vjezba 1-replikacija dnk

Kalamujić B. (2013) Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK

1

Vježba 1: Građa nukleinskih kiselina i replikacija DNK

Priprema za vježbu:

1. Ponovite koje su razlike u građi DNK i RNK.

Bez obzira na izuzetan tehnološki napredak, nijedna mašina sastavljena

ljudskom rukom nije tako savršeno organizovana, niti tako besprijekorno funkcioniše

kao organizmi u prirodi. Informacije za to savršenstvo sadržane su u njihovoj

genetičkoj strukturi, a realizacija tih infromacija teče kroz niz istovremenih i/ili

sukcesivnih reakcija, s mnoštvom kontrolnih mehanizama. Tokom vježbi iz predmeta

„Molekularna biologija“ napravićemo kratak pregled puta prijenosa genetičke info-

rmacije od razine nukleinske kiseline, pa do njene realizacije na proteinskom nivou.

UVOD

Život kakvog ga poznajemo određen je genomima bezbrojnih organizama s

kojima dijelimo planetu. Svaki organizam posjeduje genom koji sadrži biološku

informaciju potrebnu za izgradnju i održavanje života. Većina genoma, uključujući

ljudski genom i genome drugih ćelijskih organizama, građena je od DNK

(dezoksiribonukleinska kiselina), mada neki virusi imaju RNK (ribonukleinska

kiselina) genome. DNK i RNK su polimerne molekule građene od lanaca

monomernih podjedinica, označenih kao nukleotidi.

Ljudski genom, tipični genom svih višećelijskih životinja, građen je od dva

dijela:

Nuklearni genom sadrži otprilike 3 200 000 000 nukleotida DNK, podijeljenih

u 24 linearne molekule, najkraća duga 50 000 000 nukleotida, a najduža 260

000 000 nukleotida, svaka sadržana u različitom hromosomu. Od ovih 24

hromosoma, 22 su autosomna, a dva polna hromosoma, X i Y.

Mitohondrijalni genom je cirkularna DNK molekula, građena od 16 569

nukleotida, čije su multiple kopije locirane u organelama za proizvodnju

energije – mitohondrijama.

Svaka od otprilike 1013

ćelija u tijelu odraslog čovjeka ima svoju kopiju ili

kopije genoma, s izuzetkom nekoliko vrsta ćelija poput eritrocita koji nemaju nukleus

u svom zrelom, diferenciranom stanju. Velika većina ćelija su diploidne i stoga imaju

dvije kopije svakog autosomnog hromosoma, plus dva polna hromosoma, XX za

ženski ili XY za muški spol – ukupno 46 hromosoma. Ove ćelije nazivaju se tjelesnim

(somatskim), nasuprot polnim ćelijama ili gametima, koje su haploidne i imaju samo

23 hromosoma (jedna kopija svakog autosomnog hromosoma plus jedan polni

hromosom). Oba tipa ćelija imaju oko 8000 kopija mitohondrijalnog genoma, oko 10

u svakom mitohondriju.

STRUKTURA DNK


2

Imena James Watsona i Francis Cricka su tako blisko povezana s DNK da se

lako zaboravlja da je, kada su počeli saradnju u Cambridge, Engleska, oktobra 1951.

godine, detaljna struktura DNK polimera već bila poznata. Njihov doprinos nije bio

odrediti strukturu DNK per se, već pokazati da se u živoj ćeliji dva DNK lanca

isprepliću i formiraju dvostruki heliks.

Struktura DNK molekule danas je općepoznata stvar, stoga se nećemo ovdje

detaljno baviti time. Na slici 1.1 dat je shematski prikaz građe dijela jednog lanca

DNK, a na slici 1.2 građa četiri baze koje ulaze u njen sastav.

