vienas ŠŪnas kultŪra protoplastu kultŪras

2005. gada 14. aprīlis

9. lekcija

VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA

PROTOPLASTU KULTŪRAS


9. lekcija

9.1. VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA 9.1. Vienas šūnas kultūras teorētiskā jēga

Atsevišķa somatiskā šūna kalpo kā modelis, lai pētītu šūnas un apkārtējās vides savstarpējās attiecības, attiecības ar saimniekaugu, ar dažādiem patogēniem aģentiem;lai pētītu šūnas uzbūvi,diferenciāciju un dediferenciāciju,bioķīmiju, augstāko augu ģenētiku, u.c.


9. lekcija

Vienas šūnas klonu iegūšana sastāv no 2 etapiem:

dzīvotspējīgas vienas atsevišķas šūnas izolēšana,

apstākļu kompleksa nodrošināšana šīs šūnas normālai attīstībai un dalīšanās procesam.


9. lekcija

Metodes šūnas izolēšanai:

kallusa iegūšana ar sekojošu suspensiju kultūru radīšanu, kas sastāv no atsevišķām šūnām un nelieliem to

agregātiem, atsevišķo šūnu izolēšana tieši no veselu augu audiem.Kā iegūt atsevišķas šūnas no kallusa, aprakstīts, iegūstot

suspensiju kultūru.


9. lekcija

Pirmais mēģinājums iegūt vienas šūnas audzēšanu sterilos apstākļos, veikts 1902.g. (Haberlandt). Toreiz

tika izmantoti 3 dažādi augi, bet šūnas izdzīvoja tikai 15 dienas Knopa barotnē ar 1-5% saharozi, mazliet

palielināja izmērus, bet nedalījās. Vēlākajos mēģinājumos zinātnieki uzlaboja barotnes

sastāvu. 1959.g. Kohlenbach mēģināja audzēt Macleya cordata mezofila šūnas White barotnē, papildus

pievienojot 2,4-D un kokosriekstu pieniņu.


9. lekcija

Ball un Joshe (1963, 1965) konstruēja speciālu kameru šiem mērķiem.

Viņu eksperimentu objekts – Arachis hypogaea dīgļlapju mezofila šūnas.

Šai kamerā autori novēroja citoplazmas kustības, šūnas tilpuma palielināšanos.

Pēc 14 dienām no vienas šūnas ieguva 30 šūnas. Hloroplasti tajās zaudēja zaļo krāsu, bet palielināja

izmērus. Līdzīgus rezultātus šie zinātnieki ieguva ar Aster, Erogeron, Gaillardia un Oenothera lapu šūnām.


9. lekcija

Lai audzētu vienu šūnu in vitro, ir vairākas metodes, ko varētu iedalīt 3 grupās:

kultūras-“aukles” metode, mikrokultūras metode,

pleitinga metode – kultivēšana Petri platītēs uz agarizētas barotnes.


9. lekcija

Kultūras-“aukles” metode

Atsevišķas šūnas, kas izolētas ar adatu, cilpu vai mikropipeti no kallusa vai suspensiju kultūras, tiek pārvietotas uz sterila filtrpapīra kvadrātiņiem (apmēram 8x8 mm).

2-3 dienas pirms šūnu izolēšanas filtrus aseptiski novieto virs kallusa-“aukles” audiem, no kuriem izolēs šūnu (vai no līdzīga kallusa). Šāda pirmsapstrāde nepieciešama, lai filtrs samitrinātos un tajā absorbētos barības vielas no “mātes” kultūras.


9. lekcija

Pēc šūnas izolēšanas to novieto uz filtrpapīra un to savukārt virs kallusa audiem atpakaļ.

To veic ļoti ātri, lai šūna nežūtu. Šī izolētā šūna nekontaktē ar kallusa šūnām, un tomēr difūzijas ceļā caur filtra barjeru saņem no tām barības

vielas un faktorus, kas inducē šūnu dalīšanos. Kallusam-“auklei” novecojot, filtru ar šūnu vai šūnu kolonijām pārvieto uz jaunu kallusu. Jebkurā laikā šo filtru var palikt zem mikroskopa un pārbaudīt šūnu

dzīvotspēju. Ap 8% šūnu, ko ieguva šādā veidā, dalījās.


