validasi metode anfar 2 2912
DESCRIPTION
fTRANSCRIPT
Fakultas Farmasi Universitas [email protected]
Prof. Dr.rer.nat. Mochammad Yuwono, MS. Apt
Validasi dan Verifikasi
Metode AnalisisKuliah Anfar II, FFUA, 2012
2
TUJUAN MATA KULIAH VALIDASI METODE
2
1
Pokok BahasanDefinisi, acuan dan klasifikasi validasi metode; Tahapan validasi metode analisis; Macam-macam parameter validasi, rumus, cara uji dan kriteria penerimaan validasi metode
Mahasiswa memahami prinsip dasar validasi metode dan mampu melakukan validasi metode analisis
Setelah Kuliah
3
Quality is important in every product or service, but it is vital in medicines as it
involves life.
ValidasiValidasi Proses Validasi Metode Analisis
Raw Materials
Production Process
Finished Products
Produksi Obat, Makanan, Kosmetik
Validated
Process
4Validated Analytical Method
Specification Testing
In Process Control
Product Specification
Testing
Analysis of Pharmaceutical Products
Physical testingChemical Testing
Microbiology testing
5
Active Pharmaceutical Ingredient (API)Pharmaceutical ProductsIntermediates, Packaging materials
• Identity• Purity• Strength• Other characteristics
ChecksValid analytical Method
Analisis Data & Laporan Hasil
Laboratory
Quality Assurance:
Preparasi Sampel dan Analisis Lab
ISO/IEC 17025:2008G L PPen
gemba
ngan
Meto
de Validasi/Verifikasi metode
Sampel
Prosedur Analisis
Penyediaan bahan dan Kualifikasi alat/instrumen
Metode Analisis Kimia
GC-MS GC-FTIR/MSLC-MS/MS LC-NMR
Hyphenated Instruments
Metode Analisis
Optimasi
Validasi
Implementasi (rutin)
Pengembangan
Revalidasi
Pre-validasi
R&D
(Andev)
QC
Metode StandarMetode yang dikembangkan dan
ditetapkan oleh suatu organisasi atau badan standardisasi nasional suatu negara
Metode standar diterima secara luasContoh metode standar:
ISO; ASTM (American Society for Testing Material); BSN (Badan Standardisasi Nasional)
Metode ResmiDipublikasi atau ditetapkan oleh
lembaga/pemerintah negara tertentuWajib digunakan oleh organisasi
pemerintah atau swasta untuk kesesuaian dengan peraturan/standar
Dirumuskan dan ditetapkan oleh suatu komisi atau badan hukum
Contoh: Farmakope (USP, BP, FI)
11
Kenapa perlu validasi metode?
1. Agar dihasilkan data yang ajeg dan terpercaya
2. Untuk memenuhi persyaratan GLP cGMP ISO 17025 FDA dll.
Menjamin mutu produk Dapat diterima oleh badan internasional
12
Definisi Validasi Metode (USP) Validation of an analytical method is the process by which it is
established, by laboratories studies, that the performance characteristics of the method meet the requirements for the intended analytical applications.
Term
inol
ogi
Verifikasi
Validasi
Kualifikasi
• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan sebelumnya
Kualifikasi instrumen:DQ, IQ, OQ dan PQ
• Suatu proses (percobaan laboratorium)• Untuk membuktikan bahwa laboratorium mampu menggunakan metode analisis baku/standar pada kondisi nyata di laboratoriumnya
Metode
Metode
Instrumen
Metode baku/Standar Compendial Method
(USP, FI, AOAC, ISO dll.)
Metode tidak baku Metode pengembangan Metode baku yang dimodifikasi Metode baku yang digunakan di luar lingkup
Verifikasi
Validasi
Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah yang dilakukan untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan yang sesuai dengan tujuan pengunaannya.
konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.1)
Verifikasi Metode Adopsi metode baku/standar Untuk membuktikan bahwa suatu laboratorium mampu melakukan analisis di laboratoriumnya untuk menunjukkan bahwa kinerja metode
dapat ditiru atau diulang oleh laboratorium yang bersangkutan dengan hasil yang sama
Panduan validasi metode analisis
ICH Q2A : Text on validation of analytical ProcedureICH Q2B Validation of analytical procedures
methodologyFDA-CDER (Center for Drug Evaluation and Research)a. Reviewer guidance validation of
chromatographic methodsb. Submitting sample and analytical data for
method validationc. Analytical procedure and method validation
for human studies d. Bioanalytical method validation for human
studiesUSP: Validation of compendial method
Contoh Acuan Verifikasi Metode
23
Kategori Metode Analisis
Metode analisis untuk identifikasi
Penetapan cemaran atau hasil Degradasi Penetapan kuantitatif (II a) dan uji batas/kualitatif (II b)
Penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif dalam sediaan farmasi
Penetapan karakteristik sediaan (disolusi, pelepasan obat, dll)
I
II
III
IV
24
Prosedur analisis
Pengambilan Sampel
Preparasi Sampel
Analisis
Evaluasi data dan pelaporan hasil
Validasi melibatkan
keseluruhan prosedur analisis
(mulai dari pengam-bilan sampel sampai pelaporan hasil
Permintaan Validasi
Literature searchTelaah karakteristik AnalitPenyiapan bahan dan alat
Pengembangan/optimasi Metode
Pembuatan protokol Validasi
Percobaan laboratorium sesuai
protokol validasi
Analisis DataPenyusunan Laporan Validasi
Penyerahan dokumen
Tahapan Validasi Metode
ValidasiMetode
Protokol Validasi/Verifikasi Metodologi atau prosedur bagaimana
percobaan atau pengujian parameter validasi direncanakan
Disusun secara rinci Penting dibuat sebelum pelaksanaan uji
parameter validasi Pelaksanaan validasi metode menjadi terarah
dan sistematis Disusun dalam format yang telah ditetapkan
Contoh Isi Protokol Validasi/Verifikasi Cover Halaman Pengesahan Ruang lingkup Tujuan Bahan dan Alat Aspek Keamanan lab Prosedur percobaan
akurasi presisi dll.
Kriteria keberterimaan Daftar Rujukan
28
Karakteristik kinerja metodeUSP and ICH
PresisiAkurasi
Batas DeteksiBatas Kuantitasi
Linearitas
Selektivitas/Spesifisitas
Rentang
Validasi Metrode
Robustness/RuggednessSystem Suitability Test
29
Akurasi dan Presisi Metode
Akurasi rendah Presisi tinggi
Akurasi tinggi Presisi tinggi
Akurasi tinggi Presisi rendah
Akurasi rendah Presisi rendah
Karakteristik kinerja metode (parameter validasi/verifikasi)
yang dibuktikan harus berdasarkan pada tujuan
kegunaan dan kategori metode tersebut.
31
USP Data Elements Required For Assay Validation
Analytical Performan
ceParameter
Assay Category 1
Assay Category 2Assay
Category 3Quantitati
ve Limit Tests
Accuracy Yes Yes * *Precision Yes Yes No YesSpecificity Yes Yes Yes *LOD No No Yes *LOQ No Yes No *Linearity Yes Yes No *Range Yes Yes * *Ruggedness Yes Yes Yes Yes* May be required, depending on the nature of the specific test.
32
ICH Validation Characteristics
Type of Analytical Procedure
Identification
Impurity testingAssayQuantitativ
e Limit Tests
Accuracy No Yes No YesPrecision Repeatability
No Yes No Yes
Interm. Prec. No Yes No Yes
Specificity Yes Yes Yes YesLOD No No Yes NoLOQ No Yes No NoLinearity No Yes No YesRange No Yes No Yes
1. Confirmation of Identity, a method that ensures a material is what it purports to be or confirms
the detection of the target analyte.2. Quantifying an analyte at a low concentration.3. Determining if an analyte is present above or below a 4. specified, low concentration (often called a Limit Test). The
specified concentration is close to the LOQ.4. Quantifying an analyte at a high concentration.5. Determining if an analyte is present above or below a specified, high concentration (often called a Limit Test). The specified concentration is substantially above the LOQ.6. Qualitative test.
