vol. 15(27). producción de insulina a partir de organismos bacterianos (2008)
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Artículo de recopilación de la técnica molecular para la producción de insulina a través de bacterias.TRANSCRIPT
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Produccion de insulina a partir de organismos bacterianos:
Revision bibliognifica para la tecnica molecular
Viridiana Rosabelhi Soto
Javier Hernandez GuzYazmin Morales Herna
Onesimo Dios de la
Divisi6nAcademica de Ciencias Bio16Universidad JuarezAut6noma deTa
Km 0.5 carreteraVillahermosa-Cardenas entronque Bosques de Svrspbjr@hotmail.
Resumen
La diabetes millitus es una de las enfermedades con
mayor impacto en la sociedad. Esta problematica
provoca que las personas presenten la glucosa elevada
en la sangre (hiperglucemia) y otras alteraciones que
cambian el metabolismo. Las enzimas de restriccion se
utilizan para cortar de manera abierta un plasmido, por
10 que la misma enzima se utiliza para cortar el gen
deseado fuera del cromosoma; esta reaccion hace dos
cortes que emparej an y cuando se combina el gen y el
plasmido forman un enlace temporal. Otra enzima
denominada ADN ligasa se utiliza para crear un sella
permanente. De esta manera se induce a las bacteriasque tomen los plasmidos mientras que estas mismas se
desarrollan y se multiplican en el medio, generando la
insulina demanera natural a partir de bacterias.
Introducclon
La diabetes mellitus es una de las enfermedades con
mayor impacto sociosanitario, no solo por su elevada
frecuencia, sino por las consecuencias de las
complicaciones cronic as que comporta esta
enfermedad. Esta se caracteriza por tener una
insuficiente produccion de insulina por celulas
denominadas beta del pancreas, esta problematica
provoca que las personas presenten una elevacion de la
glucosa en la sangre, la cual es llamada hiperglucemia y
otras alteraciones que cambian el metabolismo
(Santisteban-Segundo, 1999; Bosch et al., 2002).
En el caso de los individuos geneticamente
predispuestos, la obesidad y el sedentarismo conducen
a la resistencia a la insulina, estado que precede
diabetes y ademas, se suele acompafiar de otros fac
de riesgos cardiovasculares como la dislipidemia
hipertension y factores protromboticos y
alteraciones como la debilidad, suefio, delga
obesidad, infarto, ceguera 0 insuficiencia renal (B
et al., 2002; Hryciw et al., 2004).
En 1978, se logro la clonacion en dond
produjeron una gran cantidad de copias identica
bacterias capaces de producir la insulina, para que
utilizada por las personas con la enfermedad d
diabetes, sin embargo, no fue hasta 1982 que se
comercializar la insulina producida por las bacthacia la disposicion de los enfermos (Caputo e
2005; Bericevik et al., 2002).
Debido a que la Biotecnologia, con la ayuda
Ingenieria genetica ha logrado extraer la insulina
son capaces de producir las bacterias y otras esp
complejas como los porcinos y los vacunos mucha
las personas hoy dia tiene la capacidad de presentar
vida con mayor normalidad (Muniappan y Oz
2007; Erb, 1980).
Por toda la importancia que tiene esta enferm
ante la poblacion actual y por el avance d
manipulacion genetica a nivel molecular
microorganismos bacterianos, se pretende logr
insercion de un ADN recombinante a otro organi
para lograr que produzca una nueva proteina, para
esta sea fabric ada naturalmente por las personas.
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P ro d uc cio n d e in su lin a a p artir d e o rg an is mo s b ac te ria no s: R ev is io n b ib lio gra fic a p ara la te cn ic « m ole cu la r.
Metodologia
Tecnica general
Se utilizan enzimas especiales para insertar genes
humanos en el ADN de las bacterias. Los geneshumanos hacen que las bacterias e1aboren un nuevo
material, que no eran capaces de producir con
anterioridad. En condiciones adecuadas, los
microbios se multiplican rapidamente, de modo que
se puede generar una gran cantidad de la nueva
sustancia en un corto periodo de tiempo. De esta
manera, los genes que controlan la producci6n de
insulina humana, se pueden colocar en una celula
bacteriana, con el fin de que los microbios e1aboren la
insulina humana. Despues, esta sustancia es extraida
del cultivo de bacterias y preparada para su uso porparte de los enfermos que la precis en (Finochieto et
al.,2008)
Metoda recombinante para la produccion deinsulina
Primeramente, se clonan los genes con la f J -
galactosidasa en el plasmido pBR322 (Figura 1). La
recombinaci6n de los plasmidos son amplificados en
E. coli. Se lleva a cabo una transformaci6n de la
bacteria, en dos nuc1e6tidos diferentes, luego la
reacci6n entre la proteina fJ-gal y el gen de la insulinacon la metionina hace que el complejo protei co
cambie, expulsando de esta manera la molecula de la
metionina y produciendo al final la insulina con
menos aminoacidos que al inicio del proceso por el
metoda de la recombinaci6n (Ladisch y Kohlmann,
1992).
