normales Huhnergewebe oder Huhnerplasma als Kontrollmaterial fur die Transplantationsversuche wurde ausschliefllich von Huhnern der Linie 15 gewonnen.

Die in vivo Vermehrung des AMV erfolgte bis 1966 in weiflen Leghorn- Huhnern der Ammerhof-Farm, Tubingen, danach in weiflen Leghorn- Huhnern der Shaver-Linie (Geflugelzucht Adlefi, Grasslfing), die fur Myelo- blastose hochempfindlich sind.

Die Rous-Tumor tragenden Mause waren aus den Inzuchtstammen STU, C57 BL/6, C 3 H, CBA und A (Tab. 3).

Tabelle 3 Bezeichnung, Xtiologie, Wirt und Passage der verwendeten Saugertumoren

Bezeichnung des Tumors

RVA, RVA,

RVA I 2

RVA 14 RVA 16 S R - A S R - 0 RVP, RVP,

MC- I MC- 8

RVB2O

Tumor induzierendes Agens

SR (Schmidt - Ruppin) - RSV I1

11

I1

I1

II

S R - R V 5 - D P IPrag) - RSV

BS I Bryan -Standard) - RSV Methylcholanthren

I1

I1

Mausestarnrn , in dern der Tumor induziert wurde

C5 lBL I 6 C3H CBA

A A

STU

ST u C57B l 16

I1

I/

I1

A

Tumor - Passage

53 - 58 L2 - L9 10 - 1L 16 - 22 10 - 16 6 - 11

2 - 1 1 6 - 12

12 - 20 6 - 8

7 8 - 86 L1 - L5

111. Gewebekulturtechniken Zellkulturen wurden ausschliefllich in Plastik-Petrischalen der Firma

Greiner, Nurtingen, oder Falcon, Los Angeles, USA, angelegt. Als Nahr- medium fur das Anzuchten und Halten von Huhnerzellen wurden Amino-

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saure-Vitamin-Salz-Losungen nach den Vorschriften von CH. WAYMOUTH (162) oder EAGLE (48) rnit einem Zusatz von 8 O / o Kalberserum verwendet. Der Agar zum Oberschichten von RSV-infizierten Zellen fur den Focustest bestand aus gleichen Teilen von zweifach konzentriertem Medium 199 und 1,8 O / o Agar mit einem Zusatz von 10 o/o Tryptosephosphatbouillon.

Zum Anlegen von primaren Huhnerzellkulturen wurden 10-1 1 Tage alte Hiihnerembryonen trypsiniert (0,25 O/o Trypsin) und 2-6 X loG Zellenl grofle ( @ 9 cm) bzw. 1-2 X 106 Zelledkleine Petrischale (@ 6 cm) aus- gesat. Weitere Subkulturen wurden durch erneutes Trypsinieren und Aussaen der Zellen angelegt, nachdem die Zellen der vorherigen Passage zu einem dichten einschichtigen Zellrasen ausgewachsen waren. Fur den Rous-Focustest wurden die Zellen zur Verhinderung einer Sekundarinfektion und zur besseren Sichtbarmachung der transformierten Zellherde einen Tag nach Infektion mit Agar uberschichtet (151). Die zu diesem Zeitpunkt erreichte Zellzahl ist fur die Focusbildung sehr kritisch und sollte etwa 2 X 106/kleine Platte betragen.

Mit den angegebenen Methoden lieflen sich Huhnerzellen ohne groi3ere Schwierigkeiten uber 4-5 oder mehr Passagen halten.

IV. Nachweis der Virusvermelirung Die in vivo Vermehrung des AMV in Huhnern erfolgt vornehmlich in

Myeloblasten. Eine starke Myeloblastose geht deshalb in der Regel mit einer hohen Virusproduktion einher (49). Virus diesen Ursprungs enthalt groi3e Mengen an wirtsspezifischer ATPase als integrierten Virusbestandteil (s. a. S. 596). Unter Standardbedingungen steigt der ATPase-Gehalt im Blut pro- portional mit der Viruskonzentration. Die Virusmenge im Plasma 1ai3t sich daher indirekt durch Messung der ATPase relativ einfach feststellen (101). Der ATPase-Test besteht darin, dai3 man zu 1 ml einer ATP-haltigen Puffer- losung mit Phenolrot als pH-Indikator O,O1 ml des virushaltigen Huhner- plasma gibt und die Zeit bis zum Farbumschlag miflt. Eine Viruskonzentration von 1 O l 2 physikalischen Partikeln entspricht dabei einer Reaktionszeit von etwa 2 Minuten.

Eine Nachweismethode fur die RSV-Vermehrung in vitro ist der bereits erwahnte Focustest, der nach den Vorschriften von TEMIN und RUBIN durchgefuhrt wurde (151). Die in vitro Vermehrung der ubrigen Leukose-Viren, die an keinerlei morphologischen Veranderungen der Huhnerfibroblasten erkennbar ist, laflt sich durch Untersuchung des virushaltigen Gewebekultur- uberstandes mit virusspezifischem Antiserum in der Komplementbindungs- reaktion nachweisen (s. CII, 1 und Ref. 14).

V. Priifung der Hiihnerfibroblasten auf Virusempfinglichkeit Die Infektion von Huhnerfibroblasten setzt voraus, dai3 diese fur das

betreffende Virus empfanglich sind. Eine Resistenz kann, wie in Kapitel V der Einleitung ausgefuhrt wurde, entweder genetisch bedingt sein oder auf einem latent vorhandenen interferierenden Leukose-Virus beruhen. Aus diesen Griinden ist es notwendig, von jedem einzelnen Huhnerembryo gesondert Zellkulturen anzulegen und diese auch getrennt zu testen. Wir pruften die Zellkulturen auf genetische Empfanglichkeit nach der von TEMIN und RUBIN beschriebenen Standardmethode (1 5 1). Primare Kulturen wurden kurz nach dem Aussaen der Zellen mit einer Standarddosis eines Virus der Gruppe A oder B beimpft. Hatte sich nach 6-10 Tagen die erwartete Anzahl von Rous-Herden gebildet, so waren die betreffenden Zellen fur dieses Virus empfanglich. Um latente Viren zu erfassen, die mit den Testviren nicht interferieren, da sie einer anderen Gruppe angehoren, wurden unbeimpfte Kulturen


auf das Vorhandensein von gruppenspezifischem Antigen gepruft (14). Ein negativer Befund in diesem Test ist ein ziemlich sicherer Hinweis dafiir, dai3 die Zellen frei von latenten Leukose-Viren sind (s. A V).

VI. Herstellung von Immunseren Gruppenspezifische (gs), komplementbindende Immunseren wurden zum

Teil von Rous-Tumor tragenden Hamstern gewonnen. In der Hauptsache aber wurden gs-Antiseren verwendet, die nach einer in unserem Institut ent- wickelten Methode durch Immunisierung von Kaninchen mit degradiertem AMV hergestellt worden waren (53, s. S. 599).

Neutralisierende Antiseren erhielten wir durch mehrmalige i. v.-Injektion von intaktem Virus in Kaninchen (16), oder einmalige Injektion in Huhner, die frei von latenten Leukose-Viren waren.

Da die Viruspraparate auch zellulare Antigene enthielten, bildeten die immunisierten Kaninchen neben den virusspezifischen Antikorpern auch solche gegen Huhner-Normalkomponenten (NK). Kaninchenseren, in denen solche NK-Antikorper nachweisbar waren, wurden vor Gebrauch mit Huhner-Nor- malgewebe abgesattigt (53).

VII. Serologische Methoden 1. Fur die Komplementbindungsreaktion (KBR) wurde ein modifiziertes

Verfahren der Mikromethode von FULTON und DUMBELL (60) angewandt. Bei konstant gehaltener Serumkonzentration (4-8 komplementbindende Ein- heiten) wurden Antigen und Komplement variiert. Als positiv wurde die Antigenverdunnung angesehen, die 1,Smal so vie1 Komplement verbrauchte wie die nelgative Kontrolle (14).

2. Fur den Agav-Gel-Diffusionstest wurden 1,2 O / o Bacto Agar (Difco) in PBS (0,l M Phosphat gepufferte 0,89 O/oige NaC1-Losung, p H 7,2) gelost und 5 ml davon in kleine Plastik-Petrischalen plattiert. Seren und Antigene wurden in ausgestanzte Locher von 3 mm @ gefullt. Die Prazipitationslinien wurden nach 1-3 Tagen Inkubation in einer feuchten Kammer bei Zimmer- temperatur fotografiert (I 7).

3. Neutvalisationsteste gegen Rous-Sarkom-Viren wurden so durchgefuhrt, dai3 gleiche Volumina einer Serum-Verdunnungsreihe mit gleichen Volumina derselben Virusmenge 30 Min. im Wasserbad bei 37' C inkubiert und dann auf Zellkulturen verimpft wurden. Nach 45 Min. langer Bebrutung bei 37' wurde 2mal rnit PBS gewaschen und die Kulturen danach wie fur einen normalen Focustest weiterbehandelt.

VIII. Isolierung von zellgebundenem gs-Antigen Zellen oder Tumorgewebe wurden - 2.T. nach 3minutigem hypo-

tonischem Schock - im Potter-Homogenisator homogenisiert, das Homogenat 15 Min. bei 3000 UpM zentrifugiert und das Antigen aus dem Oberstand mit Amrnoniumsulfat (Endkonzentration 50 O/o) prazipitiert. Das Prazipitat wurde vor dem Test in der KBR uber Nacht gegen PBS dialysiert.

IX. Tumorinduktion Eintagskuken wurden intraperitoneal mit virushaltigem Plasma von

Myeloblastose-kranken Kuken infiziert. Die Impfdosis enthielt etwa lo7 infektiose Gewebekultureinheiten des AMV. Zwei bis vier Wochen spater erkrankten bis zu 50 O/o der Tiere an Myeloblastose. Durch Herzpunktion wurden die Kuken ausgeblutet und das virushaltige Plasma bis zur Weiter-

592 HEINZ BAUER

verimpfung oder sonstigen Verwendung bei - 20' C oder - 70 O C auf- bewahrt.

Rous-Tumoren wurden in Saugetieren durch Injektion von Rous-Tumor- zellen aus Huhnern hervorgerufen. Die entstehenden Tumoren wurden durch Obertragung auf isogene Tiere in Passage gehalten. Unter isogenen Tieren versteht man hochingezuchtete Tiere, die eine vollstandige Gewebevertraglich- keit bei Ubertragung normalen Gewebes von einem auf das andere Tier (Isograft) zeigen.

X. Transplantationsteste Virustumoren enthalten ebenso wie eine Reihe chemisch oder mechanisch

induzierter Tumoren tumorspezifische, an der Zelloberflache gelegene Trans- plantationsantigene (TSTA) (1 34). Diese sind von den schon normalerweise in jeder menschlichen und tierischen Zelle vorhandenen Transplantations- antigenen immunologisch verschieden. Aus diesem Grund erkennt der Tumor- tragende Organismus die TSTA als Fremdantigene und lost entsprechende immunologische Abwehrreaktionen aus. Diese Abwehrvorgange kann man erkennen, wenn man ein Tier unter Bedingungen, bei denen kein Tumor entsteht (s. w. u.), mit Tumorzellen immunisiert und dann durch Injektion einer Tumorzelldasis, die in Kontrolltieren Tumoren hervorruft, auf Resistenz pruft. Bei den eigenen Versuchen auf Transplantationsimmunitat wurden folgende Techniken angewendet:

a) Fuhrt man die Versuche in isogenen Tieren durch, so wurde schon die zur Immunisierung gedachte Injektion einer geringen Dosis von Tumorzellen einen Tumor hervorrufen. In diesem Fall reichen die fur das Empfangertier fremden Antigene, die TSTA, nicht aus, um eine zur Abstoi3ung des Trans- plantates fuhrende Immunreaktion hervorzurufen. Man hilft sich in solchen Fallen, indem man die Entstehung eines Tumors entweder durch Rontgen- bestrahlung der Tumorzellen verhindert, oder aber die Immunisierungsdosis intradermal verabreicht, so dai3 man den Tumor bei einer Groi3e von etwa 1 cm @ abbinden und entfernen kann, ohne dai3 das Tier daran eingeht (95). Beide Prozeduren wurden in unseren Versuchen mehrmals wiederholt.

b) Bei Immunisierung mit homologen Tumorzellen (Allograft), d. h. Zellen eines anderen Stammes derselben Tierspezies, entsteht zwar in der Regel zunachst ein kleiner Tumor, der sich aber dann auf Grund einer immunologischen Reaktion gegen die fremden Gewebsantigene zuruckbildet (95). Auch diese Prozeduren wurden, wenn angewendet, mehrmals wiederholt.

c) Bei Immunisierung mit Gewebe aus einer anderen Tierspezies (Xeno- graft), in unserem Falle bei Immunisierung von Mausen rnit Huhnerzellen, besteht die Gefahr einer unspezifischen Reaktion, einer sog. primaren Immuni- ta t (1 34). Man kann diesen Eff ekt durch Rontgenbestrahlung des Tieres 24 Stdn. vor der Testinjektion weitgehend unterdrucken; hierbei wird die sekundare Immunitat allerdings auch in Mitleidenschaft gezogen (1 34). Ein anderer Weg besteht darin, die Testdosis moglichst hoch zu halten und so die unspezifische Immunitat starker zu unterdrucken. In unseren Versuchen haben wir uns vor allem bemuht, eine evtl. auftretende unspezifische Immunitat in Kontrolltieren zu erfassen, die unter vergleichbaren Bedingungen rnit Normal- gewebe behandelt worden waren.

XI. Isotopentechnik Virus wurde radioaktiv markiert, indem man den virusproduzierenden

Zellen radioaktive Protein- oder Nucleinsaure-Bausteine anbot. Der Nachweis der radioaktiven Markierung erfolgte nach Zugabe von 500 pg Hefe-RNS


als Tragersubstanz durch Fallung des saureunloslichen Materials mit 4 O / o

Trichloressigsaure auf Membranfilter, die nach Trocknen in Toluol-Scintil- lationsflussigkeit aufgenommen wurden. Die Radioaktivitat wurde in einem Packard-Tricarb-Flussigkeitsscintillationszahler gemessen.