Kategori Analisis
Percobaan Laboratorium pada Validasi Metode
Ketegaran(Robustness/Ruggedness)
1
2
3
4
Linearitas/Rentang; LOD dan LOQ
Presisi dan Akurasi
Uji Selektivitas/Spesifisitas
Uji terhadap senyawa pengganggu dari matriks, cemaran, hasil degradasi
38
Selektivitas vs. Spesifisitas
USP dan ICH menggunakan istilah Specificity
IUPAC dan AOAC menggunakan istilah Selectivity
AOAC: Specificity “highest selectivity”
Kuliah Anfar
II, 2008 FFUA
39
Specificity (ICH/USP)Specificity (USP/ICH): The ability to assess unequivocally the analyte in the presence of components to expected to be present, such as impurities, degradation products, and matrix components.
Selectivity describes the ability of an analytical method to differentiate various substances in a sample.
40
Spesifik dan SelektifSelektif:Mampu membedakan antara senyawa analit dengan derivat/degradan/ metabolit atau senyawa pengganggu lainnyaSpesifik:Mampu mengenal respons untuk analit tunggal/murni
41
Spesifisitas/Selektivitas:
Jika tersedia zat hasil degradasi:
Suntikkan:Blanko sampel/Placebo (Sampel minus analit)Zat Hasil degradasi (degradants)Zat yang memiliki struktur mirip (Related
substancesZat metabolit (untuk bioanalisis)
42
Spesifisitas/Selektivitas: Blanko sampel/Placebo
tidak menghasilkan peak/noda dengan waktu retensi/Rf yang sama dengan analit
Peak/noda analit terpisah dari peak/noda lainnya
(Rs ≥1,5)
42
Placebo
Sampel
(Rs ≥1,5)
Meloxicam dalam tablet (spektrofotometri UV/Vis)
45
Specificity/Selectivity:
Lakukan forced degradation studies (studi degradasi paksa)
Sampel disimpan pada suhu/kelembaban tertentu atau penambahan oksidator
Bandingkan profil pemisahan peak
sebelum dan sesudah perlakuan
Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)
46
Forced Degradation Studies
Heat Temperature (50 - 60 oC) Humidity Kelembaban (70 to 80%) Acid Hydrolysis HCl 0.1 N Base Hydrolysis NaOH 0.1 N Oxidation H2O2 (3 to 30%) Light UV/Vis
Spesifisitas: Uji kemurnian analit Menggunakan Detektor Diode array Teknik Spiking
Peak hasil spiking menunjukkan satu peak/noda dan memiliki tR/Rf sama
Pada TLC menggunakan sistem pengembang berbeda-
beda GC-MS LC-MS; LC-MS/MS
Contoh studi degradasi paksa (HPLC-DAD)
PENETAPAN KADAR PAROXETINE DALAM SEDIAAN TABLET
Overlay spectra UV - analit
Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine 20 mg
Condition Time (h)
% Recovery
RRT* of degradation products
Acid 0.1 N HC1, 80°C 50 98.0 None detected Base 0.1 , 80°C 50 96.5 1.65 Hydrogen peroxide 0.3%, 80°C
2 73.0 0.19, 0.22, 0.23, 0.27
0.31, 0.35, 0.39, 0.43 0.45, 0.49, 0.52, 0.55 0.59, 0.63, 0.71, 0.76 1.13, 1.36, 1.64
Heat dry, 80°C 72 99.2 None detected Heat wet, 80°C 72 96.2 1.65 Light dry, 1000 foot candles 144 99.5 None detected
Light wet, 1000 foot candles 144 80.3 0.17, 0.20, 0.23, 0.42
0.44, 0.55, 0.82, 0.88 1.13, 1.60
* RRT, relative retention time.
51
Spot Identity test: TLC Scan spektra in situ UV/Vis analit dan zat
standar Evaluasi korelasinya r > 0.999
[mv]
[nm]
52
Linearitas (Linearity)
Kemampuan suatu metode untuk menunjukkan hubungan secara langsung atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit.