9. lekcija

Kolonijas, kas sasniegušas 4 mm diametru, pārnes uz agarizētu barotni.

Atkarībā no augšanas tempiem, pēc 2-4 nedēļām koloniju sadala un pārnes uz jaunu barotni kā vienas

šūnas klonu. Viena no pirmajām kultūrām, ko šādā veidā pavairoja,

bija saulespuķe Helianthus annuus; tā auga gan uz saulespuķes, gan uz margrietiņas kallusa.

Margrietiņas vienas šūnas kultūra auga tikai uz sava kallusa – 11,5 mēnešus jeb 11 pasāžas, pēc tam to

pārnesa uz agarizētu barotni.


9. lekcija

Literatūrā aprakstīti labi rezultāti, ja filtrpapīra gabaliņus ar izolēto šūnu novietoja uz agarizētas

(0,6%) barotnes, kas saturēja rauga ekstraktu, apkārt kallusa audiem vai arī otrādi – ja kallusa

audi bija apkārt. Tas varētu būt tāpēc, ka jaunākās un dzīvākās

kallusa šūnas veidojas tieši malās.Ar šo metodi iegūtas daudzu taksonu vienas šūnas kultūras, bet plašu pielietojumu tā nav

iemantojusi.


9. lekcija

Mikrokultūras metode

Šīs metodes priekšrocība ir iespēja veikt ilgstošus novērojumus zem mikroskopa, kā šūna aug un attīstās.

Šī metode atļauj arī mikrokultūras filmēšanu. Uzsākot kultūru, šūnu suspensiju atšķaida Petri platītē, un no tās ar sterilu mikropipeti uzsūc šķīduma pilieniņu

ar vienu šūnu. Tad to ievieto speciālā kamerā vienā pilienā barības šķīduma, kam apkārt ir minerāleļļa.

Darbību veic zem mikroskopa.


9. lekcija

Līdz 80.-iem gadiem bija konstruētas 4 dažāda tipa mikrokameras. Šīs kameras atšķiras pēc šķīduma

novietojuma: 1) - karājošā pilienakarājošā piliena princips,

2) – sēdošā pilienasēdošā piliena, 3) kamera ir no speciāla stikla ar plānām sieniņāmspeciāla stikla ar plānām sieniņām,

kas sevišķi izdevīgi pastāvīgiem novērojumiem zem mikroskopa un

4) – perfūzāsperfūzās kameras. Pēdējām ir divas atveres, kas noslēgtas ar

priekšmetstikliņiem; tas dod iespēju periodiski mainīt barības šķīdumu.


9. lekcija


9. lekcija

1. Izsēšanas metode

Suspensiju kultūru, kas sastāv no atsevišķām šūnām, sajauc ar 35-40º C agarizētu barotni, kas šajā

temperatūrā ir šķidrā veidā un izlej Petri platītēs 1 mm plānā slānī.

Lai novērstu barotnes izžūšanu un inficēšanos, platītes aizlīmē ar tam paredzēto līmlentu.

Suspensijas iegūšanai no atsevišķām šūnām izmanto divkāršo suspensiju filtrēšanu aseptiskos apstākļos ar

atšķirīgu filtru poru diametru. Eksistē arī savādākas izsēšanas metodes.


9. lekcija

2. Plāksnītes-kopijas metode

Tā pamatojas uz šūnu augšanu caur sietiņu. Pirmo reizi šī metode tika lietota

mikroorganismu replikācijai (Lederberg, Lederberg, 1952),

bet augu šūnu kultūrai to pirmo reizi modificēja Schulte un Zenk (1977) objektam Morinda

citrifolia.


9. lekcija

Standarta barotnei pievienoja 60% barotnes ar

8-dienu vecu Morinda citrifolia kultūru. Izsēšanas blīvums bija 3600 šūnu/ml. Lai

replikācija būtu veiksmīga, izsējas blīvumam jābūt minimāli 1500 šūnu/ml.