XII. Hybridisierungstechnik Die Hybridisierung von Zell-DNS mit Virus-RNS wurde nach der

Gillespie-Spiegelmann-Methode durchgefuhrt (64). M-15 Nitrocellulose- Membranfilter (Sartorius Membranfilter, Gottingen) wurden mit konstanten Mengen hochgereinigter Zell-DNS beladen, und dann mit radioaktiv markier- ter Virus-RNS 13 Stdn. bei 60 O C inkubiert. Die nichthybridisierte RNS wurde mit RNase verdaut und die auf den Filtern verbliebene saurefallbare Radioaktivitat gemessen, die der hybridisierten Virus-RNS entspricht.

XIII. Elektronenmikroskopie Kohle-verstarkte Formvar-Netzchen wurden mit dem zu untersuchenden

Material beladen, der Oberstand nach 2 Min. abgesaugt und dann fur eine Minute 1 Tropfen 2 O / o Phosphorwolframsaure (PWS) (mit K O H auf p H 7,2 gebracht) auf das Netz gegeben (28). Danach wurde die uberflussige PWS abgesaugt, das Netzchen getrocknet und im Siemens Elmiskop IA bei 80 KV und einer elektronenoptischen Vergroi3erung von 20-40 000 fotografiert. In einigen Fallen wurden die Praparate vor der Negativ-Kontrastierung rnit Osmiumsaure fixiert.

C. Ergebnisse

I. Struktur und Aufbau der Huhner-Leukose-Viren

1. Konzentrierung und Reinigung des Virus Whnlich wie bei den Myxoviren (84) wird die Bildung der Hiihner-

Leukose-Viren erst beim Ausschleusen des Virus durch die Zellwand beendet (21). Man nimmt allgemein an, dai3 dabei zellulare Bestandteile in die Viren eingebaut werden (50,103, lOS), die offenbar fur die Stabilitat der Leukose- Viren von Bedeutung sind (s. S. 597). Man kann nicht erwarten, durch Reini- gungsverfahren diese zellularen Bestandteile vom Virus entfernen zu konnen, ohne dabei dessen Integritat zu zerstoren. Ziel einer Virusreinigung kann es nur sein, das Virus von anderen loslichen Substanzen in der virushaltigen Flussigkeit zu trennen.

Die Konzentrierung der Viren aus Huhnerplasma oder Gewebekultur- flussigkeit erfolgte durch Ultrazentrifugierung in einer Spinco L Beckman Ultrazentrifuge bei einem performance index (PI) (62) von 10. Hierbei erhalt man ein festgepacktes, schwer losliches Virussediment. Wenn man dieses etwa 1 Std. lang in PBS stehen lafit, bevor man es suspendiert, so kann man das Virus fast ohne Verlust an infektiosen Einheiten wiedergewinnen. 2. B. betrug in einem Versuch der RSV-Titer nach lOOfacher Anreicherung 1,5 X 1 O8 focusbildende Einheiten (FBE) gegenuber einem Ausgangstiter von 1,8 X loG FBE.

Nach der Ultrazentrifugation von AMV aus Huhnerplasma fie1 auf, dai3 man durch leichtes Bespulen des Sedimentes mit PBS bereits einen Teil des- selben losen konnte, wahrend der Rest relativ schwer loslich blieb. Der Ver- gleich des Sedimentationsverhaltens der leicht bzw. schwer loslichen Sediment- fraktionen in der analytischen Ultrazentrifuge ergab, dai3 es sich bei ersterer uberwiegend um Partikeln kleinerer Groi3e als der des Virus handelte,

594 HEINZ BAUER

o x V m

wahrend das schwer losliche Sediment aus Virus gebildet wurde (11). Aus diesem Grunde wurde nach jeder Ultrazentrifugierung des Virus zum Zweck der Reinigung das leicht losliche Sediment verworfen.

- 8

.7

I ) Nrusha/t/ges Ausgan smuferial I0 Mi'. 3000 Up& l l Sediment verworfen

2 ) (jberstand bei Pi I0 (entspricht etwa 60Min. 20 0009) zentrifugiert

Uberstand verworfen r.. I'."

3) Sediment in einer dem Ausgangsvo/umen entsprechenden Puffermenge au fgenommen und bei Pi 70 zenfrifugiert

Uberstand verworfen 4) wie bei 3) I'..

Ubersfand verworfen

Sediment in mog/ichs f wenig Pu ffedosung aufgenommen (0,5-0,8 ml), auf Rohrzucker- gradienten (20-50 %) aufge/egt und 60 Min. bei 21000 UpMim SW39 Rotor zenfrifugierf

Sichtbore Urusbonde ous der Mit te des Rohr- chens isoliert Anschh'enend Dia/yse gegen PBS zup Entfernung des Rohrzuckers

Schema der Zentrifugierungsschritte zur Virusreinigung

Um die Viren von groi3eren omder kleineren Partikeln der Suspensions- flussigkeiten (Huhnerplasma oder Gewebekulturflussigkeit) zu reinigen, wurden sie mehrmals abwechselnd bei hohen und niederen Drehzahlen zentrifugiert, wobei einmal das Virus im Uberstand blieb und das andere Ma1 sedimentiert wurde (s. Schema).

KE - Antigen

b 1 I I I I

0 m 300 coo 500 Jmp / Min

Abb. 1. Zentrifugation von C'4-Uridin-markiertem Fibroblasten-AMV in einem Rohrzudrer- gradienten. Die mittels KBR und durch Messung der Radioaktivitat nachgewiesene Virus-

bande entspricht der sichtbaren mittleren Bande im Rohrchen


Fur bestimmte Versuche, z. B. RNS-Extraktion, wurde das Virus in einem zusatzlichen Reinigungsschritt durch einen Zuckergradienten von 20-50 O/o Rohrzucker in Tris gepufferter NaC1-Losung (0,l M NaC1, 0,Ol M Tris-HC1, p H 7,3) zentrifugiert. Die Bedingungen waren hierbei so gewahlt (60 Min. bei 21 000 UpM im SW 39 Rotor), dai3 das Virus bis zur Mitte des Rohrchens sedimentierte, wo es eine deutliche Bande bildete (Abb. I). Dabei trennt es sich von Material mit vermutlich geringerer Dichte, das eine obere Bande bildet, sowie von Partikeln hoherer Sedimentationsgeschwindigkeit, die an der Grenzschicht zwischen der 35 O/nigen und 50 O/oigen Zuckerlosung erscheinen.

Dichtegradientenzentrifugation, die ein sehr erfolgreiches Reinigungs- verfahren fur Viren darstellt, welche nur aus Protein und Nucleinsauren bestehen, eignet sich nicht fur Leukose-Viren, da diese auf Grund ihres hohen Gehaltes an Zellmaterial eine ahnliche Dichte wie Zellbestandteile haben.

2. Physikalische Eigenschaften Die Schwimmdichte des AMV im Caesiumchlorid betragt je nach Zelltyp,

in dem das Virus vermehrt wurde, 1,2-1,22 g/cm3. Zum Nachweis des Virus dienten bei diesen Versuchen entweder das gs-Antigen, die im Virus enthaltene ATPase oder die radioaktiv markierte Virus-RNS. Geringfugige Schwankun- gen von Versuch zu Versuch sowie breite Virusbanden wiesen auf eine erhebliche Variabilitat der Virusdichte hin.

Abb. 2. Analytische Ultrazentrifuga- tion von AMV in 0,Ol M Phosphat- ,-eoufferter (pH 7.4) 0,89 "/a NaCI- Losung bei 2OoC und 6995UpM. Schlieren Optik. Fotografiert bei einern Winkel von 20' irn Abstand von 16 Minuten. Das rnit 665 S sedimentierende Material entspricht intaktem Virus, der kleinere Gipfel (4 S) besteht aus Zerfallsprodukten

des Virus

In der analytischen Ultrazentrifuge zeigt das Virus ein relativ einheit- liches Sedimentationsverhalten; es sedimentiert mit 665 S (Abb. 2); die mittlere Streuung bei 15 Laufen betrug f 2 "/o. Die Sedimentationsgeschwindigkeit wurde durch Anderung der Viruskonzentration nicht beeinfluat. Andere Autoren kamen zu ahnlichen Ergebnissen (156). D a das partielle spezifische Volumen des Virus nicht bekannt ist, lai3t sich der Virusdurchmes- ser aus dem Sedimentations- verhalten nicht genau errechnen.

Abb. 3. Elektronenmikroskopische Darstellung zweier AMV-Parti- keln nach Negativkontrastierung

596 HEINZ BAUER

KBR-Titer

ATPase - Reaktionszeit

Die direkte Messung des Virusdurchmessers im Elektronenmikroskop nach PWS-Kontrastierung ergibt 140-190 mp (Abb. 3; 59). Diese MaBe entsprechen wahrscheinlich nicht ganz dem tatsachlichen Durchmesser, da bei der Praparation das Virus gespreitet wird und deshalb groi3er erscheint. Die erhebliche Variationsbreite der Virusgroi3e wurde durch Beobachtungen anderer Autoren bestatigt (27, 132).

Virus aus Huhner - Plasma Fibroblasten Myeloblasten

256 a 256 256

12 Min. 2 1 2 0 Min. 20 Min.

3. Wirtszellabhangige Eigenschaften des Virus Von Myxoviren ist bekannt, dai3 sie einen hohen Gehalt an zellularen

Lipiden aufweisen, der die geringe Dichte dieser Viren bewirkt. Die ahnlich geringe spezifische Dichte der Huhner-Leukose-Viren 1ai3t vermuten, dai3 Lipide auch einen wesentlichen Bestandteil dieser Viren ausmachen. In der Tat betragt der Lipidgehalt des AMV nach Untersuchungen von BONAR und BEARD bis zu 35 O / o der Gesamtmasse des Virus (26). Nach neueren Befunden der gleichen Arbeitsgruppe, wonach der Gehalt der verschiedenen Lipide im Virus nicht der Lipidverteilung in der Zellmembran entspricht, erscheint es jedoch zweifelhaft, ob die Lipide ausschliefilich aus der Zellwand stammen (113).

Der Gehalt des Virus an Zellbestandteilen beschrankt sich nicht auf Lipide. In Untersuchungen uber den Nucleinsauregehalt von AMV, das in Fibroblasten gebildet wurde (Fibroblasten-AMV), konnte gezeigt werden, da8 auch zellulare RNS in das Virus eingebaut ist. Da diese in Fraktionen mit unterschiedlichem Sedimentationsverhalten auftritt (I 2 ; s. S. 604), handelt es sich offenbar urn RNS verschiedener Spezifitat. BOLOGNESI bestatigte in- rwischen unsere Befunde mit AMV, das aus Myeloblasten stammte (Myelo- blasten-AMV) (25). Vorerst ist ungeklart, ob der Zell-RNS, die durch das Virus von einer Wirtszelle zur andern iibertragen werden kann, eine biologische Funktion beim Infektionsprozei3 bzw. bei der Onkogenese zufallt.

Neben Zell-Lipiden und -RNS enthalt das AMV auch zelleigene Enzyme. Von besonderer praktischer Bedeutung ist die an der Virusoberflache gelegene ATPase, da man durch deren Messung, wie bereits erwahnt, das AMV im Blut kranker Kuken quantitativ bestimmen kann (102). Die anfangliche Meinung, dai3 dieses Enzym virusspezifisch sei, mui3te spater revidiert werden. Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, 1ai3t sich in AMV, das nicht in Huhnermyeloblasten vermehrt wurde, keine ATPase-Aktivitat feststellen (14). Man mui3 daraus folgern, dai3 die ATPase des in Myeloblasten synthetisierten Virus zell- spezifisch ist. In Obereinstimmung mit diesem Befund konnte elektronen-

% saurelosliche RNS

Tabelle 4 ATPase-Gehalt von AMV verschiedener Herkunft

Konzentration des Myeloblasten-Virus 10 pg RNase unverdunnt 1 I 5 1 I 20 0

53 32 5 0 32

Tabelle I Konzentrationsabhangigkeit der im Myeloblasten-AMV enthaltenen RNase-Aktivitit. Ange- geben sind O / o der C14-Uridin-markierten (AMV) RNS, die na& Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von Myeloblasten-AMV saureloslich werden, bezogen auf die Kontrolle,

die kein Myeloblasten-AMV enthalt


Abb. 4. CsC1-Dichte-Gradienten Zentrifuga- 1,36i tion von Fibroblasten- und Myeloblasten- 1,358 AMV. Ci4-Uridin markiertes Fibroblasten- ,,354 AMV und Myeloblasten-AMV wurden im selben CsC1-Gradienten 18 Std. lang bei 35 000 1,350

UpM im SW 39 Rotor zentrifugiert, und vom ‘ a x 6

Boden des Rohrchens gleich grone Fraktionen abgenommen, deren Dichte indirekt durch Messung der Refraktion im Zeiss-Refrakto- meter bestimmt wurde. Sodann wurde die saurefallbare Radioaktivitat sowie die ATPase-

Aktivitat jeder Fraktion bestimmt

fFibrobiast.-A

mikroskopisch nur dann ATPase im AMV nachgewiesen werden, wenn die Membran der betreffenden Wirtszelle ATPase enthielt (42).

Bei Versuchen, die RNS des AMV zu isolieren, zeigte es sich, dai3 das Virus als weiteres Enzym RNase enthalten kann (12; Tabelle 5). Ebenso wie

Abb. 5. Negativ kontrastiertes Fibroblasten- und Myeloblasten-AMV. Beide Viruschargen wurden gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen gereinigt und sofort danach fixiert. Fibroblasten-AMV ist danach zum groaten Teil zerfallen, wahrend die Myeloblasten-AMV-

Partikeln uberwiegend intakt erscheinen

598 HEINZ BAUER

Viruseigenschaften

ATPase- Akt iv i ta t RNase- Akt iv i ta t

Lipide CsCl-Schwirnrndichte in g I c r n 3 Stabi l i ta t lrnmunogenitat irn Kaninchen Pathogenitat fur das Kuken

die ATPase, ist die RNase in Myeloblasten-AMV, nicht aber in Fibroblasten- AMV nachweisbar (s. IV c). Es ist anzunehmen, dai3 gezielte Untersuchungen zur Entdeckung weiterer im Virus enthaltener Enzyme fuhren wurden.