Adenin (A) Citozin (C) Guanin (G) Timin (T)

STRUKTURA RNK

RNK je također polinukleotid, ali se unekoliko razlikuje u odnosu na DNK

(Slika 3). Prvo, šećer u RNK nukleotidu je riboza i, drugo, RNK sadrži uracil umjesto

timina. I RNK polinukleotidi sadrže 3'-5' fosfodiesterske veze, ali su ovdje te veze

manje stabilne nego u DNK polinukleotidu. Razlog tome je indirektan efekat

Slika 1.1 (lijevo): Shematski prikaz

građe dijela DNK polinukleotida, sa

strukturom fosfodiesterske veze

Slika 1.2 (dole): Četiri baze

koje se javljaju u DNK

molekuli


3

hidroksilne grupe na 2' poziciji šećera. Ovo bi mogao biti razlog zašto biološke

funkcije RNK ne zahtjevaju polinukleotid duži od nekoliko hiljada nukleotida.

(A) Ribonukleotid

(B) Uracil(A) Ribonukle otid

(B) Ura cil

Osnovne osobine dvostrukog heliksa

Otkriće dvostrukog heliksa (zavojnice) od strane Watson i Cricka, u subotu 07.

marta 1953. godine, predstavlja najvažnije otkriće u biologiji tokom 20. stoljeća.

Dvostruki heliks DNK je desno-zavojni. To znači da, kad bi heliks bio stepenište,

rukohvat na vanjskoj strani stepeništa bio bi s desne strane. Dva lanca idu u suprotnim

smjerovima. Heliks je stabiliziran dvjema tipovima hemijskih interakcija:

Uparivanje baza između dva lanca uključuje stvaranje vodikovih veza između

adenina na jednom lancu i timina na drugom, ili između citozina i guanina.

Ove veze su duže i mnogo slabije u odnosu na kovalentni tip veze. AT i GC

parovi su jedini prihvatljivi parovi, dijelom zbog geometrije nukleotidnih baza

i relativne pozicije grupe koja može učestvovati u vodikovoj vezi, i dijelom

zbog toga da uparivanje mora ići između purina i pirimidina; purin-purin par

bi bio prevelik za heliks, dok bi pirimidin-pirimidin par bio premali.

Uvezivanje baza, ponekad označeno kao π - π interakcija, uključuje

hidrofobne interakcije između susjednih baznih parova i dodaje na stabilnosti

dvostrukom heliksu, kad je već heliks formiran uparivanjem komplementarnih

baza. Do ovih hidrofobnih interakcija dolazi zbog strukture vode bazirane na

vodikovim vezama, koja gura hidrofobne grupe u unutrašnje dijelove

molekule.

Oba ova tipa interakcija su važna u očuvanju stabilnosti molekule, no uparivanje

komplementarnih baza dobiva na značaju zbog svojih bioloških implikacija.

Ograničenje da se A može upariti samo s T, a G sa C, znači da DNK replikacija može

rezultirati savršenim kopijama roditeljske molekule putem jednostavnog manevra

korištenja sekvence već postojećeg lanca da bi se diktirala sekvenca novog lanca. Ovo

je matrica-ovisna sinteza DNK i predstavlja sistem koji koriste sve ćelijske DNK

polimeraze. Analog ovog procesa, matrica-ovisna sinteza RNK, koriste RNK

polimeraze u sintezi RNK kopija gena. Ove kopije čuvaju biološku informaciju

Slika 1.3: A) Shematski prikaz građe ribonukleotida; B) Građa uracila


4

sadržanu u sekvenci genomske DNK molekule. Jedina razlika između sinteze DNK i

RNK je u tome što se, pri sintezi RNK, adenini u DNK matrici ne vežu s timinima u

RNK kopiji. To je stoga što RNK ne sadrži timin; umjesto toga adenin se uparuje s

uracilom u DNK-RNK hibridima i u dvolančanim RNK strukturama.

REPLIKACIJA DNK

Sposobnost autoreplikacije osobina je koja odlikuje DNK nad svim ostalim

makromolekulama. Ovaj proces leži u osnovi svih drugih bioloških procesa u

organizmu i preduslov je za rast i razvoj organizma.