9. lekcija

Kad šūnas šādā veidā bija augušas 14 dienas, Petri platītē (tās diametrs – 8,3 cm)

ievietoja sterilu neilona sietiņu (8,1 cm diametrā, 15-20 pavedieni uz 1 cm2) tā, lai tas būtu ciešā kontaktā ar agarizēto barotni un neveidotu

krokas. Pēc 20 dienām sietu noņēma un pārvietoja citā Petri

platītē ar jaunu agarizētu barotni, uzliekot otrādi – ar augšpusi uz leju.

Tādā veidā šūnas no plāksnītes-saimnieka pārnes uz plāksnīti-kopiju.


9. lekcija

Sekmīgas replikācijas nodrošināšanai liela nozīme ir sieta īpašībām:

atvēruma izmēriem; siets nedrīkst locīties,

tam jābūt arī pietiekoši smagam, lai kontaktētos ar barotnes virsmu,

tam jāiztur 60 min. autoklāvēšana 120º C režīmā, jābūt ķīmiski inertam,

sieta šķiedras nedrīkst uzsūkt barības vielas, un kopumā tas nedrīkst ietekmēt šūnu dzīvotspēju.

Sieta caurlaidību izvēlas atkarībā no kultivējamo šūnu izmēriem.


9. lekcija

Metode piemērojama, lai atlasītu šūnas un kolonijas, kas

iegūtas no protoplastiem, mutantiem,

kā arī tādu šūnu atlasei, kas pastiprināti sintezē sekundāros metabolītus.


9. lekcija

Izsēšanas efektivitātes paaugstināšana Izmantojot izsēšanas metodi uz agarizētas

barotnes, var veidoties situācija, ka kloni var attīstīties no dažādām šūnām. Tas nozīmē, ka

liela nozīme ir filtrēšanas precizitātei.


9. lekcija

Pētot atšķirības starp vienas šūnas kloniem, kas iegūti no Haplopappus gracilis un

Daucus carota ar izsēšanas metodi, konstatēja, ka, lietojot burkānu suspensijas filtrēšanai marli, ieguva 80% vienādu šūnu,

bet lietojot zīda audumu – 90%; Haplopappus gracilis attiecīgi – 25%

un 30%.


9. lekcija

Šūnu kolonijas nedrīkst sastāvēt vairāk kā no 2-4 šūnām. Šīs šūnas dalās un attīstās ātrāk nekā

atsevišķās šūnas, kas apgrūtina darbu. Un, protams, kā visos darbos ar audu kultūrām,

ļoti būtiska nozīme ir barotnes sastāvam, kas katrā atsevišķā gadījumā būs savādāks. Viena un

tā paša auga, to pašu šūnu kultivēšanas barotnes atšķirsies pat tādā gadījumā, ja nebūs vienāds

izsēšanas blīvums: jo blīvāka suspensija tiek izsēta, jo barotnei var būt vienkāršāka receptūra, un otrādi –

jo izsējas blīvums būs mazāks, jo pieaugs nepieciešamība pēc sarežģītākas barotnes sastāva .


9. lekcija Koblitz barotne šūnu kultūrām (sastāvs tuvināts kokosriekstu pieniņam),

devas tabulā dotas mg.L-1

Minerālsāļi pēc Hellera recept. Glicīns 2,7 Biotīns 0,01

Saharoze 20000 L-metionīns 0,05 Holīns 10,0

Agars 7000 L-histidīns 0,05 Folijskābe 1,0

Giberelskābe 0,05

L-oksiprolīns 1,2 Mezoinozīts 20,0

IES 0,1 L-lecitīns 5,0 Nikotīnskābes amīds 0,5

L-alanīns 29,7 L-lizīns 2,0 Ca pantotenāts 0,1

γ-aminosviestskābe 26,0 L-fenilalanīns 0,05 Tiamīna hlorīds 0,1

L-arginīns 3,1 L-prolīns 1,9 Riboflavīns 0,1

L-asparagīns 3,8 L-serīns 12,8 Kobalamīns 0,0015

L-asparagīnskābe 1,7 L-treonīns 4,1 Askorbīnskābe 0,1

L-glutamīns 0,3 L-tirozīns 0,05 ...

L-glutamīnskābe 15,7 L-valīns 2,3


9. lekcija

Ar atsevišķiem objektiem izpētīts, ka kultivēšanas efektivitāti var palielināt, paaugstinot CO2

koncentrāciju atmosfērā kultivējamā kamerā, kur novietotas Petri platītes, līdz 1%.