El mecanismo de la separaci6n de la insulina es a
traves del sistema RP-HPLC (Reversed-Phase High
Performance Liquid Chromatography) por sus siglas en
ingles, la cual es utilizada para separar la insulina deotras especies, basada en una gran variedad de
diferentes aminoacidos y gracias ala hidrofobicidad de
la insulina relacionada con otros componentes. La
tendencia de las proteinas debe ser generalmente con
las proteinas mas grandes que se encuentren en una fase
estacionaria, en la cual tienen una gran limitaci6n del
soporte de alcalinidad.
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Figura 1. Producci6n de la insulina a traves de la bac
Escherichia coli.
Resultados
Para lograr el correcto funcionamiento se nec
llevar a cabo ciertos pasos: primero, el gen del in
debe ser identificado, por ejemplo, el gen de la insu
tendria que ser aislado de las celulas bacterianas.
plasmido es una secuencia circular, double-strande
ADN, que las replica en bacterias y que son parte
cromosoma bacteriano. El gen se inserta en elplasm
en donde es tomada por una bacteria. Las bacteria
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reproducen y comienzan a generar 1aproteina deseada
(Shehata, 2008).
T RA NS FE RE NC IA Y C LO N AC li6 N D EL G E N iD E L A IN SU LIN A
,Como se transfiere el gen de la insulina? ~
• L D S .P . Jasrn.loos.so.n cfrculos p.eq.ueRo.sde .l l D . N q.ue@sa encuentran caulas bactannas, separado del
cromosom a bacteri anD
Intervenclcn de Is enzlrna de restr lcclon y la ADN' rt dinsercl6ndel ADNc . - . ! ! L . c rrserra c
,/ ,• EI plasmido que contleneel gen humane esta . ''V' '
ahora listo para sar msndo an un organlsmo vivo ~
. .(;~y, Plasmidc~ recomblnante
. ll D N p la sr ni do
CLONACION DEL GEN DELAINSUUNA HUMANA,
• EI p lasmtdo entra enla celula bacterlana y se
reproduce. OJandcla celula bactertena se divide,
el p lasrn ldo sa comparte fuera entre las dos celulas
~s y el plasmldo continua reproeuclendcse
• De esta manera un don de celulas ldanticas sa
form a y 51el gen hum ana se Incorporo, codlfi ca
para Is lnsul lna de la hormone, entonces tal clan
puede proporcionar una fuente segura de insul ina
Figura 2. Ilustraci6n que demuestra como la insulina
humana se puede producirpor las bacterias, usando elADN
recombinante (Fuente: Thinkquest, 2008 modificado).
Figura 3. Micrografia electr6nica de una celula de E. coli
donde se realiza la ruptura del ADN. Una porci6n de la
molecula deADN se enlaza a partir de 4.6 millones de pares
de bases, codificando aproximadamente 4100 genes. Los
circulos pequefios son los plasmidos.
(Fuente: Thinkquest, 2008 modificado).
Pldsmidos bacterianos (Kimball, 2004)
Las enzimas de restricci6n fueron descubiertas
1968, las cua1es son parte importantes durant
proceso de producci6n de insu1ina. En 1anatura1ez
enzimas de restricci6n cortan en una secuencianuc1e6tidos, Hamada "vista de restricci6n", 1a cu
presenta con 4-8 nuc1e6tidos largos. La secuencia
cadena de ADN que se presenta en las bacteria
comp1ementa con un grupo metilico (-CH3) en d
1a adenina y 1a citosina evita que 1a enzima
restricci6n actue de manera adecuada. E1ADN qu
algun momenta es extemo, tal como un fago (un vi
una bacteria) es dividido en secciones a traves
enzima de restricci6n. Aunque no todas las bact
cuentan con las enzimas de restricci6n hay e
actua1idad un gran numero de estas enzimas que sdescubierto y que son igua1de efectivas (Arakaki e
2008).
