Структурное выравнивание

• Структурное выравнивание

- Структура vs Структура

- Докинг

• Структурное моделирование (Структура vs Структура)

- Homology modeling

- Fold recognition/ Threading

Structural Alignment

1) Conserved 1º sequences похожие структуры

2) Похожие структуры conserved 1º sequences

?

Почему структурное выравнивание?

• Группировка/классификация белков по структурам (по схожести)

• Определение вклада отдельных аминокислот в образование 3D структуры

• Определение дистантных гомологов в белковых семействах

• Предсказание функции белков с низким уровнем sequence similarity с другими белками

• Исследования:– Структурно-функциональные отношения

– Эволюция

– Общие блоки\сайты связывания - мотивы

Distance Based Matrix

A B

DDM’s

• Самый простой метод сравнения структур

• Не требует ни трансформаций, ни поворотов, ни совмещений

• Очень эффективен для поиска движений в шарнирах или локальных отличий

• Интуитивно понятная мера похожести

Совмещение структур

A B

Выравнивание структур белков

• Уровни описания структуры: – Atom

– Group

– Fragment

– Элементы вторичной структуры (SSE)

• Описание структуры - особенности: – Геометрия/архитектура - координаты/относительные позиции

– Топология - порядок аминокислот в белке, взаиморасположение мотивов

– Свойства - физико-химические свойства аминокислот

6

Описание структурStructure I Structure II

Feature Extraction

Structure Description I

Structure Description II

Comparison Algorithm

ConstrainsScoring

Equivalence

RMSScoring

Assessment

Statistical Significant? Accurate?

•Scoring Equivalences:•Coordinate based - defined using a transformation of one structure onto the other:root mean square deviation – RMSd•Similarity of properties between equivalenced elements - conserved/similar amino acid•Similarity of relations between pairs of equivalenced elements - similar distances, internal RMSd

•Pitfalls of RMSD:•all atoms are treated equally (residues on the surface have a higher degree of freedom than those in the core)•best alignment does not always mean minimal RMSD•significance of RMSD is size dependent

•Alternative RSMDs•aRMSD = best root-mean-square deviation calculated over all aligned alpha-carbon atoms •bRMSD = the RMSD over the highest scoring residue pairs •wRMSD = weighted RMSD

( W. Taylor(1999), Protein Science, 8: 654-665.http://www.prosci.uci.edu/Articles/Vol8/issue3/8272/8272.html#relat)

Поиск оптимального выравнивания

B

• Поиск наибольшего количества атомов, выравненных с наименьшим RMSD (Root Mean Squared Deviation)

• Поиск баланса между локальными областями с очень хорошим выравниванием и общим выравниванием

Требования для сравнения структур

1. Какой атом структуры A соответствует другому атому структуры B?

Вариант ответа – в выравнивании последовательнсотей

THESESENTENCESALIGN----NICLEY

| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |

THE—SEQ--ENCE--ALIGNEDNICELY

2. Позиции\координаты атомов в структуре? Ответ: PDB-файлы (Dihedral angles, bond lengths …)

9

How good is a particular choice How good is a particular choice of heuristic and what is the of heuristic and what is the computational cost of the computational cost of the search?search?

Локальное выравнивание вторичных структур

Поиск первичного выравнивания двух белков при помощи динамического программирования для векторов вторичной структуры

A B

Сопоставление атомов

• Применение жадных методов ближайшего соседа для минимизации RMSD между Cα атомами пробы и шаблона (i.e. поиск локальных минимумов в пространстве выравнивания)

Core Superposition

Поиск лучшего выравнивания последовательно идущих Cα атомов и минимизация RMSD между ними

RMSD в множественном выравнивании структур

A B

RMSD без выравнивания

• 0.0-0.5 Å -> Essentially Identical

• <1.5 Å -> Very good fit

• < 5.0 Å -> Moderately good fit

• 5.0-7.0 Å -> Dubious relationship

• > 7.0 Å -> Structurally related

• > 12.0 Å -> Completely unrelated

Пример: Zinc Fingers

248 atoms RMS = 1.42Å

3znf and 4znf

30 CA atoms RMS = 0.70Å

Сервера для выравнивания структур

• LOCK - hierarchical protein structureSuperposition

• 3dSearch - fast secondary structuresuperposition

• CE - Tools for 3-D Protein Structure Comparison and AlignmentUsing the Combinatorial Extension (CE) Method (no hetero atoms).