Atmosfēras sastāvu šai kamerā iespējams regulēt un kontrolēt. Tas veicina ne tikai izsēšanas efektivitātes paaugstināšanu (atsevišķos eksperimentos sēšanas

blīvums 500 šūnu/ml bija pietiekams), bet arī samazina rezultātu variabilitāti, kas šādos pētījumos mēdz būt

diezgan liela.


9. lekcija

Piemērs kartupeļu šūnu kultivēšanai(Birgit Berndt)

Šķidrā barotne ar šūnām, slāņa biezums 1 mm

Agarizētabarotne


9. lekcija

9.1.2. Vienas šūnas klonu selekcija

Šūnu izsēšana uz agarizētas barotnes ir būtiska metode vienas šūnas klonu fizioloģiskiem un

ģenētiskiem pētījumiem.


9. lekcija

Uz Petri platītes ar ~ 1 mm agarizētas barotnes slāņa Uz Petri platītes ar ~ 1 mm agarizētas barotnes slāņa uzsētas šūnas, no kurām veidojas šūnu kolonijas,uzsētas šūnas, no kurām veidojas šūnu kolonijas,kallusskalluss

selekcija

Iespējama apstrāde ar ķīmiskiem reaģentiem un 1 šūnas klona atlase


9. lekcijaŠo klonu izolācija parādīja kallusu un suspensiju kultūru heterogenitāti. Vienas šūnas kloni atšķiras pēc

auguma, struktūras,

krāsas, spējām izmantot barotnes komponenetus, pēc

diferenciācijas, organoģenēzes potencēm, kā arī pēc dažādu

savienojumu biosintēzes spējām. Šīs šūnas var atšķirties arī ar ploiditāti. Piemēram, bija iegūti atšķirīgi Atropa

beladonna kloni, respektīvi, kam bija dažāds augšanas ātrums, prasība pēc barības elementiem; kas atšķīrās pēc

hloroplastu struktūras un daudzuma, u.c.


9. lekcija

Lai atlasītu klonus, var veikt iepriekšēju suspensijas apstrādi ar mutagēnām vielām, antimetabolītiem,

paaugstinātām sāļu devām, dažādiem fiziskiem faktoriem, kā

radiācija, paaugstināta vai pazemināta temperatūra, atšķirīgs gaismas spektrālais sastāvs un

intensitāte.


9. lekcija

Šūnu kultūrās var rasties kloni ar vēlamām īpašībām, un šos klonus iespējams atlasīt un

pavairot, veidojot izturīgu šūnu līnijas. Piemēram, Eriksson jau 1967.g. tādā veidā ieguva Haplopappus gracilis ar augstu antociānu saturu

apstrādē ar ultravioleto starojumu. Carlson (1973) izdalīja tabakas šūnas, kas ir izturīgas

pret metionīn-sulfoksamīdu un ieguva reģenerantus, kas savukārt ir izturīgas pret patogēnu Pseudomonas tabaci.

Iegūti vienas šūnas tabakas kloni, kam piemīt dažāda izturība pret vīrusu vairošanos šūnā.


9. lekcija

Rezumējot izklāstu, kallusa kultūru, suspensiju

un vienas šūnas kultūru pielietojums kalpo noteiktu īpašību pastiprināšanai un vienas

šūnas klonu atlasei ar šīm īpašībām, respektīvi,

selekcijai selekcijai in vitroin vitro. Gala rezultāts nav tikai teorētisks, tam ir liela

komerciāla nozīme.


9. lekcija

9.2. PROTOPLASTU KULTŪRASPROTOPLASTU KULTŪRAS

Protoplasts ir šūna (precīzāk – šūnas daļa)

bez šūnapvalka.

Lai veidotu protoplastu kultūras, no šūnapvalka atbrīvojas fermentatīvā ceļā.


9. lekcija

Protoplastu kultūru metode ir viena no visperspektīvākām metodēm ģenētikā, fizioloģijā, virusoloģijā un molekulārā

bioloģijā. Pateicoties protoplastu spējai ieņemt sevī makromolekulas un organellas, iespējai

protoplastus sapludināt un sekojoši inducēt meristematisko aktivitāti, bet gala rezultātā iegūt veselu reģenerantu, - šī metode ideāli noder augu

šūnas modifkācijai un gēnu inženierijai.


