(３)　 分化プロトコールi. 神経系細胞への誘導法

① 報告されているヒト多能性幹細胞からの神経系細胞への分化誘導法Organ / Tissue Duration

(days)Author/Year Journal Title

Astrocytes, Brain 93-126 Krencik R et. al. 2011

Nat Biotechnol Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells

162-238 Wang S et. al.2013

Cell Stem Cell Derivation of oligodendrocyte progenitor cells from stem cells using defined medium

5 Bahat-Stroomza M et. al. 2009

J Mol Neurosci Generation of atrocyte-like cells from human mesenchymal stem cells

Brain, Brain Barriers

10-16 Lippmann ES et. al. 2012

Nat Biotechnol Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells

Brain, Oligodendrocytes,

Spinal Cord

14 Najm FJ et. al.2011

Nat Methods Generation of oligodendrocytes from epiblast stem cells

63-126 Sundberg M et. al.2010

Stem Cell Res Generation of NG2 oligodendrocyte precursor cells from stem cells in a defined medium

42 Keirstead HS et. al.2005

J Neurosci Generation of oligodendrocytes from human embryonic stem cells

Brain, Dopaminergic

Neurons

25 Kriks S et. al.2011

Nature Generation of midbrain dopaminergic, forebrain and hypothalamic neural progenitor cells

14-21 Funk RT, Alexanian AR.2013

Transl Res Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergic neurons by defined growth factors

25-30 Sundberg M et. al.2013

Stem Cells Purification of stem cell-derived dopaminergic neurons by isolation of NCAM1-positive cells

63 Daadi MM et. al.2012

PLoS One Generation of neural stem cells and dopaminergic neurons via neurospheres formation

12-18 Vazin T et. al.2009

PLoS One Differentiation of stem cells into dopaminergic neurons using defined factors

45 Swistowski A et. al.2010

Stem Cells Generation of dopaminergic neurons from human pluripotent stem cells under defined conditions

62-79 Cho MS et. al.2008

Nat Protoc Highly efficient and large-scale generation of functional dopaminergic neurons from stem cells

Motor Neurons, Spinal Cord

42 Erceg S et. al.2008

PLoS One Generation of motor and gamma- aminobutyric acid (GABA) neurons

1

21-31 Amoroso MW et. al. 2013

J Neurosci Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells

21 Hester ME et. al.2011

Mol Ther Generation of motor neurons from human pluripotent stem cells by genetic modification

28 Rossi SL et. al.2010

PLoS One Motor neurons suspension-based differentiation of human embryonic stem cells

38 Wada T et. al.2009

PLoS One Motor neuron differentiation using noggin induction

55-63 Lee H et. al.2007

Stem Cells Generation of motoneurons from stem cell by co-culture with MS5 cells in a defined medium

Neural Crest 27 Chan AA et. al.2013

PLoS One Generation of corneal keratocytes from human embryonic stem cells

12-14 Menendez L et. al.2011

PNAS Directed differentiation of stem cells into neural crest cells using small molecules

14-35(14-81)

Lee G et. al.2010

Nat Protoc Derivation of neural crest cells and their progeny (MS-5 feeder cells/feeder free) from hESC

54-68 Pomp O et. al.2008

Brain Res Generation of Schwann cells and sensory neurons from human embryonic stem cells

Astrocytes, Brain, Neural Ectoderm, Oligodendrocytes,

Spinal Cord

162-238 Wang S et. al.2013

Cell Stem Cell Derivation of oligodendrocyte progenitor cells from stem cells using defined medium

Neural Ectoderm 14 Najm FJ et. al.2011

Nat Methods Generation of oligodendrocytes from epiblast stem cells

45 Swistowski A et. al.2010

Stem Cells Generation of dopaminergic neurons from human pluripotent stem cells under defined conditions

31 Shofuda et. al.2013

Neuroreport A method for efficiently generating neurospheres from human-induced pluripotent stem cells using microsphere arrays

6-19 Chambers et al. 2009

Nature biotechnolog

y

Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling

17-19 Cheung C et. al.2012

Nat Biotechnol Generation of human vascular smooth muscle subtypes from human embryonic stem cells