Aui3er dem Enzymgehalt scheint auch der Lipidanteil des AMV vom Wirtszelltyp abhangig zu sein. Fibroblasten-AMV hat eine um 0,02 g/cm3 hohere Schwimmdichte als Myeloblasten-AMV (Abb. 4), was wohl damit zu erklaren ist, dai3 jenes weniger Lipide enthalt als dieses. Ahnliche Ergebnisse wurden fur RSV (36) sowie fur Myxoviren (137) beschrieben.

D a Fibroblasten-AMV trotz Fehlens gewisser zellularer Bestandteile immer noch pathogen ist fur den naturlichen Wirt, das Huhn (11), sind Art und Menge der zellularen Bestandteile des Virus fur dessen biologische Eigen- schaften wahrscheinlich unwesentlich. Allerdings besteht hinsichtlich der Stabilitat ein bemerkenswerter Unterschied zwischen den Viren verschiedener Provenienz. Vergleichende Untersuchungen im Elektronenmikroskop (Abb. 5) und in der analytischen Ultrazentrifuge (11) liei3en erkennen, dafl die Virus- partikeln mit groi3erem Gehalt an Wirtszellbestandteilen am stabilsten sind.

Die immunogenen Unterschiede zwischen Myeloblasten- und Fibro- blasten-AMV werden in einem spateren Kapitel beschrieben. Eine Zusammen- fassung der wirtszellabhangigen Eigenschaften des AMV wird in folgender Tabelle gegeben.

Fibroblasten- AMV Myeloblasten - AMV

+ +

L + I + 1,22 12

niedrig hot h gut schlecht + t

4. Virusspezifische Bestandteile des Leukose-Virus Besondere Muhe wurde darauf verwendet, die virusspezifischen Bestand-

teile des Virus zu isolieren und naher zu charakterisieren. Dabei wurden weitere Ahnlichkeiten zu den Myxoviren festgestellt. Wie diese, so enthalt au& das Leukose-Virus eine einstrangige RNS als Trager der Erbsubstanz, weiterhin gruppenspezifisches, mit komplementbindendem Serum nachweisbares Antigen als Innenkomponente des Virion @.-Antigen), sowie typspezifische Hullenantigene (V-Antigen), die fur die spezifische Adsorption des Virion an die Zellmembran und fur die Induktion neutralisierender Antikorper im Tier verantwortlich sind. Im folgenden Kapitel werden Versuche zur Isolierung und Charakterisierung dieser Viruskomponenten beschrieben.

a) Das gruppenspezifishe (gs) komplementbindende (KB) Antigen Bisher stehen zwei Arten von KB-Antiseren gegen Leukose-Viren zur

Verfugung, einmal die aus Row-Tumor-tragenden Saugetieren gewonnenen (87) und zum anderen die nach der Methode von ECKERT und Mitarbeitern im Kaninchen hergestellten KB-Antiseren (53).

ECKERT hatte schon fruher in der BEARD’schen Arbeitsgruppe versucht, durch Injektion von intaktem Virus komplementbindende Virusantikorper in Kaninchen zu erhalten. Das Resultat sdcher Versuche waren aber Antiseren, die praktisch nur mit Zellantigen reagierten (51). Die virusspezifischen


Antigene scheinen entweder durch die zellularen Antigene des Virus abgedeckt zu sein oder es besteht eine antigene Konkurrenz (antigenic competition) zwischen den verschiedenen Virusbestandteilen.

Dieses Problem wurde in unserem Institut wieder aufgegrifien, und es gelang erstmals, virusspezifische KB-Antikorper gegen AMV zu erhalten, indem das AMV vor der Injektion in Kaninchen entweder mit Natriumlauryl- sulfat (NLS) oder mit einem Tween 80-Kther-Gemisch zerlegt wurde (53). Die resultierenden Virusspaltprodukte bewirkten in Kaninchen allerdings nicht nur eine Antikorperproduktion gegen virusspezifische, sondern auch gegen zellulare Antigene. Nach Absattigung der Immunseren mit Homogenat von normalem Hiihnergewebe reagierten sie praktisch virusspezifisch.

Die Schwierigkeit, Antikorper gegen Normalkomponente entfernen zu miissen, um virusspezifische Antiseren zu erhalten, konnten wir umgehen, indem wir zur Immunisierung Antigen benutzten, das elektrophoretisch von zellularen Antigenen weitgehend gereinigt wurde: NLS-behandeltes AMV 1ai3t sich in der Tiselius-Elektrophorese-Apparatur in fiinf Hauptfraktionen (C,-C,) auftrennen (Abb. 6). Aus der UV-Absorption der einzelnen Frak- tionen bei 260mp und 280mp 1ai3t sich folgern, dai3 C, hauptsachlich aus Protein, C, vor allem aus Nucleinsaure besteht. Nach serologischen Unter- suchungen enthalt C, nur Virus- antigen, C2-4 dagegen Virus- und zellulare Antigene. Nach Injektion von C, in Kaninchen bildeten diese ausschliefllich virusspezifische Antikorper (1 8).

Abb. 6. Elektrophoresediagramm von NLS-degradiertem AMV in Phosphat- gepufferter (pH 7.5) 0.5 "/o NaC1- Losung. Anodische Wanderung. Auf- nahme nach 327 Minuten; Tempera-

tu r 2,4' C

Alle bisher getesteten Virusstamme der Huhner-Leukose-Sarkomatose- Gruppe reagierten in der KBR mit solcherart hergestellten Anti-AMV-Kanin- chenseren (Tabelle 2; 17, 18). Das bedeutet, dai3 mit diesen Seren ein gruppenspezifisches (gs)-Antigen der Leukose-Viren erfai3t wird.

Obwohl zur Herstellung der gs-Kaninchen-Antiseren das gesamte Virus- Spaltprodukt injiziert wurde, haben diese Seren keinerlei neutralisierenden Effekt auf das AMV. Dieser uberraschende Befund ist vorerst nur so erklarbar, dai3 das V-Antigen durch die Behandlung mit SDS oder Tween-Kther seine antigene Eigenschaft verandert oder nicht ausreichend von Normalkompo- nente befreit wird.

Weitere Untersuchungen zeigten, dai3 gs-Kaninchen-Antikorper nicht an intaktes Virus adsorbiert werden. Benutzt man jedoch degradiertes Virus, so lassen sich die komplementbindenden gs-Antikorper praktisch vollstandig absattigen (Tab. 6; 19). Wir folgerten aus diesen Versuchen, dai3 es sich bei diesem Antigen um eine Innenkomponente des Virus handelt. Die Tatsache, dai3 intaktes Virus dennoch in der Komplementbindung reagiert, beruht darauf, dai3 bei der iiber-Nacht-Inkubation des Antigen-Antiserum-Komple-

600 HEINZ BAUER

Reziproker K B - Titer des Serums

Tabelle 6 Absattigung von gs-Kaninchen-Antiserum

Gs-Serumtiter nach Absattigung m i l

Puffer I NLS - AMV I unbehandeltem AMV nach AMV I lnkubation bei L o C

320 < 20 320 20

Seren

gs -Hamster

gs - Kaninchen

K P - Maus

ment-Gemisches bei 4 O C die Viruspartikeln so weit spontan zerfallen, dai3 das innere Antigen den Antikorpern zuganglich wird. Dies 1ai3t sich dadurcb beweisen, dai3 gs-Antikorper mit Virus abgesattigt werden konnen, nachdem dies 16 Stunden bei 4 O C gehalten wurde (Tab. 6; 19).

Das Molekulargewicht des gs-Antigens wurde mit etwa 23 000 bestimmt; das C-terminale Ende des Peptids enthalt Alanin und das N-terminale Ende P r o h (169, 170).

Die von HUEBNER und Mitarbeitern in Row-Sarkom-tragenden Hamstern und Meerschweinalen entdeckten virusspezifischen Antikorper sind ebenfalls gruppenspezifisch fur die Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren (87). In der Regel erhielt man mit diesen Antiseren eine, seltener zwei Pra- zipitationsbanden im Gel-Difiusionstest (22). Die HUEBNER’Sche Arbeits- gruppe hielt es lange Zeit fur moglich, dai3 mit ihrem gs-Serum ein losliches, d. h. nicht virusgebundenes und schlecht sedimentierbares Nebenprodukt der Virusinfektion erfaflt werde. Aus vergleichenden serologischen Untersuchungen mit verschiedenen Methoden ging jedoch hervor, dai3 es sich um dasselbe gs- Antigen handelt wie das von uns beschriebene. Gs-Kaninchenserum und gs- Hamsterserum verhielten sich in allen gepruften Fallen analog (Tab. 7 ; 18,

Antigen

RSV RSV R I F AMV 9s - KP - (RAV- I1 (RAV-21 An1 igen Virus

6L 16 800 0

32 L 32 8 LOO 0

0 0 0 0 0 32

93, 109). Ein uberzeugender Beweis fur die Identitat der beiden gs-Antigene verschiedenen Ursprungs Lei3 sich jedoch im Agar-Gel-Prazipitationstest er- bringen. In einem Ansatz von gs-Kaninchenseren und gs-Hamsterseren gegen gs-Antigen, das aus Virus- bzw. Saugertumorzellen isoliert wurde, erhalt man eine durchgehende Prazipitationslinie (Abb. 7; 17). Mit den gs-Kaninchenseren beobachteten wir, ahnlich zum gs-Hamsterserum, ganz vereinzelt eine zweite Prazipitationsbande (I 7).

Die von der HUEBNER’schen Arbeitsgruppe beschriebene ,,Loslichkeit“ des gs-Antigens im Oberstand von Leukose-Virus-infizierten Huhnerfibro- blasten findet ihre Erklarung darin, dai3 diese Autoren das virushaltige Gewebekulturmedium zunachst einfroren, bevor sie die Sedimentierbarkeit von gs-Antigen und Virus verglichen. Bei Frieren und Tauen zerfallt aber ein

Untersuchungen der Hiihner-Leukose-Sarkomatose-Viren

Antiserum fur die KBR

gs-Kaninchen- Serum

gs-Hamster - Serum

9s- Kaninchen - Serum

601

Ausgangs - Nach Ultrazentrifugation

material Uberstand Sediment nach Resuspension in 1 /10

des Ausgangsvolumens

128 adb L 800

2L b 2 128

6 L 32 4

Abb. 7. Agar-Gel-Difiusionstest rnit gs-Kanin- chen und gs-Hamster Seren gegen gs-Antigen

verschiedenen Ursprungs Abkiirzungen : HS I = Serum von Rous-Sarkom

tragendem Hamster AMV-RS = Kaninchen- Antiserum gegen

NLS beh. AMV C-1-RS Kaninchen-Antiserum gegen ge-

reinigtes gs.Antigen (C-l- Komponente)

AMV-SDS NLS gespaltenes AMV gs-AMV Gs-Antigen, das elektrophoretisch

aus Tween 80-Ather gespaltenern AMV isoliert wurde

Rous-Sarkom- Zellen gs-Tu = gs-Antigen aus Hamster-

groi3er Teil der Virusteilchen, was zur Folge hat, dai3 das gs-Antigen freigesetzt bzw. ,,loslich" wird. Zentrifugiert man Gewebekulturmedium unmittel- bar nach der Ernte untes Bedingungen, bei denen das Virus vollig sedimentiert, so findet man auch eine entsprechende Anreicherung des gs-Antigens im Sedi- ment (Tab. 8; 19).

Tabelle 8 Sedimentationsverhalten des gs-KB-Antigens aus dem Medium von AMV-infizierten

Hiihnerfibroblasten

In den letzten beiden Jahren hauften sich die Indizien fur die Existenz von mehr als einem gs-Antigen. In zwei Fallen wurden bis zu 5 Prazipitations- banden im Agar-Gel-Difiusionstest beschrieben (1 71,188), wahrend DUESBERG und Mitarbeiter nach Phenol-NLS-Extraktion der Virusproteine drei Protein- fraktionen im Polyacrylamidgel isolierten, von denen zwei in der KBR mit gs-Hamsterserum reagierten (1 78). Zur Klarung, ob es sich hierbei wirklich um verschiedene Polypeptide oder aber um Polymere einunddesselben Peptids oder Aggregate eines Peptids mit anderen Molekulen handelt, fuhrten wir in jungster Zeit einige Versuche durch mit dem Ziel, die einzelnen Komponenten nach Phenol-NLS-Extraktion zu isolieren und immunologisch und physikalisch zu charakterisieren. Vorlaufige Ergebnisse zeigten, dai3 von vier isolierten Proteinfraktionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht zumindest drei serologisch voneinander verschieden und nicht identisch sind mit typspezifi- schem Virus-Hull-Antigen (174).

O b eine oder mehrere der gs-Antigene identisch mit einem normalen Huhnerzellantigen sind, das normalerweise nur in embryonalem Gewebe synthetisiert wird (1 87), bedarf weiterer Klarung.

Zbl. Vet. Med., Reihe B, Bd. 17, Heft 5

602 HEINZ BAUER

Serum-Verda , die 100 FEE yon BH- RSV I AMV- 2 ) neutralisiert

1 I 6LO 1 I6000 1 I 1280 1 12560 1 I 250 1 I 250

b) Das typspezifische V-Antigen Im Gegensatz zum gs-Antigen bestand bis vor kurzem keine Moglichkeit,

das V-Antigen in einer schnell durchfuhrbaren Reaktion nachzuweisen. Eine einfache Methode ware z. B. gegeben, wenn die Leukose-Viren Erythrocyten agglutinieren wiirden. Die Viruseigenschaft der Hamagglutination (HA) ist namlich, wie z. B. im Fall der Myxoviren (126), meistens typspezifisch und an die Hiillantigene des Virus gebunden. Mit typspezifischen Antiseren kann man die H A hemmen und damit das Hull-Antigen nachweisen. Trotz Anwendung verschiedener pH-Werte und Puff erbedingungen konnte jedoch keinerlei HA- Aktivitat von AMV gegenuber Erythrocyten von Maus, Ratte, Meerschwein- chen, Hammel, Huhn, Gans und Ente beobachtet werden (1 1).

