vpliv genetske raznolikosti na učinkovitost farmakološkega ... · uporabili smo test hi-kvadrat,...

Medicinska fakulteta Univerze v Mariboru

Vpliv genetske raznolikosti na učinkovitost

farmakološkega zdravljenja sindroma policističnih

jajčnikov

Katja Jerenec, Maša Samojlenko

Delo je pripravljeno v skladu s Pravilnikom o častnih nazivih,

nagradah, priznanjih in pohvalah Medicinske fakultete Univerze v

Mariboru pod mentorstvom doc. dr. Polonce Ferk, mag. farm.

Maribor, 2012

1

IZVLEČEK

Namen: Sindrom policističnih jajčnikov (PCOS) je pogosta endokrinopatija pri

ženskah in vodilni vzrok ženske neplodnosti. Glede na simptomatiko in terapevtske

cilje pri posamezni bolnici imamo na voljo različne možnosti farmakološkega

zdravljenja, med njimi tudi metformin, ki se je v zadnjem času izkazal kot učinkovita

in varna izbira. Pri zdravljenju z metforminom pa se pojavlja problematika različnega

odziva bolnic s PCOS na zdravljenje. Zato je osnovni namen naše raziskave potrditi

učinkovitost zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom in ugotoviti morebitni vpliv

genetskega polimorfizma znotraj respiratornega kompleksa 1 (rs366313 v genu

NDUFS4) in polimorfizma prenašalca MATE2-K (rs12943590 v genu SLC47A2) na izid

zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom.

Hipoteza: V raziskavi pričakujemo, da bo metformin učinkovit pri zdravljenju

slovenskih bolnic s PCOS. Polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in rs12943590 v genu

SLC47A2 ter kombinacije njunih genotipov bodo imele vpliv na izid zdravljenja bolnic

s PCOS z metforminom. Med bolnicami in kontrolno skupino pričakujemo razlike v

frekvencah genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4, razlik v frekvencah

genotipov polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 pa ne pričakujemo. Vrednosti

indeksa telesne mase (ITM) in indeksa prostih androgenov (FAI) pred začetkom

zdravljenja bodo imele vpliv na uspešnost zanositve in na izboljšanje aknavosti po

zdravljenju bolnic s PCOS z metforminom.

Metode: V retrospektivno raziskavo je bilo vključenih 122 odraslih bolnic s PCOS, 20

bolnic s PCOS zdravljenih z metforminom v obdobju 6 mesecev, povprečno starih 30,

5 let in 81 predvidoma zdravih žensk, primerljive starosti, ki so predstavljale

kontrolno skupino. Anamnestične, klinične in laboratorijske parametre in podatke o

bolnicah s PCOS zdravljenih z metforminom smo pridobili iz njihovih zdravstvenih

kartotek. Na podlagi ugotovitev iz prebrane literature smo izbrali genetska

polimorfizma posameznih nukleotidov iz področja farmakokinetike in

farmakodinamike metformina, ki po dosedanjih podatkih še nista bila preučevana na

bolnicah s PCOS. Na že izolirani DNA preiskovank smo izvedli genetsko analizo obeh

izbranih polimorfizmov z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) v realnem času na

aparaturi LightCycler® 480 Real-Time PCR System II. Podatke smo statistično obdelali

s programom SPSS 20.0. Uporabili smo test hi-kvadrat, T-test za odvisne vzorce T-test

za neodvisne vzorce, eno-faktorsko analizo variance (ANOVA) in Bonferronijev

popravek. Statistično pomembnost je predstavljala vrednost p<0,05.

2

Rezultati: V kontrolni skupini preiskovank je frekvenca manj pogostega alela

polimorfizma rs366313 A>G v genu NDUFS4 16% (MAF je G=0,16/26), frekvenca manj

pogostega alela polimorfizma rs12943590 G>A v genu SLC47A2 pa 33%(MAF je

A=0,33/53). Primerjava frekvenc alelov polimorfizma rs366313 A>G v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 G>A v genu SLC47A2 med skupino bolnic in kontrol ni

pokazala statistično pomembnih razlik (Test hi-kvadrat, p=0,501 in p=0,599).

Primerjava frekvenc posameznih genotipov obeh polimorfizmov med skupino bolnic in

kontrol prav tako ni pokazala statistično pomembnih razlik med skupinama (Test hi-

kvadrat, p=0,792 in p=0,885). Tudi kombinacije genotipov obeh polimorfizmov so

enako razporejene med omenjenima skupinama (Test hi-kvadrat, p=0,938). V skupini

20 bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom, so se po 6 mesečnem zdravljenju

statistično pomembno izboljšale vrednosti koncentracije celokupnega plazemskega

testosterona (T)(T-test za odvisne vzorce, p=0,049), vrednost indeksa prostih

androgenov (FAI) (T-test za odvisne vzorce, p=0,016), plazemske koncentracije

luteinizirajočega hormona (LH) (T-test za odvisne vzorce, p<0,001) razmerje LH/FSH

(folikle stimulirajoči hormon) (T-test za odvisne vzorce, p<0,001), aknavost (Test hi-

kvadrat, p<0,001), vidnost corpus luteum (CL) na ultrazvoku(UZ) (Test hi-kvadrat,

p<0,001) in uspešnost zanositve (Test hi-kvadrat, p=0,035). Polimorfizem rs366313 v

genu NDUFS4 in polimorfizem rs12943590 v genu SLC47A2 nista imela statistično

pomembnega vpliva na spremembo kliničnih in laboratorijskih parametrov (eno-

faktorska analiza variance, p>0,05). Se pa iz rezultatov nakazuje vpliv genotipa AG

polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in genotipa GG polimorfizma rs12943590 v

genu SLC47A2 na izboljšanje reproduktivne funkcije. Kombinacija genotipov AG/AG

(rs12943590/rs366313) je imela statistično pomemben vpliv na izboljšanje plazemske

koncentracije celokupnega testosterona po zdravljenju z metforminom (eno-

faktorska analiza variance z Bonferronijevim popravkom, p=0,036). Pri kombinaciji

AG/AA pa se nakazuje vpliv na slabši izid zdravljenja reproduktivne disfunkcije z

metforminom. Začetna vrednost ITM je imela statistično pomemben vpliv na

uspešnost zanositve po zdravljenju, na izboljšanje aknavosti pa ne (T-test za

neodvisne vzorce, p=0,025 in p=0,294).Začetna vrednost FAI ni imela statistično

pomembnega vpliva na nobenega izmed navedenih kliničnih parametrov (T-test za

neodvisne vzorce, p>0,05).

Zaključki: V naši raziskavi smo potrdili, da je metformin učinkovit v zdravljenju

bolnic s PCOS. Ugotovili smo, da se pri obravnavanih bolnicah s PCOS zdravljenih z

metforminom nakazuje tendenca vpliva genotipa AG polimorfizma rs366313 v genu

NDUFS4 in genotipa GG polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na učinkovitejše

3

zdravljenje reproduktivne disfunkcije z metforminom. Kombinacija genotipov AG/AG

(rs12943590 /rs366313) je imela statistično pomemben vpliv na izboljšanje

laboratorijskih kazalcev hiperandrogenizma, pri bolnicah s kombinacijo AG/AA pa

smo opazili slabši odziv pri zdravljenju reproduktivne disfunkcije z metforminom.

Ključne besede: PCOS, metformin, učinkovitost zdravljenja, farmakogenetika,

osebni pristop k zdravljenju

4

ABSTRACT

Purpose: Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common endocrinopathy in women

and the leading cause of female infertility. Bearing the specific symptoms and

therapeutic goals for each patient in mind, we can choose among different

possibilities of pharmacological treatment, including metformin, a drug that has

shown itself to be very effective and safe. However, the response of patients with

PCOS to treatment with metformin varies widely. Therefore, the purpose of this

study is to confirm the efficacy of treating PCOS patients with metformin, as well as

establish the potential impact genetic polymorphism of the respiratory complex 1

(rs366313 on gene NDUFS4) and the MATE2-K transporter (rs12943590 on gene

SLC47A2) have on the success of treating PCOS patients with metformin.

Hypothesis: We expect our research to show that metformin is effective in treating

patients with PCOS in Slovenia. The genetic polymorphisms (rs366313 on gene

NDUFS4, rs12943590 on gene SLC47A2 and their combinations) will affect the efficacy

of metformin treatment in PCOS patients. .Presumably, the patients and control

group will have a different frequency of rs12943590 polymorphism on gene NDUFS4

genotypes but will not differ in the frequency of rs12943590 polymorphism on gene

SLC47A2 genotypes. The body mass index (BMI) and free androgen index (FAI) prior to

onset of treatment will influence the rate of successful restoration of fertility and

acne reduction after treatment with metformin.

Methods: We performed a retrospective study which included 122 adult PCOS

patients, 20 PCOS patients who had received metformin treatment for a period of six

months, their average age being 30,5 years. The control group consisted of 81

presumably health women of comparable age. We acquired anamnestic, clinical and

laboratory data about metformin-treated PCOS patients from their healthcare files.

We chose two genetic nucleotide polymorphisms within the pharmacokinetical and

pharmacodynamical field of metformin which, according to data we were able to

find, have not yet been studied in relation to PCOS patients. We used the already

isolated DNA of research subjects to perform a genetic analysis of both seleced

polymorphisms by means of polymerase chain reaction (PCR) in real time using the

LightCycler® 480 Real-Time PCR System II. We processed the statistical data with

SPSS 20.0. We used the chi-squared test, the t-test for dependent samples, the t-test

for independent sample, the one-factor variance analysis (ANOVA) and the Bonferroni

correction. The statistical significance was p<0,05.

5

Results: The frequency of the less common allele of rs366313 A>G polymorphism on

gene NDUFS4 is 16% (minor allele frequency - MAF is G=0,16/26) while the frequency

of the less common allele of rs12943590 G>A polymorphism on gene SLC47A2 is 33%

(MAF is A=0,33/53). Comparing the frequencies of alleles rs366313 A>G polymorphism

on gene NDUFS4 and rs12943590 G>A polymorphism on gene SLC47A2, we found no

significant differences (the chi-squared test, p=0,501 and p=0,599). Likewise, no

statistically significant differences were shown when comparing the frequencies of

respective genotypes of both polymorphisms (chi-squared test, p=0,792 and p=0,885).

The combinations of both polymorphism genotypes also occured with virtually the

same frequency in both groups (chi-squared test, p=0,938). After six months of being

treated with metformin, the group of 20 PCOS patients showed significant

improvement in levels of total plasma testosterone (T) (t-test for dependent

samples, p=0,049), free androgen index (FAI) values (t-test for dependent samples,

p=0,016), plasma concentrations of luteinising hormone (LH) (t-test for dependent

samples, p<0,001), LH/FSH (follicle stimulating hormone) ratio (t-test for dependent

samples, p<0,001), acne (chi-squared test, p<0,001), corpus luteum (CL) visibility

upon ultrasound (US) examination (chi-squared test, p<0,001) and restoration of

fertility (chi-squared test, p=0,035). The rs366313 polymorphism on gene NDUFS4 and

the rs12943590 polymorphism on gene SLC47A2 had no statistically significant impact

on the clinical and laboratory parameters (one-factor variance analysis, p>0,05).

However, the results suggest that the AG rs366313 polymorphism on gene NDUFS4

genotype and the GG rs12943590 polymorphism on gene SLC47A2 genotype have

positive effects on reproductive function. The combination of AG/AG

(rs12943590/rs366313) genotypes was linked to a significantly improved level of

plasma testosterone after metformin treatment (one-factor variance analysis with

Bonferroni correction, p=0,036). Conversely, the AG/AA combination was linked to

less satisfactory results of metformin treatmet. The initial BMI was shown to affect

the rate of successful fertility restoration but not the extent of acne (t-test for

independent samples, p=0,025, p=0,294).FAI values had no significant effect on any

of the two variables (t-test for independent samples, p>0,05).

Conclusion: Our study confirmed the efficacy of metformin treatment in PCOS

patients. We have found that, in metformin-treated PCOS patients who possess AG

rs366313 polymorphism on gene NDUFS4 and GG rs12943590 polymorphism on gene

SLC47A2 genotypes, there is a tendency towards more satisfactory treatment results.

The combination of AG/AG (rs12943590/rs366313) genotypes significantly improved

6

hyperandrogenism marker, whereas the AG/AA genotype combination correlated with

poor results in terms of reproductive function improvement.

Key words: PCOS, metformin, treatment efficacy, pharmacogenetics, individual

approach to treatment

7

KAZALO

1 UVOD ........................................................................................ 11

1.1 SINDROM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV ............................................... 11

1.1.1 OPREDELITEV IN KLINIČNA SLIKA SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

(PCOS) 11

1.1.2 PATOGENEZA IN ETIOLOGIJA SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV ..... 11

1.1.3 DIAGNOZA SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV ........................... 12

1.1.4 ZDRAVLJENJE SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV ....................... 13

1.2 METFORMIN ............................................................................ 14

1.2.1 UPORABA METFORMINA V KLINIČNI PRAKSI .................................. 14

1.2.2 FARMAKODINAMIKA METFORMINA ............................................. 15

1.2.3 FARMAKOKINETIKA METFORMINA .............................................. 18

1.3 SPREMLJANJE IN VREDOTENJE UČINKOVITOSTI IN VARNOSTI ZDRAVLJENJA

BOLNIC S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV Z METFORMINOM ................... 19

1.4 RAZLIKE V ODZIVU BOLNIC S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV NA

ZDRAVLJENJE Z METFORMINOM ............................................................. 21

1.4.1 VPLIV OKOLJSKIH, KLINIČNIH IN BIOKEMIČNIH DEJAVNIKOV NA ODZIV

BOLNIC S S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV NA ZDRAVLJENJE Z

METFORMINOM ............................................................................. 22

1.4.2 VPLIV GENETSKIH DEJAVNIKOV NA ODZIV BOLNIC S SINDROMOM

POLICISTIČNIH JAJČNIKOV NA ZDRAVLJENJE Z METFOMINOM ....................... 22

1.5 NAMEN RAZISKAVE .................................................................... 27

1.5.1 CILJI RAZISKAVE ................................................................. 27

2 PREISKOVANKE IN METODE DELA ......................................................... 29

2.1 PREISKOVANKE ........................................................................ 29

2.1.1 BOLNICE S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV ......................... 29

2.1.2 BOLNICE S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV, ZDRAVLJENE Z

METFORMINOM ............................................................................. 29

2.1.3 KONTROLNA SKUPINA PREISKOVANK .......................................... 29

2.2 METODE DELA ......................................................................... 30

2.2.1 IZBIRA GENETSKIH POLIMORFIZMOV POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV ........ 30

2.2.2 VRSTA RAZISKAVE ............................................................... 31

2.2.3 PRIDOBIVANJE PODATKOV O BOLNICAH IZ ZDRAVSTVENIH KARTOTEK... 32

2.2.4 MOLEKULARNO GENETSKA ANALIZA .......................................... 33

8

2.2.5 STATISTIČNA ANALIZA .......................................................... 33

3 REZULTATI .................................................................................. 35

3.1 PRIMERJAVA FREKVENC ALELOV, GENOTIPOV POLIMORFIZMA rs366313 A>G V

GENU ZA NADH-KOENCIM Q-REDUKTAZO 4 (GEN NDUFS4) IN POLIMORFIZMA

rs12943590 G>A V GENU ZA MATE2-K (GEN SLC47A2) TER KOMBINACIJ TEH

GENOTIPOV MED BOLNICAMI S PCOS IN KONTROLAMI ................................... 35

3.2 KLINIČNE, LABORATORIJSKE IN GENETSKE ZNAČILNOSTI SKUPINE BOLNIC S

PCOS ZDRAVLJENIH Z METFORMINOM ...................................................... 38

3.3 PRIMERJAVA KLINIČNIH ZNAČILNOSTI IN LABORATORIJSKIH VREDNOSTI PRI

BOLNICAH S PCOS PRED UVEDBO ZDRAVLJENJA Z METFORMINOM IN PO

ŠESTMESEČNEM ZDRAVLJENJU .............................................................. 43

3.4 VPLIV POLIMORFIZMA rs366313 A>G V GENU ZA NADH-KOENCIM Q-

REDUKTAZO 4 (GEN NDUFS4) NA SPREMEMBO KLINIČNIH IN LABORATORIJSKIH

PARAMETROV PRI BOLNICAH S PCOS PO ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM ............ 44

3.5 VPLIV POLIMORFIZMA rs12943590 G>A V GENU ZA MATE2-K (GEN SLC47A2)NA

SPREMEMBO KLINIČNIH IN LABORATORIJSKIH PARAMETROV PRI BOLNICAH S PCOS PO

ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM ............................................................ 46

3.6 VPLIV KOMBINACIJE GENOTIPOV POLIMORFIZMA rs12943590 G>A V GENU ZA

MATE2-K (GEN SLC47A2)IN POLIMORFIZMA rs366313 A>G V GENU ZA NADH-KOENCIM

Q-REDUKTAZO 4 (GEN NDUFS4) NA SPREMEMBO KLINIČNIH IN LABORATORIJSKIH

PARAMETROV PRI BOLNICAH S PCOS PO ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM ............ 47

3.7 VPLIV ZAČETNE VREDNOSTI ITM IN ZAČETNE VREDNNOSTI FAI NA

IZBOLJŠANJE REPRODUKTIVNE FUNKCIJE IN AKNAVOSTI PRI BOLNICAH S PCOS PO

ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM ............................................................ 49

4 RAZPRAVA ................................................................................... 51

5 ZAKJUČEK ................................................................................... 57

6 LITERATURA................................................................................. 58

7 ZAHVALA .................................................................................... 64

8 POGOSTEJE UPORABLJENE KRATICE ..................................................... 65

9

KAZALO TABEL IN SLIK

Tabela 1: Možnosti nekirurškega zdravljenja sindroma policističnih jajčnikov ........ 14