11 Fasano CA et. al.2010

Cell Stem Cell Generation of functional floor plate or neuroectoderm cells from human embryonic stem cells

②　分化誘導法の検証

(1) ドパミン産生ニューロン（Dopaminergic Neurons）

2

京都大学高橋淳先生　（2014）ES・iPS 細胞実験スタンダード

(2) 運動ニューロン（Motor Neurons）

Hu BY, Zhang SC. （2009）Nature Protocol(3) 神経前駆細胞（NPCs）

Kozhich et al. （2013） Stem Cell Reviews and Reports（NIH stem cell unit ホームページ掲載）

https://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/neural_precursors.htm主 な 分 化 誘 導 法 （ 上 記 3 種 類 ） を 検 証 し た 結 果 、 細 胞 の 凝 集 体 （ EB; 胚 様 体 や

neurosphere）を形成することにより外胚葉系細胞へ分化誘導させる従来の方法は、確実に分化する。一方、現状においては高度な技術を要し、画一化するのが難しい。そこで次に、二次元培養法で神経幹細胞を誘導するプロトコール UKN1 の検証を行った。

(4) 神経幹細胞：EU プロジェクトによる発生神経毒性のための誘導プロトコール―UKN1―Anne K. Krug et al. (2013) Toxicogenomics

使用した細胞株： iPS DF19-9-7 Ｔ（ウィスコンシン大学にてプラスミドにて作成された iPS 細胞）　http://www.wicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/ips-df19-9-7t.cmsx

評価方法：　神経幹細胞マーカー SOX2/Nestin ダブルポジティブの細胞の画像解析により、誘導効率を検証した。

結果：　設定条件が複数あり、その条件を 変 更すると、誘導効率も変動した。

③　UKN1 神経幹細胞分化誘導プロトコール（本検証で実施した方法）

【準備するもの】 細胞

ヒト iPS 細胞iPS DF-19-9-7T line (WiCell)TeSR-E8 及び Matrigel を使用して未分化維持培養をおこなった。

試薬及び実験器具などDMEM (Low glucose) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 11885)DMEM (High glucose) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 11965)F-12 (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 11765)Knockout DMEM (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 10829-018)KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 10828)L-Glutamine 200 mM (100×) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 25030)Glutamax 200 mM (100×) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 35050-061)MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100×) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 11140-050)2-Mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 21985-023)

3

条件 A 条件 B

条件C

0%10%20%30%40%

神経幹細胞誘導効率（ Sox2+/Nestin+ ％）

N-2 Supplement (100×) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 17502-048)Corning®Matrigel®hESC-qualified (BD Bioscience, Cat no. 354277)Accutase (Millipore, Cat no. SF006)FGF-2 (片山化学工業)ROCK inhibitior(Y-27632)　(Wako, Cat no. 253-00513)Recombinant Human Noggin, Fc Chimera (R&D, Cat no. 3344-NG-050)Dorsomorphin (Wako, Cat no. 041-33763)SB431542 (Tocris, Cat no. 1614)Valproic acid sodium salt（VPA）(Sigma-Aldrich, Cat no. P4543-10G)Distilled water (DW) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 15230-162)DPBS(-) (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 14190-144)4％ Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution (Wako, Cat no. 163-2015)

物品

マルチプレート 24 well (BD Bioscience, Cat no. 353047)【手順】

（１）培地の作製

KSR 培地 の作製　(300 mL)

添加量 終濃度

Knockout DMEM 249 mLKSR 45 mL 15%Glutamax（200mM, 100×） 3 mL 2 mMMEM NEAA (100×) 3 mL 0.1 mMMercaptoethanol (55 mM) 272.7 L 50 M

N2 培地の作製 (200 mL)

添加量 終濃度

DMEM (Low glucose) 98 mLF-12 98 mLGlutamax（200mM, 100×） 2 mL 2 mMN-2 Supplement (100×) 2 mL 1x

（２）コンディショナルメディウム (CM) の作製

CM 用 KSR 培地 の作製　(500 mL)