Replikacija DNK odvija se prije svake ćelijske diobe i omogućava kasniju

podjelu svakog hromosoma na dvije hromatide. U ovoj vježbi pokušaćemo da

razjasnimo misteriju faza replikacije DNK kod eukariota (replikacija kod prokariota

biće objašnjena tokom termina praktične nastave).

Prva važna etapa u replikaciji DNK jeste pucanje vodikovih veza između dviju

baza antiparalelnih lanaca. Odmatanje

dvaju lanaca predstavlja polaznu tačku.

Razdvajanje se događa u mjestima na

lanacima koja su bogata A-T. To je zato

što postoje samo dvije veze između

adenina i timina (tri su vodikove veze

između citozina i guanina). Helikaza je

enzim koji razdvaja dva lanca.

Inicijacijska tačka gdje razdvajanje

lanaca počinje zove se "ishodište

replikacije". Strukturu koja nastane

nazivamo "replikacijska viljuška"

(Slika 1.4).

Slika 1.4: Replikacijska viljuška

Jedan od najvažnijih koraka u replikaciji

DNK jeste vezivanje RNK primaze na

inicijacijsku tačku na roditeljskom 3'-5' lancu.

RNK primaza vezuje RNK nukleotide za 3'-5'

DNK lanac po principu komplementarnosti

(Slika 1.5). RNK nukleotidi predstavljaju

prajmer (početnicu, klicu) za vezivanje DNK

nukleotida.

Slika 1.5: Vezivanje RNK

prajmera za DNK

lanac

Helikaza

RNK prajmer


5

DNK polimeraze su enzimi koji imaju ključnu ulogu u replikaciji. U

eukariotskim ćelijama nalazi se najmanje 5 vrsta ovih enzima koje su označene kao

DNK polimeraze a (alfa), b (beta), g (gama), d (delta) i e (epsilon), pri čemu je

najvažnija DNK-poly d. DNK polimeraza d u 5’- 3’ pravcu povezuje nukleotide

novog lanca fosfodiesterskim vezama, pošto su se oni postavili komplementarno

(A=T, C≡G) nukleotidima starog (roditeljskog) lanca.

Proces elongacije DNK lanca odvija se drugačije na 5'-3' i 3'-5' DNK matrici

(kalupu). Novonastajući lanac koji za svoju sintezu koristi 5'-3' matricu naziva se

vodeći lanac zato što DNK polimeraza delta može da „čita“ matricu i kontinuirano,

bez prekida dodaje nove nukleotide komplementarno onima koji se nalaze na matrici

(npr. adenin nasuprot timinu).

Novonastajući lanac koji za svoju sintezu koristi 3'-5' matricu naziva se

zaostajući lanac (Slika 1.6). Obzirom da je orijentacija 3'-5' DNK matrice suprotna

radnoj orijentaciji DNK polimeraze epsilon, elongacija zaostajućeg lanca je

komplikovanija od sinteze vodećeg lanca. U zaostajućem lancu, primaza dodaje

nekoliko RNK prajmera, koji su neophodni kako bi se DNK polimeraza vezala za

njihov 3' kraj. Nadovezujući se na ove prajmere, DNK polimeraza e „čita“ matricu i

dodaje komplementarne DNK nukleotide. Fragmenti koji nastaju na ovaj način

nazivaju se Okazaki fragmenti (Slika 1.7).

Slika 1.6: Vodeći i zaostajući lanci Slika 1.7: Okazaki fragmenti

DNK polimeraza d koja, pored sintetske aktivnosti, posjeduje i 5'-3' egzo-

nukleaznu aktivnost, uklanja RNK prajmere (Slika 1.8) i zamjenjuje ih sa DNK nukle-

otidima (to je neophodno obzirom da DNK i RNK imaju unekoliko različite nukle-

otide; timin-uracil). Konačno, nastali Okazaki fragmenti bivaju spojeni radom enzima

ligaze (dodaje nedostajući fosfat u prazninu u fosfatno-šećernom skeletu DNK).