9. lekcija

Lai risinātu ģenētikas jautājumus, protoplastu kultūras lieto:

somatisko hibrīdu iegūšanaisomatisko hibrīdu iegūšanai no attāli radniecīgiem vecākiem, kas krustojot nedod

dzīvotspējīgus pēcnācējus, jaunas augu daudzveidības iegūšanaijaunas augu daudzveidības iegūšanai

transgenozā ceļā, ievadot protoplastā svešu gēnu vai tā daļu,

neuzņēmības radīšanaineuzņēmības radīšanai pret dažādām slimībām, ievadot protoplastā to genoma daļu, kas atbild par

izturību pret vienu vai otru patogēnu, u.c.


9. lekcija

Tā kā protoplastiem nav apvalka, tajos vieglāk iekļūst fizioloģiski aktīvās vielas, un mums rodas iespēja

novērot primāro augu šūnas reakciju uz tām.

Lieto arī savienojumus ar iezīmētiem atomiem, kas ļauj pētīt to metabolismu kontrolējamos apstākļos.

No protoplastiem iespējams izdalīt dzīvus un normāli funkcionējošus organoīdus bioķīmiskiem un

fizioloģiskiem eksperimentiem.

Tā kā protoplastiem šunapvalks atjaunojas nosacīti īsā laikā, tad ir ērti izsekot, kā veidojas celulozes fibrillas.


9. lekcija

Tomēr nevar teikt, ka protoplasts pēc savām īpašībām ir identisks šūnai, tikai bez apvalka.

Lai kultivētu protoplastus, bieži ir vajadzīgi citi apstākļi un fizioloģiski aktīvās vielas nekā

kultivējot atbilstošo šūnu kultūru. Ir izteikta hipotēze, ka, izolējot protoplastus, tiek zaudēta arī daļa plazmolemmas (Prevot, 1977).

Tādējādi var tikt zaudēta arī daļa aktīvo komponentu, piemēram, inhibitoru. Tas

acīmredzot traucē normālu diferenciāciju.


9. lekcija

Protoplastus var iegūt no dažādu audu šūnām. Iegūšanas metodes bija divas –

mehāniskā un fermentatīvāmehāniskā un fermentatīvā.

Lietojot mehānisko metodi, vispirms izraisīja plazmolīzi un pēc tam izgrieza šūnu. Šī metode bija ļoti darbietilpīga un mazefektīva, tādēļ tā tika maz

lietota. Fermentatīvo metodi pirmo reizi pielietoja Cocking

(1966).


9. lekcija

Šūnapvalka sadalīšanai lieto vienu vai vairākus fermentus, kā celulāzi un pektināzi, to preparātus.

Populārākie celulāzes preparāti ir “Onozuka” P-3000,

P-1500, R-10,

“Meicelase P”, driselāze;

pektināzes preparāti – “Macerosyme R-10”, “Pectinase”,

“Pectinol R-10”.


9. lekcija

Fermentus pirms lietošanas sterilizē filtrējot vai nu ar Millipore (poru diametrs 0,45 m) vai ar stikla filtru

3G5. Fermentu veidu, sastāvu un koncentrāciju piemeklē empīriskos eksperimentos katrai augu dažādībai un audu

veidam atsevišķi. Piemēram, lai izdalītu protoplastus no lapām, saknēm un

veidotājaudiem, varētu lietot “Onozuka R-10” un “Macerozyme R-10” maisījumu, katru 0,1-0,2%

koncentrācijā, bet lai izdalītu protoplastus no ziedlapiņām un augu šūnu

kultūrām – “Driselase” 0,5-5% koncentrācijā.


9. lekcija

Protoplastu izdalīšana

Protoplastus var izdalīt kā no in vitroin vitro, tā no in vivoin vivo augiem.

Piemēram, in vivo augoša auga lapu serilizē, atdala epidermu un novieto tādā pašā stāvoklī mazā Petri

platītē ar plānām sieniņām, lai būtu ērta novērošana caur binokulāro stereoskopisko mikroskopu.