Eine andere einfache Nachweismethode ware die der KBR. Die wahrscheinlichen Grunde, weshalb man bisher keine KB-Antiseren gegen intaktes Virus erhielt, wurden eingangs dieses Kapitels diskutiert. Da jedoch eine Reihe unserer jungsten Ergebnisse dahingehend interpretiert werden konnen, dai3 Fibroblasten-AMV weniger Normalkomponente enthalt als Myeloblasten-

Nr. der Kaninchen- An t i -

seren gegen Myeloblasten AMV

179 181 389 390

Tabelle 9 Neutralisierende Kapazitat yon Kaninchen-Anti-AMV-Seren

Nr. der Kaninchen- Ant i - seren gegen Flbroblasten-

151 155 160 163 195 196

Serum-Verd. , die 100 FEE von BH-RSV ( A M V - 2 ) neutralisiert

I 1 50 1 / I00 1 / 80 I 1 80

a Die neutralisierende Kapazitat ist pro rnl der jeweiligen Serurnverdiinnung angegeben b FBE: Focus-bildende Einheiten

AMV, schien es denkbar, dai3 die Virusantigene des ersteren weniger durch Normalkomponente abgedeckt und daher besser antigen wirksam sind. Ver- gleichende Immunisierungen mehrerer Kaninchen mit Fibroblasten- und Myeloblasten-AMV bestatigten diese Vermutung (16). Die so erhaltenen Kaninchen-Immunseren hatten zwar gleichhohe KB-Titer gegen Huhner- Normalkomponente, nach Absattigung rnit Milz-, Leber-, Niere-Homogenat von virusfreien Huhnern besagen die Antiseren gegen Fibroblasten-AMV jedoch z. T. recht hohe Titer von neutralisierenden Antikorpern, die im Durch- schnitt lofach hoher waren als die der Seren gegen Myeloblasten-AMV (Tab. 9). Leider wurde das Ziel, KB-Antikorper gegen das V-Antigen zu erhalten, auch mit dieser Methode nicht erreicht. Es ist bisher noch nicht geklart, warum diese Seren rnit hoher neutralisierender Kapazitat nicht im KB-Test reagieren. Die Spezifitat der neutralisierenden Kaninchenseren scheint jedoch gesichert. Wenn namlich die Neutralisation auf einer Reaktion mit Huhner- Normalkomponente beruhen wurde, sollten andere Viren, die in gleicher Weise Huhner-Normalkomponente enthalten, ebenfalls neutralisiert werden. Dies ist nicht der Fall, wie Kontrollversuche rnit einem Influenzavirus und dem SR-RSV, einem Leukose-Virus der Gruppe D, ergaben (16).

Obwohl nach Virusbehandlung mit verschiedenen Detergentien oder Ather bisher kein losliches immunologisch aktives V-Antigen freigesetzt werden konnte, gelang uns dies kurzlich doch durch die Behandlung von hoch- gereinigtem Virus rnit Tween-20 (1 74, 191). Nach mehreren Reinigungsschrit- ten mittels Zuckergradientenzentrifugation erhielten wir ein Antigen, das nach


Abb. 8. Subgruppenspezifitat der isolierten V-Antigene im Agar-Gel-Diffusionstest bei Verwendung von neutralisierenden Hiihner-

seren.

Abkurzungen: Anti A

Anti B = Anti MAV-B-Huhnerserum Anti A 4- B

= Anti SR-RSV-1 Hiihner- serum

= Gemisch von Anti SR-RSV-1 und Anti MAV-B-Serum

A, isoliert aus SR-RSV-1

B, isoliert aus MAV-B

A = V-Antigen der Subgruppe

B = V-Antigen der Subgruppe

KBR- und Gel-Diff usionstests weitgehend frei von Wirtskomponente sowie gs-Antigen und je nach Ausgangsvirus fur die betreff ende Virusuntergruppe spezifisch war (Abb. 8). Entsprechende Enzymbehandlungen des gereinigten Antigens ergaben, dai3 seine Antigenitat protein-, aber nicht lipidgebunden ist. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dai3 das betreff ende Antigen die Eigenschaften hat, neutralisierende Antikorper zu absorbieren und in vitro eine fruhe Interferenz (STRECK und RUBIN) gegen Viren mit ahnlichem Hull- Antigen zu bewirken (191). Weiterhin scheint nach einem ersten Versuch das so gereinigte V-Antigen auch als Impfstoff verwendbar zu sein.

c) Die Virus-Nucleinsiure Seit der ersten erfolgreichen Isolierung intakter Virus-RNS durch GIERER

und SCHRAMM (63) gelangen ahnliche Versuche bei den meisten Viren, deren Bausteine lediglich aus Nucleinsaure und Protein bestehen. Die gleiche Methode versagte jedoch bei den lipidhaltigen groi3en RNS-Viren. Der entscheidende Schritt war hier die Anwendung von Detergentien, wodurch erstmals die Isolierung hochmolekularer RNS aus Huhner-Leukose-Viren gelang (12). Ober die Isolierung und Charakterisierung der im AMV enthaltenen RNS wird im folgenden Kapitel berichtet.

Behandelt man gereinigtes Fibroblasten-AMV, dessen RNS durch Ver- mehrung des Virus in Zellkulturen mit C14-Uridin-haltigem Medium radioaktiv markiert ist, mit 0,5-1 O / o NLS und fraktioniert danach die Nuclein- saure durch Zentrifugation in einem Rohrzuckergradienten, so erhalt man in der Regel vier verschieden schnell sedimentierende RNS-Fraktionen (Fraktion a-d in Abb.9). Eine fiinfte Fraktion wird gelegentlich zwischen c und d beobachtet. Bei Verwendung von frisch gereinigtem Virus wird die hochste Radioaktivitat in der am schnellsten sedimentierenden Fraktion a gefunden. Durch vergleichende Zentrifugation mit der RNS des Tabak-Mosaik-Virus (TMV), deren Sedimentationskoeffizient in 0,1 m NaC1-Losung in der analytischen Ultrazentrifuge mit 29 Svedberg bestimmt worden war, liei3en sich die Sedimentationsgeschwindigkeiten fur die Fraktionen a-d annahernd mit

39')

HEINZ BAUER

a

~ : ~ . & # ~ ~ ~ ~ , , , , . , 9 4 6 8 W l 2 Y S d ~ U U ~ M D

FmM.Nc L_. s m 15 20 2s 30

Frakl Nr. - Abb. 9. Fraktionieren der Nucleinsaure aus Abb. 10. Vergleich des Sedimentations-Ver- C"-Uridin-markiertem Fibroblasten-AMV haltens von TMV-RNS und Fibroblasten- durch Zentrifugieren im Saccharose-Gra- AMV-RNS im Saccharose-Gradienten.

dienten AMV-RNS CI4-Uridin markiert TMV-RNS nicht markiert, erfaRt d u d Messung von OD,,,

62 S, 45 S, 30 und 4-10 S errechnen (Abb. 10). Hierbei ist die unterschiedliche Rohrzuckerkonzentration im Gradienten nicht berucksichtigt. Direkte Messungen der am schnellsten sedimentierenden RNS-Fraktion in der analytischen Ultrazentrifuge ergaben 6 7 s und 71 S fur das AMV bzw. das RSV (114, 116).

1 . ' 0 ; P

P 15

Versuche, hochmolekulare RNS aus Myeloblasten-AMV zu isolieren, schlugen zunachst fehl. Es stellte si& heraus, dai3 dieses, wie bereits erwahnt, RNnase enthalt, die die im Virus enthaltene RNS nach ihrer Frei- setzung durch NLS verdaut. Dur& gleichzeitige Zugabe des proteolyti- schen Enzyms Pronase wahrend der Spaltung des Virus kann die RNase jedoch zerstort werden, und man erhalt ein ahnliches RNS-Sedimentati- onsprofil wie mit Fibroblasten AMV (Abb. 11).

Abb. 11. Isolierung der Nucleinsaure aus Myeloblasten-AMV nach und ohne Behand-

lung mit Pronase

Nach den Ergebnissen von ,,Chase"-Experimenten stellt die 60-70 S- RNS-Fraktion die eigentliche Virus-RNS dar, wahrend die ubrigen Fraktionen zumindest teilweise aus zellularer RNS bestehen. In solchen Versuchen wurden Fibroblastenzellen mit H3-Uridin-haltigem Medium inkubiert und das Hs- Uridin zur Zeit der Virusinfektion entweder mit kaltem oder C'd-Uridin ausverdunnt. 2-3 Tage spater wurde das Virus in der ublichen Weise aus dem

Untersuchungen der Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren

Literatur

RNS-Typ

S,, der RNS

C A G U

605

116 114 47 116 1 I4 47 116

RSV AMV NDV RSV AMV NDV Hjhner- Normal-Zellen

64 S 71 S 51 S L S 4 s 3 s 4 s

24.2 23.0 23.0 26.6 18.5 26.3 28.2 25.1 25.3 23.8 21.3 19.3 20.0 18.7 28.3 28.7 23.8 32.8 34.4 33.L 33.1 22.L 23.0 29.L 19.3 17.6 20.3 20.0

Jmp/Min

tl

- FmktNr

Abb. 12. Nachweis zellspezifischer RNS durch differentielle Markierung der im AMV enthaltenen RNS. Markierung des Wirtsystems vor Infektion mit H3-Uridin; ,,Chase" zur Zeit der Infektion mit C'd-Uridin. Vertei- lung der Radioaktivitat auf die Nuclein-

saure-Fraktionen des geernteten Virus

7' \. 40 i *,-*

, I ~ I ~ I

2 6 6 6 W l 2 Y 1 6 U Z Z S X 2 3 3 - Fmkl. Nr.

Abb. 13. Wie Abb. 12, ,,Chase" aber mit kaltem Uridin durchgefuhrt. Hs-Uridin voc Infektion, loofache Menge C12-Uridin zur

Zeit der Infektion

Gewebekulturmedium gereinigt, die im Virus enthaltene RNS im Rohrzucker- gradienten isoliert und der HS- und CI4-Uridin-Gehalt der Gradienten- fraktionen bestimmt (Abb. 12). Gemai3 der Versuchsanordnung sollte die mit H3-Uridin markierte RNS zellularen Ursprungs sein, da sie bereits vor der Virusinfektion synthetisiert worden sein mug. Vor allem aus dem Versuch, in dem das H3-Uridin mit kaltem Uridin ausverdunnt worden war, geht ein- deutig hervor, dai3 die mit etwa 45 S und noch langsamer sedimentierende RNS im wesentlichen zellularen Ursprungs ist (Abb. 13) .

ROBINSON und Mitarbeiter, die im Gegensatz zu uns NLS-haltiges Phenol zur Extraktion benutzten, isolierten aus RSV, AMV und NDV neben der 60-70 S-RNS eine 4 S-RNS. Sie pladierten dafur, dac letztere vor allem durch Zerfall der hochmolekularen RNS entsteht. Ein Vergleich der von denselben Autoren durchgefuhrten Basenbestimmungen zeigt jedoch, dai3 die Basenverhaltnisse der 4 S-RNS der drei Viren, die alle in Huhnerzellen vermehrt worden waren, von denen der hochmolekularen RNS erheblich ab- weichen. Sie sind untereinander aber gleich und entsprechen dem Basenver- haltnis der 4 S-RNS aus der Wirtszelle (Tab. 10). Dies ist ein weiterer Hin- weis fur die Zellspezifitat der 4 S-RNS. Unsere Ergebnisse wurden daruber hinaus inzwischen von anderen Autoren bestatigt, die einmal zeigen konnten, dai3 die 4 S-RNS teilweise transfer-RNS (1 76, 192) und die beiden mittleren Fraktionen ribosomaler RNS entsprechen (25,175).

Der Gehalt des Virus an Zell-RNS scheint nicht auf eine zufalligi An- lagerung radioaktiven Materials aus der Gewebekulturflussigkeit ztiruck- zugehen. Aus Versuchen, in denen nichtmarkiertes Virus in Medium von radioaktiv markierten Zellen suspendiert und dann zentrifugiert wurde, geht her-

Tabelle 10 Basenzusammensetzung der RNS vershiedener Viren und Zellen

606 HEINZ BAUER

Abb. 14. Priifung, ob sich C"-Uridin-markiertes Material aus dem Medium normaler Kulturen an nicht markiertes AMV anlagert. Isolierung des Virus im CsCl-Dichtegradien-

ten. a) Kontrolle: C14-Uridin-markiertes AMV

b) Kontrolle: Medium von CId-Uridin-markierten normalen Fibroblasten (0-0)

c) Nichtmarkiertes Virus zusammen mit Medium von C"-Uridin-markierten Fibro- blasten ( 0 - 0 ) n D der einzelnen Fraktionen wurde im Zeiss-AbbC-Refraktometer bei

Zimmertemperatur bestimmt

(x-4

vor, daf3 es zu keiner Anlagerung von radioaktiven Zellbestandteilen an die Viren kommt (Abb. 14). Die Zell-RNS scheint auch nicht nur oberflachlich an das Virus angelagert zu werden, da sie durch RNase-Behandlung des intakten Virus nicht verdaut wird (12).

Die 60 S-RNS-Fraktion ist RNase-sensitiv, DNase-resistent, reagiert nicht mit gs-Antiserum, wird bei der Synthese nicht mit Cl4-Leucin markiert, hat ein Absorptionsmaximum bei 258 mp, ein Minimum bei 227 mp und ein 260/280 Absorptionsverhaltnis von etwa 2 (12). Aus diesen Befunden geht hervor, daf3 es sich um eine weitgehend proteinfreie einzelstrangige RNS handelt. Die 45 S- und 30 S-Fraktion stellen keine reine RNS dar, da einerseits in diesem Sedimentationsbereich Leucin-Markierung gefunden wird und ande-

rerseits die UV-Absorption dieser Fraktion nicht der einer reinen RNS entspricht (OD 280/280 = 1,3-1,4).