Vodeći lanac

Zaostajući lanac

Vodeći lanac

Zaostajući lanac


6

Po završenoj replikaciji, svaki

novonastali dvostruki DNK heliks

sastoji se od jednog starog i jednog

novog lanca. Zbog toga se za

autoreplikaciju DNK kaže da je

semikonzervativna.

Slika 1.8: Uklanjanje RNK prajmera (izvor 1.4-1.8: www.dnareplication.info)

Posljednji korak u replikaciji DNK jeste terminacija. Ovaj proces se dešava

kada DNK polimeraza dođe do kraja lanaca. Jasno je da u posljednjoj sekciji u

zaostajućem lancu, nakon uklanjanja RNK prajmera, nije moguće da DNK polimeraza

popuni prazninu (obzirom da nema prajmera). Stoga se kraj roditeljskog lanca gdje je

vezan posljednji prajmer ne replicira. Ovi krajevi linearne (hromosomske) DNK se

sastoje od nekodirajućih regiona sa ponavljajućim sekvencama i nazivaju se telomere.

Kao rezultat toga, dio telomere se uklanja prilikom svake replikacije.

Autoreplikacija DNK nije gotova dok reparacijski mehanizmi ne poprave

moguće greške nastale tokom replikacije. Enzimi tipa nukleaza uklanjaju pogrešno

sparene nukleotide, a DNK polimeraza popunjava prazninu komplementarnim

nukleotidom.

Literatura:

Dennis, P.P., Bremer, H. (1974). Differential rate of ribosomal protein synthesis in

Escherichia coli B/r. Journal of Molecular Biology 84, 407–422.

Izban, M.G., Luse, D.S. (1992). Factor-stimulated RNA polymerase II transcribes at

physiological elongation rates on naked DNA but very poorly on chromatin templates.

Journal of Biological Chemistry 267, 13647–13655

Lewin B. (2008). Genes IX. Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, Massachusetts

http://www.johnkyrk.com/

Zadaci:

1. Pažljivo pratite prezentaciju koja prati ovu vježbu. Zabilježite u svesku detalje

koji nisu obrađeni u tekstu.

Uklonjeni prajmeri


7

DODATAK:

Escherichia coli ima pet DNK polimeraza

Enzim Gen Funkcija

I polA Glavni reparacijski enzim

II polB Ponavljanje replikacije

III polC Replikaza

IV dinB Translezijska replikacija

V umuD' 2C Translezijska replikacija

DNK polimeraza eukariota vrši replikaciju ili reparaciju

DNK polimeraza Funkcija Struktura

Visoko pouzdane replikaze

Αlfa Nuklearna replikacija 350 kD tetramer

Delta Nuklearna replikacija 250 kD tetramer

Epsilon Nuklearna replikacija 350 kD tetramer

Gama Mitohondrijalna replikacija 200 kD dimer

Visoko pouzdani popravak

Beta Popravak isjecanjem baza 39 kD monomer

Slabo pouzdani popravak

Ksi Popravak timinskih dimera Heteromer

Eta Popravak oštećenih baza Monomer

Jota Potreban u mejozi Monomer

Kappa Delecije i substitucije baza Monomer


8

Autor: Mariana Ruiz (slika reprodukovana uz dopuštenje autora)

Sažetak DNK replikacije. Dvostruka uzvojnica se odmotava radom helikaze i topoizomeraze. Potom, jedna DNK polimeraza

sintetizira kopiju vodećeg lanca (engl. leading strand). Druga DNK polimeraza se vezuje za zaostajući lanac (engl. lagging

strand). Ovaj enzim sintetizira diskontinuirane segmente (koji se nazivaju Okazaki fragmenti) prije nego ih spoji DNK ligaza.

vjezba 1-replikacija dnk

Documents