9. lekcija

Platītē ir barības šķīdums, kam pievienots osmolītiķis un vajadzīgie fermenti. Kā barības

vielu, tai skaitā cukuru, kvalitatīvo un kvantitatīvo saturu, tā arī nepieciešamos

fermentus, to koncentrāciju un ekspozīcijas laiku, nosaka empīriskos izmēģinājumos katram

taksonam, tā orgānam un audu veidam atsevišķi.


9. lekcija

Piemērs Piemērs barotnei barotnei

protoplastu protoplastu izdalīšanaiizdalīšanai

(ekspozīcija 17 h tumsā,autori

E.Firoozabady, D.L.DeBoer,

obj. Gossypium hirsutum un G. Barbadense 3 ned. vecu augu jaunās lapas)

Receptūra/ vielasReceptūra/ vielas

Daudzums uz 1 l Daudzums uz 1 l barotnes barotnes (15 ml šķīd. (15 ml šķīd. uz 1 g svaigiem uz 1 g svaigiem audiemaudiem))

Makro-un mikroelementi MS

Vitamīni (Uchimiya, Murashige) UM (tiamīns 5x devā)

Celulizīns 1 %

Macerāze 0,5 %

Mezoinozīts 400 mg

2,4-D 0,5 mg

NES 1 mg

BAP 0,25 mg

Kinetīns 0,25 mg

Mannitols 7 %

Glikoze 2 %

CaCl2 10 mM

pH 5,7


9. lekcija

Ja fermentus pievieno lielākā koncentrācijā, protoplastu izdalīšanās ir ātrāka, bet var tikt

bojāta citoplazma. Ja nav speciāla nepieciešamība pēc gaismas, tad

Petri platītes ievieto siltumā un tumsā, kas samazina šūnu un protoplastu stresu, un līdz ar

to arī palielina to izdzīvotību.


9. lekcija

Kad izdalījušos protoplastu daudzums ir pietiekams (zem mikroskopa var veikt arī skaitīšanu), tos kopā ar

šķīdumu “atmazgā” no fermentiem. Vispirms suspensiju nolej un filtrē caur sietu, lai

atbrīvotos no nevajadzīgām auga daļām, tad centrifugē. To veic vairākas reizes, noņemot vajadzīgo frakciju un

tai pievienojot svaigu barības šķīdumu ar kādu no cukuriem vai to maisījumu osmolītiskā koncentrācijā.

Tas nepieciešams, lai protoplasts saglabātu apaļo formu, lai tas neizjuktu.

Centrifugēšanai jānotiek ļoti maigā režīmā, kā, piemēram, 100 g 1 minūtē (literatūras dati).


9. lekcija

Apskatīsim vienu piemēru. Sterilu krizantēmu lapu ar asu skalpeli sagraiza, kā parādīts

zīmējumā, un novieto Petri platītē ar iegriezto pusi uz šķīduma virsmas.


9. lekcija

Šeit ir arī neliels “āķis”: no tādām lapām, kas nepeld pa šķīduma virspusi,

bet atrodas šķīdumā, protoplasti neizdalās. Konkrētajā gadījumā bija vajadzīgs šāds šķīduma

sastāvs: 1% “Onozuka R-10”,

0,4% dreiselāze, 0,5 mol.L-1 saharoze, 5 mmol.L-1 CaCl2.


9. lekcija

Kultūru ievieto tumšā kamerā. Pēc 3 stundām3 stundām ar Pastēra pipeti ņem šķīdumu un

laiž cauri 2 sietiem (kaprona sietus sterilizē autoklāvējot tādā režīmā kā barotnes absolūti

plakanā gludā veidā). Vispirms ņem sietu, kam poru diametrs 1000 µ, tad otru - ar poru diametru

100 µ. Beigās pāris pilienu liek uz priekšmetstikliņa un skatās invertētā

mikroskopā.


9. lekcija

Centrifugēšana: Pirmā reize: 0,5 mol.L-1 saharoze,

centrifugēšana 1000 apgr./1 min.Otrā un trešā reize: 0,5 mol.L-1 saharoze + MS barotne

ar modifikācijām, centrifugēšana 700 apgr./3 min.