A B C D
●
●●
●●
Respon alat
53
Linieritas
Melalui analisis statistik Linear Regression (y = mx + b) Correlation Coefficient (r), y-intercept (b), slope (m), residual sum of squares
Disarankan menggunakan minimum 5 macam konsentrasi analit
Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan dari sampel hasil pengenceran
Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran dan/atau larutan spike
2/122 })(){())((
1 yyxxyyxx
ri
ii
54
Evaluasi terhadap LinieritasRelative process standard deviation
(Vxo)Mandel’ testResidual testANOVA-linearity testingRSD of the Plot of response factor Vs.
concentrationXp value- Funk’s et al. r value Homogeneity of the linear-curve
55
Evaluasi Linieritas
i
iiY
YXO
xoXO
bxayN
yyS
bSS
XSV
ˆ , 2
ˆ where
%100
0.05 p and
2-N ffor factor student t t , 1
11. .Y
with.
11. . 2
22
2
P
2
2
iiXX
XXtableY
XX
PtableXOP
XN
XQ
QX
NtSa
QbYY
NtSX
Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear Vxo = koefisien variansi regresi linear
Vxo = <2-5%
Koefisien korelasi Nilai r ternyata TIDAK menjamin
linieritas respons dan konsentrasi Kurva non linier dapat memiliki r
yang tinggi Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r
tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5 rtabel = 0,878; n = 10 r tabel = 0,632
r membuktikan linieritas jika rentang tidak terlalu lebar dan r ≥ 0,999
Residual dan Least square
Makin kecil atau makin besar konsentrasi deviasi makin besar dikuadratkan dan diminimasi Least square
Oleh karena itu, respons harus memiliki varians yang sama (Homogeneity of variance = homoscedasticity)
Persamaan garis regresi koefisien korelasi r ≥ 0,999 Persamaan garis melewati titik 0,0 Intersep tidak berbeda secara bermakna dengan nol
lakukan uji t Slope berbeda secara bermakna dengan harga nol
lakukan uji t
Respons faktor = y/x
Uji Homogenitas digunakan untuk mengetahui
homogenitas varian pada persamaan garis regresi
Uji F menguji homogenitas batas atas dan bawah
Uji Cochran dan uji Barlett menguji keseluruhan titik pada rentang persamaan garis
61
62
Rentang (Range)
Interval antara konsentrasi terbesar dan terkecil dari analit dalam sampel
Memenuhi syarat dalam hal presisi, akurasi dan linieritas
Contoh soal
Kadar Vitamin B2
(µg/mL)
Area Vitamin B2
0,50 10,85673
1,01 16,84920
2,03 35,91708
5,08 83,20131
10,16 161,14166
20,32 322,53513
40,64 629,94366
r hitung = ????Persamaan garis regresi : ????Vx0 = ????
64
Minimum Specified Range:For Drug Substance & Drug product Assay
80 to 120% of test Concentration
For Content Uniformity Assay 70 to 130% of test Concentration
For Dissolution Test Method +/- 20% over entire Specification Range
For Impurity Assays From Reporting Level to 120% of Impurity
Specification for Impurity Assays
65
Uji Homogenitas kurva kalibrasi
Batas Deteksi
Batas Deteksi?
Batas Deteksi:Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi
67
Lowest amount of analyte in a sample that can be detected but not necessarily quantitated.
Estimated by Signal to Noise Ratio of 3:1.
Detection Limit (DL)
Lowest amount of analyte in a sample that can be quantified with suitable accuracy and precision.
Estimated by Signal to Noise Ratio of 10:1.
Quantitation Limit (QL)
68
Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)
1. Based in Visual Evaluations- Used for non-instrumental methods
2. Based on Signal-to Noise-Ratio- 3:1 for Detection Limit- 10:1 for Quantitation Limit
3. Based on Standard Deviation of the Response and the Slope menggunakan sampel konsentrasi rendah dapat digunakan SD dari residual; SD intrersep
70
Based on Signal-to Noise-Ratio
71
Based on the Standard Deviation of the Response and the Slope
where s = the standard deviation of the response ( SD of blank samples or SD of intercepts of regression line)S = the slope of the calibration curve
72
Akurasi
Biasanya dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)
Dapat dilakukan melalui pebandingan hasil analisis antara metode yang divalidasi dengan metode standar uji t harus tidak berbeda makna
Dapat dilakukan metode adisi standar terhadap blanko atau sampel.
73
Akurasi
Persen perolehan kembali (% recovery)
Persyaratan untuk assay validation = 98-102%
Dianjurkan menggunakan tiga macam konsentrasi masing-masing 3 kali replikasi
Adisi standar pada blanko/plasebo
%100Re% xyasesungguhnKadar
diperolehyangKadarc
74
KURVA AKURASI menurut Funk et. al.