Tabela 2: Parametri spremljanja učinkovitosti zdravljenja z metforminom ........... 20

Tabela 3: Povzetek dosedanjih kliničnih ter in vitro farmakogenetskih študij vpliva

genetskih polimorfizmov na farmakokinetične in farmakodinamične lastnosti

metformina....................................................................................... 25

Tabela 4: Primerjava frekvenc alelov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 med bolnicami s PCOS in kontrolami ...... 35


polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 med bolnicami s PCOS in kontrolami ...... 36

Tabela 6: Primerjava frekvenc genotipov polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2

med bolnicami in kontrolami .................................................................. 36

Tabela 7: Primerjava kombinacij genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 med bolnicami in kontrolami ............... 38

Tabela 8: Značilnosti skupine bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom, pred

začetkom zdravljenja ........................................................................... 39

Tabela 9: Klinične značilnosti in laboratorijske vrednosti posameznih bolnic s PCOS

pred in po zdravljenju z metfominom ter rezultati genotipizacije ...................... 40

Tabela 10: Frekvence alelov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in polimorfizma

rs12943590 v genu SLC47A2 pri skupini bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom .. 41

Tabela 11: Frekvence genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 pri bolnicah s PCOS, zdravljenih z

metforminom .................................................................................... 42

Tabela 12: Kombinacije genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in


metforminom .................................................................................... 42

Tabela 13: Laboratorijske vrednosti in ITM pri bolnicah s PCOS pred in po zdravljenju

z metforminom .................................................................................. 43

Tabela 14: Klinične značilnosti bolnic s PCOS pred in po zdravljenju z metforminom

..................................................................................................... 44

Tabela 15: Vpliv polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 na spremembo laboratorijskih

parametrov pri bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom ......................... 45

Tabela 16: Vpliv polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 na spremembo kliničnih


10

Tabela 17: Vpliv polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo

laboratorijskih parametrov pri bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom....... 46

Tabela 18: Vpliv polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo kliničnih


Tabela 19: Vpliv kombinacije genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo laboratorijskih parametrov

pri bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom ........................................ 48


polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo kliničnih parametrov pri

bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom ............................................ 49

Tabela 21: Vpliv začetne vrednosti ITM in FAI pri bolnicah s PCOS na izboljšanje

aknavosti po zdravljenju z metforminom .................................................... 50

Tabela 22: Vpliv začetne vrednosti ITM in FAI pri bolnicah s PCOS na uspešnost

zanositev po zdravljenju z metforminom .................................................... 50

Slika 1: Splošen in specifični mehanizmi delovanja metformina na tarčna tkiva ...... 17

Slika 2: Glavni prenašalci metformina preko membran v človeškem telesu ........... 18

Slika 3: Primer genotipizacije z reakcijo PCR v realnem času na aparaturi

LightCycler® 480 Real-Time PCR System II za polimorfizem rs12943590 v genu

SLC47A2 ........................................................................................... 37

11

1 UVOD

1.1 SINDROM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

1.1.1 OPREDELITEV IN KLINIČNA SLIKA SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

(PCOS)

Sindrom policističnih jajčnikov (PCOS; angl. PolyCystic Ovary Syndrome) je pogosta

endokrinopatija, ki prizadene približno 7 % žensk v rodnem obdobju (1) in je

najpogostejši vzrok anovulatorne neplodnosti (2). Klinična slika PCOS je praviloma

zelo kompleksna in se med bolnicami razlikuje. Prisotni klinični znaki so

hiperandrogenizem, motnje menstrualnega cikla, presnovne motnje, morfološko

policistično spremenjeni jajčniki. Androgenizacija se kaže kot čezmerna telesna

poraščenost ali poraščenost po moškem tipu (hirzutizem), kot androgena plešavost

in/ali aknavost, ki traja še po puberteti. Menstrualni cikli so praviloma kronično

oligo- oz. an-ovulatorni (odražajo se kot oligo- oz. a-menoreja), zaradi česar je

večina bolnic s PCOS zmanjšano plodnih oz. neplodnih. Presnovne motnje, ki so

pogosto prisotne pri bolnicah s PCOS, so inzulinska rezistenca in kompenzacijska

hiperinzulinemija, dislipidemije, skoraj polovica bolnic s PCOS je tudi debelih.

Velikokrat je navedenim kliničnim znakom pridružena tudi psihološka simptomatika

(anksioznost, depresija in druge motnje razpoloženja). Zaradi presnovnih motenj

imajo bolnice s PCOS zvečano tveganje za razvoj sladkorne bolezni tipa 2 (SB2), za

metabolični sindrom ter srčno-žilne bolezni in zaplete, PCOS pa je povezan tudi s

pogostejšim pojavljanjem ovarijskega karcinoma in karcinoma endometrija (2,3, 4).

1.1.2 PATOGENEZA IN ETIOLOGIJA SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

V patogenezo sindroma je vključeno spremenjeno sproščanje in delovanje

luteinizirajočega hormona (LH), na kar kažejo zvečane serumske koncentracije LH,

večja pogostost in amplituda pulznih sproščanj LH, povečana ekspresija receptorjev

za LH v celicah teke in granuloze v jajčniku ter prisotnost genetskih različic LH pri

bolnicah s PCOS (5, 6, 7, 8). Pri sindromu so značilno prisotne motnje v uravnavanju

steroidogeneze, kar pomeni, da se jajčniki pretirano odzivajo na zvečane vrednosti

LH s sintezo steroidov, ki bi bila sicer zavrta, ko LH prestopi stabilne vrednosti (9).

Zaradi povišanih vrednosti LH je porušeno tudi razmerje med LH in folikle

12

stimulirajočim hormonom (FSH). Pod vplivom FSH poteka sinteza estrogena iz

prekurzorjev androgenov, v primeru presežka LH pa se sintetizirajo v glavnem

androgeni (4). Povečana intraovarijska sinteza androgenov spodbuja rast multiplih

manjših foliklov in zaustavi zorenje vodilnega folikla, kar vodi v anovulacijo in

nastanek multiplih ovarijskih cist (10). Kljub temu pa raziskave kažejo, da povišana

sinteza androgenov in policistična morfologija jajčnikov nista vedno odvisni od

povišanih vrednosti LH. Hiperandrogenizem je lahko tudi posledica ekstraglandularne

sinteze androgenov, predvsem v maščobnem tkivu (9) oz. adrenalne disfunkcije, ki jo

zasledimo pri približno polovici bolnic s PCOS (11,12).

Zelo pogosto (v 50-70 %) je pri bolnicah s PCOS prisotna inzulinska rezistenca, lahko s

kompenzacijsko hiperinzulinemijo. Inzulin stimulira izločanje androgenov iz celic

teke jajčnika in zavira nastajanje vezavnega globulina za spolne hormone (SHBG;

angl. Sex Hormone-Binding Globulin) v jetrih, s čimer zvišuje koncentracije prostih

androgenov v serumu. Poleg tega je za bolnice s PCOS značilna tudi povečana

odzivnost jajčnikov na učinke inzulina (13,14,15).

Veliko bolnic s PCOS je predebelih. Debelost poslabša inzulinsko rezistenco, stopnjo

hiperinzulinemije, ovulatorno in menstrualno disfunkcijo, izid nosečnosti in je

povezana s povečano prevalenco metaboličnega sindroma in srčno-žilnih zapletov.

Raziskave kažejo, da je debelost pri bolnicah s PCOS najbrž odraz okoljskih

dejavnikov, možno pa je tudi, da je PCOS vzročni dejavnik za prekomerno telesno

težo in debelost (16, 17).

Glede na dosedanja dognanja na nastanek PCOS vpliva mnogo genetskih različic in

okoljskih dejavnikov (18). Genetski polimorfizmi, ki so predvidoma pomemben

etiološki dejavnik PCOS, se nahajajo v genih za uravnavanje sekrecije in delovanja

gonadotropinov, v genih za proteine, ki vplivajo na sekrecijo in delovanje inzulina, v

genih z vplivom na regulacijo telesne teže in metabolizma ter v genih z vplivom na

regulacijo biosinteze in delovanja androgenov (19,20). Etiologija PCOS pa kljub

številnim raziskavam še vedno ostaja v veliki meri nepojasnjena, zato so za

natančnejšo opredelitev genetskih in drugih dejavnikov tveganja za razvoj PCOS

potrebne še nadaljnje ustrezno zasnovane študije.

1.1.3 DIAGNOZA SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

Diagnozo PCOS postavimo na podlagi Rotterdamskih diagnostičnih kriterijev iz leta

2003:

13

1. Oligo- in/ali a-novulacije

2. Klinični in/ali biokemični znaki hiperandrogenizma

3. Policistična morfologija jajčnikov na ultrazvoku (UZ)

Za postavitev diagnoze morata biti izpolnjena vsaj 2 od 3 navedenih kriterijev ter

izključeni kakršnikoli drugi možni vzroki za podobno klinično sliko (npr. kongenitalna

adrenalna hiperplazija, tumorji, ki sproščajo androgene, Cushingov sindrom ipd.)

(21).

1.1.4 ZDRAVLJENJE SINDROMA POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

Sindrom policističnih jajčnikov zdravimo simptomatsko in individualizirano glede na

terapevtske cilje pri posamezni bolnici (22). Zdravljenje lahko razdelimo na terapijo

»akutnih« težav, kot so motnje menstruacijskega ciklusa, ovulatorna disfunkcija in z

njo povezana neplodnost, simptomi, povezani s hiperandrogenizmom (23), ter na zelo

pomembno dolgoročno obravnavo inzulinske rezistence kot dejavnika pri nastanku

hiperandogenizma, anovulacij (22) in razvoja SB2 v kasnejšem življenjskem obdobju

(22, 24). Terapija se tako med potekom bolezni spreminja, in sicer glede na

pomembnost določene simptomatike v specifičnem življenjskem obdobju bolnice

(24).

Prvi terapevtski ukrep je sprememba življenjskega sloga, predvsem pri bolnicah s

preveliko telesno težo (25). Sledi farmakološko zdravljenje, katerega osnovo

predstavlja zdravljenje s peroralno hormonsko kontracepcijo, klomifen citratom,

metforminom in drugimi peroralnimi antidiabetiki, z antiandrogeni, progestageni in

agonisti gonadotropine sproščujočega hormona (GnRH; angl. Gonadotopin-Releasing

Hormone) (tabela 1). V primeru neuspešnosti farmakološkega zdravljenja se lahko

odločimo tudi za kirurški poseg (laparoskopska resekcija ali elektrokoagulacija

jajčnikov) (23,25).

14

Tabela 1: Možnosti nekirurškega zdravljenja sindroma policističnih jajčnikov (26)

Terapevtski cilj Metoda nekirurškega zdravljenja PCOS

Uravnavanje nerednih menstruacij peroralni kontraceptivi

prilagoditev življenjskega sloga

izguba telesne teže

metformin

Zdravljenje hiperandrogenizma

Biokemično

Zmanjševanje biosinteze androgenov

peroralni kontraceptivi

metformin


izguba telesne teže Zmanjševanje učinkov androgenov

antiandrogeni (npr. spironolakton)

metformin



Mehanična terapija hirzutizma

britje

elektroliza

lasersko odstranjevanje dlak

eflornitin (mazilo 13,9 %)

Zdravljenje neplodnosti klomifen citrat



metformin

Zdravljenje inzulinske rezistence in zmanjševanje tveganja za nastanek SB2


izguba teže

metformin

Legenda: PCOS – sindrom policističnih jajčnikov, SB2 - sladkorna bolezen tipa 2.

1.2 METFORMIN

1.2.1 UPORABA METFORMINA V KLINIČNI PRAKSI

Metfomin je peroralni antidiabetik bigvanidnega tipa in se uporablja za zdravljenje

SB2, zlasti pri bolnikih s prekomerno telesno težo. Sladkorna bolezen tipa 2 je tudi

edina sprejeta terapevtska indikacija metformina (27). Mnoge dosedanje raziskave pa

so potrdile učinkovitost metformina tudi pri zdravljenju PCOS, vendar PCOS (še) ni

15

uradna indikacija za zdravljenje z metforminom. Čeprav ima veliko bolnic s PCOS

pridruženo inzulinsko rezistenco in je zdravljenje z metforminom v njegovi osnovni

indikaciji pri njih na mestu, pa ima metformin učinek tudi na druge presnovne,

hormonske in reproduktivne nepravilnosti, ki so prisotne pri bolnicah s PCOS (28).

Običajni režim zdravljenja se začne z začetnim odmerkom 500 mg ali 850 mg

metformina dvakrat ali trikrat na dan ob obroku. V 10 do 15 dneh postopno večamo

začetni odmerek do želenega terapevtskega, ki navadno znaša 2000 mg na dan. S

postopnim uvajanjem metformina je verjetnost za pojav (hujših oblik) neželenih

stranskih učinkov, zlasti motenj v gastrointestinalnem traktu, manjša (27).

1.2.2 FARMAKODINAMIKA METFORMINA

Primarne tarčne celice metformina so jetrne celice, učinke pa povzroča tudi v

skeletnih mišicah, maščobnem tkivu, endoteliju in jajčnikih (1). Ključni mehanizem

delovanja metformina je inhibicija glukoneogeneze. Metformin zavira tudi proces

glikogenolize, povečuje občutljivost perifernih tkiv za inzulin, izboljša periferni

privzem in porabo glukoze, upočasni absorpcijo glukoze iz črevesja ter ugodno vpliva

na presnovo lipidov (25).

Poleg navedenih presnovnih učinkov metformin pri bolnicah s PCOS tudi učinkovito

zmanjšuje plazemske koncentracije androgenov, in sicer posredno z zmanjšanjem

plazemskih koncentracij inzulina in posledično zmanjšanjem njegovih učinkov na

povečano sintezo androgenov, deluje pa tudi neposredno na jajčnik z zaviranjem

encimov, ki so vključeni v biosintezo androgenov. Tako metfromin ugodno deluje na

vse klinične posledice hiperandrogenizma (1), izboljšuje cikličnost krvavitev in

povzroči ovulacijo, s čimer poveča možnosti za uspešno zanositev (25).

Na molekularnem nivoju je večina učinkov metformina v vseh tarčnih tkivih posledica

aktivacije od adenozin-monofosfata (AMP) odvisne proteinske kinaze (AMPK),

pomembnega znotrajceličnega encima, ki služi kot energetski senzor celice in igra

ključno vlogo pri ohranjanju celičnih funkcij v energetsko neugodnih pogojih.

Posledica aktivacije AMPK je fosforilacija ključnih presnovnih encimov in

transkripcijskih faktorjev ter koaktivatorjev, ki sodelujejo pri izražanju genov, kar

vodi do spremembe celičnega stanja iz anaboličnega v katabolično. Tako je zavrta

sinteza glukoze, lipidov in proteinov, zavrta je celična rast, spodbujena pa je

oksidacija maščobnih kislin in privzem glukoze v celico (29). V posameznih tarčnih

16

tkivih pa metformin deluje tudi po dodatnih mehanizmih, ki so natančneje

predstavljeni na sliki 1.

Natančen mehanizem, kako metformin povzroči aktivacijo AMPK, še ni popolnoma

znan. Raziskave kažejo, da je primarna tarča metformina respiratorna veriga

mitohondrija. Natančneje, metformin inhibira izključno respiratorni kompleks I, prvi

in največji encimski kompleks respiratorne verige, in nima vpliva na ostale korake v

respiratorni verigi mitohondrija. Posledica tega specifičnega delovanja je zmanjšanje

oksidacije molekule nikotinamid dinukleotid (NADH), zaradi česar se zmanjša

protonski gradient čez membrano mitohondrija in s tem nastajanje adenozin-

trifosfata (ATP) iz adenozin-difosfata (ADP) in fosfata. Tako metformin prehodno

zniža energetski status celice, zveča se znotrajcelično razmerje AMP/ATP, kar sproži

aktivacijo AMPK. Za aktivacijo pa je potrebna tudi fosforilacija AMPK s kinazama

serin-treoninsko kinazo 11 (STK11), imenovano tudi jetrna kinaza B1 (LKB1), ter z od

Ca2+/kalmodulina odvisno proteinsko kinazo β (CaMKKβ), kar bi naj alosterično

sprožila molekula AMP (29). Da je primarna tarča metformina prav respiratorni

kompleks 1 in ne neposredno AMPK so nedavno še podkrepili, saj so dokazali

presnovni učinek metformina tudi pri miših z deficienco jetrno specifične AMPK (29).

17

Delovanje v jetrih

Delovanje v jetrih

Metformin deluje v jetrih na spremembo metabolizma glukoze in

lipidov. Glavni posrednik pri delovanju metformina na jetrno

glukoneogenezo in lipogenezo je stimulacija AMPK. Posledično so zavrti geni, ki kodirajo ključne encime, potrebne v procesu

glukoneogeneze in lipogeneze. Vzporedno z zaviranjem lipogeneze

metformin spodbuja tudi oksidacijo maščobnih kislin. Z aktivacijo

heksokinaze in piruvatne kinaze, kar posreduje AMPK, metformin poveča privzem glukoze v celico in spodbuja glikolizo. Legenda: AMPK – z adenozin-monofosfatom aktivirana proteinska kinaza.