Las enzimas de restricci6n se uti1izan para cort
plasmido abierto, 1amisma enzima se uti1iza para c
e1 gen deseado fuera del cromosoma. Esto hace
cortes que emparej an y cuando se combina e1gen
plasmido forman un enlace temporal, posteriorm
este es sellado con e1ADN 1igasa(Moks et al., 1987
MOLECULAA
' $ ' ~, G -B -A- T -'C -!C ~ J '
MOLECULAB
'~J;'-I IHHII~f -C-C-3 'i ri ,i ,i Ii ,iI ,Ij ,I ,I ;I ,I
J- C-C-T-A-G-IG-5' 3- C-C-'f-a:-IHi ,-5"
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Figura 4. El funcionamiento de una enzima derestricci6
sitio de restricci6n es GGATCC (Kimball,
modificado ).
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= l a sm t d o
~.y - y - Y ' P '
I n c om p at i b i I i d a d
+I n c om p at i b i I i d ad
+
Figura 5. Interacci6n de la enzima de restricci6n con elADN
en un plasmido. El sitio de restricci6n es GAATTC (Fuente:
Thinkquest, 2008 modificado).
En la actualidad, los cientificos producen un ADN
recombinante a gran escala, en donde millones de
plasmidos se mezc1an con millones de genes, millones
de enzimas de restricci6n realizan una gran cantidad de
c0rt:es, los plasmidos atan a los genes multiples,
haciendo de esta tecnica muy compleja (Muniappan y
Ozcan, 2007).
Los plasmidos que comienzan el procedimiento se
llaman vectores reproductivos que es una molecula que
puede llevar el ADN extemo a una celula y replegarlaen esta misma. Este plasmido tambien inc1uye un gen
que le confiere resistencia a la ampicilina y un segundo
gen denominado lacZ. El sito de restricci6n en donde la
enzima de restricci6n realiza un corte se localiza en el
gen lacZ, si el ADN extemo se inserta en el gen lacZ
donde la enzima de restricci6n realiz6 su corte, el gen
lacZ da como terminado su funci6n. Las enzimas de
restricci6n se mezc1an con los plasmidos y se agregan
los genes deseados, es decir, aquellos genes que se
desean combinar con los plasmidos. En dond
inducen a las bacterias que interactuen con
plasmidos, al interactuar, las bacterias cambian
color. Despues de la interacci6n de las bacterias co
plasmidos, estos se multiplican en un medio
ampicilina (Ladisch y Colhmann, 1992).
Si un grupo de bacterias toma un plasmido
tiene el gen intacto de lacZ, significa que ese plasm
no es recombinante, en donde tomara un color azu
Mientras que las bacterias que no tomaron ni
plasmido no tendran la capacidad crecer dentro
ampicilina, por 10que solamente aquellas bacterias
~omaron el plasmido creceran y aquellas que te
msertado el gen de lacZ tendran una aparie
blanquecina (Ladisch y Kohlmann, 1992).
Para realizar los marcadores de forma radiacti
con un marcador fluorescente en el A
desnaturalizado de las bacterias se puede efectuar
variaciones de temperatura 0 con productos quim
Cuando estas son marcadas, la cadena complement
~el ~DN de la bacteria se enlaza con el gen
msulma. De esta manera sabemos cual es la bac
que tiene el gen deseado de la insulina, en donde
misma puede colocarse como medio de cultivo para
se pueda duplicar el gen de la insulina, tambie
conocida como la tecnica de hiperhibridaci6n del a
nuc1eico (Ladisch y Kolhmann, 1980).
Conclusion
La tecnica de recombinaci6n de ADN de los plasm
bacterianos es parte de una de las tecnologias
ingenieria genetica con grandes aplicaciones de in
cientifico y econ6mico. Estas aplicaciones tiene
amplio espectro de beneficios, no solo para lamed
sino tambien para la industria farmaceutica
fabricaci6n en masa de gran cantidad de produ
derivados de la producci6n de proteinas. En gengracias a las actuales tecnicas para la manipulaci6n
ADN es posible producir en gran cantidad insu
geneticamente compatible con el paciente.
practicamente identica a la producida de ma
natural en el organismo humano y por 10
completamente util y aprovechable para aqu
personas que no pueden producir la insu
denominados personas diabeticas. La producci6n
insulina mediante los procesos anteriorme
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expuestos abre las puertas a una nueva industria de
producci6n en masa que beneficia a millones de
personas enTabasco y de todo elmundo.
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