添加量 終濃度

DMEM (High glucose) 200 mLF-12 200 mLKSR 100 mL 20%L-glutamine （ 200mM, 100×）

2.5 mL 1 mM

MEM NEAA (100×) 4 mL 0.8xMercaptoethanol (55 mM) 0.925 mL 100 M

4

MEF CM の作製

1. MEF をＴ 75 フラスコ に播種後 24~48 時間の間に培地を除去し、30 ml の CM 用KSR 培地を加える

2. 48 時間後、培養上清を回収し、0.22 μm のフィルターを通し、-20℃保存

（3）プレートのコーティング　（Matrigel）1. 滅菌済 10mL ピペットと滅菌済 1000 Ｐチップを 4℃の冷蔵庫で冷却しておく

2. あらかじめ小分け分注しておいた Matrigel を氷上で保管しておく

3. 遠心管に、DMEM 培地とＦ-12 培地を等量で必要量分取し（もしくは、DMEM/F-12 培地を使用）、氷上で冷却する

4. 小分け分注しておいた Matrigel の容器に、3.の培地を 1.のチップで少量入れ、その培地を 3.の遠心管に再び回収する

5. 1.の 4℃で冷却しておいた 10 ｍＬピペットを用いて、Matrigel 溶液をよく混和する

6. 混和した Matrigel 溶液を 1.の冷却したチップを用いて 24well plate のウェルに入れ（250　µL/well）、プレートを静かに揺すり、Matrigel 溶液をウェル全体にいきわたらせる

7. 当日使用する場合は、1 時間以上室温に静置する

8. 当日使用しない場合は、蓋の周りをパラフィルムで巻き、さらにプレート全体をアルミホイルで包んで、4℃冷蔵庫で保管し、（使用期限は 1週間）、使用する 30 分前に室温に戻す

（4）iPS 細胞の播種　（day -3）

1. 使用する iPS 細胞の状態を確認しておく（24well plate 1枚分播種するには 6well plate 2well 分の細胞が必要）　

1） 未分化か？　

2） パッキングされているか？　

3） オーバーグロースしていないか？

2. 播種用の CM を必要量分取し、FGF-2（最終濃度 10ng/m Ｌ）と ROCK inhibitor （最終濃度 10µＭ）を加え、37℃恒温水槽で温めておく

3. wash 用の KSR 培地を必要量分取して、37℃恒温水槽で温めておく

4. Matrigel をコート した 24well plate の左半分（12well 分）のコート剤(Matrigel 溶液)を吸引除去し、CM (+FGF-2,+ROCK inhibitor)を入れておく (0.5 mL/well)

5. 1. の iPS 細 胞 の 培 養 液 を吸引除 去 し 、アキュ タ ーゼを 加 え (1 mL/well, 6-well plate）、37℃インキュベーター内で約 5 分間反応させる

6. wash 用培地の一部（2～3 ｍ L）をウェルに入れ、ピペッティング操作により細胞を剥がして遠心管に回収し、1400rpm 3 分間の遠心操作をおこなう

7. 上清を吸引除去し、wash 培地を 3mL～5 ｍＬ（細胞量に合わせる）入れ、軽くピペッ

5

ティングし、その一部を採取して細胞数のカウントを行い、必要な細胞液量を計算する

8. 1400rpm 3 分間遠心操作を行い、上清を吸引除去し、CM (+FGF-2,+ROCK inhibitor) を必要量加えてピペッティングをし、細胞懸濁液を作る

9. 新しい 50 ｍＬ遠心管を準備し、8.の細胞懸濁液と、CM (+FGF-2,+ROCK inhibitor)を加えて、3.6ｘ 10＾4 cells/ml の細胞播種液を調製する

10. 24well plate の右半分（12well 分）のコート剤を吸引除去し、細胞播種液を 1.0 mL/wellずつ加える（36000 cells/ well/ 2 cm^2）

11. 24well plate の左半分（12well 分）に細胞播種液を 0.5 mL/wellずつ加える　（18000 cells/ well/ 2 cm^2）