Delovanje na skeletne mišice

Tudi v skeletnih mišicah so učinki metformina v glavnem posledica aktivacije AMPK. Kinaza AMPK aktivira atipično proteinsko kinazo C, ki stimulira translokacijo glukoznega transporterja 4 na citoplazemsko membrano. S tem se poveča privzem glukoze v celice. Privzem glukoze pa naj bi metformin povečal tudi z vplivom na izboljšanje inzulinske signalizacije in posredno z zmanjšanjem glukotoksičnosti, lipotoksičnosti in z zmanjšanjem vnetja. Preko aktivacije AMPK metformin inhibira tudi lipogene encime, s čimer se zmanjša lipogeneza, poveča pa se oksidacija maščobnih kislin. Legenda: AMPK – z adenozin-monofosfatom aktivirana proteinska kinaza, aPKC – atipična proteinska kinaza C, GLUT 4 – glukozni transporter 4.

Delovanje na maščobno tkivo

Metformin v maščobnih celicah inhibira lipolizo z inhibicijo fosforilacije kinaze ERK1/2. Tako se zmanjša koncentracija prostih maščobnih kislin v krvi, posledično se izboljša občutljivost tkiv za inzulin. Preko aktivacije AMPK metformin stimulira oksidacijo maščobnih kislin in inhibira lipogenezo ter poveča privzem glukoze v maščevje. Občutljivost maščobnega tkiva za inzulin se izboljša tudi z zmanjšanjem glukotoksičnosti in lipotoksičnosti. Metformin modulira tudi sekrecijo adipokinov iz maščobnih celic. Legenda: AMPK – z adenozin-monofosfatom aktivirana proteinska kinaza, ERK – z zunanjim signalom aktivirana kinaza.

Delovanje na endotelij

Na žilno steno deluje mertformin posredno in neposredno: posredno z vplivom na zmanjšanje koncentracije glukoze v krvi in s tem glukotoksičnosti, z vplivom na zmanjšanje krožečih glikoziliranih spojin in z vplivom na zmanjšanje inzulinske rezistence oz. hiperinzulinemije; neposredno na epitelij pa deluje podobno kot v drugih tkivih, tj. aktivira AMPK. Kinaza AMPK v endoteliju vpliva na aktivacijo sintetaze dušikovega oksida in inhibicijo jedrnega faktorja κB; posledično se poveča sinteza dušikovega oksida (NO), ki je vazodilatator, zmanjšajo se oksidativni stres, nastajanje provnetnih citokinov in vazokonstriktorjev. Z izboljšanjem delovanja inzulina na žilno steno se razmerje med z mitogeni aktivirano protein-kinazno in fosfatidilinozitol-3-kinazno kaskadno signalno potjo prevesi v prid slednje, kar prav tako vpliva na povečano nastajanje NO. Legenda: MAPK – z mitogeni aktivirana proteinska kinaza, PI3K –fosfatidilinozitol-3-kinaza, AMPK – z adenozin-monofosfatom aktivirana proteinska kinaza, NF-κB – jedrni faktor κB, NO – dušikov oksid, eNOS –sintetaza dušikovega oksida v endoteliju, ET-1 – endotelin 1, PAI-1 –inhibitor aktivatorja plazminogena 1, AdMols – adhezijske molekule.

Delovanje na jajčnik

Metformin deluje na jajčnik na dva načina; neposredno in

posredno z zmanjšanjem presežka inzulina v krvi. V celicah teke

inhibira aktivnost encima CYP17. Z zmanjšanjem koncentracij inzulina inhibira ekspresijo receptorja za LH in aktivnost encimov,

ki so vključeni v proces steroidogeneze v celicah granuloze (StAR,

HSD3β, CYP11A1). V celicah granuloze aktivira AMPK, kar dodatno zmanjša sintezo encimov, ki so vključeni v steroidogenezo,

poveča pa se koncentracija antioksidantov. Ti mehanizmi

povzročijo zmanjšanje prekomerne sinteze steroidnih hormonov in

preprečijo prezgodnjo luteinizacijo (zaradi prezgodnje ekspresije receptorjev za LH), s čimer se zveča verjetnost za ovulacijo.

Legenda: PI3K – fosfatidilinozitol-3-kinaza, CYP17 – 17,20-liaza/17-hidroksilaza, LH – luteinizirajoči hormon, LHr – receptor za LH, StAR –protein StAR, HSD3β – 3β-hidroksisteroidna dehidrogenaza, CYP11A1 – citokrom P450scc, AMPK – z adenozin-monofosfatom aktivirana proteinska kinaza.

Slika 1: Splošen in specifični mehanizmi delovanja metformina na tarčna tkiva (1)

18

1.2.3 FARMAKOKINETIKA METFORMINA

Absorpcija metformina po peroralni aplikaciji poteka večinoma iz tankega črevesa.

Pri fiziološkem pH se metformin nahaja v hidrofilni kationski obliki in kot tak ne more

prehajati membran s pasivno difuzijo. Preko celičnih membran ga prenašajo kationski

prenašalci (transporterji), ki so specifično razporejeni po organih (slika 2) (30).

Slika 2:Glavni prenašalci metformina preko membran v človeškem telesu (30)

Legenda: OCT 1/2/3 - organski kationski prenašalec 1/2/3 (angl. Organic Cation Transporter

1/2/3), MATE - antiporter MATE (angl. Multidrug And Toxin Extrusion), PMAT - membranski

prenašalec za monoamine (angl. Plasma membrane MonoAmine Transporter).

Na luminalni strani enterocitov je glavni prenašalec za privzem metformina v črevesu

membranski prenašalec za monoamine (PMAT; angl. Plasma membrane MonoAmine

Transporter), manjšo vlogo pri privzemu metformina iz lumna v enterocite pa ima

tudi organski kationski prenašalec 3 (OCT3; angl. Organic Cation Transporter 3). Na

bazolateralni membrani in v citoplazmi enterocita se nahaja organski kationski

prenašalec 1 (OCT1), ki je odgovoren za prenos metformina v intersticijsko tekočino

oz. v kri. Po peroralni aplikaciji se 20-30 % odmerka metformina ne absorbira in se

neposredno izloča z blatom. Metformin se ne veže na plazemske proteine. Ima velik

volumen porazdelitve, kar nakazuje na to, da tkiva privzemajo metformin v veliki

meri (30). Prenos metformina v tkiva poteka s prenašalci OCT1, organskim kationskim

prenašalcem 2 (OCT2) in OCT3. Prenašalca OCT1 in OCT2 sta prisotna zlasti v organih

za izločanje (31), prvi se v največji meri nahaja v jetrih, drugi v ledvicah. Prenašalec

OCT3 se nahaja v enterocitih, hepatocitih in skeletnih mišicah ter tudi v nadledvični

žlezi (30), v srcu, možganih in placenti (32). Prenašalca OCT1 in OCT3 sta glavna

posrednika prenosa metformina v skeletno-mišično in jetrno celico ter morda

19

prenašata metformin tudi v smeri iz hepatocitov v kri. Oba prenašalca se nahajata

tudi na membrani holangiocitov, kjer njune funkcije niso znane. V jetrih se nahaja

tudi antiporter MATE (angl. Multidrug And Toxin Extrusion), in sicer specifično

MATE1, ki prenaša metformin v žolčni kanal, vendar se metformin po i.v. aplikaciji

ne nahaja v blatu, tako da ta sekrecija ni značilna oz. prihaja do reabsorpcije v

žolčnih vodih. Po prihodu v plazmo se metformin počasi transportira tudi v eritrocite,

kjer se vzdržuje relativno konstantna koncentracija metformina, kar lahko

izkoriščamo za spremljanje (monitoring) odmerjanja. Metformin se v človeškem

organizmu verjetno ne presnavlja in se v nespremenjeni obliki izloča skozi ledvice z

glomerulno filtracijo in tubularno sekrecijo. Glavni ledvični prenašalec metformina v

proksimalno tubulno celico je OCT2, na luminalni strani pa metformin v urin

transportirata prenašalca MATE1 in MATE2-K. Na apikalni (luminalni) membrani so

potrdili tudi prisotnost prenašalca OCT1, ki je najverjetneje vključen v sekrecijo

metformina, čeprav je tudi reabsorpcija možna. Transporterja OCT3 v ledvicah za

enkrat še niso potrdili, dokazali pa so prisotnost mRNA za OCT3. V podocitih so odkrili

tudi prenašalce PMAT, vendar njihova funkcija trenutno še ni pojasnjena (30).

1.3 SPREMLJANJE IN VREDOTENJE UČINKOVITOSTI IN VARNOSTI

ZDRAVLJENJA BOLNIC S SINDROMOM POLICISTIČNIH

JAJČNIKOV Z METFORMINOM

Sindrom policističnih jajčnikov je kompleksna in heterogena bolezen, kar se odraža v

različnih kliničnih slikah in spremembah v samem poteku bolezni. Učinkovitost

terapije zato spremljamo individualno, glede na prisotne klinične simptome in znake

ter glede na pričakovane cilje zdravljenja.

Na osnovi doslej znanih mehanizmov delovanja metformina in dosedanjih raziskav o

učinkovitosti terapije PCOS z metfominom je pri bolnicah s PCOS, zdravljenih z

metforminom, smiselno spremljati in vrednotiti izboljšanje biokemičnih in kliničnih

kazalcev endokrine in reproduktivne disfunkcije (hiperandrogenizem, serumske

koncentracije gonadotropnih hormonov, cikličnost krvavitev, uspešnost ovulacij in

možnosti za zanositev) ter presnovnih nepravilnosti, ki se pojavljajo pri bolnicah s

PCOS (inzulinska rezistenca, hiperinzulinizem, motena toleranca za glukozo,

debelost, dislipidemije) (1,33, 34). V idealnih razmerah bi bilo pri bolnicah s PCOS

smiselno spremljati parametre, ki so navedeni v tabeli 2.

20

Tabela 2:Parametri spremljanja učinkovitosti zdravljenja z metforminom (22, 25, 34

35, 36, 37, 38,)

Klinične značilnosti

ITM

razmerje pas-boki

menstrualni status

morfologija jajčnikov (UZ)

vidnost CL na UZ

Zanositev

Hirzutizem

Aknavost

androgena plešavost

Biokemične značilnosti

serumske koncentracije androgenov: celokupnega in prostega testosterona, androstendiona, dihidroepiandrosteron-sulfata

serumske koncentracije SHBG

FAI

serumske koncentracije gonadotropinov (LH,

FSH)

razmerje serumskih koncentracij LH/FSH

serumske koncentracije estradiola in

progesterona

serumske koncentracije glukoze in inzulina na

tešče

OGTT

indeks HOMA-IR

serumske koncentracije celokupnega holesterola, trigliceridov, HDL in LDL

Legenda: ITM - indeks telesne mase, CL – rumeno telesce (lat. Corpus Luteum), UZ -

ultrazvok, SHBG – vezavni globulin za spolne hormone (angl. Sex Hormone-Binding Globulin),

FAI- indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index), LH - luteinizirajoči hormon, FSH

- folikle stimulirajoči hormon, OGTT - oralni glukozni tolerančni test, indeks HOMA-IR -

merilo za kvantifikacijo inzulinske rezistence (angl. Homeostatic Model Assessment – Insulin

Resistance), HDL -lipoprotein velike gostote (angl. High Density Lipoprotein), LDL -

lipoprotein majhne gostote (angl. Low Density Lipoprotein).

V klinični praksi ne spremljamo vedno vseh parametrov, saj se bolnice fenotipsko

razlikujejo, poleg tega pa se osredotočamo le na neposredne cilje zdravljenja pri

21

posamezni bolnici. Trenutno natančne smernice, katere parametre bi bilo smiselno

spremljati in po kolikšnem času vrednotiti učinkovitost terapije z metforminom pri

bolnicah s PCOS, še niso oblikovane in poenotene. V literaturi se učinkovitost

zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom najpogosteje vrednoti po 6 mesecih od

uvedbe terapije, ko se preveri cikličnost menstruacij in prisotnost ovulatornih

ciklusov ter se sprejmejo odločitve o nadaljnjem zdravljenju (22).

Zdravljenje z metforminom je razmeroma varno. Neželeni učinki, kot so

gastrointestinalne motnje, največkrat slabost in bruhanje, se pojavijo pri 10-25 %

bolnikov, vendar praviloma v blagi obliki in med zdravljenjem praviloma izzvenijo.

Redek, a resen možen zaplet je laktatna acidoza, ki se pojavi predvsem zaradi

neupoštevanja kontraindikacij, zlasti pri bolnikih z ledvičnimi oz. jetrnimi boleznimi;

pri takih bolnikih je zato potrebna previdnost pri predpisovanju (22, 27).

Pred uvedbo zdravljenja z metforminom je potrebno dosledno upoštevati tudi

njegove kontraindikacije, ki so: preobčutljivost na metformin ali katerokoli pomožno

snov v farmacevtski obliki, diabetična ketoacidoza, diabetična predkoma, odpoved ali

zmanjšano delovanje ledvic (očistek kreatinina < 60 ml/min), akutna stanja, ki lahko

vplivajo na delovanje ledvic (npr. dehidracija, huda okužba, šok, intravaskularna

uporaba kontrastnih sredstev, ki vsebujejo jod), akutna ali kronična bolezen, ki lahko

povzroči tkivno hipoksijo (npr. srčno popuščanje, odpoved dihanja, nedavno preboleli

miokardni infarkt, šok), jetrna insuficienca, akutna zastrupitev z alkoholom in

alkoholizem (27).

Zdravljenje opredelimo kot neuspešno, kadar pri bolnici ne pride do izboljšanja

kliničnih in biokemičnih znakov PCOS ali je potrebno zdravljenje ukiniti zaradi

prehudih neželenih učinkov, ki ob zmanjšanju odmerka metformina oz. sčasoma med

terapijo ne izzvenijo.

1.4 RAZLIKE V ODZIVU BOLNIC S SINDROMOM POLICISTIČNIH

JAJČNIKOV NA ZDRAVLJENJE Z METFORMINOM

Pri zdravljenju bolnic s PCOS prihaja do opaznih interindividualnih razlik v odzivu na

terapijo, kar gre pripisati kompleksni patofiziologiji in fenotipskim raznolikostim

bolezni ter posledično različnim farmakološkim odgovorom, tudi v primeru

zdravljenja z metforminom.

22

Pri določenih bolnicah je aplikacija nekega odmerka metformina v določenem

časovnem intervalu ustrezno učinkovita, medtem ko enak režim odmerjanja pri drugi

bolnici ne izzove terapevtskega učinka ali pa je ta manjši, pri tretji bolnici pa je v

enakem primeru terapevtski učinek primeren, a se pojavljajo (prehudi) neželeni

učinki, ki med terapijo ne izzvenijo. Novejše klinične študije so zasnovane tako, da bi

na osnovi poznavanja čim več specifičnih biokemijskih, kliničnih, genetskih, okoljskih

in drugih značilnosti bolnic, bilo možno razložiti razlike v farmakoloških odgovorih

med posamezniki ter predlagati potencialne napovedne dejavnike izida zdravljenja, s

končnim ciljem oblikovati posamezniku optimalno prilagojene režime zdravljenja še

pred uvedbo farmakoterapije (1,29).

1.4.1 VPLIV OKOLJSKIH, KLINIČNIH IN BIOKEMIČNIH DEJAVNIKOV NA ODZIV

BOLNIC S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV NA ZDRAVLJENJE Z

METFORMINOM

Dosedanje raziskave kažejo, da imata višja starost in dalj časa trajajoča neplodnost

negativen vpliv na učinek metformina na reproduktivne nepravilnosti. Kot izstopajoč

dejavnik se je izkazala tudi začetna telesna teža; čeprav so si rezultati dosedanjih

študij nasprotujoči, prevladujejo ugotovitve, da je večji indeks telesne mase (ITM)

povezan s slabšimi terapevtskimi rezultati v smislu presnovnih in reproduktivnih

učinkov (29). Bolnice z anovulatornimi ciklusi so se v primerjavi z bolnicami z

ovulatornimi ciklusi razlikovale tudi v vrednosti indeksa inzulinske rezistence (38),

vendar kliničnega pomena tega dejavnika v napovedovanju izida zdravljenja še niso

potrdili (28). Pomemben vpliv na učinkovitost zdravljenja reproduktivne disfunkcije

imajo tudi serumske koncentracije androgenov pred začetkov zdravljenja; bolnice s

PCOS z manj izraženim hiperandrogenizmom se namreč na zdravljenje z

metforminom odzivajo bolje (1).

1.4.2 VPLIV GENETSKIH DEJAVNIKOV NA ODZIV BOLNIC S SINDROMOM

POLICISTIČNIH JAJČNIKOV NA ZDRAVLJENJE Z METFOMINOM

Velika vloga se v novejših študijah pripisuje genetskim dejavnikom, ki vplivajo na

farmakokinetiko in farmakodinamiko metformina. Rezultati dosedanjih kliničnih

študij in študij in vitro, v katerih so preučevali vpliv izbranih polimorfizmov

23

posameznih nukleotidov (SNP; angl. Single Nucleotide Polymorphism) na učinkovitost

zdravljenja z metforminom, so zbrani v tabeli 3.

S področja farmakokinetike metformina so med najbolj preučevanimi polimorfizmi

genov, ki kodirajo prenašalce OCT1 (31), OCT2 (39, 40), MATE1 (41, 42) in MATE2-K

(42, 43). Rezultati študij kažejo, da polimorfizmi v genu za prenašalec OCT1 verjetno

pomembno vplivajo na ledvični očistek metformina (31), nekateri pa vplivajo tudi na

presnovne učinke metformina (35, 44). V genu za prenašalec OCT2 so preučevali več

polimorfizmov, vendar pri večini nisi odkrili povezave z ledvičnim očistkom

metformina (31), ali pa so se polimorfizmi v populaciji pojavljali s pogostostjo 0,1

%, tako da ne moremo govoriti o njihovem ključnem vplivu na farmakokinetiko

metformina (41). Veliko študij obravnava vpliv polimorfizma rs3160198 v genu za

OCT2 (808GT, Ala270Ser) na farmakokinetične lastnosti metformina, vendar

rezultati ne ponujajo enotnih odgovorov (39, 40, 45). Vpliva genetskih različic v genu

za prenašalec OCT3 na ledvični očistek kreatinina doslej niso potrdili (31). V genu za

prenašalec MATE1 so ugotovili prisotnost enajstih polimorfizmov, ki določajo

zmanjšano aktivnost prenašalca, vendar so frekvence ustreznih alelov v populaciji

večinoma < 5 %, zato ne moremo govoriti o klinični pomembnosti teh rezultatov (41).