DNS ist, wenn uberhaupt, nur in Spuren im Virus enthalten. AMV, das in Gegenwart von HS-Thymidin vermehrt worden war, enthalt keine nachweisbare Ra- dioaktivitat nach Reinigung und Zentrifugation im

Jmp/Min 1 C*- Uridin

4m Rohrzuckergradienten (Abb. 15).

Frakl NC -.

Abb. 15. Saccharose-Gradienten-Zentrifugation von intaktem AMV aus C14-Uridin- bzw. H3-Thymidin-markierten Fibro-

blastenkulturen

Es ist anzunehmen, daf3 die aus den Leukose-Viren isolierbare 60-70 S- RNS, deren Molekulargewicht sich nach elektronenoptischer Vermessung und gemai3 ihrem Sedimentationsverhalten auf etwa 10 Mio. errechnet (69,116), geniigend genetische Information fur die vollstandige Virussynthese enthalt. Dennoch ist es bisher nicht mit Sicherheit gelungen, Zellen mit der isolierten

Untersuchungen der Hiihner-Leukose-Sarkornatose-Viren 607

60 S-RNS zu infizieren (12). Vorlaufigen Berichten zufolge sol1 es jedoch in Huhnerzellen nach Vorbehandlung mit Virus-RNS zur Synthese von virusspezifischen Antigenen kommen, die immunfluoreszenzoptisch nachgewiesen wurden (80, 11 1). Diese Befunde bedurfen jedoch der Bestatigung. Kurzlich hat DUESBERG postuliert, dai3 das eigentliche Virusgenom lediglich durch eine 36 S-RNS reprasentiert wird, da die 60-70 S-RNS durch Erhitzen oder Dimethylsulfoxid-Behandlung in RNS-Molekule mit - 36 S uberfuhrt werden kann (177). Uber die Infektiositat dieser 36 S-RNS ist noch nichts bekannt.

5. Ultrastruktur des Virus Elektronenmikroskopische Untersuchungen von negativ kontrastiertem

(28) Virus bestatigten die fruheren Ergebnisse an Dunnschnittpraparaten (24), wonach der ,,Kern" des Virus mit eiiiem Durchmesser von 35-45 mp von einer inneren Membran und diese wiederum von einer aui3eren Hulle umgeben ist (Abb. 16). Daruber hinaus kann man mit der Methode der Negativ- kontrastierung knopfformige Fortsatze an der Virusoberflache (Abb. 17 k, l), sowie eine fadige Struktur im ,,Viruskern" erkennen (Abb. 16; 20, 26,52). Vermutlich sind die Fortsatze der Virushulle Trager des typspezifischen V- Antigens. Bei der fadenformigen Innenkomponente konnte es sich urn ein Ribonucleoprotein (RNP)-Molekul handeln, ahnlich der Innenkomponente der Myxoviren, die aus Komplement-bindendem Antigen und der Virus-RNS gebildet wird (Abb. 17 i; 128). In analoger Weise konnte das gs-KB-Antigen der Leukose-Viren, das im Inneren des Virusteilchens gelegen ist, einen Kom-

Abb. 16. Elektronenrnikroskopische Darstellung der fadenforrnigen Innenkomponente (Pfeile oben) und der inneren Mernbran (Pfeile unten) in spontan zerfallenen Virusteilchen des AMV

608 HEINZ BAUER

Abb. 17. Elektronenmikroskopisher Vergleich zwischen Influenza- (KP) (a-c), Para- influenza- (NDV) (f-i) und Leukose-Virus (AMV) (d, e, k-n)

a, f, k: b, g, 1: c, h, m: Virusoberflache in der Aufsicht (Vergr.; 256 000fach) d, e :

1: n:

intakte Viria (Vergr.: 160 000fach) Fortsatze in 256 OOOfacher Vergr.

AMV-Untereinheiten ihnlich dem Hamagglutinin der Myxoviren (Vergr. 256 000- fa&) RNP-Fragmente (Pfeil) in spontan zerfallenem NDV (Vergr. 96 OOOfach) RNP-ahnliches Filament aus AMV (Vergr. 96 OOOfach)

plex mit der RNS bilden. Entsprechende RNP-ahnliche Gebilde konnten wir des ofteren in Leukose-Virus-Praparaten beobachten (Abb. 17 n).

In der Abbildung 18 sind die derzeitigen Kenntnisse uber den Aufbau des Virion und die mogliche Zuordnung der verschiedenen Virusbestandteile zu den einzelnen Struktureinheiten zusammengefai3t.

Hiihner-Leukose-Viren werden von mehreren Autoren auf Grund ihrer Struktur als Myxoviren angesehen. Die Bezeichnung Myxovirus-ahnlich ware zutreffender, denn abgesehen davon, dai3 Leukose-Viren keine Neuraminidase enthalten, lassen sich die beiden Virusgruppen im Elektronenmikroskop ein-

Untersuchungen der Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren

Vlrusgenom (+g-

nnere Membran

uflere Hiille

-V - Antken 1

Wrtszellmaterid

Antigen

609

= RNP?)

Abb. 18. Schematische Darstellung der Struktur der Leukose-Viren

wandfrei unterscheiden (Abb. 17; 59): Der Gro13e nach nehmen die Huhner- Leukose-Viren rnit einem Durchmesser von 1400-1900 A eine Mittelstellung ein zwischen den Influenza- (1200-1400 A) und den Parainfluenza-Viren (2000-3000 A). Die oberflachlichen Fortsatze der Myxoviren sind stachel- artig, gut erkennbar und etwa 100 A lang (Abb. 17 a, by f , g; 83). Dagegen haben die Fortsatze der Hiihner-Leukose-Viren eine knopfformige Endplatte (Durchmesser 40 A), die Stiele sind nur halb so lang wie die Stacheln der Myxoviren und auf Grund ihres geringen Durchmessers kaum zu erkennen (Abb. 17 k, 1). Die Aufsicht auf die Viren zeigt eine regelmaflige Anordnung der Fortsatze aller drei Viren, aber auch deren verschiedene Durchmesser (Abb. 17 c, k, m).

11. Virusvermehrung in vitro

1. Nachweisverfahren fur nicht Focus-bildende Viren Man kann die in vitro Vermehrung der meisten Viren an einem cytociden

Eff ekt (CPE) erkennen. Selbst einige Tumorviren, namlich die DNS-haltigen Adenoviren, SV 40 und Polyoma-Virus haben neben der Fahigkeit, eine Zelle zu transformieren, auch die, Zellen zu lysieren. Im Gegensatz dazu scheinen die Huhner-Leukose-Viren uberhaupt nicht cytocid zu wirken. Dies hat zur Folge, dafl fur diese Viren ein einfaches in vitro Nachweisverfahren nicht zur Verfugung steht.

Eine Infektion von Huhnerfibroblasten durch Rous-Sarkom-Viren 1aBt sich immerhin noch an der morphologischen Transformation der Zellen erkennen (Focus-Test). Zum Nachweis der Vermehrung der ubrigen Leukose- Viren, die Huhnerfibroblasten nicht transformieren, hat man jedoch die verschiedensten Methoden versucht, z. B. den RIF-Test (121), den Immun- fluoreszenztest (1 55), die in vitro Transformation spezieller Treffzellen (1 0) u. a., deren Vielfalt allein schon die technischen Schwierigkeiten und Nachteile der erwahnten Teste vermuten laBt.

Demgegenuber ist die von uns entwickelte Methode relativ einfach zu handhaben und mit vergleichsweise mai3igem Aufwand verbunden. Ihre Effektivitat wurde inzwischen von anderer Seite bestatigt (4). Die Methode ist auf alle Leukose-Viren anwendbar und beruht auf dem Nachweis von neugebildetem Virus in der Gewebekulturflussigkeit infizierter Zellen mit Hilfe von gruppenspezifischem KB-Antiserum (14). Da nur sich teilende Zellen infiziert werden konnen (9, 152), mussen fur diesen Test die einzelnen Gewebekulturen, die mit den verschiedenen Virusverdunnungen infiziert wurden, zweimal durch Mediumwechsel oder besser noch durch Subkulti- vierung zur Teilung gebracht werden. Dadurch werden zuletzt auch in den Kulturen, die mit einer geringen Virusmenge beimpft wurden, alle Zellen

610 HEINZ BAUER

infiziert. Diese Voraussetzung mui3 erfullt sein, da sonst nicht die minimale Viruskonzentration im Zell-Nahrmedium erreicht wird, die fur den Nachweis des Virus in der KBR erforderlich ist. Sie betragt ungefahr lo9 physikalische Viruspartikeln/ml. Bei Viren mit geringer Vermehrungsrate ist u. U. vor dem KB-Test eine Konzentration des Virus in der Ultrazentrifuge notwendig. Bei den meisten genugt jedoch die Untersuchung der nicht vorbehandelten Gewebe- kulturfliissigkeit .

Das Studium der Virusvermehrung mit dieser Methode ergibt folgende Kinetik: In der Gewebekulturflussigkeit erscheint 1 Tag nach Infektion erstes neugebildetes Virus, und nach 4-5 Tagen wird ein maximaler Virustiter im Medium erreicht, der uber langere Zeit konstant bleibt (Abb. 19; 14). DaB kein weiteres Ansteigen des Virustiters erfolgt, ist darauf zuruckzufuhren, dai3 das Virus eine sehr kurze Halbwertszeit hat (2 Stdn. bei 37" C) (156) und sich nach 4-5 Tagen ein Gleichgewicht zwischen neugebildetem und zerfallendem Virus einstellt. Das zellgebundene gs-Antigen erreicht bereits 3 Tage nach Infektion einen maximalen Titer (Abb. 19).

10 ' - 1 . 2 3 4 5 6 7 -

rage noeh Jnfekl.

27

1 2 3 4 5 6 7 - rag? nah JnfrRI.

Abb. 19. Bildung von gs-Antigen und infektiosen Einheiten des AMV in Hiihnerfibro- blasten-Kulturen.

x - x A - A Virusgebundene komplementbindende Einheiten im Medium nach lofaher

0 - o

Infektiose Einheiten im Medium

Virusanreicherung durch Ultrazentrifugation Komplementbindende Einheiten im Zellmaterial

D a das verwendete Serum mit allen Leukose-Viren reagiert, gleichgultig zu welcher Untergruppe sie gehoren, scheint der oben beschriebene KB-Test mit Gewebekulturflussigkeit als Antigen z. Z. die einfachste und zuverlassigste Methode zu sein, um Huhnerzellen auf latente Leukose-Viren zu prufen. Er wurde von uns in zahlreichen Fallen zu diesem Zmeck rnit Erfolg angewendet.

2. Intrazellulare Lokalisierung einzelner Virusbestandteile Im Gegensatz zu anderen Virussystemen gelingt es bei den Leukose-Viren

nur sehr schwer, mittels Immunfluoreszenz die Anordnung der verschiedenen Virusantigene in der Zelle und damit deren wahrscheinlichen Syntheseort fest- zustellen. VOGT berichtete, dai3 er nach Behandlung der Zellen mit Huhner- immunseren - wenn uberhaupt -, dann nur eine sehr schwache Immun- fluoreszenz im Cytoplasma von AMV-infizierten Fibroblasten beobachtete (155).

Bei Anwendung des indirekten Immunfluoreszenztests mit Kaninchen- Antiserum gegen gs- und V-Antigen konnten wir mit beiden Seren eine zwar

Untersuchungen der Hiihner-Leukose-Sarkomatose-Viren 61 1

schwache aber eindeutige Fluoreszenz im Cytoplasma AMV-infizierter Huhnerfibroblastenkulturen beobachten, deren Intensitat jedoch nicht aus- reichte, um einen Unterschied in der Lokalisation der beiden Antigene fest- zustellen (I I). In Obereinstimmung mit den Immunfluoreszenzversuchen fanden wir nach Fraktionierung von Hamstertumorzellen (1 3) komplementbindendes gs-Antigen nur in der cytoplasmatischen, nicht jedoch in der Kern- fraktion (17). Die Ergebnisse von PAYNE et al., wonach in der fruhen Phase der Infektion unter bestimmten Bedingungen gs-Antigen im Zellkern nachweisbar sein sol1 (109), konnten bisher weder von uns noch von andereri Autoren reproduziert werden.

Zur Zeit ist nichts bekannt uber den Syntheseort der Virus-RNS. Da es nicht einmal gelang, hochmolekulare Virus-RNS aus dem Gesamtextrakt infizierter Zellen zu isolieren, kamen die ebenfalls negativen Ergebnisse mit Zellfraktionen nicht uberraschend (1 3). Auch autoradiographisch war kein Unterschied zwischen AMV-infizierten und Kontrollzellen feststellbar (97). Moglicherweise gelingt es, unter der Wirkung geringer Actinomycin D-Dosen zwischen Zell- und Virus-RNS in der Zelle zu unterscheiden (1 15).

Die Schwierigkeiten des intrazellularen Nachweises von Viruskomponen- ten beruhen auf deren geringer Konzentration. Wahrend es nach Infektion mit einem cytociden Virus bald zu einer groi3en Anhaufung von Virus- komponenten oder auch reifen Viria in der Zelle kommt, ist dies bei Leukose- Viren nicht der Fall. Moglicherweise ist die Syntheserate von Leukose-Virus- Bestandteilen entweder sehr vie1 geringer oder aber Bildung und Aus- schleusung von reifen Viruspartikeln erfolgt schneller als bei cytociden Viren. Dies hat zur Folge, dai3 der intrazellulare Gehalt an Leukose-Virus-Unter- einheiten immer nur gering ist. Vielleicht ist dies sogar die Voraussetzung dafur, dai3 die Zelle durch das Virus nicht geschadigt wird und transformiert werden kann.