Dotais variants bija labākais no izmēģinātajiem, kaut gan tas atšķiras no klasiskajiem (piemēram, ar

centrifugēšana) (piemērs par krizantēmām ņemts no G.Jakobsones izmēģinājumiem 1986.g. Maskavā).


9. lekcija

Protoplastu kultivēšana

Pēc tam protoplastus izsēj Petri platītēs, parasti šķidrā barotnē, lai tos mazāk bojātu. Dzīvu protoplastu

stāvoklis nevar saglabāties ilgi – ja tie izdzīvo, tie veido šūnapvalku un dalās. Tādēļ šis ir brīdis, lai veiktu

dažādas manipulācijas ar protoplastiem.


9. lekcija

Protoplastu kultūrasProtoplastu kultūras

Protoplasts ir šūna bez šūnapvalka. Šīs kultūras pastāvēšana ir īslaicīga, jo dzīvotspējīgie protoplasti visai drīz veido apvalku, sāk dalīties un veido šūnu grupas.


9. lekcija

Piemērs protoplastu kultivēšanas sākuma

barotnei.

Šūnu sieniņu reģenerāciju konstatē ar krāsošanu ar Calcofluor

White pēc Galbreith (Physiol.Plant.

1981,53:111-116).(vitamīni: Plant

Physiol.1974,54: 936-944)

Receptūra/ vielasReceptūra/ vielas Daudzums 1 l Daudzums 1 l barotnesbarotnes

MS neorgan. sāļi, modificēti, īpaši > CaCl2, vitamīni UM

mezoinozīts 400 mg

mannitols 7 %

glikoze 2 %

galaktoze 0,3 %

BAP 0,2 mg

kinetīns 0,2 mg

2,4-D 0,5 mg

NES 1 mg

zeatīns 1 mg

glutamīns 1 mM

pH

~ ~ ~ ~


9. lekcija

Kad veidojas šūnas un šūnu agregāti, tos izsēj uz agarizētas barotnes. Tādā veidā var labāk izsekot vienas

šūnas kolonijas attīstībai. Protoplastus parasti tur kamerā ar augstāku temperatūru

nekā citas kultūras – 25-28º C. Barotnes receptūru, kā vienmēr, nosaka empīriskos

eksperimentos. Vai būtu vajadzīga tumsa vai neliels apgaismojums, arī

tas ir jānosaka eksperimentāli. Lai sekmīgi varētu kultivēt protoplastu un šūnu

populāciju, ir jābūt noteiktam kultūras blīvumam – ap 5 . 103 līdz 5 . 104 uz 1 ml.


9. lekcija

Šūnapvalku reģenerācijas ātrums ir dažāds: nelieli protoplasti no meristēmu audiem var sākt reģenerēt šūnapvalku ~ 1,5 stundās, skaitot no kultivēšanas sākuma, bet pilnībā to izveidojot

pēc 24 stundām; protoplasti no pieaugušām lapām ir lielāki, pēc

4 stundām var novērot pirmās šūnapvalka reģenerācijas pazīmes nelielai daļai protoplastu.

Jaunizveidojušies šūnapvalki nesatur pektīnvielas.


9. lekcija

Protoplastu sapludināšana

Kā jau teikts iepriekš, protoplastus izmanto ģenētiskām Kā jau teikts iepriekš, protoplastus izmanto ģenētiskām manipulācijām. Viena no tām ir attālā hibridizācija manipulācijām. Viena no tām ir attālā hibridizācija

protoplastu līmenī: protoplastu līmenī: tiek sapludināti divu dažādu, attāli radniecīgu augu tiek sapludināti divu dažādu, attāli radniecīgu augu

protoplasti. Normālā krustošanā ar putekšņiem protoplasti. Normālā krustošanā ar putekšņiem pārmantojas tikai pārmantojas tikai tēva auga kodola informācija, bet, tēva auga kodola informācija, bet, izmantojot protoplastus, arī citoplazmas ģenētiskā izmantojot protoplastus, arī citoplazmas ģenētiskā

informācijainformācija..