12. 細胞を播種した 24well plate を静かに 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

（5）培地交換 (day -2, day -1)1. CM を必要量分取し、FGF-2 (最終濃度 10 ng/mL) を加え、37℃恒温水槽で温めておく

2. 培地を吸引除去し、温めた CM を加える　(0.5 mL/well)3. 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

（6）培地交換 (day 0, day1)1. 必要量分取した KSR 培地に Noggin (最終濃度 35 ng/mL)、Dorsomorphin (最終濃度

600 nM)、SB431542(最終濃度 10 M)を添加し、３７℃恒温水槽で温める

2. 2 本の新しい遠心管を用意し、温まった培地をピペッティングで混和した後に等量に分ける

3. 2.の一方の培地に VPA 溶液（最終濃度　0.6 ｍＭ）を添加し、もう一方の培地に VPA 溶液（溶媒はＤＷ）と等量のＤＷを添加する

4. 培地を吸引除去し、3.の培地をそれぞれ加える　(0.5 mL/well)5. 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

（7）培地交換 (day 2)1. 必要量分取した KSR 培地に Noggin (最終濃度 35 ng/mL)、Dorsomorphin (最終濃度

600 nM)、SB431542(最終濃度 10 M)を添加し、３７℃恒温水槽で温め、添加した試薬が完全に溶けたことを確認する

2. 2 本の新しい遠心管を用意し、温まった培地をピペッティングで混和した後に等量に分ける

3. 2.の一方の培地に VPA 溶液（最終濃度　0.6 ｍＭ）を添加し、もう一方の培地に VPA 溶液（溶媒はＤＷ）と等量のＤＷを添加する

4. 培地を吸引除去し、3.の培地をそれぞれ加える　(0.5 mL/well)5. 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

6

（8）培地交換 (day 4)1. KSR 培地（全体の 75％）と N2 培地（全体の 25％）とを混和し、Noggin (最終濃度 35

ng/mL)、Dorsomorphin (最終濃度 600 nM)、SB431542(最終濃度 10 M)を添加し、３７℃恒温水槽で温め、添加した試薬が完全に溶けたことを確認する

2. 2 本の新しい遠心管を用意し、温まった培地をピペッティングで混和した後に等量に分ける

3. 2.の一方の培地に VPA 溶液（最終濃度　0.6 ｍＭ）を添加し、もう一方の培地に VPA 溶液（溶媒はＤＷ）と等量のＤＷを添加する

4. 培地を吸引除去し、3.の培地をそれぞれ加える　(0.5 mL/well)5. 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

（9）培地交換　(day 6)1. KSR 培地（全体の 50％）と N2 培地（全体の 50％）とを混和し、Noggin (最終濃度 35

ng/mL)、Dorsomorphin (最終濃度 600 nM)、SB431542(最終濃度 10 M)を添加し、３７℃恒温水槽で温め、添加した試薬が完全に溶けたことを確認する

2. 2 本の新しい遠心管を用意し、温まった培地をピペッティングで混和した後に等量に分ける

3. 2.の一方の培地に VPA 溶液（最終濃度　0.6 ｍＭ）を添加し、もう一方の培地に VPA 溶液（溶媒はＤＷ）と等量のＤＷを添加する

4. 培地を吸引除去し、3.の培地をそれぞれ加える　(0.5 mL/well)5. 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

（10）培地交換（day 8）

1. KSR 培地（全体の 25％）と N2 培地（全体の 75％）とを混和し、Noggin (最終濃度 35 ng/mL)、Dorsomorphin (最終濃度 600 nM)、SB431542(最終濃度 10 M)を添加し、３７℃恒温水槽で温め、添加した試薬が完全に溶けたことを確認する