•Дополнительная информация об алгоритмах

•http://cmgm.stanford.edu/~brutlag/Papers/singh00.pdf

Алгоритмы структурного выравнивания

Distance based methods: DALI (Holm and Sander): Aligning scalar distance plots (similarity between the 2-D distance

matrices)

STRUCTAL (Gerstein and Levitt): Dynamic programming using pair wise inter-molecular distances

SSAP (Orengo and Taylor): Dynamic programming using intra-molecular vector distances MINAREA (Falicov and Cohen): Minimizing soap-bubble surface area

Vector based methods:

VAST (Bryant): Graph theory based secondary structure alignment 3dSearch (Singh and Brutlag): Fast secondary structure index lookup

Both

LOCK (Singh and Brutlag): Hierarchically uses both secondary structure vectors and atomic distances

Docking и Scoring

How Do You Du(o)ck?

Ресурсы

Reviews in computational chemistry, vol. 17, 2001, 1-59http://www.zbi.uni-saarland.de/zbi/stud/lehrveranstaltungen/ws01/bioinformatikI/materialien/PL-Docking.pdfReviews in comp. chem., Vol 17. 2001. Ed. Kenny B. Lipkowitz, Donald B. Boyd

Почему докинг?

Молекулярное узнавание – центральный феномен в биологии• Ферменты Субстраты• Рецепторы Сигналы (лиганды)• Антитела Антигены

Классификация проблем докинга • Докинг белок-лиганд

–Rigid-body докинг–Flexible докинг

• Докинг белок-белок• Докинг белок-ДНК

Проблема молекулярного докинга

Дано: две молекулы в 3D с атомарным разрешением:

• Связываются ли они друг с другом? Если да:• Как выглядит комплекс?• Насколько сильно связывание?

Структуры белок-лиганд• X-ray (PDB: 20946 entries from X-ray)• NMR

Важность 3D структур• Разрешение < 2.5Å• Проблема моделирования гомологов

Основные принципыСвязывание молекул основано на взаимодействии

• H-связи, солевые мостики, гидрофобные контакты, эдектростатические взаимодействия

• Очень сильное отталкивающее влияние VdW на коротких дистанциях.

Случайные взаимодействия – слабые и короткие.• Сильное связывание предполагает комплементарность

поверхностей.Большинство молекул гибкие.

Binding Affinity

Склонность к связыванию – энергетическая разность между связанным и свободным состояниями.

• Среда (обычно вода) играет важную роль.• Энтропия вносит значимый вклад.

Binding affinity описывает комплекс, а не единичные структуры.

Applications

Оценка склонности к связыванию• Поиск ключевых структур для белка\ов

(виртуальный скрининг).• Оценка влияния модификаций ключевых

структур.• Дизайн лигандов De Novo.• Создание библиотек.

Предсказание молекулярных комплексов.• Распознавание вида связывания.• Оптимизация ключевых структур.

Docking и Scoring

Идентификация верного связывания лиганда с активным сайтом

• Пробы• Spatial DOF• Internal DOF

Идентификация верного связывания по наименьшей энергии

• Функции скоринга - оценка

ТребованияХарактеристки

Требования и характеристики

Требования• Осуществить докинг и его оценку для базы

структурно различных (гипотетически) соединений.• Идентифицировать weak binders среди non-binders.• Идентифицировать как минимум одно соединение с

низкой IC50 mM активностью.• Оценить ~10000 лигандов в день на процессор.• RMS между экспериментом и моделью дока < 2Å -

допустимо.

Характеристики• Высокий уровень false positives и false negatives.• Отсутствие универсальной функции оценки.

False Positive и False negative

База данных – 100000 соединений, среди которых 20 - хорошо связывающихся.

При 50% false negatives имеем 10 binders.

При 1% false positives имеем 1000 false positives.

Если мы можем лабораторными методами проверить 50 50 молекул (серьезный труд) из 1010 позитивных хитов, то 60% за то, что мы не получим ни одного верного соединения.

Для того, чтобы достичь 90% успеха в определении верного хита уровень false positives должен быть 0.2%

Допустим

Что такое Docking?

• Вычислительный подход к предсказанию взаимодействий между белками или между белками и другими молекулами (лигандами)

• Предположение: компоненты, которые хорошо стыкуются, могут и связываться друг с другом.

• Предсказание какие протеины могут взаимодействовать друг с другом

• Предсказание сайтов для такого взаимодействия

• Автоматизированное предсказание для белок–лекарственного взаимодействия

• Улучшение и облегчение инженерии белков и разработки лекарств (drug design)

Docking – почему это важно?