9. lekcija

Protoplastusaplūšanas rezultātāhibrīds saņemne tikaikodola, bet arīcitoplazmas gēnus no tēva auga

Protoplastu kultūras


9. lekcija

Lai sapludinātu protoplastus, tos apstrādā ar NaNO3 un polietilēnglikolu (PEG)

paaugstinātā pH un Ca++ jonu klātbūtnē.

Lai atvieglotu heterozitātes identifikāciju, var izmantot protoplastus, kas iegūti no viena auga

lapas un satur hlorofilu, bet no otra auga – bezkrāsainus, kas, teiksim, auguši audu kultūrās

tumsā.


9. lekcijaMikrokallusa veidošanās pēc divu somatisko šūnu protoplastu

sapludināšanas


9. lekcijaDetalizētu metodiku mēs šeit neapskatīsim, bet pieminēsim faktorus, kas traucē iegūt hibrīdu šūnu

(Cocking, 1977):

1. viena vai abu protoplastu nestabilitāte pēc apstrādes, kas inducē sapludināšanu,

2. viena vai abu veidu protoplastu izsējas zemā efektivitāte,

3.asinhrona šūnu dalīšanās,4. nepilnīga protoplastu saplūšana, traucējot lielām

vakuolām,5. dēļ hromosomu pazaudēšanas sekojošo mitožu laikā,

6. dēļ hibrīdās šūnas nespējas izdzīvot pazeminātā suspensijas blīvumā.


9. lekcija

Pētījumi ģenētikā un augu fizioloģijā

Ir pierādīts, ka eksogēnā DNS var iekļūt citoplazmā un kodolā bez pilnas degradācijas.

Ģenētiskās transformācijas izmēģinājumos nepieciešams izslēgt tādus faktorus kā eksogēnās DNS saistīšanu uz membrānām, tās degradāciju citoplazmā

ceļā uz kodolu un saistīšanu uz kodola apvalka. Pirmo divu šķēršļu pārvarēšanai izmanto eksogēnās

DNS izmantošanu tieši ar kodolu, ko izdala no protoplastiem.


9. lekcija

Izolētos protoplastus izmanto arī transkripcijas hormonālās regulācijas pētījumiem augos. RNS sintēze izolētos protoplastos palielinās

giberelskābes (G3) ietekmē un maksimāli

pieauga gadījumā, kad dīgstu augšana norisinājās G3 klātbūtnē un kad G3 bija barotņu

sastāvā, ko lietoja visā protoplastu izolēšanas laikā.


9. lekcija

Cits piemērs. Auksīnu iedarbība uz protoplazmu norisinās ļoti ātri: inkubējot tabakas mezofila vai

tomātu augļu protoplastus šķīdumā ar IES vai 2,4-D, tie sabrūk.

Šāda IES (10-5 mol.L-1) ietekme tiek novērsta, ja šķīdumam pievieno antiauksīnu –

4-hlorfenoksiizosviestskābi. Ar ABS to nevarēja novērst. Tika izteikta doma, ka

protoplasti sabrūk tādā gadījumā, ja eksogēnā auksīna koncentrācija ir vienāda ar endogēno.

Ar protoplastu palīdzību tiek pētīta arī šūnapvalka veidošanās, u.c.


9. lekcija

Organellu izdalīšana

Kodolu izdalīšanaKodolu izdalīšana. Tos izmanto RNS un DNS sintēzes eksperimentiem, DNS izdalīšanai un analīzei,

hromosomu skaitīšanai, u.c.

Vakuolu un hloroplastu izdalīšanaVakuolu un hloroplastu izdalīšana. Izrādījās, ka izdalītajiem hloroplastiem bija augsta fotoķīmiskā

aktivitāte.


9. lekcija1.-lapa in vitro un2.sagraizīta protoplastu (PL)izdalīšanai3.PL izdalīšana4.atmazgāšana5.PL kultūras iegūšana 6.PL sapludināšana7.PL sapludināšana8.hibrīdais PL9.PL kultivēšana10.šūnapvalka veidošanās.

11.hibrīdās šūnas dalīšanās12.-13.šūnu agregātu veidošanās14.kalluss15.organogēnais kalluss

16.reģenerants in vitro17.hibrīds ex vitro


9. lekcija

Pārtraukums 10 minūtes!

vienas ŠŪnas kultŪra protoplastu kultŪras

Documents