2. 2 本の新しい遠心管を用意し、温まった培地をピペッティングで混和した後に等量に分ける

3. 2.の一方の培地に VPA 溶液（最終濃度　0.6 ｍＭ）を添加し、もう一方の培地に VPA 溶液（溶媒はＤＷ）と等量のＤＷを添加する

4. 培地を吸引除去し、3.の培地をそれぞれ加える　(0.5 mL/well)5. 37℃インキュベーター内に入れ、培養する

（11）免疫染色解析のための細胞の固定（day10）

1. 4％PFA を必要量分取する

2. DPBS(-)を必要量分取する

3. 培地を吸引除去し、DPBS(-)を加えてリンスし(1.0 mL/well)、吸引除去する

4. 4％ PFA を加え(0.5 mL/well)、室温で 15 分間静置して細胞を固定する

7

5. 4％ PFA を除去し、DPBS(-)を加えてリンスし(1.0 mL/well)、吸引除去する操作を 3 回繰り返す

6. 免疫染色を実施するまで十分量の DPBS(-)で細胞を浸した状態で冷蔵保存する

免疫染色の実施例Day10 では Tuj1陽性の神経細胞も一部観察される。

8

i. 血液前駆細胞、血管内皮細胞への誘導法①　これまでに報告されているヒト多能性幹細胞から血液前駆細胞あるいは血管内皮細胞への分化誘導法

Organ/ Tissue Duration (days) Author/ Year J ournal Title Methods

Hematopoietic progenitor 15 days Chadwick K et al./ 2003 Blood Cytokines and BMP-4 promote hematopoieticdiff erentiation of human embryonic stem cells EB f ormation

15 days Takayama N et al. / 2008 Blood

Generation of f unctional platelets f rom humanembryonic stem cells in vitro via ES-sacs,VEGF-promoted structures that concentratehemtopoietic progenitors.

Sac (co-culture)

13-15 days Niwa A. et al. / 2011 PLoS One

A novel serum-f ree monolayer culture f ororderly hematopoietic diff erentiation ofhuman pluripotent cells via mesodermalprogeniots.

monolayer culture

8 days Nakajima-Takagi Y et al. /2013 Blood Role of SOX17 in hematopoietic development

f rom huma pluripotent stem cells. EB f ormation

16 days Ronn RE et al. / 2015 Stem cell Reports.Retinoic acid regulates hematopoieticdevelopment f rom human pluripotent stemcells.

EB f ormation

15 days Ditadi A et al. / 2016 MethodsDirected diff erentiation of defi nitivehemogenic endothelium and hematopoieticprogenitors f rom human pluripotent stem cells

EB f ormation

Endothelial cell 14 days Yang L et al. / 2008 NatureHuman cardiovascular progenitor cells developf rom a KDR+ embryonic stem cell-derivedpopulation.

EB f ormation

5 days Tatsumi R et al. / 2011 Cell TransplantSimple and highly effi cient method f orproduction of endothelial cells f rom humanembryonic stem cells.

monolayer culture

10 days Orlova V. V et al. / 2014 Nat. Protoc.Generation, expansion and f unctional analysisof endothelial cells and pericytes derivedf rom human pluripotent stem cells.

monolayer culture

7 days Sahara M et al. / 2014 Cell Res.

Manipilation of a VEGF-Notch signaling circuitdrives f ormation of f unctional vascularendothelial progenitors f rom humanpluripotent stem cells.

EB f ormation /monolayer culture

5 days Lian X et al. / 2014 Stem Cell ReportsEffi cient diff erentiation of human pluripotentstem cells to endothelial progenitor via small-,olecule activation of Wnt signaling.

monolayer culture

6 days Patsch C et al. / 2015 Nature Cell Biology Generation of vascular endothelial and smoothmuscle cells f rom human pluripotent stem cells. monolayer culture

10 days Song W et al. / 2015 J Biomed Mater Res A

Effi cient generation of endothelial cells f romhuman pluripotent stem cells andcharacterization of their f unctionalproperties.

EB f ormation

9 days Minami H et al. / 2015 PLoS OneGeneation of brain microvascular endothelial-like cells f rom human induced pluripotent stemcells by co-culture with C6 glioma cells.