- Untuk mengetahui ada atau tidaknya kesalahan sistematis, Dibuat kurva regresi antara Xf (konsentrasi analit hasil analisis) terhadap Xc (konsentrasi nominal analit)
Xf = af + bf. Xc
- Dihitung confidence range (Cr) dari intercept {VB(af)} dan slope {VB(bf)} dari recovery Pada p = 0.05
QxxXc
N1 . S . ta =aCr
2
yftableff
Qxx.Stb=bCr yftable
ff
2-N)]X-b+(a-[X
=S2
iffifyf
t = Student-t-factor f = N-2, P = 95 %.
75
M. Yuwono & G. Indrayanto, Validation method of Chromatography Methods of Analysis, Profiles of Drugs Substances, Excipients and Related Methodology, Vol. 32, Elsevier Academic Press, San Diego, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto. In Press (2005)
76
Analyte recovery at different concentration
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
Analyte Ingred. (%)
Analyte ratio Unit Mean recovery (%)
100 1 100 % 98-102≥ 10 10-1 10 % 98-102≥ 1 10-2 1% 97-103
≥ 0.1 10-3 0.1% 95-1050.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-1100.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-1100.000001 10-8 10 ppb 60-1150.0000001 10-9 1 ppb 40-120
Hitung berapa % recovery?% Bahan Aktif
terhadap klaim label dalam Tablet
Berat yang ditimbang (mg)
Berat tablet yang ditemukan (mg)
50 10,02 9,9810,02 9,9910,02 9,98
100 20,04 19,9920,04 19,9920,04 19,99
150 30,05 29,9730,05 29,9630,05 22,99
78
PresisiKedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen
Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)
Meliputi: - Repeatability - Intermediate Precision - Reproducibility
79
Repeatability
Kondisi sama pada interval waktu yang singkat
Satu larutan uji disuntikkan berkali-kali pada hari yang sama, alat yang sama, analisis serta kondisi lain yang sama.
Disebut juga Intra-assay precision
80
Intermediate Precision
Disebut juga “within-laboratory varia-
tions”.
Berbeda hari, atau analis, atau in-
strument (dalam satu laboratorium)
Sebagai bagian Ruggedness menurut
USP
81
Repeatability test at different labs.
Berbeda analis atau instrument dari
laboratorium yang berbeda
Reproducibility
82
Uji Presisi :Dianjurkan menggunakan 3 macam
konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120 % dari konsentrasi target
Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 replikasi
Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang berbeda dan analisis yang berbeda
Kriteria penerimaan: tergantung kategori analisis atau konsentrasi analit
Contoh: RSD < 2% (kategori I)
83
Analyte concentration vs precision
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)
100 1 100 % 1.3≥ 10 10-1 10 % 2.7≥ 1 10-2 1 % 2.8
≥ 0.1 10-3 0.1% 3.70.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.30.0001 10-6 1 ppm 110.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 210.0000001 10-9 1 ppb 30
Kurva Horwitz
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)
C adalah konsentrasi (fraksi desimal)
Misalnya : Untuk kadar C = 100% maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%
HORRAT = SBRobs/SBRcalc
Hitung presisinyaReplikasi Kadar Paroxetine
(mg/tablet)(Analis I)
Kadar Paroxetine (mg/tablet)(Analis II)
1 19,93 19,89
2 20,03 19,823 19,91 19,914 19,86 19,935 20,02 19,92
6 19,79 19,90
86
Definition: Capacity to remain unaffected by small variations in method parameters
Determination: Comparison results under differing conditions with precision under normal conditions Variations may include: stability of analytical
solution, variation of pH in a mobile phase, different column (lot/supplier), temperature, flow rate.
Robustness
87
Ruggedness
degree of reproducibility of test results obtained by the analysis of same samples
under a variety of conditions, such as different laboratories, analysts, instruments, different lot of reagents, days etc.
88
Re-Validation
“When sponsors make changes in the analytical procedure, drug substance, drug product, the changes, may necessitate revalidation of the analytical procedures.”
“The degree of revalidation depends on the nature of the change.”
Terima Kasih!