Potencialno klinično uporaben napovedni dejavnik učinkovitosti terapije z

metforminom je med polimorfizmi v genu za prenašalec MATE1 za enkrat le

polimorfizem rs2289669, in sicer prisotnost alela A pri bolnikih s SB2 določa večji

antihiperglikemični učinek (46). Genetske različice v genu za prenašalec MATE2-K so

bile doslej preučevane le v manjšem obsegu; opisali so popolno izgubo funkcije

navedenega transporterja ob prisotnosti manj pogostih alelnih različic polimorfizmov

rs111060529 in rs111060532 (42) ter zmanjšano aktivnost MATE2-K in slabši odziv na

zdravljenje v primeru manj pogostih različic polimorfizmov PMT5634, rs34399035 in

rs1294530 (43). Polimorfizmi v genih za SHBG, za receptor za androgene (AR) ter za

substrat za inzulinski receptor 1 (IRS1) vplivajo verjetno predvsem na presnovne

učinke bolnikov (47, 48).

Dosedanje študije v zvezi z genetskimi polimorfizmi v genih za proteine, ki lahko

vplivajo na farmakodinamične lastnosti metformina, so se osredotočile predvsem na

serin-treoninsko kinazo 11 (STK11). Prisotnost alela C polimorfizma rs8111699 G>C v

genu za STK11 je povezana z zmanjšanim odzivom jajčnika na metformin pri bolnicah

s PCOS (49) ter s slabšo učinkovitost zdravljenja pri dekletih s hiperinzulinemjo (50).

24

Posamezne genetske različice pa vplivajo le na določen nivo v kompleksnem

mehanizmu delovanju metformina. Zato je sklepanje o učinkovitosti terapije z

metforminom pri kompleksnih več faktorskih boleznih, kot je PCOS, pogosto le

posredno in omejeno na specifične parametre posameznih podskupin bolnikov.

Dosedanje asociacijske študije povezave izbranih genetskih polimorfizmov z

učinkovitostjo in varnostjo zdravljenja bolnikov z metforminom so bile izvedene že

na različnih populacijah, a v pretežni meri le pri bolnikih s SB2. Glede na dosedanja

odkritja na področju farmakogenetike metformina in vpliva izbranih genetskih

polimorfizmov na učinkovitost zdravljenja pri bolnikih s SB2 bi bilo farmakogenetski

vidik metformina smiselno v večji meri ovrednotiti tudi na več populacijah bolnic s

PCOS, pri katerih je metformin prav tako ena izmed terapevtskih možnosti.

25

Tabela 3: Povzetek dosedanjih kliničnih ter in vitro farmakogenetskih študij vpliva

genetskih polimorfizmov na farmakokinetične in farmakodinamične lastnosti

metformina

Protein (oznaka gena)

Genetski polimorfizem

Vrsta študije (populacija)

Rezultat: vpliva na ...

Ref.

OCT1 (SLC22A1)

rs12208357 CT

rs34130495 GA rs72552763 420del

rs34059508 GA

prospektivna klinična (150 bolnic s PCOS)

plazemske koncentracije lipidov in učinke inzulina

35

klinična (103 zdravi belci)

ledvični očistek metformina

31

rs622342 A>C klinična (98 bolnikov)

antihiperglikemični učinek

44

rs1867351 G>C rs45476695 G>A

klinična (103 zdravi belci)


31

Q97K 289 CA

P117L 350 CT

R206C 616 CT

in vitro (celice HEK293)

aktivnost prenašalca

51

rs12208357 CT

in vitro (jetrne celice živih darovalcev)

izražanje prenašalca

52

OCT2 (SLC22A2)

rs316019 GT

klinična (112 zdravih Kitajcev)


45

in vitro (celice HEK293)

aktivnost prenašalca

39 klinična (23 zdravih belcev)


in vitro (človeške ledvične celice)

občutljivost za metformin

41

OCT3 (SLC22A3)

rs1810126 C>T rs3088442 C>T rs2048327 T>C rs2292334 G>A

in vitro (jetrne celice živih darovalcev)

izražanje mRNA 52

MATE1 (SLC47A1)

rs2289669 GA klinična (116 bolnikov)

antihiperglikemični učinek

46

rs35646404 TC rs35790011 G>A

in vitro (celice HeLa)


41

rs7763069 G>A klinična (populacija 89 Japoncev)

prenašalno funkcijo

42

MATE2-K (SLC47A2)

PMT5634 C>T rs34399035 G>A

in vitro (HEK 293 celice) klinična (43-46 belcev s SB2)

aktivnost prenašalca 43

rs1294350 (130G>A)

odziv na zdravljenje

26

Legenda: SLC22A1/2/3 - gen za organski kationski prenašalec 1/2/3, OCT1/2/3 - organski

kationski prenašalec 1/2/3, SLC47A1 - gen za prenašalec MATE1, MATE1 - antiporter angl.

Multidrug And Toxin Extrusion 1, STK11 - serin-treoninska kinaza 11, SHBG – vezavni

protein za spolne hormone, AR – receptor za androgene, SB2 - sladkorna bolezen tipa 2,

HEK-293 - humane zarodne ledvične celice, HeLa - humane rakave celice ustja

materničnega vratu, mRNA - informacijska RNA, PCOS - sindrom policističnih jajčnikov, A -

adenin, T - timin, G - gvanin, C – citozin, ref. - referenca

rs111060532 GC>TT rs111060529 G>T

klinična (89 Japoncev)

prenašalno funkcijo

42

SHBG (SHBG) in AR (AR)

SHBG (TAAAA)n AR (CAG)n

klinična (70 deklet s PCOS)

plazemske koncentracije androgenov in lipidov

47

STK11 (STK11)

rs8111699 C>G

klinična (312 žensk s PCOS)

odgovor jajčnikov 49

klinična (85 deklet s hiperinzulinemijo)

aktivnost STK11, občutljivost za inzulin, učinkovitost metformina

50

27

1.5 NAMEN RAZISKAVE

Osnovni namen raziskave je ugotoviti potencialni vpliv izbranih genetskih

polimorfizmov v genu za respiratorni kompleks 1 oz. za prenašalec MATE2-K na

učinkovitost zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom. Zaradi kompleksne

patofiziologije PCOS in fenotipskih raznolikosti namreč prihaja pri bolnicah do

precejšnjih interindividualnih razlik v farmakološkem odzivu na zdravljenje. Z dobrim

poznavanjem anamnestičnih, kliničnih, biokemičnih in genetskih značilnosti

posamezne bolnice bi lahko že pred uvedbo zdravljenja z metforminom predvideli

odziv bolnice ter predlagali zanjo ustrezen način zdravljenja, optimalni odmerek in

odmerni interval.

Z raziskavo želimo preveriti in dokazati, da je metformin učinkovito in varno zdravilo

tudi pri zdravljenju slovenskih bolnic s PCOS in da velja zato dolgoročno razmisliti o

vključitvi PCOS med uradno priznane indikacije za zdravljenje z metforminom.

1.5.1 CILJI RAZISKAVE

ugotoviti in primerjati frekvence alelov, genotipov in kombinacije

genotipov polimorfizma rs366313 A>G v genu za NADH-koencim Q-

reduktazo 4 (gen NDUFS4) in polimorfizma rs12943590 G>A v genu za

MATE2-K (gen SLC47A2) med bolnicami s PCOS in kontrolami

ugotoviti, ali se po 6-mesečnem zdravljenju z metforminom pri bolnicah s

PCOS izboljšajo izbrani biokemijski in klinični parametri, ki kažejo na

uspešnost zdravljenja

ugotoviti, ali ima polimorfizem rs366313 A>G v genu za NADH-koencim Q-

reduktazo 4 (gen NDUFS4) vpliv na spremembo kliničnih in biokemijskih

parametrov po 6-mesečnem zdravljenju bolnic s PCOS z metforminom

ugotoviti, ali ima polimorfizem rs12943590 G>A v genu za MATE2-K (gen

SLC47A2) vpliv na spremembo kliničnih in biokemijskih parametrov po 6-

mesečnem zdravljenju bolnic s PCOS z metforminom

ugotoviti, ali ima kombinacija genotipov polimorfizma rs366313 A>G v genu

za NADH-koencim Q-reduktazo 4 (gen NDUFS4) in polimorfizma rs12943590

G>A v genu za MATE2-K (gen SLC47A2) vpliv na spremembo kliničnih in

28

biokemijskih parametrov po 6-mesečnem zdravljenju bolnic s PCOS z

metforminom

potrditi, da manjša začetna vrednost ITM in manjši začetni indeks prostih

androgenov (FAI) pri bolnicah s PCOS, zdravljenih z metforminom, ugodno

vplivata na izboljšanje reproduktivne funkcije (zanositev) in aknavosti

29

2 PREISKOVANKE IN METODE DELA

2.1 PREISKOVANKE

2.1.1 BOLNICE S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV

V raziskavi smo obravnavali 122 odraslih bolnic s potrjeno diagnozo sindroma PCOS, ki

so bile obravnavane v sklopu redne ambulantne dejavnosti prof. dr. Ksenije Geršak,

dr. med., svetnice na Ginekološki kliniki v Ljubljani med leti 2002-2008. Vse bolnice

so izpolnjevale vsaj dva izmed treh Rotterdamskih kriterijev za postavitev diagnoze

PCOS (21, podrobneje pod točko 1.1.3) in so imele izključene druge vzroke

hiperandrogenizma in anovulatornih ciklusov, kot so prirojena hiperplazija

nadledvične žleze, Cushingov sindrom, tumorji, ki imajo za posledico izločanje

androgenov, veliki odmerki eksogenih androgenov, sindrom hude inzulinske

rezistence, idiopatska poraščenost, idiopatski hiperandrogenizem in drugi vzroki za

moteno delovanje jajčnikov (hiperprolaktinemija, nepravilno delovanje ščitnice).

2.1.2 BOLNICE S SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJČNIKOV, ZDRAVLJENE Z

METFORMINOM

Iz skupine bolnic s PCOS smo izbrali tiste bolnice, ki so bile zdravljene z

metforminom v monoterapiji vsaj šest mesecev in so bile brez kontraidikacij za

jemanje metformina (27, podrobneje pod točko 1.3). Tako smo obravnavali 20 bolnic

v povprečni starosti 30,5 ± 5,4 leta. Vse bolnice so imele izražene motnje

menstrualnega cikla, policistično morfologijo jajčnikov na UZ in klinično izražen

hiperandrogenizem (aknavost). Vodilni cilj zdravljenja je bila pri vseh bolnicah želja

po zanositvi.

2.1.3 KONTROLNA SKUPINA PREISKOVANK

Kontrolno skupino je sestavljalo 81 predvidoma zdravih žensk primerljive starosti, z

dokazano plodnostjo (zdrave nosečnice) oz. žensk, ki so bile vključene v postopek

oploditve z biomedicinsko pomočjo zaradi mehanskega vzroka neplodnosti ali zaradi

neplodnosti njihovega partnerja. Vključitveni kriteriji so bili morfologija jajčnikov

30

brez posebnosti, odsotnost kliničnega in/ali biokemičnega hiperandrogenizma in

motenj menstrualnega cikla ter negativna anamneza operacij v medeničnem predelu,

avtoimunskih in endokrinih motenj.

Preiskovanke so bile seznanjene z namenom in potekom raziskave in so se s

sodelovanjem v raziskavi strinjale. Zaščita osebnih podatkov bolnic je bila v skladu z

Zakonom o zaščiti osebnih podatkov. Načrt in protokol raziskave je odobrila Komisija

Republike Slovenije za medicinsko etiko (št. 159/08/12).

2.2 METODE DELA

2.2.1 IZBIRA GENETSKIH POLIMORFIZMOV POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV

Genetske raznolikosti, ki vplivajo na farmakodinamične in farmakokinetične lastnosti

metformina, verjetno pomembno vplivajo na učinkovitost in varnost zdravljenja z

metforminom. Domnevamo pa, da imajo genetske raznolikosti na področju

farmakodinamike vpliv tudi na razvoj sindroma, saj so v patogenezo vključeni tudi

mehanizmi na katere učinkuje metformin. Vpletenosti genetskih raznolikosti na

področju farmakokinetike v razvoj sindroma pa ni smiselno pričakovati. Za analizo v

naši raziskavi smo izbrali genetska polimorfizma iz obeh skupin farmakoloških

značilnosti metformina ter pri izbiri upoštevali ustrezno frekvenco alelov v populaciji

(MAF; angl. Minor Allele Frequency).

2.2.1.1 IZBIRA POLIMORFIZMA rs366313 A>G V GENU ZA NADH-KOENCIM Q-

REDUKTAZO 4 (GEN NDUFS4)

Glede na doslej znane mehanizme delovanja metformina smo v raziskavi kot genetski

polimorfizem s področja farmakodinamike izbrali rs366313 A>G v genu za NADH-

koencim Q-reduktazo 4 (gen NDUFS4). Encim NADH-koencim Q-reduktaza 4 je ena

izmed 45 podenot respiratornega kompleksa 1, ki je po najnovejših dognanjih

primarna tarča delovanja metformina (29). Gre za protein velikosti 18 kDa, ki ga

kodira gen NDUFS4 na kromosomu 5. Njegova fosforilacija naj bi bila ključni korak v

aktivaciji in regulaciji delovanja kompleksa 1 ter aktivaciji celotne respiratorne

verige. Gen NDUFS4 naj bi predstavljal tudi predilekcijsko mesto za pogostejše

31

pojavljanje genetskih mutacij (53, 54). Vrednost MAF izbranega polimorfizma je

G=0,33 (55).

Poleg navedenega smo pri izbiri tega polimorfizma upoštevali tudi, da genetskih

različic za podenote respiratornega kompleksa 1 po doslej znanih in dostopnih

relevantnih virih v povezavi z odzivom bolnic s PCOS na zdravljenje z metforminom

še niso testirali niti v študijah in vitro niti v kliničnih farmakogenetskih študijah.

2.2.1.2 IZBIRA POLIMORFIZMA rs12943590 G>A V GENU ZA MATE2-K (GEN SLC47A2)

V farmakokinetiki metformina imajo ključno vlogo polispecifični prenašalci, ki

prenašajo metformin skozi celične membrane (56). Polimorfne različice v genih za te

prenašalce vplivajo na učinkovitost prenosa metformina, zaradi česar prihaja med

posamezniki do razlik v odzivu na zdravljenje z metforminom, kar je potrdilo mnogo

kliničnih in in vitro farmakogenomskih študij (tabela 3). Iz tabele 3 je razvidno, da se

je večina tovrstnih študij osredotočila na prenašalce OCT1, OCT2, OCT3 in MATE1.

Med manj proučevanimi prenašalci je MATE2-K, ki deluje kot H+/organski kationski

izmenjevalec na luminalni membrani ledvične tubulne celice (57). Vpliv polimorfnih

različic v genu za MATE2-K na učinkovitost terapije z metforminom so doslej

preučevali le pri bolnikih s SB2 (42, 43).

Za analizo v naši raziskavi smo tako kot polimorfizem s področja farmakokinetike

izbrali rs12943590 G>A v genu za MATE2-K (gen SLC47A2). Vrednost MAF navedenega

polimorfizma je A=0,30 (55).

Po naših podatkih klinična študija, ki bi preučevala vpliv genetske raznolikosti v genu

SLC47A2 doslej na populaciji slovenskih bolnic s PCOS še ni bila narejena.

2.2.2 VRSTA RAZISKAVE

Izvedli smo asociacijsko študijo dveh izbranih genetskih polimorfizmov na slovenski

populaciji bolnic s PCOS in kontrolni skupini preiskovank ter na osnovi retrospektivnih

podatkov iz zdravstvenih kartotek bolnic s PCOS ovrednotili vpliv izbranih genetskih,

biokemijskih in kliničnih parametrov na uspešnost zdravljenja z metforminom.

32

2.2.3 PRIDOBIVANJE PODATKOV O BOLNICAH IZ ZDRAVSTVENIH KARTOTEK

Za potrebe raziskave smo anamnestične, klinične in biokemijske parametre in

podatke o bolnicah s PCOS, zdravljenih z metforminom, pridobili iz njihovih

zdravstvenih kartotek. Pridobili smo naslednje podatke in parametre:

pred uvedbo zdravljenja z metforminom: starost bolnice, ITM, plazemske

koncentracije celokupnega testosterona, plazemske koncentracije SHBG,

plazemske koncentracije LH in FSH, plazemske koncentracije glukoze in

inzulina na tešče, podatke o aknavosti (da/ne) in o vidnosti rumenega

telesca (CL) na UZ (da/ne)

po 6 mesecih zdravljenja z metforminom: ITM, plazemske koncentracije

celokupnega testosterona, plazemske koncentracije SHBG, plazemske

koncentracije LH in FSH, podatke o aknavosti (da/ne), o vidnosti CL na UZ

(da/ne) in o zanositvi (da/ne)

Na podlagi navedenih parametrov smo izračunali vrednosti FAI, razmerje LH/FSH

pred in po uvedbi zdravljenja z metforminom ter indeks HOMA-IR. Vrednost FAI

predstavlja indeks prostih androgenov in se izračuna po formuli: 100 x plazemska

koncentracija celokupnega testosterona / plazemska koncentracija SHBG. Indeks

HOMA-IR je parameter za kvantifikacijo inzulinske rezistence in ga izračunamo po

formuli: plazemska koncentracija inzulina na tešče (mIU/L) x plazemska

koncentracija glukoze na tešče (mmol/L) / 22,5 (58).