EB f ormation

10 days Liu X et al. / 2016 Diff erentiation

Diff erentiation of f unctional endothlial cellsf rom human induced pluripotent stem cells: Anovel, highly effi cient and cost eff ectivemethod.

monolayer culture

②　分化誘導法の検証

使用した細胞株： 201B7, NEPB#22 (筑波大学で血液細胞から樹立された iPS 細胞)誘導プロトコール：単層培養、共培養、胚様体形成法

培地など：

（血液前駆細胞）

mTeSR1 (Stem Cell Technologies), ascorbic acid (Sigma), 1-thioglycerol (MTG: Sigma), L-glutamine (Life Technologies), human bone morphogenetic protein 4 (BMP4: R&D Systems), Activin A (R&D Systems), Y27632 (ROCK inhibitor; Wako), Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM), human vascular endothelial growth factor (VEGF: Peprotech), SB431542 (TGF- inhibitor; Wako), human stem cell factor (SCF: Peprotech), human thrombopoietin (TPO: Peprotech)※BMP4 は他メーカーのものではうまくいかなかったので、R&D社のものが良い。

9

（血管内皮細胞）

StemPro-34 Serum Free Medium (Life Technologies), ascorbic acid (Sigma), 1-thioglycerol (MTG: Sigma), L-glutamine (Life Technologies), human bone morphogenetic protein 4 (BMP4: R&D Systems), Activin A (R&D Systems), Y27632 (ROCK inhibitor; Wako), human vascular endothelial growth factor (VEGF: Peprotech), SB431542 (TGF- inhibitor; Wako), human fibroblast growth factor 2 (FGF2: Katayama Kagaku Kogyo)※BMP4 は他メーカーのものではうまくいかなかったので、R&D社のものが良い。

血液前駆細胞マーカー：　CD34/CD43 ダブルポジティブの細胞を解析

血管内皮細胞マーカー：　CD34/ CD144 (VE-カドヘリン)ダブルポジティブの細胞を解析

結果：　

（血液前駆細胞）

・OP9 細胞（骨髄ストローマ細胞）との共培養法：血液前駆細胞への分化効率が低かった。

・C3H10T1/2 細胞との共培養法：コロニー状で iPS 細胞を播種するため、実験間でばらつきが大きく、安定した結果を得ることができなかった。

・胚様体形成法：C3H10T1/2 細胞との共培養法と比較し、短期間で効率よく安定的に血液前駆細胞が分化誘導可能であった。

（血管内皮細胞）

・単層培養法：細胞のプレートへの接着が実験間でばらつき、毎回同様の結果を得ることができなかった。

・胚様体形成法：低接着性の 96-well プレートへ単細胞に解離した細胞を播種したところ均一な大きさの胚様体が得られ、実験間で CD34 と CD144 を共発現する血管内皮細胞様の細胞への分化効率に大きなばらつきはなかった。

(a) (b)

CD43

CD34

Figure 1　異なるヒト iPS 細胞株から血液前駆細胞への分化誘導効率の違い

(a) 201B7 株、(b) NEPB 株からそれぞれ血管内皮細胞への分化誘導を行い、9日目にセルソーターにて CD34 およ

び CD43 の発現について検討した。

10

(a) (b) (c)

CD34

VE-Cadhe

rin

Figure 2　異なるヒト iPS 細胞株から血管内皮細胞への分化誘導効率の違い

(a) 201B7 株、(b)Tic 株、(c) NEPB 株からそれぞれ血管内皮細胞への分化誘導を行い、9日目にフローサイトメー

ターにて CD34 および CD144 (VE-カドヘリン)の発現について検討した。

11

iii. 肝細胞への誘導法

① これまでに報告されているヒト多能性幹細胞からの肝細胞への分化誘導法Duration (days) Author/Year Journal Title

18 Hamazaki T. et al., 2001 FEBS Letters Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro

18 Jun C. et al., 2007 Hepatology Directed differentiation of human embryonic stem cells functional hepatic cells

20 Si-Tayeb K. et al., 2010 Hepatology Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.

20 Touboul T. et al., 2010 Hepatology Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development.

20-22 Duan Y. et al., 2010 Stem Cells Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells.

12 Chen YF. et al., 2012 Hepatology Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.

17 Kajiwara M. et al., 2012 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.

Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.