3. Mechanismus der Virussynthese Eine Reihe von Autoren entdeckten, dai3 durch Zugabe von Inhibitoren

der DNS-Synthese innerhalb der ersten Stunden nach Infektion das Angehen der RSV-Infektion verhindert wird. 1st die Infektion bereits erfolgt, so 1ai3t sich eine weitere DNS-Synthese durch Substanzen, die die DNS-Funktion hemmen, wie z. B. Actinomycin D, stark reduzieren (6-9, 147-149,154). Diese Befunde veranlai3ten TEMIN zu der Hypothese, dai3 die Synthese der Virus-RNS uber eine zur RNS komplementare DNS erfolge (148-150). Diese DNS sollte zu Beginn der Virusinfektion synthetisiert werden (Hemm- barkeit der Virusinfektion zu dieser Zeit durch DNS-Inhibitoren) und wahrend des weiteren Verlaufs der Virusvermehrung stabil sein (Hemmbar- keit der Virusvermehrung durch Actinomycin D). TEMIN nannte diese DNS Provirus. Er postulierte, dai3 sie in Analogie zu Bakteriophagen in einer den lysogenen Phagen ahnlichen Form in das Zellgenom inkorporiert sei und versuchte, seine Hypothese durch Hybridisierungsversuche zwischen Virus- RNS und Zell-DNS zu stutzen (150). Die betreffenden Ergebnisse schienen jedoch nicht signifikant und konnten im gleichen System auch bisher nicht bestatigt werden (8, 77, 165).

Wir versuchten, die Beobachtungen von TEMIN u. a. beim AMV nach- zuprufen. Zu diesem Zweck wurden Huhnerfibroblastenkulturen unter gleich- zeitiger Zugabe von 5-Fluordeoxyuridin, 5- Joddeoxyuridin oder Cytosin- arabinosid mit AMV infiziert und nach 5 Tagen der Gewebekulturuberstand mit der KBR-Methode auf neugebildetes Virus getestet. Im Vergleich zu un- behandelten Kulturen fand sich eine Reduktion der AMV-Produktion um

612 HEINZ BAUER

inhibitor 0 Cytosin- Fluordeoxy - Arabinosid uridin

KBR-Titer 128 -=1 < 1

iododeoxy- uridin

16 _ _ _ _ _ _ _ _ _ ~~

" Eine Stunde vor Infektion wurden je 100 pg des jeweiligen Inhibitors zu einer groflen

Proben Nr.

Gewebekulturschale gegeben 12 Tage nach Infektion wurde die Virusuroduktion durch Priifung der Gewebekultur-

RNS - Konzentration irn Hybridisierungsgemisch

medien & der KBR gegen gs-Serum gemessen' Reziproker Wert des Antigen-Titers

1

2

3

L

5

mindestens zwei Zehnerpotenzen (Tab. 11) . Versuche mit anderen DNS-Inhi- bitoren fuhrten zu ahnlichen Ergebnissen (5). Auf Grund dieser Befunde kann angenommen werden, dai3 der RNS-Replikationsmechanismus des AMV ahnlich dem des RSV ist. Mit einer inzwischen verbesserten Methode fur DNS-RNS-Hybridisierung (64) versuchten wir, in AMV-infizierten Zellen eine der TEMIN'schen Hypothese entsprechende DNS nachzuweisen. Nach dem GILLESPIE-SPIEGELMANN-verfahren wurde Virus-RNS mit der DNS aus normalen und aus AMV-infizierten Huhnerfibroblasten hybridisiert (165). Das Ergebnis eines solchen Versuches ist in Tabelle 12 dargestellt und zeigt, dai3 in der Tat Virus-RNS mit DNS aus infizierten Zellen hybridisiert, uberraschen- derweise aber in gleichem Mai3e auch rnit der DNS aus nichtinfizierten Kon- trollzellen. Da man eine Absattigung der DNS durch weitere Zugabe von RNS erreicht (Proben 2 u. 3 in Tab. 12) und die Hybridisierungsrate mit der DNS des Phagen um den Faktor 10 geringer ist (letzte Spalte in Tab. 12), mu8 angenommen werden, dai3 diese Hybridisierung spezifisch ist. Sie scheint darauf zu beruhen, dai3 die Virus-RNS Basensequenzen enthalt, die solchen in der Zell-DNS homolog sind. Durch Zugabe an nichtradioaktiver Zell-RNS im Oberschui3 zur Virus-RNS wird deren Hybridisierung mit Zell-DNS verhindert (Tab. 12, Probe 5).

Kurzlich wurden aus zwei anderen Laboratorien Ehnliche Versuche mit RSV und AMV berichtet, die das gleiche Ergebnis brachten (8, 77). Nach den Untersuchungen der franzosischen Autoren scheinen es vor allem Uridin-reihe Sequenzen der Virus-RNS zu sein, die rnit normaler zellularer DNS Basen- paarungen zeigen. Die TEMIN'Sche Hypothese bleibt rnit Huhnerfibroblasten also weiterhin unbestatigt. Sie wird aber gestutzt durch vorlaufige Versuche von BADER, der fur seine Versuche auch DNS aus Hamsterzellen verwendete und feststellte, dai3 die DNS aus RSV-transformierten Hamsterzellen mit einer 4--5fach groi3eren Menge an Virus-RNS hybridisiert als die DNS aus normalen Hamsterzellen (8).

1,27 pg I rnl AMV - RNS - H3 2.55 pg I ml AMV-RNS-H '

4 4 5 pg I rnl AMV- RNS- H5

3,3 pg I rnl 2 8 5 Ribosomen-RNS-H3

1,27 pg I m l AMV-RNS-H3 plus 100 p g / rnl nichtrnarkierte Z e l l - RNS

Tabelle 12 Hybridisierung von AMV-RNS rnit DNS von normalen und AMV-infizierten

Hiihnerfibroblasten sowie von I-Phagen

w RNS , die hybridislert rnit DNS ws I Normalen Zellen

0.01 2

0,020

0,02L

0,021

0,0020

Infiziert. I A - Phagen I Zellen

0,012

0,019 0,0020

0,020 0,0037

0,022

0,0037


Wir pruften in Zusammenarbeit mit P.H. HOFSCHNEIDER noch eine weitere Moglichkeit der Virus-RNS-Replikation, indem wir versuchten, in AMV-infizierten Hiihnerzellen eine virusspezifische doppelstrangi e RNS

replikativen Form der Virus-RNS (82). Unsere Untersuchungen waren in dieser Hinsicht jedoch ohne Erfolg (81). Desgleichen scheiterten die Versuche anderer Autoren, eine DNS-unabhangige RNS-Polymerase aus Leukose-Virus- infizierten Huhnerfibroblasten zu isolieren (1 64). Dagegen gelang es kurzlich WATSON und BEAUDREAU, aus AMV-transformierten Huhnerzellen eine RNS- abhangige RNS-Polymerase zu isolieren, die moglicherweise virusspezifisch ist (193).

nachzuweisen, ahnlich der bei vielen RNS-haltigen Viren ge F undenen

111. Virusspezifische VerHnderungen in Rous-Sarkomen von SIugetieren Wie einleitend erwahnt, wird in Rous-Sarkomen von Saugetieren in der

Regel kein infektioses Virus produziert. Auch nach extensiven elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten wir keine RSV-Teilchen in solchen Tumoren feststellen (180). Es gibt aber experimentelle Hinweise dafur, dai3 in solchen Tumoren das Virusgenom nicht nur repliziert wird, sondern zumindest teilweise in Funktion ist. Letzteres mui3 man aus dem Vorhandensein von gruppenspezifischem KB-Antigen sowie virusspezifischen Transplanta- tionsantigenen in solchen Tumoren folgern, und ersteres aus Versuchen, in denen durch Kontakt von Rous-Saugerzellen mit normalen Huhnerzellen eine Virussynthese bewirkt wurde. Eine solche in-vivo-Kokultivierung wurde erstmals von SVOBODA durch Injektion von Saugertumorzellen in Huhner durchgefuhrt, worauf in diesen virusproduzierende Rous-Sarkome entstanden (141). Dies bedeutet, dai3 in den Saugertumorzellen das gesamte Virusgenom enthalten ist und auch repliziert wird, obwohl aus bisher unbekannten Grunden in der Regel keine Virussynthese stattfindet (87,125, 142). Das Virusgenom geht moglicherweise bei Kontakt mit Hiihnerzellen uber intrazellulare Brucken in diese uber, worauf seine genetische Information fur die Virussynthese voll ausgepragt wird.

Durch systematische Untersuchung mehrerer Tumorlinien versuhten wir einige entscheidende Fragen zu beantworten, die nach den bisher vorliegenden Arbeiten uber Saugertumoren off en geblieben waren. Insbesondere interessierte uns die Art der virusspezifischen Antigene in der Tumorzelle und deren Beziehung zur Vermehrung des Virusgenoms. Wir wahlten hierzu eine Reihe von Tumoren aus, die ursprunglih durch drei verschiedene RSV-Stamme in verschiedenen isogenen Mausestammen induziert worden waren (Tab. 3), so dai3 die Voraussetzung fur die Durchfuhrung von Transplantationsversuchen gegeben war.

1. Gruppenspezifisches, komplernentbindendes Antigen in Siugertumoren HUEBNER und Mitarbeiter hatten erstmals gs-KB-Antigen in Rous-

Sarkomen von Hamster und Meerschweinchen entdeckt (87). Wir pruften zunachst, ob dies auch fur die verschiedenen Rous-Tumorlinien der Maus zutrifft. Zu diesem Zweck wurden Tumorextrakte mit gs-Kaninchenserum in der KBR getestet. Aus Tabelle 13 ist zu ersehen, dai3 dabei nur in einem Teil der Tumoren gs-Antigen nachweisbar war. Wegen der niederen KBR-Titer, die allerdings mit denen anderer Autoren ubereinstimmen (87), wurden nach negativen Ergebnissen wiederholte Aufarbeitungen des gleichen Tumors gepruft. Die Qualitat der Ergebnisse war immer gleich (Tab. 13).

614 HEINZ BAUER

Versuch

Nr.

1

2

3

L

Tabelle 13 Test verschiedener Maus-Sarkome auf gs-Antigen

Turnoren

RVA2 RVA, RVA12 RVA,, RVA16 SR-A RVBZO RVP1 RVP, MC1 MC)

2 a e l L 16 2 16 L e l < 1 c1 <1

8 <1 - - 8 8 - < I < I - - b <1 - - 8 - C I -

- - - - e1 -

Tumor

RVA RVA,

RVA,2 R V A I4

RVA 16 S R - A

RVP, RVP, M C - I MC- 1

2. Ubertragbarkeit von Saugertumoren auf Hiihner In einer nachsten Versuchsserie pruften wir, ob sich die auf gs-Antigen

getesteten Mausetumoren auf Huhner ubertragen lassen, was als direkter Beweis fur das Vorhandensein des Virusgenoms in Saugertumorzellen gilt. In wiederholten Versuchen gelang dies nur mit solchen Saugertumoren, in denen auch gs-Antigen gefunden worden war (Tab. 14).

Der nicht iibertragbare Tumor RVP, wurde hinsichtlich der Aktivierung eines Virusgenoms besonders intensiv untersucht. Z. B. wurden RVP,-Zellen zunachst mit normalen virusempfanglichen Huhnerfibroblasten mehrere Tage kokultiviert, bevor das Zellgemisch in Huhner injiziert wurde. Die Vorstellung war dabei die, dai3 das in den RVP,-Zellen enthaltene Virusgenom in die Hiihnerzellen eindringe, und dai3 dort zunachst einmal ausreichend Virus gebildet werden sollte (133), das dann im Huhn einen Tumor hatte hervorrufen konnen. Obwohl das fur diesen Tumor verantwortliche P-RSV nicht defekt sein sol1 (65), gingen wir in anderen Versuchen dennoch von dieser Annahme aus und fuhrten die in vivo Kokultivierung mit AMV- oder RAV 50-infizierten Huhnerfibroblasten durch in der Hoffnung, dai3 eines dieser Viren eine Helferfunktion fur das P-RSV-Genom ubernehmen wurde (125). Alle diese Versuche verliefen negativ.

Die Ergebnisse der in den beiden letzten Kapiteln beschriebenen Ver- suchsreihen scheinen darauf hinzuweisen, dai3 in einem Teil der Tumoren, und zwar unabhangig vom Virusstamm, mit denen diese ursprunglich in Saugern hervorgerufen wurden, das Virusgenom entweder nicht komplett vorhanden oder aber teilweise in seiner Funktion gehemmt ist (Tumoren RVA,, RVP,, RVP,). Es mui3te allerdings auch mit der Moglichkeit gerechnet werden, dai3 die nicht auf das Huhn iibertragbaren und gs-Antigen-negativen Tumoren gar

Nachweis von Ubertragbarkeit Nachweis von virusspezif. gs - Antigen auf das Huhn Transplantationsantigen

+ + t

0 0 + + t b + + + + + + + + + d P + 0 0 + 0 0 6 0 0 0


lmmunisierender Tumor

RVA, RVA,

R V A l 2 RVA14 RVA16

RVP,

RVB20

R V P ,

MC- 1 MC- 8

nicht Rous-Virus-spezifisch sind, sondern ihre Entstehung einer anderen unbekannten Ursache verdanken. Die einzige Moglichkeit, dies zu iiberpriifen, sahen wir in dem Nachweis tumorspezifischer Transplantationsantigene (TSTA). Entsprechende Versuche werden im folgenden Abschnitt beschrieben.