Zdravljenje smo v raziskavi opredelili kot uspešno pri bolnicah, pri katerih je prišlo

do izboljšanja vsaj enega od kliničnih (uspešna zanositev, manj aknavosti, viden CL

na UZ) oz. biokemijskih parametrov (zmanjšanje plazemskih koncentracij

testosterona, zvečanje plazemskih koncentracij SHBG, zmanjšanje FAI, zmanjšanje

plazemskih koncentracij LH, zmanjšanje razmerja LH/FSH, zmanjšanje ITM).

Zdravljenje je bilo bolj uspešno, če je prišlo do izboljšanja večjega števila

parametrov. Nasprotno pa smo zdravljenje opredelili kot neuspešno, če pri bolnicah

ni prišlo do izboljšanja nobenega od navedenih parametrov.

33

2.2.4 MOLEKULARNO GENETSKA ANALIZA

V raziskavi smo na že izolirani DNA iz levkocitov polne periferne krvi preiskovank

izvedli genetsko analizo dveh izbranih polimorfizmov. Za analizo smo uporabili

verižno reakcijo s polimerazo (PCR) v realnem času, ki je potekala na aparaturi

LightCycler® 480 Real-Time PCR System II (Roche Applied Science, Basel, Švica).

Protokol laboratorijskega dela je potekal v skladu z navodili proizvajalca pod

univerzalnimi reakcijskimi pogoji. Uporabili smo metodo alelne diskriminacije, v

kateri sta bili sondi označeni z barviloma VIC in FAM. Reakcijsko zmes je sestavljala

DNA preiskovank, univerzalna reakcijska zmes za reakcijo PCR TaqMan® in komplet

reagentov za genotipizacijo polimorfizmov posameznih nukleotidov z ustreznimi

oligonukleotidi in sondami TaqMan® (Life Technologies, Applied Biosystems,

Carlsbad, California, ZDA). Vse reakcije so potekale na ploščici s 96 luknjami v

volumnu reakcijske zmesi 20 µL. Dobljene rezultate smo analizirali s programom

LightCycler® 480 Gene Scanning Software (Life Technologies, Applied Biosystems,

Carlsbad, California, ZDA)

2.2.5 STATISTIČNA ANALIZA

Klinične in laboratorijske podatke o bolnicah (starost, ITM, aknavost, viden CL na UZ,

zanositev ter plazemske koncentracije inzulina na tešče, glukoze na tešče, indeksa

HOMA-IR, plazemskih koncentracij celokupnega testosterona, SHGB, LH, FSH,

razmerja LH/FSH ter FAI) smo statistično obdelali s pomočjo deskriptivne analize.

Podatki so predstavljeni kot srednja vrednost ± SD. Raziskovalni vzorec smo

predstavili na podlagi frekvenčne in odstotne porazdelitve vrednosti. Za primerjavo

frekvenc alelov in genotipov posameznih polimorfizmov in njihovih kombinacij med

bolnicami in kontrolno skupino smo uporabili test hi-kvadrat. Enak test smo uporabili

za primerjavo kliničnih parametrov pred in po zdravljenju ter za ugotavljanje vpliva

genotipa posameznega polimorfizma oz. kombinacije obeh genotipov na spremembo

kliničnih in biokemijskih parametrov po zdravljenju. Za primerjavo biokemijskih

parametrov pred in po zdravljenju smo uporabili t-test za odvisne vzorce, za

ugotavljanje vpliva začetne vrednosti ITM in FAI na izboljšanje kliničnih parametrov,

smo uporabili t- test za neodvisne vzorce. Pri ugotavljanju vpliva genotipa

posameznih polimorfizmov in njihovih kombinacij na spremembo biokemijskih

parametrov po zdravljenju smo uporabili enofaktorsko analizo variance (ANOVA).

34

Statistično pomembnost je predstavljala vrednost p<0,05. Statistična analiza je bila

narejena s programom SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, ZDA).

Praktični del raziskovalne naloge smo v celoti izvedli v laboratoriju Katedre za

farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo Medicinske fakultete Univerze v

Mariboru.

35

3 REZULTATI

3.1 PRIMERJAVA FREKVENC ALELOV, GENOTIPOV POLIMORFIZMA

rs366313 A>G V GENU ZA NADH-KOENCIM Q-REDUKTAZO 4

(GEN NDUFS4) IN POLIMORFIZMA rs12943590 G>A V GENU

ZA MATE2-K (GEN SLC47A2) TER KOMBINACIJ TEH

GENOTIPOV MED BOLNICAMI S PCOS IN KONTROLAMI

Primerjava frekvenc alelov obeh polimorfizmov med skupino bolnic s PCOS in kontrol

ni pokazala statistično pomembne razlike v porazdelitvi alelov polimorfizma rs366313

v genu NDUFS4 (X²= 0,435 p= 0,501) in polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 (X²=

0,277 p= 0,599) med obema skupinama. Rezultate prikazuje tabela 4.


polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 med bolnicami s PCOS in kontrolami

Polimorfizem Alel Število alelov

Bolnice Kontrole

rs366313 v genu NDUFS4

A n 209 136

% 86% 84%

G n 33 26

% 14 % 16%

rs12943590 v genu SLC47A2

A n 86 53

% 35% 33%

G n 158 109

% 65% 67%

Legenda: NDUFS4 – gen za protein NADH-koencim Q-reduktaza 4,

SLC47A2 – gen za prenašalec MATE2-K, , A- alanin, G- gvanin,

Rezultati genotipizacije in primerjava genotipov polimorfizma rs366313 v genu

NDUFS4 med bolnicami in kontrolami so prikazani v tabeli 5. AG, GG in AA so možne

variante genotipa. Rezultati prikazujejo, da so le te med skupinama približno enako

razporejene, v vsaki skupini največji delež predstavljajo homozigoti AA. Test hi-

kvadrat ni pokazal statistično pomembnih razlik med skupinama (X²= 0,466 p= 0,792).

36


polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 med bolnicami s PCOS in kontrolami

Število

Bolnice Kontrole

Genotip

polimorfizma

rs366313 v

genu NDUFS4

AG n 29 22

% 24,0% 27,2%

GG n 2 2

% 1,7% 2,5%

AA n 90 57

% 74,4% 70,4%

Legenda: NDUFS4 – gen za protein NADH-koencim Q-reduktaza 4, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

Tabela 6 prikazuje rezultate genotipizacije in primerjavo med skupinami za

polimorfizem rs12943590 v genu SLC47A2. Možne variante genotipa so AA, GG in AG.

Rezultati kažejo, da so variante po skupinah približno enako razporejene, v vsaki

skupini pa največji delež predstavljajo homozigoti GG. Test hi-kvadrat ni pokazal

statistično pomembnih razlik med skupinama (X²= 0,245, p=0,885).

Tabela 6: Primerjava frekvenc genotipov polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2

med bolnicami in kontrolami

Število

Bolnice Kontrole

Genotip

polimorfizma

rs12943590 v

genu SLC47A2

AG n 44 29

% 36,1% 35,8%

GG n 57 40

% 46,7% 49,4%

AA n 21 12

% 17,2% 14,8%

Legenda: SLC47A2 – gen za prenašalec MATE2-K, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

37

Legenda: Endpoint Fluorescence Scatter plot- fluorescenčni signali po končani

reakciji PCRv realnem času, Fluorescenca 533-610 – fluorescenca barvila VIC,

Fluorescenca 465-510- fluorescenca barvila FAM

Slika 3: Primer genotipizacije z reakcijo PCR v realnem času na aparaturi

LightCycler® 480 Real-Time PCR System II za polimorfizem rs12943590 v genu

SLC47A2

V tabeli 7 so prikazane kombinacije genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4

in polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 (genotip rs366313/genotip rs12943590),

ki so zastopane v skupini preiskovank. Pri obeh skupinah se pojavljajo enake

kombinacije genotipov, razen kombinacije AG/GG, ki se v skupini kontrol ne pojavi, v

skupini bolnic pa le enkrat. Kombinacije so med skupinama približno enako

razporejene, test hi- kvadrat ni pokazal statistično pomembnih razlik med skupinama

(X2=2,353; p=0,938).

38

Tabela 7: Primerjava kombinacij genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 med bolnicami in kontrolami

Število Bolnice Kontrole

Kombinacija genotipov polimorfizmov

(rs12943590/ rs366313)

AA/AA

n 13 7

% 10,7% 8,6%

AA/AG

n 7 5

% 5,8% 6,2%

AG/AA

n 37 23

% 30,6% 28,4%

AG/AG

n 6 6

% 5,0% 7,4%

AG/GG

n 1 0

% 0,8% 0,0%

GG/AA

n 40 27

% 33,1% 33,3%

GG/AG

n 16 11

% 13,2% 13,6%

GG/GG

n 1 2

% 0,8% 2,5%

Legenda: AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

3.2 KLINIČNE, LABORATORIJSKE IN GENETSKE ZNAČILNOSTI

SKUPINE BOLNIC S PCOS ZDRAVLJENIH Z METFORMINOM

V tabeli 8 so predstavljene povprečne vrednosti laboratorijskih parametrov,

povprečna starost in ITM bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom, pred začetkom

zdravljenja. Obravnavali smo 20 bolnic, v povprečju starih 30,5 let. Povprečne

vrednosti ITM in merjenih laboratorijskih parametrov so bile večinoma v okviru

referenčnih vrednosti, razen vrednosti FAI, razmerja LH/FSH in celokupnega

plazemskega testosterona, ki so bile pri bolnicah povišane. Iz tabele 8 pa je razvidno,

da nekatere vrednosti zelo odstopajo od referenčnih. Vse bolnice so imele akne, na

UZ niso imele vidnega CL in so želele zanositi.

39

Tabela 8: Značilnosti skupine bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom, pred

začetkom zdravljenja

Povprečje ± SD

Razpon Referenčna vrednost

Starost (leta) 30,5 ± 5,4 23 – 45 /

ITM (kg/m2) 23,4 ± 3,3 18,3 - 32,4 20 – 25

Inzulin (mIU/l) 8,5 ± 2,4 5,0 - 15,7 5 - 25

Glukoza (mmol/l) 3,9 ± 0,7 2,3 - 5,1 3,6- 6,1

HOMA-IR indeks 1,5 ± 0,5 0,8 - 3,0 < 2,6

T (nmol/l) 3,3 ± 1,6 1,7 - 6,8 1,0 – 3,0

SHBG (nmol/l) 36,5 ± 18,8 9,0 - 82,0 19,8 - 155,2

FAI 11,3 ± 7,3 2,3 - 33,3 0,5 – 7,3

LH (IU/l) 11,3 ± 5,4 4,0 - 24,6 1,1 – 11,6

FSH (IU/l) 5,8 ± 3,8 2,5 - 20,1 2,8 – 11,3

Razmerje LH/FSH 2,1 ± 0,7 1,1 - 3,9 1

Legenda: SD=standardna deviacija,ITM – indeks telesne mase, indeks HOMA-IR – merilo za

kvantifikacijo inzulinske rezistence (angl. Homeostatic Model Assessment – Insulin

Resistance), T – celokupni plazemski testosteron, SHBG – vezalni globulin za spolne hormone

(angl. Sex Hormone Binding Globuline), FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free

Androgen Index), LH – luteinizirajoči hormon, FSH – folikle stimulirajoči hormon

V tabeli 9 so podrobno predstavljene klinične značilnosti in laboratorijske vrednosti

posameznih bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom, pred in po 6 mesečnem

zdravljenju ter rezultati genotipizacije. Ker so rezultati prikazani za vsako

posamezno bolnico, imamo vpogled v individualni izid zdravljenja.

40

Tabela 9: Klinične značilnosti in laboratorijske vrednosti pri posameznih bolnicah s PCOS pred in po zdravljenju z metfominom ter rezultati genotipizacije

Legenda: Str – starost, ITM – indeks telesne mase, INS – vrednost plazemskega inzulina, GLK – vrednost plazemske koncentracije glukoze, indeks HOMA-IR - merilo za kvantifikacijo inzulinske rezistence (angl. Homeostatic Model Assessment – Insulin Resistance), T- celokupni plazemski testosteron, SHBG – vezalni globulin za spolne hormone (angl. Sex Hormone Binding Globuline), FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index), LH – luteinizirajoči hormon, FSH – folikle stimulirajoči hormon, Akn – akne, CL – rumeno telesce, UZ – ultrazvok, Zn – zanositev, P1- polimorfizem rs366313 v genu NDUFS4, P2 - polimorfizem rs12943590 v genu SLC47A2, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

N Str ITM (kg/m2)

INS (mIU/l)

GLK( mmol/l )

HOMA-IR

T( nmol/l)

SHBG ( nmol/l)

FAI

LH ( IU/l)

FSH ( IU/l)

LH/FSH Akn Viden CL na

UZ Zn

Genotip

pred po pred po Pred po Pred po pred Po pred Po Pred po P1 P2

1 24 24,42 24,4 7,40 4,20 1,38 3,40 3,2 66 62 5,2 5,2 11,30 5,5 4,90 5,8 2,31 0,95 ne da

AA AA

2 36 25,83 25,3 5,00 4,20 0,93 4,70 4,5 46 40 10,2 11,3 14,90 10,2 9,80 6,9 1,52 1,48 ne ne

AA AG

3 33 24,01 24 8,00 3,80 1,35 3,30 3,3 21 29 15,7 11,4 12,20 12,2 6,00 6,1 2,03 2 ne ne

AA GG

4 39 20,74 20,7 9,10 4,50 1,82 5,80 4,9 30 48 19,3 10,2 20,20 6,8 7,08 6,5 2,85 1,05 ne da da AA GG

5 30 22,52 22,5 8,20 3,40 1,24 2,10 2 19 28 11,1 7,1 6,93 5,1 4,16 5,2 1,67 0,99 da da

AA AG

6 27 22,35 22,4 7,60 2,30 0,78 2,90 3 62 59 4,7 5,1 9,30 8,3 5,50 4,9 1,69 1,69 ne ne

AG GG

7 26 21,51 21,5 8,20 4,60 1,68 1,80 2,1 44 62 4,1 3,4 9,80 5,2 4,00 5,6 2,45 0,93 ne da

AA GG

8 28 23,05 27,6 6,10 4,20 1,14 2,70 2,4 41 28 6,6 8,6 14,70 6,6 5,80 4,2 2,53 1,57 ne ne

AA AG

9 35 20,85 22,5 7,90 4,30 1,51 4,20 2 30 20 14,0 10 13,90 3,9 5,03 4,6 2,76 0,85 da da da AG AG

10 29 24,11 24 11,20 4,70 2,34 1,90 2,1 82 75 2,3 2,8 12,80 10 5,60 5,9 2,29 1,69 da ne

AA AG

11 32 29,89 27,9 11,38 3,10 1,57 1,70 1,6 9 21 18,8 7,6 6,57 4,8 3,06 5,3 2,15 0,91 da da

AA GG

12 26 32,35 28,6 15,76 4,30 3,01 1,80 1,8 16,5 23 10,9 7,8 7,89 8,3 6,40 6,2 1,23 1,34 da ne

AA GG

13 32 18,34 18,3 6,10 3,40 0,92 2,00 1,9 25 33 8,0 5,8 16,96 6,2 6,14 6,2 2,76 1 ne da da AA GG

14 25 24,05 23,8 8,90 3,90 1,54 2,20 2,2 39 45 5,6 4,9 5,90 5,2 5,30 5,6 1,11 0,93 da da

AG GG

15 34 25,45 25,3 9,80 4,00 1,74 6,80 5,9 46 49 14,8 12 24,60 19,7 20,1 18,2 1,22 1,08 ne ne

AA AG

16 23 22,54 22,5 9,70 4,30 1,85 2,80 2,2 43 55 6,5 4 4,00 4 3,40 4,3 1,18 0,933 ne da

AG AG

17 28 23,07 23,1 8,60 2,50 0,96 2,10 1,9 33 35 6,4 5,4 9,00 4,9 3,90 5,1 2,31 0,96 ne da da AG GG

18 28 21,05 21 6,90 5,10 1,56 3,00 2,5 9 21 33,3 11,9 4,17 3,8 2,47 4,2 1,69 0,90 da da

AA AA

19 29 28,62 28,5 5,80 3,80 0,98 6,70 6,1 41 45 16,6 13,5 6,16 4,2 2,62 3,8 2,35 1,11 ne ne

AA AG

20 45 24,80 27,6 7,60 4,90 1,66 3,20 3,9 27 28 11,9 13,9 15,10 10,5 3,90 6,3 3,87 1,67 da ne

AA GG

41

V tabeli 10 so prikazane frekvence alelov A in G obeh polimorfizmov pri skupini bolnic

zdravljeni z metforminom. Alel z manjšo pogostostjo pojavljanja pri polimorfizmu

rs366313 v genu NDUFS4 je alel G, pri polimorfizmu rs12943590 v genu SLC47A2 pa

alel A.

Tabela 10: Frekvence alelov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in polimorfizma

rs12943590 v genu SLC47A2 pri skupini bolnic s PCOS, zdravljenih z metforminom

Polimorfizem Število Alel A Alel G Skupaj

rs366313 v genu NDUFS4

n 35 5 40

% 87,5 % 12,5 % 100 %


n 12 28 40

% 30 % 70 % 100 %

Legenda: NDUFS4 – gen za protein NADH-koencim Q-reduktaza 4, SLC47A2 – gen za prenašalec MATE2-K, A- alanin, G- gvanin

V obravnavani skupini bolnic sta pri polimorfizmu rs366313 v genu NDUFS4 zastopana

le genotipa AA in AG, genotip GG se pri njih ne pojavi. Pri polimorfizmu rs12943590 v

genu SLC47A2 so zastopane vse tri različice, z najpogostejšim pojavljanjem

homozigotov GG. Rezultate genotipizacije skupine bolnic s PCOS zdravljenih z

metforminom prikazuje tabela 11.