② 分化誘導法の検証Protocol 1: Stenphen Duncan Lab. Si-Tayeb K. et al., Hepatology., 2010Protocol 2: David Hay Lab. Hay DC. Stem Cells., 2008Protocol 3: Ludovic Vallier Lab. Hannan NR., Nat. Protoc., 2013各肝分化誘導プロトコールは、下図に示す(Fig. 1)。なお、入手困難な試薬類は適宜変更した。

分化誘導法の検証結果

12

Protocol 1 Stenphen Duncan Lab.

Protocol 2 David Hay Lab.

Protocol 3 Ludovic Vallier Lab.

RPMI1640+2% B27matrigel

100 ng/ml Activin AWnt3a-CM

4 days

RPMI1640+2% B27matrigel

20 ng/ml FGF220 ng/ml BMP4

5 days

RPMI1640+2% B27matrigel

20 ng/ml HGF

5 days

HCM (- EGF)matrigel

20 ng/ml OsM

11 days

RPMI1640+2% B27matrigel

100 ng/ml Activin A Wnt3a-CM

3 days

DMEM+20% KSRmatrigel

1% DMSO

5 days

L15 10% FBSmatrigel

20 ng/ml OsM10 ng/ml HGF

9 days

RPMI1640fibronectin

100 ng/ml Activin A100 ng/ml FGF2

Wnt3a-CM

2 days

RPMI1640+2%B27fibronectin

100 ng/ml Activin A100 ng/ml FGF2

1 days

50 ng/ml Activin A

3 days

RPMI1640+2%B27 fibronectin

10 ng/ml BMP410 ng/ml FGF10

4 days

RPMI1640+2%B27 fibronectin

50 ng/ml HGF30 ng/ml OsM

11 days

HCM (-EGF)fibronectin

Fig. 1. 各肝分化誘導法のプロトコル

使用した細胞株

Tic 株：国立成育医療センターにてレトロウイルスを用いて作製された iPS 細胞

http://cellbank.nibiohn.go.jp/~cellbank/cgi-bin/search_res_det.cgi?RNO=JCRB1331 評価方法

ASGR1(アシアロ糖タンパク受容体 1, 成熟肝細胞マーカー)陽性細胞率を、フローサイトメトリーを用いて評価した(Fig. 2A)。さらに、ALB(アルブミン, 肝細胞マーカー)産生能を ELISA により測定した(Fig. 2B)。

結果

Protocol 1 を用いることで再現性良く肝機能の高いヒト iPS 細胞由来肝細胞を作製できた。

13

0

20

40

60

80

100

protocol 1 protocol 2 protocol 3

ASGR1

0

5

10

15

protocol 1 protocol 2 protocol 3

ALB

A B

% o

f ASG

R+

cells

ALB

se

cret

ion

leve

l

Fig. 2. 各肝分化誘導効率の比較

③ Protocol 1 (Stephen Duncan Lab.)の分化誘導方法

【準備するもの】 細胞

ヒト iPS 細胞L Wnt-3A cell line (Cat no. ATCC CRL2647)EmbryoMax® Primary Mouse Embryo Fibroblasts, Mytomycin C Treated (Merck Millipore)

試薬DMEM/F-12, HEPES (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 11330032)KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 10828-028)MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 11140050)2-Mercaptoethanol (Thermo Fisher Scientific, Cat no. 21985023)RPMI1640 medium (sigma, Cat no. R8758)HBM Basal medium + HCM Bulletkit (Lonza, Cat no. CC-3198, C-3199)Minimum Essential Medium Eagle (sigma, Cat no. M4655)fatty acid-free bovine serum albumin (FAF-BSA; Merck Millipore, Cat no. 82-067)

Reagent name

Supplier Cat no. Solvent Stock solution Final conc.