Tumoren , mit denen auf Resistenr gepruft wurde

RVA, RVP, M C - I

lrnmunisierte Nicht lmmunisierte Nicht lmmunisierte Nicht Mause immunisierte Mause imrnunisierte Mause immunisierte

Mause Mause Mause

1 I 9 = 5 I 13 5 1 5 3 1 8 6 I 13 8 1 8

10 I 10 8 1 8 7 1 8 3 I 10 5 I 11 6 1 6

L I 9 L I 10 7 1 8 7 I 13 20 / 20 L I 9 17 I 18 10 I 10 10 / 10 L I 12 I I 16 7 1 I 3 1 9 3 1 8 5 1 5 8 1 8 5 1 5 2 I 16

10 I 10 7 1 7 8 i 10

3. Spezifitat der Transplantationsantigene in Rous-Tumoren Es ist ein Charakteristikum der tumorspezifischen Transplantationsanti-

gene von Virustumoren, daf3 sie sich in allen Tumoren derselben Virusatiologie immunologisch gleich verhalten, selbst wenn man Tumoren verschiedener Tier- spezies miteinander vergleicht (134). Dies trifft fur Tumoren, die durch DNS- Viren hervorgerufen wurden, ebenso zu wie fur Rous-Sarkome (91,92). Im letzteren Falle wurde dies an einer Reihe von SR-RSV induzierten Tumo- ren untersucht. Auf Grund dieser immunologischen Kreuzreaktion zwischen verschiedenen SR-RSV-Tumoren konnten wir uns darauf beschranken, die mit den verschiedenen SR-RSV-Tumoren immunisierten Mause gegen einen SR-RSV-Tumor auf Resistenz zu prufen. Da bisher aber nicht bekannt war, ob auch eine Kreuzimmunitat zwischen Rous-Tumoren besteht, deren Ent- stehung auf verrchiedene Rous-Virusstamme zuriickgeht, testeten wir SR-RSV- und P-RSV-Tumoren immunologisch uber Kreuz, d. h. von den Mausen, die mit den verschiedenen Rous-Tumoren immunisiert worden waren, wurde ein Teil rnit dem SR-RSV (RVA,)- und ein Teil mit dem P-RSV-(RVP,)-Tumor auf Resistenz gepruft. Aus Tabelle 15 ist zu ersehen, dai3 mit einer Aus- nahme (RVA,,) die Rous-Tumoren nicht nur gegen den Testtumor des gleichen sondern auch des verschiedenen Virusstammes immunisieren, d. h. SR-Tumoren immunisieren gegen den Prag-Testtumor und umgekehrt. Ein mit einem BRYAN-Stamm des RSV induzierter Tumor immunisiert ebenfalls gegen beide Testtumoren. Fur die Spezifitat der Ergebnisse sprechen die Kontrollversuche rnit zwei Methylcholantren-Tumoren. Diese beiden Tumoren enthalten ebenfalls tumorspezifische Transplantationsantigene, sie erwiesen sich aber weder immunogen noch immunosensitiv gegen Rous-Tumoren.

Wenn man von dem RVA,,-Tumor absieht, so enthalten also alle von uns untersuchten RSV-Tumoren RSV-spezifische Transplantationsantigene, womit die RSV-Spezifitat dieser Tumoren gesichert ist. Es ist noch nicht endgiiltig entschieden, ob der RVA,,-Tumor, der in anderenversuchen auch nicht gegen

0 Anzahl der Tumor-tragenden Tiere/Gesamtzahl n a h Zmonatiger Beobachtung

616 HEINZ BAUER

Versuch

1

2

3

den isologen Tumor immunogen wirkte, gar kein oder nur schwach wirksames TSTA enthalt. Dai3 Virustumoren nur schwach wirksame Transplantations- antigene enthalten konnen, wurde an einem Polyoma-Tumor demonstriert, in dem virusspezifische Transplantationsantigene nur durch komplizierte Immunisierungsmethoden nachgewiesen werden konnten (76).

Alter und Stamm lmmunisierung Anzahl der Mause Test -Tumor der Mause mit Tumor und

Gesamtzahl der Test -Dosis Mause

2 1 I 2 1 - STU Huhn- Muskulatur 20 I 20 S R - A

50 x DM a I Erwachsene) Huhn- Myeloblasten 4 1 7

Maus- SR - A - Zellen 6 I 13

12 I 12

Huhn- Plasma 10 I 10

Huhn- Milz 9 1 9

Huhn- Myeloblasten 11 I I4

- C 5 7 B l 1 6 RVP,

(Erwachsenel 50 x DM,OO

Maus - RVPJ - Zellen I I 16

9 1 9 Huhn- Plasma 7 1 7

AMV I I 12

10 I 10

Huhnerembryo- Fibroblasten 30 I 30

- STU S R - A

I Neugeborene) 5 DMlOO

-

4. Gruppenspezifitlt der Leukose-Virus-spezifischen Transplantationsantigene Aus den im vorigen Kapitel beschriebenen Versuchen geht u. a. hervor,

dai3 drei verschiedene RSV-Stamme, die sich in manchen biologischen Eigen- schaften, wie Defektivitat und Grad der Pathogenitat fur Saugetiere unterscheiden (30), virusspezifische Transplantationsantigene gleicher Antigenitat induzieren. Es war daher von Interesse, einmal zu untersuchen, ob AMV, das im Huhn eine andere Art von Zellen transformiert als das RSV, ebenfalls spezifische Transplantationsantigene induziert (1 73). Wenn das der Fall war, sollte deren Antigenitat mit der der Rous-spezifischen Transplantations- antigene verglichen werden.

Da wir solche Versuche aus methodischen Griinden in Mausen durch- fiihren wollten, versuchten wir zunachst, in diesen AMV-Tumoren hervorzurufen, um spater Mause mit isogenen AMV-transformierten Zellen immunisieren bzw. testen zu konnen. Dieses Ziel wurde jedoch bisher nicht erreicht, obwohl mehrere Hundert erwachsene und neugeborene Mause mit AMV unter Anwendung verschiedener Techniken infiziert wurden.

3 DM,,,, ist die Zelldosis, die in 100 O/o der Kontrolltiere einen Tumor hervorruft


D a der Mii3erfolg dieser Versuche moglicherweise darauf zuruckzufuhren ist, dai3 das verwendete AMV keine geeigneten Rezeptoren fur die Infektion von Mausezellen besitzt, injizierten wir den Mausen Huhnerzellen, die gleichzeitig mit AMV und RAV 50 infiziert worden waren. Von der Mischinfektion erhofften wir uns ein phenotypic mixing (79) der beiden Viren, d. h. Neu- synthese von Virus, dessen Genom vom AMV, dessen Hulle aber vom RAV 50 stammte. Von letzterem ist bekannt, dai3 es besonders gut Saugerzellen infiziert (73). Diese Versuche fuhrten jedoch ebenfalls nicht zu der gewunschten Tumor- bildung.

Aus diesem Grund verwendeten wir fur die Transplantationsversuche AMV-transformierte (Myeloblasten) bzw. infizierte (Fibroblasten) Huhner- zellen, sowie in Huhnermyeloblasten vermehrtes AMV. Um unspezifische Immunreaktionen zu erfassen, wurden Kontrolltiere mit vergleichbaren Mengen an normalen Huhnerzellen und Huhnerplasma aus virusfreien Huhnern immunisiert (15). In Tabelle 16 sind die Ergebnisse einiger Versuche dargestellt. Aus ihnen geht hervor, dai3 man Mause sowohl durch Vorbehandlung mit AMV wie auch mit AMV-transformierten Huhnermyeloblasten gegen ein spateres Oberimpfen mit Rous-Tumorzellen resistent machen kann. In nicht vorbehandelten und mit normalem Gewebe vorbehandelten Kontrolltieren entstanden bei gleicher Testdosis an Tumorzellen in annahernd 100 O/o der Falle Tumoren. Nach den Ergebnissen dieser Versuche induzieren also Huhner-Leukose-Sarkomatose- Viren gleiche,d. h. gruppenspezifische Transplantationsantigene.

Zur Klarung der in unseren Versuchen beobachteten Immunitat durch Myeloblasten bzw. AMV konnen mehrere Mechanismen in Erwagung gezogen werden. Die Immunitat durch Myeloblasten konnte darauf beruhen, dai3 diese Transplantationsantigene enthalten, die denen von Rous-Tumorzellen ahnlich sind, wodurch die Mause gegen Rous-Tumorzellen sensibilisiert werden. Es ware aber auch denkbar, dai3 die Myeloblasten wahrend der Oberlebenszeit von einigen Tagen in der Maus (2) AMV produzieren, das seinerseits eine Immunitat bewirkt. Die Immunisierung durch AMV konnte auf zweierlei Art geschehen. Entweder werden Mausezellen durch das Virus transformiert und in diesen virusspezifisches TSTA induziert, gegen das die Mause immunologisch reagieren. Man konnte sich aber auch vorstellen, dai3 das AMV an seiner Oberflache neben anderen Zellbestandteilen Transplantationsantigene aus Myeloblasten enthalt. Eine solche Moglichkeit wurde kurzlich auch von LINDEMANN und KLEIN im Falle eines Influenzavirus diskutiert, das in Ehrlich- Ascites-Tumorzellen vermehrt wurde (98). Weiterhin ware denkbar, dai3 das virushaltige Huhnerplasma, das zum Immunisieren verwendet wurde, TSTA in loslicher Form enthielt.

Die beiden letzteren Moglichkeiten wurden in einem Experiment gepruft, in dem Mause mit virusfreiem Plasma von kranken Huhnern ([AMVI- Plasma) oder mit nichtinfektiosen Virusteilchen immunisiert wurden. Letztere wurden durch Behandlung des AMV mit Hydroxylamin unter Bedingungen hergestellt, bei denen nach 14stundiger Behandlung die Fahigkeit des Virus, eine Virus-Neusynthese zu bewirken, vollstandig inaktiviert wird (67). Aus den Ergebnissen in Tabelle 17 geht hervor, dai3 weder virusfreies Huhner- plasma ([AMVI-Plasma) noch inaktiviertes AMV immunogen wirken. Es ist wahrscheinlich, dai3 letzteres durch Inaktivierung des Virusgenoms zu erklaren ist. Es kann aber andererseits nicht ausgeschlossen werden, dai3 die antigenen Eigenschaften von evtl. in der Virushulle enthaltenem TSTA durch Hydroxy- lamin verandert werden, obwohl keine antigenen oder morphologischen Ver- anderungen des AMV nach einer solchen Behandlung feststellbar sind (67).

Zbl. Vet. Med., Reihe B, Bd. 17, Heft 5 40

618 HEINZ BAUER

10 x DMlO0 50 x DMIOO

1 9 1 9 ' 9 1 9

0 Die Test-Tumoren SR-D wurden durch das geklonte SR-RSV-D induziert. b Anzahl der Tumor-rragenden Tiere pro Gesamtzahl der Mause.

Normales Huhner - Plasma (AMV 1 - Huhner - Plasma AMV - 50h HAb - behandelt AMV - ISh HA - behandelt AMV - O h HA - behandelt

erklfren, dai3 das AMV in Mausezellen die Synthese von TSTA bewirkt. Diese Zellen konnen auf Grund noch fehlender immunologischer Kompetenz der jungen Mause langer persistieren als dies in erwachsenen Mausen der Fall ware und daher einen starken immunogenen Reiz bewirken, der zur Immunitat der Mause fiihrt.

Es erhebt sich zuletzt die Frage, ob die TSTA mit einem der Virus- Struktur-Antigene identisch sind. Hierfur gibt es bisher keinerlei Anhalt. Gs-Antigen wurde nur in einem Teil der untersuchten Tumoren nachgewiesen, TSTA dagegen rnit einer Ausnahme in allen Tumoren. Ein Tumor ohne gs-Antigen (RVP,) war im selben Grad immunosensitiv wie ein Tumor rnit gs-Antigen (RVA,). Auch fur eine Identitat von V-Antigen und TSTA gibt es bisher keinerlei Hinweise. Weder konnten neutralisierende Antikorper in Mausen nachgewiesen werden, die als Neugeborene eine einmalige Virus- injektion erhalten hatten, noch ist es gelungen, mit einem dem SR-RSV-D serologisch verwandten Virus der Subgruppe B Mause gegen SR-D-Tumoren zu immunisieren (1 73).

L I 4 L I L L / 5 L I L 6 1 6 6 1 6 L I L L l h L 1 1 5 1 1

D. Abshliei3ende Betrahtungen Aufbau und Vermehrungsmechanismus eines Virus lassen keine Ruck-

schlusse auf dessen mogliche onkogene Eigenschaften zu. Dies wird besonders

lrnrnunisierung

Norrnales Huhner - Plasma

AMV in norm. Plasma suspendiert

Turnorzell- Testdosis ' 5 x DM,m 25 x DMIOO 125 x DM,,

L I L b 8 1 8 8 1 8

2 1 5 L I 10 12 I 12


augenfallig bei einem Vergleich der Hiihner-Leukose und Influenza-Viren. Nach den genannten Kriterien gehoren beide Virusarten zwar in eine Gruppe: Beide enthalten neben einer gruppenspezifischen Innenkomponente des Virion ein typspezifisches Hullantigen sowie als Genom eine einstrangige RNS; auch die Reifung erfolgt bei beiden Viren in ahnlicher Weise; dennoch bestehen hinsichtlich Pathogenitat erhebliche Unterschiede, da die Influenza-Viren uberwiegend cytocid, die Leukose-Viren aber hauptsachlich onkogen wirken.

Vergleicht man dagegen die Leukose-Viren mit den DNS-haltigen Tumorviren, wie SV 40, Polyoma- und Adenoviren, so findet man grundlegen- de Unterschiede in Struktur und Vermehrung, stoi3t aber auf interessante Parallelen beim Vergleich der Tumoren verschiedener Virusatiologie. Es sind vor allem drei Eigenschaften, die die meisten Virustumoren gemeinsam haben und die daher besonders bemerkenswert erscheinen. Einmal findet man in fast allen Virustumoren intrazellular gelegene virusspezifische Antigene, die allerdings verschieden lokalisiert sein konnen. Eine weitere Ahnlichkeit zwischen den verschiedenen Virustumoren besteht im Auftreten von tumorspezifischen Transplantationsantigenen, die fur die betreff ende Virusart bzw. Gruppe spezifisch und off enbar auch in verschiedenen Tierspezies immunologisch gleich- artig sind (134). Zuletzt sei darauf hingewiesen, dai3 in den verschiedenen Virustumoren von Saugetieren in der Regel kein Virus produziert wird. Man hat aber bei einigen DNS-Virus-Tumoren zeigen konnen, dai3 auch hier genau- so wie bei Rous-Sarkomen durch Kokultivierung mit geeigneten Zellen eine Virussynthese aktiviert werden kann (61, 123).

Aus diesem Vergleich kann man die Regel ableiten, dai3 Weiterbestehen und Wachstum eines Virustumors zwar keine permanente Virusproduktion voraus- setzen, jedoch an die permanente Funktion zumindest eines Teils des Virus- genoms gebunden sind. Man kann sagen, dai3 die Viruskrebszelle neue genetische Information hinzugewonnen hat, von der z. 2. noch nicht bekannt ist, welche ihrer Produkte direkt oder indirekt zur neoplastischen Trans- formation fuhren. Eine Antwort hierauf ist erst zu erwarten, wenn alle fur die Zelltransformatioii wichtigen Virusgenprodukte bekannt und charakterisiert sind. Da diese aber vor allem durch serologische Methoden entdeckt werden, stellt sich zumeist die Frage nach deren Identitat mit Virusstrukturantigenen.