42

Tabela 11: Frekvence genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in


metforminom

Polimorfizem Genotip Število (n) Delež

rs366313 v genu

NDUFS4

AG 5 25 %

AA 15 75 %

Skupaj 20 100 %


AG 8 40 %

AA 2 10 %

GG 10 50 %

Skupaj 20 100 %

Legenda: NDUFS4 – gen za protein NADH-koencim Q-reduktaza 4, SLC47A2 – gen za prenašalec MATE2-K, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

Zastopane kombinacije genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in


metforminom, so prikazane v tabeli 12. V obravnavani skupini bolnic se najpogosteje

pojavlja kombinacija homozigotov GG polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 in

homozigotov AA polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4.

Tabela 12: Kombinacije genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 pri bolnicah s PCOS zdravljenih z

metforminom

Število Delež

Kombinacija genotipov

polimorfizmov

(rs12943590/ rs366313)

AA/AA 2 10 %

AG/AG 2 10 %

GG/AA 7 35 %

AG/AA 6 30 %

GG/AG 3 15 %

Skupaj 20 100 %

Legenda: AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA-

homozigoti A

43

3.3 PRIMERJAVA KLINIČNIH ZNAČILNOSTI IN LABORATORIJSKIH

VREDNOSTI PRI BOLNICAH S PCOS PRED UVEDBO

ZDRAVLJENJA Z METFORMINOM IN PO ŠESTMESEČNEM

ZDRAVLJENJU

Primerjali smo povprečne vrednosti merjenih parametrov pred in po uvedbi

zdravljenja z metforminom. V omenjenem obdobju je prišlo do statistično

pomembnega izboljšanja plazemske koncentracije LH, razmerja LH/FSH,

koncentracije celokupnega plazemskega testosterona in vrednosti FAI. Za primerjavo

je bil uporabljen t- test za odvisne vzorce. V povprečju se je izboljšala tudi vrednost

SHBG, vendar razlika ni bila statistično značilna. Rezultati so prikazani v tabeli 13.

Tabela 13: Laboratorijske vrednosti in ITM pri bolnicah s PCOS pred in po zdravljenju

z metforminom

Parametri Povprečna vrednost ± SD pred zdravljenjem

Povprečna vrednost ± SD po zdravljenju

t – vrednost

p- vrednost

ITM 24,0 ± 3,3 24,1 ± 2,9 0,270 0,790

FSH 5,8 ± 3,8 6,0 ±3,9 0,934 0,362

LH 11,3 ± 5,4 7,3 ± 3,8 -4,620 <0,001

LH/FSH 2,1 ± 0,7 1,2 ± 0,4 -5,450 <0,001

SHBG 36,5 ± 18,8 40,3 ± 16,2 1,936 0,068

T 3,3 ± 1,6 3,0 ± 1,4 -2,104 0,049

FAI 11,3 ± 7,3 8,1 ± 3,5 -2,638 0,016

Legenda: SD=standardna deviacija, ITM – indeks telesne mase, FSH – folikle stimulirajoči

hormon, LH – luteinizirajoči hormon, SHBG – vezalni globulin za spolne hormone (angl. Sex

Hormone Binding Globuline), T – celokupni plazemski testosteron, FAI – indeks prostih

androgenov (angl. Free Androgen Index)

Po zdravljenju z metforminom so se izboljšali vsi trije klinični parametri- aknavost,

vidnost CL na kontrolnem UZ in zanositev. Za vse je test hi- kvadrat pokazal, da gre

za statistično pomemben uspeh. Rezultati so prikazani v tabeli 14.

44

Tabela 14: Klinične značilnosti bolnic s PCOS pred in po zdravljenju z metforminom

Pred

zdravljenjem Po

zdravljenju Vrednost X2 in p

Zanositev

Ne

Da

N 20 16

X2=4,444; p=0,035

% 100,0% 80,0%

N 0 4

% 0,0% 20,0%

CL na UZ

Ne

Da

N 20 9

X2=15,172; p<0,01

% 100,0% 45,0%

n 0 11

% 0,0% 55,0%

Akne

Ne

Da

n 0 12 X2=17,143;

p<0,01

% 0,0% 60,0%

n 20 8

% 100,0% 40,0%

Legenda: CL – rumeno telesce, UZ - ultrazvok

3.4 VPLIV POLIMORFIZMA rs366313 A>G V GENU ZA NADH-

KOENCIM Q-REDUKTAZO 4 (GEN NDUFS4) NA SPREMEMBO

KLINIČNIH IN LABORATORIJSKIH PARAMETROV PRI BOLNICAH

S PCOS PO ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM

Pri analizi vpliva polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 na spremembo laboratorijskih

parametrov je eno-faktorska analiza variance pokazala, da genotip na velikost

sprememb parametrov statistično ne vpliva. Obravnavali smo štiri laboratorijske

parametre, ki so se statistično pomembno izboljšali po zdravljenju. Rezultate

prikazuje tabela 15.

45

Tabela 15: Vpliv polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 na spremembo laboratorijskih

parametrov pri bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom

Parametri Povprečna vrednost ± SD Vrednost t Vrednost p

AG (n=5) AA (n=15)

Δ LH -3,2 ± 4,1 -4,3 ± 3,9 0,575 0,572

Δ LH/FSH -0,7 ± 0,8 -1,0 ± 0,7 0,551 0,589

Δ T -0,6 ± 0,9 -0,2 ± 0,4 -1,327 0,201

Δ FAI -1,6 ± 1,7 -3,8 ± 6,2 0,773 0,449

Legenda: SD- Standardna deviacija, Δ- sprememba, LH – luteinizirajoči hormon, FSH – folikle stimulirajoči hormon, T – celokupni plazemski testosteron, FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index)

Pri analizi vpliva polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 na spremembo kliničnih

parametrov ni prišlo do statistično pomembnega rezultata. Iz tabele 16 pa je

razvidno, da je imela večina bolnic z genotipom AG viden CL na kontrolnem UZ in

tudi zanositev je bila uspešnejša v višjem procentu kot pri genotipu AA.

Tabela 16: Vpliv polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 na spremembo kliničnih


Genotip Polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4

AG AA

Akne

Ne

N 3 9

% 60,00% 60,00%

Da

n 2 6

% 40,00% 40,00%

CL na UZ

Ne

N 1 8

% 20,00% 53,30%

Da

N 4 7

% 80,00% 46,70%

Zanositev

Ne

N 3 13

% 60,00% 86,70%

Da

N 2 2

% 40,00% 13,30%

Legenda: NDUFS4 – gen za protein NADH-koencim Q-reduktaza 4, AG- heterozigoti, AA- homozigoti A

46

3.5 VPLIV POLIMORFIZMA rs12943590 G>A V GENU ZA MATE2-K

(GEN SLC47A2)NA SPREMEMBO KLINIČNIH IN

LABORATORIJSKIH PARAMETROV PRI BOLNICAH S PCOS PO

ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM

V tabeli 17 je prikazan vpliv polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo

laboratorijskih parametrov, ki so se po zdravljenju značilno spremenili. Eno-faktorska

analiza variance ni pokazala statistično pomembnega vpliva posameznega genotipa

na spremembo parametrov.

Tabela 17: Vpliv polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo

laboratorijskih parametrov pri bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom

Parametri Genotip polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2

AG (n=10) AA (n=2) GG (n=10)

Povprečna vrednost ± SD F P

Δ LH -4,3 ± 3,4 -3,1 ± 3,8 -4,1 ± 4,7 0,068 0,935

Δ LH/FSH -0,7 ± 0,6 -1,1 ± 0,4 -1,0 ± 0,9 0,335 0,720

Δ Tsk -0,6 ± 0,7 -0,4 ± 0,2 0,0 ± 0,4 2,318 0,129

Δ FAI -1,6 ± 2,4 -10,7 ± 15,1 -3,0 ± 4,2 2,652 0,099

Legenda: SLC47A2 – gen za prenašalec MATE2-K, SD- Standardna deviacija, Δ- sprememba, LH – luteinizirajoči hormon, FSH – folikle stimulirajoči hormon, T – celokupni plazemski testosteron, FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index)

Analiza vpliva polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo kliničnih

parametrov ni pokazala statistično značilnega vpliva. Iz tabele 18 pa je razvidno, da

imajo tri bolnice izmed štirih, ki so po zdravljenju zanosile, genotip GG.

47

Tabela 18: Vpliv polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo kliničnih


Genotip polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2

AG AA GG

Akne

Ne

n 5 1 6

% 62,50% 50,00% 60,00%

Da

n 3 1 4

% 37,50% 50,00% 40,00%

CL na UZ

Ne

n 5 0 4

% 62,50% 0,00% 40,00%

Da

n 3 2 6

% 37,50% 100,00% 60,00%

Zanositev

Ne

n 7 2 7

% 87,50% 100,00% 70,00%

Da

n 1 0 3

% 12,50% 0,00% 30,00%

Legenda: SLC47A2 – gen za prenašalec MATE2-K, CL – rumeno telesce, UZ – ultrazvok, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

3.6 VPLIV KOMBINACIJE GENOTIPOV POLIMORFIZMA rs12943590

G>A V GENU ZA MATE2-K (GEN SLC47A2)IN POLIMORFIZMA

rs366313 A>G V GENU ZA NADH-KOENCIM Q-REDUKTAZO 4

(GEN NDUFS4) NA SPREMEMBO KLINIČNIH IN

LABORATORIJSKIH PARAMETROV PRI BOLNICAH S PCOS PO

ZDRAVLJENJU Z METFORMINOM

Pri analizi vpliva kombinacije genotipov polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 in

polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 (genotip rs12943590/genotip rs366313) je eno-

faktorska analiza variance pokazala statistično pomemben vpliv kombinacije

genotipov na spremembo plazemskih koncentracij celokupnega testosterona. Z

Bonferronijevim testom se je pokazala statistično pomembna razlika med

kombinacijo AG/AG in GG/AA znotraj skupine ΔT. Sprememba plazemske

koncentracije celokupnega testosterona je bila največja pri bolnicah s kombinacijo

48

AG/AG in najmanjša pri bolnicah s kombinacijo GG/AA. Rezultate prikazuje tabela

19.


polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo laboratorijskih parametrov

pri bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom

Parameter

Kombinacija genotipov

polimorfizmov (rs12943590/

rs366313) Število

(n)

Povprečna vrednost ±

SD Vrednost

F Vrednost

p

Δ LH AA/AA 2 -3,1 ± 3,8

0,319 0,861

AG/AG 2 -5,0 ±7,1

GG/AA 7 -4,9 ± 5,3

AG/AA 6 -4,0 ±2,4

GG/AG 3 -1,9 ±1,9

Δ LH/FSH AA/AA 2 -1,1 ±0,4

0,766 0,564

AG/AG 2 -1,1 ±1,2

GG/AA 7 -1,2 ±0,9

AG/AA 6 -0,6 ±0,5

GG/AG 3 -0,5 ±0,7

Δ T

AA/AA 2 -0,3 ±0,2

3,404 0,036

AG/AG 2 -1,4 ±1,1

GG/AA 7 -0,01 ±

0,5

AG/AA 6 -0,3 ± 0,4

GG/AG 3 -0,03 ±

0,2

Δ FAI AA/AA 2

-10,7 ± 15,1

1,612 0,223 AG/AG 2

-3,25 ± 1,1

GG/AA 7 -4,1 ± 4,6

AG/AA 6 -1,6 ± 2,5

GG/AG 3 -0,4 ± 0,7

Legenda: SD- Standardna deviacija, Δ- sprememba, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A, LH – luteinizirajoči hormon, FSH – folikle stimulirajoči hormon, T – celokupni plazemski testosteron, FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index)

Pri analizi vpliva kombinacij genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in

polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo kliničnih parametrov po

zdravljenju z metforminom test hi- kvadrat ni pokazal statistične pomembnosti. Iz

49

tabele 20 pa izstopajo bolnice s kombinacijo genotipov AG/AA, pri katerih v velikem

deležu ni prišlo do izboljšanja reproduktivne funkcije (vidnost CL na UZ in zanositev).


polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na spremembo kliničnih parametrov pri

bolnicah s PCOS po zdravljenju z metforminom

Kombinacija genotipov polimorfizmov (rs12943590/rs366313) Vrednost X2

in p AA/AA AG/AG GG/AA AG/AA GG/AG

Akne

Ne

n 1 1 4 4 2

X2=0,357; p=0,986

% 50,00% 50,00% 57,10% 66,70% 66,70%

Da

n 1 1 3 2 1

% 50,00% 50,00% 42,90% 33,30% 33,30%

CL na UZ

Ne

n 0 0 3 5 1

X2=7,013; p=0,135

% 0,00% 0,00% 42,90% 83,30% 33,30%

Da

n 2 2 4 1 2

% 100,00% 100,00% 57,10% 16,70% 66,70%

Zanositev

Ne

n 2 1 5 6 2

X2=3,780; p=0,437

% 100,00% 50,00% 71,40% 100,00% 66,70%

Da

n 0 1 2 0 1

% 0,00% 50,00% 28,60% 0,00% 33,30%

Legenda:CL – rumeno telesce, UZ – ultrazvok, AG- heterozigoti, GG- homozigoti G, AA- homozigoti A

3.7 VPLIV ZAČETNE VREDNOSTI ITM IN ZAČETNE VREDNNOSTI

FAI NA IZBOLJŠANJE REPRODUKTIVNE FUNKCIJE IN

AKNAVOSTI PRI BOLNICAH S PCOS PO ZDRAVLJENJU Z

METFORMINOM

V tabeli 21 so prikazani rezultati vpliva začetne vrednosti ITM in FAI na izboljšanje

aknavosti po zdravljenju bolnic s PCOS z metforminom. Sicer analiza ni pokazala

statistične pomembnosti, je pa iz tabele razvidno,da se je aknavost izboljšala pri

bolnicah z nekoliko nižjim povprečnim ITM in nižjimi povprečnimi začetnimi

vrednostmi FAI.

50

Tabela 21: Vpliv začetne vrednosti ITM in FAI pri bolnicah s PCOS na izboljšanje

aknavosti po zdravljenju z metforminom

Akne Število

Povprečna vrednost

± SD Vrednost

t Vrednost

p

ITM

Ne 12 23,3±2,6 -1,080 0,294

Da 8 25,0±4,1

FAI

Ne 12 9,8±5,3 -1,108 0,282

Da 8 13,5±9,4

Legenda: SD – standardna deviacija, ITM – indeks telesne mase, FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index)

Tabela 22 pa prikazuje vpliv začetne vrednosti ITM in FAI na uspešnost zanositve po

zdravljenju bolnic s PCOS z metforminom. Pokazal se je statistično pomemben vpliv

nižje začetne vrednosti ITM na uspešnost zanositve po zdravljenju, medtem ko

začetna vrednost FAI ni imela vpliva.

Tabela 22: Vpliv začetne vrednosti ITM in FAI pri bolnicah s PCOS na uspešnost

zanositev po zdravljenju z metforminom

Zanositev Število

Povprečna vrednost ±

SD Vrednost

t Vrednost

p

ITM

Ne 16 24,8±3,1 2,450 0,025

Da 4 20,8±1,9

FAI

Ne 16 11,1±7,7 -0,188 0,853

Da 4 11,9±5,9

Legenda: SD - standardna deviacija, ITM – indeks telesne mase, FAI – indeks prostih androgenov (angl. Free Androgen Index)

51

4 RAZPRAVA

Našo asociacijsko raziskavo vpliva polimorfizma v genu, ki kodira NADH-

dehidrogenazo 4 (gen NDUFS4) in v genu, ki kodira kationski prenašalec MATE2-K (gen

SLC472A), na učinkovitost zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom, smo izvedli s

pomočjo retrospektivnih podatkov iz kartotek bolnic in molekularno genetske analize

njihove DNK. V raziskavo so bile vključene slovenske bolnice, kar je po podatkih iz

literature prva raziskava vpliva genetske raznolikosti na učinkovitost zdravljenja

bolnic s PCOS z metforminom v našem prostoru.

Za raziskavo smo izbrali polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in rs12943590 v genu

SLC472A. Pri izbiri smo poleg tega,da sta polimorfizma verjetno pomembno

udeležena v farmakodinamiki in farmakokinetiki metformina, upoštevali tudi

ustrezno vrednost MAF v populaciji. Podatke smo pridobili iz spletne baze

polimorfizmov posameznih nukleotidov (55). Vrednost MAF polimorfizma rs366313

A>G po teh podatkih znaša 0,330 (G=0,330/720), polimorfizma rs12943590 G>A pa

0,304 (A=0,304/664) in je izračunana za naključno izbrano populacijo iz Projekta

genom 1000 (1000 Genomes Project). Za našo slovensko populacijo predvidoma

zdravih žensk primerljive starosti z dokazano plodnostjo (kontrolna skupina) so

rezultati analize frekvenc alelov pokazali, da je pri polimorfizmu rs366313 v genu

NDUFS4 frekvenca alela G 16% in alela A 84%. Vrednost MAF rs366313 v genu NDUFS4

za našo populacijo tako znaša 0,16 (G=0,16/26), kar se razlikuje od podatkov iz

omenjene literature. Pri polimorfizmu rs12943590 v genu SLC472A je alel G zastopan

v 67%, alel A pa v 33%. MAF tako znaša 0,33 (A=0,33/53), kar je primerljiva vrednost

tisti iz omenjene literature. Razlike v vrednosti MAF smo pričakovali, saj se naša

populacija razlikuje od izbrane populacije za Projekt genom 1000. Primerjali smo

tudi frekvence alelov znotraj naše skupine preiskovank, med bolnicami in kontrolami,

pri čemer razlik nismo ugotovili.