• Биомолекулярные взаимодействия – ядро всех регуляторных и метаболических процессов.

• Роль компьютерного анализа возрастает, поскольку растут объёмы баз данных известных структур.

• Увеличение вычислительных мощностей позволяет производить более детальный анализ и предсказание молекулярных взаимодействий.

• Автоматизированное предсказание молекулярных взаимодействий – ключ к рациональной разработке новых лекарств.

Цели докинга

• Для двух заданных биомолекул определить:

1. Могут ли они взаимодействовать согласно Gibbs free energy

Есть ли такая энергетически выгодная ориентация двух молекул,

при которой одна может модифицировать функцию\свойства

другой?

Могут ли две молекулы «соответствовать» друг другу в каком-

либо энергетически выгодном состоянии?

2. Если могут, то какова их ориентация, которая сделает взаимодействие

максимальным при минимизации общей «энергии» комплекса?

• Цель: Найти такие молекулы в базах данных молекулярных структур.

Docking – Совмещение (Superposition)

• Найти матрицу трансформации, которая наилучшим образом перекроет стол и стул. Иными словами найти такую матрицу трансформации, которая минимизирует RMS между соответствующими точками стола и стула.

• Соответствия:

• Верх стула – верх стола

• Бок стула – бок стола и т.д.

Алгоритм абсолютной ориентации

Ключ – нахождение соответствующих точек между двумя структурами

Docking – Совмещение (Superposition)

Docking – почему это так непросто?

Обе молекулы гибкие и могут изменять друг друга во время взаимодействия:

• Степени свободы

• Допустимые конформации

Белок-белковое взаимодействие

• Обе молекулы рассматриваются как rigid bodies (но можно и иначе!).

• Огромная область для поиска (6 dof: 3 поворота, 3 перемещения)

• Стерические/энергетические ограничения для уменьшения области поиска.

Полости, впадины и взаимодействие

•CASTp Идентификация и характеризация областей на поверхности (и внутренних, недоступных для взаимодействия) белков и иных молекул. •MolSurfer Белок-белковые интерфейсы •PASSБыстрое определение и визуализация впадин для предсказания сайтов связывания•Surface RacerРасчет доступной дл явзаимодействия поверхности, её кривизны и впадин (включая внутренние). •SURFNETПоверхности и доступные области на молекулярных поверхностях•ASC Набор скриптов для расчета поверхностей на базе PDB файла

CAPRI

• CAPRI: Critical Assessment of PRediction of Interactions

First community wide experiment on the comparative evaluation of protein-protein docking for structure prediction

Hosted By EMBL/EBI-MSD Group

Жесткий докинг

Допущения• Ригидный белок• Ригидный лиганд

Применения метода• Докинг малых или очень ригидных молекул.• Докинг фрагментов (гибкий докинг дизайн De

Novo).• Докинг по базе мульти-конформеров.

The Clique MethodСопоставляем подходящие точки/характеристики двух молекул (рецептора и лиганда).

1. Для N сайтов рецептора и n сайтов лиганда образуем N x n узлов.2. Для каждой пары узлов определяем Δd = D receptor sites – D ligand sites.3. При Δd < ε, соединяем узлы линиями.4. A clique – подграф, в котором все узлы соединены между собой.

A

BC

D

рецептор

b

ca

лиганд

Aa

Ab

Ba

Ca CbAc

BcBb

Cc

Da

Db

Dc

Distance compatibility graph

The Dock Programhttp://www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz/dock35/dock_demo.html

X-ray structure of HIV protease Connolly surface for active site

Active site заполнен сферами. Их центры – потенциальные места для атомов лиганда.

The Dock Program

Центры сфер соответствуют атомам лиганда. Используя clique technique (до 4 точек на cliques), можно определить возможные ориентации лиганда. Обычно генерируется несколько десятков тысяч ориентаций для каждой молекулы.

Лиганд представляется как перекрывающиеся сферы (или как атомы)

ScoringShape scoring – используя аппроксимацию: Lennard-Jones potential.Electrostatic scoring – ПО DELPHI , расчет электростатического потенциала.Force-field scoring – потенциал AMBER.

Модель с наивысшим score vs X-ray структура

Гибкий докинг: ДопущенияГибкость лиганда ограничена торзионными углами + кольцевыми структурами.

• Конформационные ансамбли–Жесткий докинг пула конформаций для каждой

молекулы (DOCK).• Фрагментация лиганда

–Постепенно наращиваемые конструкции (FlexX)–«Вписываем-соединяем»

• Явный конформационный поиск–Генетические алгоритмы (GOLD)–Monte Carlo (LigandFit)

• СимуляцииБелок рассматривается как почти полностью жесткая молекула

• Множественные модели белка (FlexE)• Симуляции

Гибкий докинг: Применения

Анализ комплексов, поиск возможных вариантов связывания.