Durch das anfangs vernachlassigte, in jungster Zeit aber intensivierte Studium von Struktur und Bestandteilen der einzelnen Tumorviren kam man der Losung dieser Probleme in letzter Zeit etwas naher. So wurden z. B. tumorspezifische Transplantationsantigene und gruppenspezifisches KB-Anti- gen in Row-Sarkomen bereits 1963 (.135) bzw. 1964 (87) entdeckt. Auf Grund unserer Untersuchungen kann man jetzt sagen, dai3 das gs-KB-Antigen ein Virusstrukturantigen und mit dem TSTA nicht identisch ist. Weiterhin zeigen unsere Versuche, dai3 das gs-KB-Antigen nicht unabdingbar ist fur die Per- sistenz eines Tumors, wahrend die TSTA, die nach unseren Versuchen fur die Leukose-Viren ebenfalls gruppenspezifisch sind, off enbar einen wesentlichen Bestandteil der Tumorzelle ausmachen und daher von besonderem Interesse sind. Die gelungene Isolierung des V-Antigens wird jetzt ermoglichen, auch dessen mogliche Funktion bei der Onkugenese zu studieren, und vor allem die Frage zu entscheiden, ob es als Transplantationsantigen fungieren kann. Da- neben sollte versucht werden, die TSTA aus der Tumorzelle zu isolieren, chemisch und physikalisch zu charakterisieren und sie mit normalen Zell- bestandteilen wie auch mit Virusstrukturantigenen zu vergleichen.

Neben diesen serologischen Problemen interessiert naturlich auch der Mechanismus der off enbar teilweisen Repression des Virusgenoms in der Tumorzelle. Das Verstandnis dieser Vorgange wird wahrscheinlich erleichtert

40"

620 HEINZ BAUER

werden, wenn man erst einmal den normalen Replikationsmechanismus der Virus-RNS in der Huhnerzelle kennt.

Aus diesen Ausfiihrungen geht hervor, dai3 in-vivo-, in-vitro- und physikalisch-chemische Untersuchungen am Virion in Zukunft Hand in Hand gehen mussen, wenn man den Mechanismus der Virusonkogenese verstehen lernen will. Abgesehen von den grundlegenden Erkenntnissen uber die Onkogenese, die man sich aus derartigen Untersuchungen verspricht, erhebt sich aber auch die Frage, welche Anwendungen sich daraus fur die Humanmedizin erhoffen oder bereits erkennen lassen.

Obwohl immer noch nicht entschieden ist, ob Viren auch im Menschen cancerogen wirken, gewinnt diese Frage in letzter Zeit immer mehr an Aktu- alitat. Das Argument, dai3 aus menschlichem Krebsgewebe bisher kein Virus isoliert worden sei, ist heute nicht mehr stichhaltig. Einerseits hat man in Knochenmark und Blut zahlreicher menschlicher Leukamie-Falle elektronen- mikroskopisch Teilchen nachgewiesen, die von Huhner- und Mause-Leukamie- Viren kaum zu unterscheiden sind (43, 70). Andererseits verdichtet sich der Verdacht immer mehr, dai3 das sogenannte menschliche Burkitt-Lymphom durch ein Virus verursacht wird (78). Den schwerwiegendsten Hinweis auf die Virusatiologie eines menschlichen Tumors stellen aber die Befunde von MOR- TON et al. dar. Diese Untersucher konnten aus einem menschlichen Tumor ein den tierischen Leukamie-Viren ahnliches Virus isolieren, das imstande ist, menschliche Zellen in vitro zu transformieren ( 1 84).

Die in vorliegender Arbeit beschriebenen Ergebnisse zeigen, ebenso wie die Untersuchungen zahlreicher anderer Autoren, dai3 man auf der Suche nach einem Tumorvirus neue Wege beschreiten mufl. Der Virusnachweis gelingt selbst in experimentellen Virustumoren oft nur indirekt und unter Anwendung besonderer Techniken, da ein Tumorvirus sich nach der Zelltransformation sozusagen eine ,,Tarnkappe uberziehen" und nur noch an einigen ,,antigenen Fuflspuren" erkennbar bleiben kann (127). Die Folgerung, die hieraus fur das Studium neoplastischer Tumoren des Menschen zu ziehen ist, ist einfach: Man suche die Fuflspuren des Virus. Hierfur zeichnen sich z. 2. mehrere Wege ab. Auf der Suche nach bereits bekannten Viren kann man menschliches Tumor- gewebe mit nunmehr zur Verfugung stehenden Antiseren gegen bekannte Virustumorantigene, z. B. das gs-Antigen der Huhner-Leukose-Viren, testen. Urn bisher unbekannte fur den Menschen onkogene Viren zu erfassen, sollte man untersuchen, ob sich durch Kokultivierung menschlicher Tumorzellen mit den verschiedensten Zellkulturen eine Virussynthese aktivieren 1ai3t. Dabei mui3 man nach unseren Erfahrungen mit Huhner-Leukose-Viren mit der Moglichkeit rechnen, dai3 die gesuchten Viren extrem instabil und nur schwa& immunogen sind. - Um bessere experimentelle Bedingungen zu schaffen, kann man schliei3lich versuchen, menschliches Tumorgewebe auf Tiere zu ubertragen, die sehr empfanglich sind fur Tumoren verschiedenster Genese. Derartige Experimente mui3 man geradezu fordern, wenn man liest, dai3 in 84O/o von 565 untersuchten menschlichen Seren Antikorper gegen das in Saugetieren onkogene Adenovirus Typ 18 nachgewiesen wurden (145).

Weitere interessante Aspekte fur die Humanmedizin ergeben sich aus den Ergebnissen uber die tumorspezifischen Transplantationsantigene. Im Unter- schied zu chemisch induzierten Tumoren sind die TSTA von Virustumoren virusspezifisch, d. h. Tumoren derselben Virusatiologie haben selbst in verschiedenen Tierspezies gleiche TSTA. Nach unseren Untersuchungen kann man sogar von gruppenspezifischen TSTA sprechen, da verschiedene Viren der gleichen Gruppe immunologisch gleiche TSTA induzieren. Da nun bereits Hinweise vorliegen, dai3 auch menschliche Tumoren neue Transplantations-

Untersuchungen der Hiihner-Leukose-Sarkomatose-Viren 62 1

antigene enthalten (136), stellt sich die hochst interessante Frage, ob man auch beim Menschen gleiche TSTA in verschiedenen Tumoren feststellen kann. Mit dieser Moglichkeit ware nach den heutigen Kenntnissen am ehesten zu rechnen, wenn sich herausstellen sollte, dai3 Viren als ursachliche Agentien fur menschliche Tumoren in Frage kommen. Die kiirzlich von HELLSTROM et al. ver- off entlichten Untersuchungen geben erste Hinweise in dieser Richtung. Diese Autoren konnten namlich zeigen, dai3 menschliche Tumoren gleicher Patho- logie gleichartige Antigene enthalten, gegen die der Organismus spezifische Antikorper bildet (1 82, 183). Damit eroffnet sich die Moglichkeit, anhand dieser TSTA Immuntherapie oder gar Immunprophylaxe zu betreiben.

Zusammenfassung Die Huhner-Leukose-Sarkomatose-Viren stellen eine Gruppe morpholo-

gisch einheitlicher und serologisch verwandter Viren dar. Sie unterscheiden sich vor allem hinsichtlich ihrer Pathogenitat in Vogeln und Saugetieren. In ihrer Struktur sind sie den Myxoviren ahnlich, aber von diesen morphologisch unter- scheidbar. Wie diese enthalten sie Zellbestandteile, deren Quantitat und Qualitat vom Wirtszelltyp bestimmt wird. Als virusspezifische Bestandteile konnten eine einzelstrangige hochmolekulare RNS, eine gruppenspezifische Innenkomponente sowie ein typspezifisches Hull-Antigen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von gruppenspezifischen Antiseren kann man die Ver- mehrung der einzelnen Leukose-Virus-Typen in Zellkulturen verfolgen. Wahrend Mechanismus und Lokalisation der Virus-RNS-Synthese in der Zelle noch unbekannt sind, konnen die Virusantigene im Cytoplasma nachgewiesen werden.

Aus Leukose-Virus-induzierten Saugetiertumoren wird in der Regel kein Virus freigesetzt. Dennoch kann durch Nachweis virusspezifischer Antigene und durch Obertragung auf das Huhn die Prasenz des gesamten oder teilweisen Virusgenoms in solchen Saugertumoren festgestellt werden. Van besonderem Interesse sind virusspezifische Antigene an der Oberflache der Tumorzellen, da sie sich unabhangig vom Leukose-Virus-Stamm und tumor- tragender Tierspezies serologisch gleich verhalten. Sie sind offenbar in allen Virustumoren enthalten und nicht identisch mit Strukturantigenen des Virus.

Die Bedeutung der an tierischen Virustumoren gewonnenen Erkenntnisse und Erfahrungen fur die Erforschung menschlicher Tumoren wird diskutiert.

Summary Studies on the structure, multiplication and oncogenic effect

of chicken-leucosis-sarcomatosis viruses These form a group of morphologically uniform and serologically related

viruses. They differ above all in their pathogenicity for birds and mammals. In structure they are similar to the myxoviruses but are morphologically distinguishable from them. Like the myxoviruses they contain cellular constituents, the amount and nature of which depend on the cell type of the host. Among the virus-specific constituents, it is possible to demonstrate a single- stranded R N A of high molecular weight, a group-specific internal component and a type-specific envelope antigen. With the help of group-specific antisera i t is possible to follow the multiplication of each type of leucosis virus in cell cultures. Although the mechanism and the site of synthesis of the RNA within the cell are still not known, the viral antigens can be demonstrated in the cytoplasm.

622 HEINZ BAUER

In general, no virus is set free in mammalian tumours induced by leucosis viruses but it is possible to identify the complete or partial viral genome in such tumours by the demonstration of virus-specific antigen and by transmission to the fowl. The virus-specific antigens on the surface of the tumour cells are of special interest because they behave in the same way serologically no matter what the virus strain may be or the species carrying the tumour. They appear to be contained within all virus tumours and are not identical with the structural antigens of the virus.

The significance of findings with animal tumours in relation to research on human tumours is discussed.

RCsumC Recherches sur la structure, la multiplication

et l’action oncogene des virus de la leucose-sarcomatose aviaire Les virus de la leucose-sarcomatose aviaire forment un groupe morpho-

logiquement uniforme, ayant une parent6 skrologique. 11s se diffkrencient avant tout par leur degrk de pathogknitk pour les oiseaux et les mammifhes. Par leur structure, ils ressemblent aux myxovirus, mais s’en distinguent par leur morphologie. Comme ceux-ci, ils contiennent des constituants cellulaires, dont la quantitk et la qualitk dkpendent du type de la cellule h6te. Parmi les constituants spkcifiques du virus, on peut mettre en kvidence un ARN A poids molkculaire klevk et monospiralk, une composante interne spkcifique du groupe, de m&me qu’un antighne de l’enveloppe spkcifique du type. A l’aide des antiskrums spkcifiques du groupe, on peut suivre en culture de cellules la multiplication de chacun des types de virus de la leucose. Alors que le mkcanisme et le lieu de la synthhse de 1’ARN viral dans la cellule sont encore inconnus, les antighes vireaux peuvent 2tre mis en kvidence dans le cytoplasme.

En gknkral, aucun virus n’est libkrk dans les tumeurs de mammifhres induites par le virus de la leucose. Mais on peut constater la prksence du gkn8me viral complet ou partiel dans de telles tumeurs, par la mise en kvidence des antighnes spkcifiques du virus et leur retransmission chez la poule. Les antigknes spkcifiques du virus la surface des cellules tumorales sont d’un intkrgt particulier, car ils se comportent skrologiquement de la m2me fagon, quelles que soient la souche du virus de la leucose et I’espkce animale atteinte de la tumeur. 11s se trouvent apparemment dans toutes les tumeurs virales et ne sont pas identiques aux antigknes de structure du virus.

On discute la signification des connaissances et expkriences faites sur les tumeurs animales pour la recherche sur les tumeurs humaines.

Resumen Estudios sobre la estructura, multiplicacibn

y acci6n onc6gena d 10s virus de la leucosis-sarcomatosis aviar Los virus de la leucosis-sarcomatosis de la gallina forman un grupo

virbsico con morfologia uniforme y serologia afin. Se diferencian, ante todo, en su patogeneidad en pijaros y mamiferos. En su estructura se parecen a 10s myxovirus, per0 son diferenciables de kstos por morfologia. Igual que ellos, contienen componentes celulares, cuya cantidad y calidad es determinada pot el tip0 de cklula anfitriona. Como partes integrantes especificas de virus se pudieron identificar un ARN polimolecular de cordbn hnico, un componente interno especifico de grupo, asi como un antigen0 de envoltura, especifico de tipo. Con ayuda de antisueros especificos de grupo se puede seguir la multiplicacibn de 10s distintos tipos de virus leucbticos en cultivos celulares.


Mientras que todavia siguen desconocidos el mecanismo y la localizaci6n de la sintesis virica del ARN en la cklula, se pudieron identificar 10s antigenos vorbsicos en ei citoplasma.

Como regla general, 10s tumores en mamiferos inducidos por virus de la leucosis no liberaban virus. Sin embargo, mediante la identificacibn de antigenos especificos de virus y por medio de inoculacibn a la gallina se pudo establecer la presencia de todo o parte del genoma vir6sico en tales tumores mamiferos. De interks especial son 10s antigenos especificos de virus en la super- ficie de las cklulas tumorales, ya que se comportan serol6gicamente igual, independientes de la estirpe del virus leucbtico y de la especie animal porta- dora del tumor. A1 parecer, se hallan contenidos en todos 10s tumores viricos y no son idknticos a 10s antigenos estructurales del virus.

Se discute la importancia de 10s conocimientos y experiencias adquiridas relativas a 10s tumores viricos animales para la investigacibn de 10s tumores humanos.

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