Na celotni študijski populaciji smo izvedli analize genotipov izbranih polimorfizmov,

njihove frekvence in primerjave med posameznimi skupinami preiskovank.

Primerjava frekvenc posameznih genotipov polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4

med bolnicami s PCOS in kontrolami ni pokazala statistično pomembne razlike med

skupinama. V skupini bolnic so frekvence genotipov AA, GG in AG znašale 74,4%, 1,7%

in 24,0%, v skupini kontrol pa 70,4%, 2,5% in 27,2% iz česar je razvidno, da so genotipi

med skupinama približno enako razporejeni s prevladovanjem homozigotov AA. Tako

52

na vzročno povezavo med polimorfizmom rs366313 v genu NDUFS4 in PCOS ne

moremo sklepati. Tudi različice genotipa rs12943590 v genu SLC472A so med

skupinama približno enako razporejene. Frekvence genotipov AA, GG in AG v skupini

bolnic znašajo 17,2%, 46,7% in 36,1%, v skupini kontrol pa 14,8%, 49,4% in 35,8%.

Rezultati primerjave frekvenc genotipov tudi pri polimorfizmu rs12943590 v genu

SLC472A niso pokazali povezave s pojavnostjo PCOS. V raziskavi smo preverjali tudi

razliko v kombinacijah genotipov obeh polimorfizmov med skupino bolnic in kontrol

ter njihove frekvence v obeh skupinah. Rezultati niso pokazali razlik v kombinacijah

in frekvencah kombinacij med navedenima skupinama, s čimer povezave med

kombinacijo genotipov izbranih polimorfizmov in pojavnostjo PCOS nismo mogli

potrditi.

Osnovni cilj naše raziskave je bil ugotoviti ali se pri bolnicah s PCOS po uvedbi

zdravljenja z metforminom izboljšajo izbrani laboratorijski in klinični parametri in ali

imata izbrana polimorfizma vpliv na izid zdravljenja. Študijsko skupino je sestavljalo

20 bolnic s PCOS, povprečno starih 30,5 let, ki so bile zdravljene z metforminom v

obdobju 6 mesecev. Vse bolnice so imele pred začetkom zdravljenja izražene

klinične znake hiperandrogenizma (akne) in reproduktivno disfunkcijo (anovulatorni

cikel – ni bilo vidnega CL na UZ in neuspešna zanositev). V povprečju so imele

normalen ITM, normalne koncentracije plazemskega inzulina in glukoze na tešče in

niso imele inzulinske rezistence glede na izračunan indeks HOMA-IR. Zato metformina

pri njih nismo uvedli zaradi presnovnih nepravilnosti, ampak zaradi

hiperandrogenizma in reproduktivne disfunkcije. Vrednosti laboratorijskih rezultatov

so se pri bolnicah precej razlikovale, v povprečju so od referenčnih vrednosti

odstopale vrednosti T, FAI in razmerje LH/FSH. Pri analizi uspešnosti zdravljenja z

metforminom smo ugotovili, da so se pri bolnicah v povprečju statistično značilno

izboljšale laboratorijske vrednosti plazemskega LH, T, vrednost FAI in LH/FSH.

Izboljšale so se tudi vrednosti plazemskega SHBG, vendar ne statistično značilno.

Rezultati so primerljivi z ugotovitvami nekaterih drugih študij (34, 35, 47, 49).

Vrednosti ITM in koncentracije plazemskega FSH se po zdravljenju v povprečju niso

spremenile. Glede na to, da so bile vrednosti ITM že pred začetkom zdravljenja v

povprečju normalne, vpliva zdravljenja niti nismo pričakovali. Gambineri in sodelavci

so v njihovi študij dokazali, da pa se v primeru povišanih vrednosti ITM, po

zdravljenju z metforminom le te izboljšajo (35). V povprečju so bile normalne tudi

koncentracije plazemskega FSH, kar je za sindrom značilno, saj je glavni dejavnik, ki

poruši razmerje LH/FSH v patogenezi sindroma povišana koncentracija plazemskega

53

LH (4), zato tudi sprememb FSH nismo pričakovali. V raziskavi so se po zdravljenju

statistično značilno izboljšali tudi vsi trije klinični parametri, aknavost, vidnost CL na

UZ in zanositev. Zanositev je bila dosežena pri 20% bolnic, CL je bil viden v 55%,

aknavost pa se je izboljšala v 60%. Glede na ugotovitve o učinkovitosti zdravljenja z

metforminom iz prebrane literature (1, 22, 23, 24, 25, 28, 34, 37), smo izboljšanje

kliničnih parametrov pri bolnicah pričakovali in s tem še dodatno potrdili vpliv

metformina na izboljšanje reproduktivne funkcije in kliničnih znakov

hiperandrogenizma.

Iz tabele 9 želimo izpostaviti nekaj posameznih primerov bolnic s PCOS zdravljenih z

metforminom. Bolnica z najvišjim ITM je imela pred začetkom zdravljenja edina

izraženo inzulinsko rezistenco. Po šestmesečnem zdravljenju je prišlo le do znižanja

ITM, vsi ostali laboratorijski in klinični parametri so ostali praktično nespremenjeni.

Do znižanja ITM je najverjetneje prišlo le na račun metformina, saj bolnica ni

bistveno spremenila načina življenja. Glede na ugotovitve, da ima metformin boljši

učinek pri bolnicah z nizkim ITM, lahko predvidevamo, da bo pri tej bolnici prišlo do

izboljšanja laboratorijskih in kliničnih parametrov, ko se bo normalizirala vrednost

ITM. Raziskave so pokazale, da je pri bolnicah z višjim ITM potreben višji odmerek

metformina za doseganje primerljivih rezultatov zdravljenja (28), vendar podatka o

tem, ali je bil pri bolnici odmerek metformina ustrezno prilagojen, nimamo. Ugoden

vpliv nizkega ITM lahko potrdimo na primeru bolnice z ITM 18,34, pri kateri je prišlo

po zdravljenju z metforminom do evidentnega padca plazemske koncentracije LH in s

tem razmerja LH/FSH. Bolnica po šestmesečnem zdravljenju z metforminom ni imela

več aken in je tudi uspešno zanosila. Vse bolnice, ki so po zdravljenju zanosile, so

imele že pred zdravljenjem nižje vrednosti ITM in razmeroma ugodnejšo biokemično

sliko. Metformin je pri njih značilno vplival na padec plazemske koncentracije LH in

znižanje razmerja LH/FSH. Na kakšen način metformin znižuje LH še ni povsem

znano, verjetno pa ima učinek tudi na centralno regulacijo ovulacije z uravnavanjem

izločanja GnRH (1).Pri vseh bolnicah, pri katerih je prišlo do padca razmerja LH/FSH,

je bil viden CL na kontrolnem UZ. Tako se je pokazalo, da je normalizacija razmerja

LH/FSH potrebna za nastop ovulacije in možnost uspešne zanositve. Metformin je

imel zelo slab učinek pri najstarejši bolnici, stari 45 let, pri kateri ni prišlo do

izboljšanja laboratorijskih in kliničnih parametrov, ugotovili smo celo zvišanje ITM in

FAI. Da bo imel metformin pri bolnicah z višjo starostjo in dalj časa trajajočo

neplodnostjo slabši učinek na reproduktivno funkcijo, smo pričakovali (38).

54

Pri štirih laboratorijskih parametrih in vseh treh kliničnih parametrih , ki so se po

zdravljenju statistično izboljšali,smo analizirali vpliv obeh polimorfizmov na velikost

spremembe. V naši raziskavi zaradi majhnosti vzorca statistično pomembnega vpliva

polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in polimorfizma rs12943590 v genu NDUFS4 na

spremembo laboratorijskih parametrov nismo dokazali. Pri vplivu polimorfizma

rs366313 v genu NDUFS4 na klinične parametre smo ugotovili trend relativno

pogostejšega pojavljanja CL na UZ in višji procent uspešne zanositve pri skupini

heterozigov AG, pri vplivu polimorfizma rs12943590 v genu NDUFS4 pa so rezultati

pokazali tendenco k večji uspešnosti zanositve pri homozigotih GG. Iz ugotovitev se

nakazuje vpliv genotipa AG polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in genotipa GG

polimorfizma rs12943590 v genu SLC74A2 na večjo učinkovitost zdravljenja bolnic s

PCOS z metforminom. Choi in sodelavci so v raziskavi na bolnikih s SB2 ugotovili, da

ima pri homozigotih AA v polimorfizmu rs12943590 metformin slabši antidiabetični

učinek (43), v naši raziskavi pa pri bolnicah s PCOS vpliva tega polimorfizma na slabši

odziv zdravljenja nismo ugotovili. Po nam dostopnih virih vplivi polimorfizma

rs366313 genu NDUFS4 na učinkovitost zdravljenja z metforminom še niso bili

raziskani na nobeni skupini bolnikov, zato dobljenih rezultatov vpliva polimorfizma

rs366313 v genu NDUFS4 ne moremo primerjati. V naši raziskavi smo poleg vpliva

posameznih polimorfizmov preverjali tudi vpliv kombinacij genotipov obeh

polimorfizmov na izid zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom. Statistična analiza

je pokazala signifikanten vpliv na spremembo plazemske koncentracije celokupnega

testosterona. Do največjega izboljšanja je prišlo pri bolnicah, heterozigotnih za oba

polimorfizma. Na izboljšanje kliničnih parametrov kombinacija genotipov ni imela

signifikantnega vpliva, izstopajo pa bolnice z genotipom AG polimorfizma rs12943590

in genotipom AA polimorfizma rs366313, pri katerih praktično ni prišlo do izboljšanja

reproduktivne funkcije. Iz ugotovitev se nakazuje vpliv kombinacije AG/AA na slabši

odziv in vpliv kombinacije AG/AG na boljši odziv bolnic s PCOS na zdravljenje z

metforminom.

Izbrana polimorfizma rs366313 v genu NDUFS4 in polimorfizem rs12943590 v genu

SLC74A2 se nahajata v regulatornem področju posameznega gena in tako

najverjetneje vplivata na nivo transkripcije proteina NADH-dehidrogenaze 4 in

prenašalca MATE2-K, na kar nakazujejo tudi rezultati naše raziskave. V kolikšni meri

in na kakšen način vplivata na izražanje bi bilo smiselno preveriti v in vitro študiji na

ustreznih celičnih modelih.

55

Poleg gentskih raznolikosti smo v raziskavi preučili tudi vpliv začetne vrednosti ITM in

začetne stopnje biokemičnega hiperandrogenizma na izboljšanje aknavosti in na

uspešnost zanositve pri bolnicah s PCOS, zdravljenih z metforminom. Kot kazalec

biokemičnega hiperandrogenizma smo upoštevali vrednost FAI. Izkazalo se je, da ima

nižja začetna vrednost ITM signifikanten vpliv na uspešnost zanositve, iz česar lahko

ponovno sklepamo, da je nižja telesna teža ugoden napovedni dejavnik za izboljšanje

reproduktivne funkcije po zdravljenju z metforminom. Dobljeni rezultati so

pričakovani, saj se je nižja začetna vrednost ITM že v več dosedanjih študijah

izkazala kot ugoden napovedni dejavnik (38, 49, 59). Pokazalo se je tudi,da so imele

bolnice, pri katerih se je aknavost po zdravljenju izboljšala, v povprečju nekoliko

nižje začetne vrednosti ITM, vendar izboljšanje ni bilo statistično značilno. V raznih

študijah so preučevali vpliv začetnega hiperandrogenizma na izboljšanje

reproduktivne funkcije po zdravljenju z metforminom. Dokazali so, da so se bolnice z

nižjimi vrednosti androgenov bolje odzvale na zdravljenje (49, 59, 60), česar pa v

naši raziskavi nismo potrdili, saj začetna vrednost FAI ni imela vpliva na uspešnost

zanositve.

Naša raziskava je prva farmakogenetska raziskava, ki daje podatke o vplivu genetske

raznolikosti bolnic s PCOS na učinkovitost zdravljenja z metforminom v slovenskem

prostoru in je zasnovana z namenom približati se čim bolj osebnemu pristopu k

zdravljenju.

Glavna pomanjkljivost raziskave je majhnost študijske skupine, na kateri smo

preučevali vpliv genetskih polimorfizmov na učinkovitost zdravljenja z metforminom.

Z metforminom je bilo zdravljenih le 20 izmed obravnavanih bolnic s PCOS, zato smo

pogosto težko govorili o signifikantnosti dobljenih rezultatov in smo rezultate

interpretirali opisno. Majhnost vzorca je v prvi vrsti posledica tega, da PCOS (še) ne

spada med uradne indikacije za zdravljenje z metforminom, čeprav se je metformin

že v mnogih raziskavah izkazal kot učinkovita izbira zdravljenja, kar smo dokazali

tudi v naši raziskavi. Raziskavo smo zasnovali retrospektivno, zato smo bili omejeni z

že obstoječimi podatki iz kartotek bolnic in nismo bili seznanjeni z natančnim

režimom zdravljenja in morebitnimi neželenimi učinki metformina. Za dosego bolj

relevantnih rezultatov bi bilo smiselno zasnovati prospektivno študijo, v katero bi

zajeli čim večje število bolnic in merjenih parametrov. Potrebno bi bilo natančno

definirali odmerek in režim zdravljenja ter upoštevati morebiten pojav neželenih

učinkov. V naši raziskavi smo preučevali vpliv le dveh polimorfizmov na učinkovitost

zdravljenja z metforminom , kar predstavlja le delček v kompleksnem in še precej

56

nerazjasnjenem področju mehanizma delovanja in farmakokinetike metformina. Če

bi želeli celosten vpogled v farmakogenomiko metformina, bi bilo potrebno izvesti

asociacijsko študijo na celotnem genomu (angl. Genome – wide association study;

GWAS).

Upoštevajoč obetavne rezultate, dobljene v naši raziskavi, omejitve raziskave in

problematiko različnih odzivov bolnic s PCOS na zdravljenje z metforminom, se

nakazuje smiselna potreba po izvedbi obsežnejše prospektivne raziskave, s katero bi

bilo moč že pred uvedbo zdravljenja napovedati uspešnost in varnost terapije. Cilj je

osebni pristop k zdravljenju, h kateremu stremi medicina prihodnosti.

57

5 ZAKLJUČEK

Z našo raziskavo smo potrdili, da je metformin učinkovito zdravilo za simptomatsko

zdravljenje tudi pri slovenskih bolnicah s PCOS. Ugotovili smo, da je še posebej

učinkovit pri bolnicah s PCOS, ki imajo manjši ITM. Izkazalo se je tudi, da metformin

na izboljšanje reproduktivne funkcije ne vpliva le preko presnovnih učinkov, temveč

uspešno deluje tudi pri bolnicah z razmeroma urejeno biokemično sliko. Uspešno

znižuje predvsem razmerje LH/FSH, s čimer se poveča število ovulacij in tem

možnosti za zanositev. Na podlagi dosedanjih raziskav in naših ugotovitev

predlagamo, da bi bilo smiselno vključiti PCOS med indikacije za zdravljenje z

metforminom.

Raziskovali smo vpliv polimorfizma rs366313 v genu, ki kodira NADH-dehidrogenazo 4

(gen NDUFS4) in polimorfizma rs12943590 v genu, ki kodira kationski prenašalec

MATE2-K (gen SLC472A) na učinkovitost zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom.

Zaradi majhne skupine preiskovank o statistični pomembnosti rezultatov večinoma

nismo mogli govoriti. Pokazal pa se je trend vpliva genotipa AG polimorfizma

rs366313 v genu NDUFS4 in genotipa GG polimorfizma rs12943590 v genu SLC47A2 na

večjo učinkovitost zdravljenja bolnic s PCOS z metforminom, v smislu izboljšanja

reproduktivne funkcije. Analizirali smo tudi vpliv kombinacije genotipov obeh

izbranih polimorfizmov. Kot statistično pomemben se je izkazal vpliv kombinacije

AG/AG (rs12943590/ rs366313) na izboljšanje vrednosti plazemskih koncentracij

celokupnega testosterona po zdravljenju z metforminom. Pri bolnicah s kombinacijo

AG/AA pa se nakazuje slabši reproduktivni odziv na zdravljenje z metfominom.

V raziskavi smo opozorili na problem različnega odziva na zdravljenje in na vpliv

genetske raznolikosti na ta odziv. Zato bi bilo v prihodnosti smiselno zasnovati

obsežnejše prospektivne raziskave vpliva genetskih raznolikost in drugih dejavnikov

na zdravljenje bolnic s PCOS z metforminom, saj bi lahko na podlagi poznavanja čim

več dejavnikov, ki vplivajo na učinkovitost zdravljenja z metforminom, optimalno

prilagodili režim zdravljenja vsaki posamezni bolnici glede na njene individualne

značilnosti.

58

6 LITERATURA

1. Diamanti-Kandarakis E, Christakou CD, Kandaraki E, Economou FN. Metformin: an

old medication of new fashion: evolving new molecular mechanisms and clinical

implications in polycystic ovary syndrome. Eur J Endocrinol 2010; 162: 193-212.

2. Pasquali R, Stener-Victorin E, Yildiz BO, Duleba AJ, Hoeger K, Mason H, et al.

PCOS Forum: research in polycystic ovary syndrome today and tomorrow. Clin

Endocrinol 2011; 74: 424-33.

3. Kocijančič A, Mrevlje F, Štajer D. Interna medicina. Ljubljana: Littera Picta,

2005.