Виртуальный скрининг по базам малых молекул.

Incremental Construction

Стратегия• Разбиение молекулы на фрагменты.• Вставка одного или нескольких фрагментов в активный

сайт, игнорируя положение остальных.• Последовательное добавление остальных фрагментов.

Стратегия поиска• Жадный поиск: После добавления фрагмента – выбор

конформацию с наивысшей оценкой. Остальные отбрасываем.

–Линейный масштаб от количества фрагментов.–Без учета возможных взаимодействий между

фрагментами.

The FlexX Programhttp://cartan.gmd.de/flexx/

Взаимодействия белок-лиганд описываются типами и геометрией.Типы взаимодействия делятся на группы и «антигруппы».

Уровень взаимодействия - геометрия.Чем выше уровень, тем более строгие требования к геометрии взаимодействия.

Group Counter group Level

Hydrogen bond acceptor Hydrogen bond donor 3Metal acceptor Metal 3Aromatic ring atom, methyl, amide Aromatic ring center 2Aliphatic carbons, aromatic carbons, sulfur 1

Геометрия взаимодействияВзаимодействие между группой A лиганда и группой B белка наблюдается, если:1. Группа взаимодействия B находится в антигруппе A.2. Центр взаимодействия A лежит примерно на

поверхности взаимодействия B и наоборот.

O Центр взаимодействия

Поверхность взаимодействия

O

HN

H-bond donor

H-bond acceptor

Геометрия взаимодействия

Hydrogen bonds (3)

Hydrophobic:Aromatic (2)

Hydrophobic: Aliphatic (1)

Гибкость белков

• Protein flexibility and drug design: how to hit a moving target

• Несмотря на миллионы лет эволюции, создававшей рецепторы, которые могут распознавать специфический лиганд мы все ещё можем идентифицировать молекулы, которые связываются с ним с большей афинностью

• Сайт связывания может взаимодействовать с множеством молекул – существует возможность реорганизации сайта с относительно небольшим «штрафом» для соответствия малой молекуле.

• Двойная природа сайта связывания– высокая стабильность и высокая гибкость (зачастую большая, чем у белка в целом).

• Парадигма «Ключ-замок» устарела. Белок – совокупность предопределенных состояний.

Carlson/ Curr. Op. Chem. Biol. 2002, 6: 447-452.

Решения

Использование единичной структуры белка в эксперименте докинга может пропустить возможное взаимодействие

Cross docking• Докинг всех лигандов на все имеющиеся структуры

белка с дальнейшим объединением в ранжированный список.

• Ограничено имеющимися конформациями белка.Protein flexibility

• FlexE–Включает все комбинации структур белка.

Гибкость белков

Взаимодействие «Белок-Лиганд»

Идентификация сайтов взаимодействия между белком (rigid body) и подвижной, гибкой малой молекулой (лигандом)

Очень большое поле поиска

Рассматривать лиганд как rigid body

Или как фрагменты rigid body, соединенные гибкими связками.

Метод Монте-Карло или MD.

Лиганд2 типа:

-Связывание средней силы, но в конформации c минимальной свободной энергией (most populated).

или

- Сильное связывание с менее выгодной конформацией (less populated). Связывание может сдвигать распределение (induced-fit system).

Взаимодействие «белок-лиганд». Серверы

LPC-CSU Server: Предсказание контактов «лиганд-белок» и контактов структурных элементов

LigBase: Структурная БД сайтов связывания

Multiple Protein Structure•Abl связывается с STI-571 в неактивной конформации петли Abl.

•Abl связывается с PD173955 – «петля активации» в иной конформации (активная киназа).

Nagar et al./ CANCER RESEARCH 62, 4236–4243, August 1, 2002

MPS

Nagar et al./ CANCER RESEARCH 62, 4236–4243, August 1, 2002

Grid Based Dock Scoring• Сначала - Расчет вероятных взаимодействий

•Построение сети – объем такой же, как и у белка

• Расчет стерических и электростатических взаимодействий в каждой точке сети

• Ориентация лиганда – scoring суммированием взаимодействий с точками сети

Пренебрегаем:

• электростатические взаимодействия с растворителем

• изменения энтропии

• изменения конформации белка

Drug Design

Drug Design

~6-7 лет. 3 фазы