4. Ehrmann DA. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med 2005; 352: 1223-36.

5. Balen AH. Hypersecretion of luteinizing hormone and the polycystic ovary

syndrome. Hum Reprod 1993; 8 Suppl 2: 123-8.

6. Taylor AE, McCourt B, Martin KA, Anderson EJ, Adams JM, Schoenfeld DH.

Determinants of abnormal gonadotropin secretion in clinically defined women

with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 2248-56.

7. Jakimiuk AJ, Weitsman SR, Navab A, Magoffin DA. Luteinizing hormone receptor,

steroidogenesis acute regulatory protein, and steroidogenic enzyme messenger

ribonucleic acids are overexpressed in thecal and granulosa cells from polycystic

ovaries. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 1318-23.

8. Nilsson C, Jiang M, Pettersson K, Iitia A, Makela M, Simonsen H, et al.

Determination of a common genetic variant of luteinizing hormone using DNA

hybridization and immunoassays. Clin Endocrinol (Oxf) 1998; 49: 369-76.

9. Ehrmann DA, Barnes RB, Rosenfield RL. Polycystic ovary syndrome as a form of

functional ovarian hyperandrogenism due to dysregulation of androgen secretion.

Endocr Rev 1995; 16: 322-53

10. Jonard S, Dewailly D. The follicular excess in polycystic ovaries, due to intra-

ovarian hyperandrogenism, may be the main culprit for the follicular arrest. Hum

Reprod Update 2004; 10: 107-17.

http://www.uptodate.com/contents/epidemiology-and-pathogenesis-of-the-polycystic-ovary-syndrome-in-adults/abstract/54












http://www.uptodate.com/contents/definition-pathogenesis-and-etiology-of-polycystic-ovary-syndrome-in-adolescents/abstract/36



59

11. Kumar A, Woods KS, Bartolucci AA, Azziz R. Prevalence of adrenal androgen

excess in patients with the polycystic ovary syndrome (PCOS). Clin Endocrinol

2005; 62: 644-9.

12. Vassiliadi DA, Barber TM, Hughes BA, McCarthy MI, Wass JA, Francs S, et al.

Increased 5 alpha-reductase activity and adrenocortical drive in women with

polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2009; 94: 3558-66.

13. Nestler JE, Jakubowicz DJ, de Vargas AF, Brik C, Quintero N, Medina F. Insulin

stimulates testosterone biosynthesis by human thecal cells from women with

polycystic ovary syndrome by activating its own receptor and using inositolglycan

mediators as the signal transduction system. J Clin Endocrinol Metab. 1998; 83:

2001–5.

14. Nestler JE, Powers LP, Matt DW, Steingold KA, Plymate SR, Rittmaster RS, et al.

A direct effect of hyperinsulinemia on serum sex hormone-binding globulin levels

in obese women with the polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab.

1991;72-83.

15. Legro RS, Kunselman AR, Dodson WC, Dunaif A. Prevalence and predictors of risk

for type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance in polycystic ovary

syndrome: a prospective, controlled study in 254 affected women. J Clin

Endocrinol Metab 1999; 84:165-9.

16. Ehrmann DA, Liljenquist DR, Kasza K, Azziz R, Lego RS, Ghazzi MN, et al.

Prevalence and predictors of the metabolic syndrome in women with polycystic

ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2006; 91:48-53.

17. Boomsma CM, Eijkemans MJ, Hughes EG, Visser GH, Fauser BC, Macklon NS. A

meta-analysis of pregnancy outcomes in women with polycystic ovary syndrome.

Hum Reprod Update 2006; 12:673-83.

18. Diamanti-Kandarakis E, Kandarakis H, Legro RS. The role of genes and

environment in the etiology of PCOS. Endocrine 2006; 30: 19-26.

19. Vink JM, Sadrzadeh S, Lambalk CB, Boomsma DI. Heritability of polycystic ovary

syndrome in a Dutch twin-family study. J Clin Endocrinol Metab 2006; 91: 2100-4.

20. Ewens KG, Stewart DR, Ankener W, Urbanek M, McAllister JM, Chen C, et al.

Family-based analysis of candidate genes for polycystic ovary syndrome. J Clin

Endocrinol Metab 2010; 95: 2306-15.



















60

21. The Rotterdam ESHRE/ASRM-sponsored PCOS consensus workshop group. Revised

2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risk related to

polycystic ovary syndrome (PCOS). Hum Reprod 2004; 19: 41-47.

22. Nestler JE. Metformin for the Treatment of the Polycystic Ovary Sindrome. N

Engl J Med 2008; 358 :47-54.

23. Badawy A, Elnashar A. Treatment options for polycystic ovary syndrome.

International Journal of Women's Health 2011; 3: 25-35.

24. Teede H, Deeks A, Moran L. Polycystic ovary syndrome: a complex condition with

psychological, reproductive and metabolic manifestations that impacts on health

across the lifespan. BMC Med 2010; 8: 41-51.

25. Košir R, Meden-Vrtovec H. Vloga metformina pri obravnavi bolnic s sindromom

policističnih jajčnikov. Zdrav Vestn 2009; 78: 137-41.

26. Sheehan MT. Polycistic ovarian syndrome: Diagnosis and menegment. Clinical

Medicine and Research 2004; 2: 13-27.

27. Baza podatkov o zdravilih. Povzetek glavnih značilnosti zdravila (metformin).

Dosegljivo na: www.zdravila.net; datum zadnjega dostopa: 24.08.2012.

28. Palomba S, Falbo A, Zullo F, Orio F Jr. Evidence- based and potencial benefits of

metformin in the polycystic ovary syndrome: a comprehensive review. Endocr

Rev 2009; 30: 1-50.

29. Viollet B, Guigas B, Sanz Garcia N, Leclerc J, Foretz M, Andreelli F. Cellular and

molecular mechanisms of metformin: an overview. Clin Sci 2012; 122: 253-70

30. Graham GG, Punt J, Arora M, Day RO, Doogue MP, Duong JK et al. Clinical

pharmacocinetics of metformin. Clin Pharmacokinet 2011; 50: 81-98.

31. Tzvetkov MV, Vormfelde SV, Balen D, Meineke I, Schmidt T, Sehrt D, et al. The

effects ofgenetic polymorphisms in the organic cation transporters OCT1, OCT2,

and OCT3 on the renal clearance of metformin. Clin Pharmacol Ther 2009; 86:

299-306.

32. Chen L, Pawlikowski B, Schlessinger A, More SS, Stryke D, Johns SJ, et al. Role of

organic cation transporter 3 (SLC22A3) and its missense variants in the

pharmacologic action of metformin. Pharmacogenet Genomics 2010; 20: 687-99.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tzvetkov%20MV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vormfelde%20SV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Balen%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meineke%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schmidt%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sehrt%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19536068

61

33. De Leo V, Musacchio MC, Morgante G, Piomboni P, Petraglia F. Metformin

treatment is effective in obese teenage girls with PCOS. Hum Reprod 2006; 21:

2252–56.

34. Palomba S, Falbo A, Russo T, Orio F, Tolino A, Zullo F. Systemic and local effects

of metformin administratin in patients with polycystic ovary syndrome (PCOS):

relationship to the ovulatory response. Hum Reprod 2010; 25: 1005-13

35. Gambineri A, Tomassoni F, Gasparini DI, Di Rocco A, Mantovani V, Pagotto U, et

al. Organic cation transporter 1 polymorphisms predict the metabolic response to

metformin in women with the polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol

Metab 2010; 95: 204-8.

36. Ibanez L, Valls C, Potau N, Marcos MV, de Zegher F. Sensitization to insulin in

adolescent girls to normalize hirsutism, hiperandrogenism, oligomenorrhea,

dyslipidemia, and hyperinsulinism after precocious pubarche. J Clin Endocrinol

Metab 2000; 85: 3526-30.

37. Harborne L, Fleming R, Lyall H, Sattar N, Norman J. Metformin or antiandrogen

in the treatment of hirsutism in polycistic ovary syndrome. J Clin Endocrinol

Metab 2003; 88: 4116-23.

38. Palomba S, Falbo A, Orio F, Tolino A, Zullo F. Efficacy predictors for metformin

and clomiphene citrate treatment in anovulatory infertile patients with

polycystic ovary sindrome. Fertil Steril 2009; 91: 2557-67.

39. Chen Y, Li S, Brown C, Cheatham S, Castro RA, Leabman MK, et al. Effect of

genetic variation in the organic cation transporter 2 on the renal elimination of

metformin. Pharmacogenet Genomics 2009; 19: 497-504.

40. Zolk O. Disposition of metformin: Variability due to polymorphisms of organic

cation transporters. Ann Med 2011; 44: 119-29.

41. Meyer zu Schwabedissen HE, Verstuyft C, Kroemer HK, Becquemont L, Kim RB.

Human multidrug and toxin extrusion 1 (MATE1/SLC47A1) transporter: functional

characterization, interaction with OCT2 (SLC22A2), and single nucleotide

polymorphisms. Am J Physiol Renal Physiol 2010; 298: 997-1005.

42. Kajiwara M, Terada T, Ogasawara K, Iwano J, Katsura T, Fukatsu A et.al.

Identification of multidrug and toxin extrusion (MATE1 and MATE2-K) variants

with complete loss of transport activity. J Hum Genet 2009; 54: 40-6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Di%20Rocco%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mantovani%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pagotto%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Li%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brown%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cheatham%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Castro%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Leabman%20MK%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meyer%20zu%20Schwabedissen%20HE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verstuyft%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kroemer%20HK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Becquemont%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kim%20RB%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kajiwara%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19158817

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Terada%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19158817

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ogasawara%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19158817

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=kajiwara%20metformin

62

43. Choi JH, Yee SW, Ramirez AH, Morrissey KM, Jang GH, Joski PJ et.al. A common

5′-UTR Variant in MATE2-K is associated with poor response to metformin. Clin

Pharmacol Ther 2011; 90: 674–84.

44. Becker ML, Visser LE, Van Schaik RH, Hofman A, Uitterlinden AG, Stricker BH.

Interaction between polymorphisms in the OCT1 and MATE1 transporter and

metformin response. Pharmacogenet Genomics 2010; 20: 38-44.

45. Wang ZJ, Yin OQP, Tomlinson B, Chow MSS. OCT2 polymrphisms and in-vivo renal

functional consequence: studies with metformin and cimetidine. Pharmacogent

Genomics 2008; 18: 637-45.

46. Becker ML, Visser LE, van Schaik RHN, Hofman A, Uitterlinden AG, Stricker BH.

Genetic variation in the multidrug and toxin extrusion 1 transporter protein

influences the glucose-lowering effect of metformin in patients with diabetes: a

preliminary study. Diabetes 2009; 58: 745-9.

47. Díaz M, López-Bermejo A, Petry CJ, de Zegher F, Ibanez L. Efficacy of metformin

therapy in adolescent girls with androgen excess: relation to sex hormone-

binding globulin and androgen receptor polymorphisms. Fertil Steril. 2010; 94:

2800-3.

48. Ertunc D, Tok EC, Aktas A, Erdal EM, Dilek S. The importance of IRS-1 Gly972Arg

polymorphism in evaluating the response to metformin treatment in polycystic

ovary syndrome.Hum Reprod 2005; 20: 1207-12.

49. Legro RS, Barnhart HX, Schlaff WD, Carr BR, Diamond MP, Carson SA, et al.

Ovulatory response to treatment of polycystic ovary syndrome is associated with

a polymorphism in the STK11 gene. J Clin Endocrinol Metab 2008; 93: 792-800.

50. Lopez-Bermejo A, Diaz M, Moran E. A single nucleotide polymorphism in STK11

influences insulin sensitivity and metformin efficacy in hyperinsulinemic girls

with androgen excess. Diabetes Care 2010; 33: 1544-8.

51. Chen L, Takizawa M, Chen E, Schlessinger A, Segenthlar J, Choi JH, et al.

Genetic Polymorphisms in Organic Cation Transporter 1(OCT1) in Chinese and

Japanese Populations Exhibit Altered Function. J Pharmacol Exp Ther 2010; 335:

42-50.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Becker%20ML%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Visser%20LE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Schaik%20RH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hofman%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Uitterlinden%20AG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stricker%20BH%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22D%C3%ADaz%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22L%C3%B3pez-Bermejo%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Petry%20CJ%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Legro%20RS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barnhart%20HX%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schlaff%20WD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carr%20BR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Diamond%20MP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carson%20SA%22%5BAuthor%5D

63

52. Nies AT, Koepsell H, Winter S, Burk O, Klein K, Kerb R, et al. Expression of

organic cation transporters OCT1 (SLC22A1) and OCT3 (SLC22A3) is affected by

genetic factors and cholestasis in human liver. Hepatology 2009; 50: 1227-40.

53. Papa S, Scacco S, Sardanelli AM, Petruzzella V, Vergari R, Signorile A. Complex I

and the cAMP cascade in human physiopathology. Biosci Rep 2002; 22: 3-16.

54. Scacco S, Petruzzella V, Budde S, Vergari R, Tamborra R, Panelli D. Pathological

mutations of the human NDUFS4 gene of the18-kDa (AQDQ) subunit of complex I

affect the expression of the protein and the assembly and function of the

complex. J Biol Chem 2003; 278: 44161-7

55. Baza podatkov o polimorfizmih posameznih nukleotidov (angl. dbSNP). Dosegljivo

na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP; datum zadnjega dostopa:

10.7.2012.

56. Koepsell H, Lips K, Volk C. Polyspecific Organnic cation transporters: structure,

function, physiological roles, and biopharmaceutical implictions. Pharm Res,

2007; 24: 1227-51

57. Yonezawa A, Inui K. Importance of multidrug and toxin extrusion MATE/SLC47A

family to pharmacocinetis, pharmacodynamcs/toxicodynamics and

pharmacogenomics. Br J Pharmacol, 2011; 164: 1817-25.

58. Wallace TM, Levy JC, Matthews DR. Use and abuse of HOMA modeling. Diabetes

care 2004; 27:1487-95.

59. Fleming R, Hopkinson ZE, Wallace AM, Greer IA, Sattar N. Ovarian function and

metabolic factors in women with oligomenorrhea treated with metformin in a

randomized double blind placebo-controlled trial. J Clin Endocrinol Metab 2002;

87: 569-74.

60. Moghetti P, Castello R, Negri C, Tosi F, Perrone F, Caputo M, et al. Metformin

effects on clinical features, endocrine and metabolic profiles, and insuline

sensitivity in polycystic ovary syndrome: a randomised, double blind, placebo-

controlled 6-month trial, followed by open, long-term clinical evaluation. J Clin

Endocrinol Metab 2000; 85: 139-46.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nies%20AT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koepsell%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Winter%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Burk%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Klein%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kerb%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP

64

7 ZAHVALA

Zahvaljujeva se g. Alojzu Tapajnerju za pomoč pri statistični analizi rezultatov, za

potrpežljivost in prijaznost. Zahvaljujeva se tudi dekanu MFUM, red. prof. dr. Ivanu

Krajncu, dr.med., za delno finančno podporo raziskovalne naloge in prof. dr. Kseniji

Geršak, dr. med., svetnici na Ginekološki kliniki v Ljubljani, ki je zdravila in

spremljala bolnice s PCOS obravnavane v najini nalogi. Iskrena hvala vsem

preiskovankam, ki so sodelovale v raziskavi. Hvala tudi Taji Rukavina za pomoč pri

prevajanju in Tadeju Duriču za pomoč pri oblikovanju naloge.

V največji meri pa se zahvaljujeva najini mentorici, doc. dr. Polonci Ferk,

mag.farm., ki naju je vodila skozi ustvarjanje raziskovalne naloge, za izredno

vzpodbudo, trud in potrpežljivost ter za vso strokovno pomoč.

65

8 POGOSTEJE UPORABLJENE KRATICE

A = adenin

ADP = adenozin-difosfat

AMP = adenozin-monofosfat

AMPK = z adenozin-monofosfatom aktivirana proteinska kinaza.

AR = receptor za androgene

ATP = adenozin-trifosfat

C = citozin

CL = rumeno telesce (lat. Corpus Luteum)

DNA = deoksiribonukleinska kislina

FAI = indeks prostih androgenov (angl. Free androgen index)

FSH = folikle stimulirajoči hormon

G = gvanin

GnRH = gonadoliberin

HDL= lipoprotein velike gostote (ang. High density lipoprotein)

HOMA–IR = merilo za kvantifikacijo inzulinske rezistence (angl. Homeostatic Model

Assessment – Insulin Resistance)

ITM = indeks telesne mase

IRS1 = substrat 1 za inzulinski receptor

LH = luteinizirajoči hormon

LKB1 = jetrna kinaza B1

LDL= lipoprotein majhne gostote (ang. Low density lipoprotein)

MATE = antiporter MATE (angl. Multidrug And Toxin Extrusion)

66

mRNA = informacijska RNA

NADH = nikotinamid dinukleotid

NDUFS4 = gen za encim NADH-koencim Q-reduktazo 4

OCT = organski kationski prenašalec

OGTT= oralni glukoza tolerančni test

PCOS = sindrom policističnih jajčnikov

PCR = verižna reakcija s polimerazo

PMAT = plazemski membranski monoaminski prenašalec

PV = povprečna vrednost

SB2 = sladkorna bolezen tipa 2

SD = standardna deviacija

SHBG = vezalni globulin za spolne hormone

SLC22A1/2/3 = gen za organski kationski prenašalec 1/2/3,

SLC47A1 = gen za prenašalec MATE1

SNP = polimorfizem posameznega nukleotida (angl. Single Nucleotide Frequency)

STK11 = serin-treonin kinaza 11

SLC47A2 = gen za prenašalec MATE2-K

T = timin

UZ = ultrazvok

vpliv genetske raznolikosti na učinkovitost farmakološkega ... · uporabili smo test hi-kvadrat,...

Documents