Activin A R&D systems 338-AC 4 mM HCl + 1 mg/ ml FAF-BSA

10 μg/100 μl 100 ng/ml

BMP4 R&D systems 314-BP 4 mM HCl + 1 mg/ ml FAF-BSA

10 μg/100 μl 20 ng/ml

FGF4 R&D systems 235-F4 1 mg/ ml FAF-BSA 10 μg/100 μl 20 ng/mlHGF R&D systems 294-HG 1 mg/ ml FAF-BSA 10 μg/100 μl 20 ng/mlOsM R&D systems 295-OM 1 mg/ ml FAF-BSA 10 μg/100 μl 20 ng/ml

dispase Ⅱ Roche 0492078001 MEM 10 mg/ml 1 mg/mlmatrigel BD Bioscience 354230 5 μl/cm2

Y-27632 Wako 253-00511 DW 10 mM 10 μM

B-27 Invitrogen 12587-010 2%

FGF2 片山化学工業 16100103 1 mg/ ml FAF-BSA 10 μg/100 μl 10 ng/ml

物品

マルチプレート 12F （独立ウェル） フタ付, 12, 平底 (住友ベークライト株式会社, Cat no. MS-80120)

【手順】

（１）培地の作製

Human ES culture medium の作製

80% DMEM/F12, 20% KSR, 1×NEAA, 2 mM L-Glutamine, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol

RPMI1640 + B27 の作製

RPMI1640 medium + 2% B27 + 4 mM L-Glu　

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HCMHBM Basal medium + HCM Bullekit + 3 × GlutaMAXHCM Bullekit の EGF は使用しない

Fatty acid free BSA (FAF-BSA)1 mg/ml in PBS

（２）コンディショナルメディウム (CM) の作製

MEF CM3. MEF を 10 cm dish に播種 48 時間後、培地を除去し、10 ml の Human ES

culture medium を加える

4. 48 時間後、培養上清を回収

5. 10 ml の Human ES culture medium を加える6. 72 時間後、培養上清を回収

7. 2, 4 で回収した培養上清を合わせて、 0.22 μm のフィルターを通す

8. －20℃ 保存

Wnt-3a CM1. Wnt3a-expressing cell (L Wnt-3A cell line) を、RPMI1640 + B27 培地に 1%

FBS を加え、10 cm dish に播種する

2. 48 時間後、培養上清を回収し、新鮮な RPMI1640 + B27 培地を加える

3. 72 時間後、培養上清を回収4. 2, 3 で回収した培養上清を合わせて、 0.22 μm のフィルターを通す5. －20℃ 保存

（２）プレートのコーティング

9. マルチプレート 12F に、matrigel 240 μl (コート量:5 μl/cm2) を、RPMI1640 培地 12 ml に希釈し、1 ml/well 入れる

10. 37°C、CO2 5%インキュベーターで 60 min 以上静置する

（３）iPS 細胞の播種

clump differentiation1. 80% コンフルエントの iPS 細胞を、1mg/ml の dispase を用いて matrigel 上に

Passage 2. matrigel 上で培養する時の培地は、 50% MEF CM + 50% Human ES culture

medium + 10 ng/ml FGF2 3. 80 % コンフルエント/well になるまで、Pre-culture (最大 4日間、培地交換は毎

日)

15

single cell differentiation13. 80% コンフルエントの iPS 細胞を、accutase を用いて matrigel 上に (2.5×105

cells/well) Passage14. matrigel 上で培養する時の培地は、50% MEFCM + 50% Human ES culture medium

+ 10ng/ml FGF2 + 10 μM Y-2763215. 80 % コンフルエント/well になるまで、Pre-culture (最大 4日間、培地交換は毎日)

（4）内胚葉への分化 (day 0 ～ day 4)4. 80% コンフルエントになったら分化開始

5. 培地を除去

6. 50% Wnt-3a CM + 50% RPMI1640 + B27 + 100 ng/ml Activin A を入れる

7. 4 days culture (毎日培地交換)

（5）肝幹前駆細胞への分化 (day 4 ～ day 9)6. RPMI1640 + B27 + 20 ng/ml BMP4 + 20 ng/ml FGF4 に培地交換

7. 5 days culture (毎日培地交換)

（6）肝細胞への分化.1 (day 9 ～ day 14)6. RPMI1640 + B27 + 20 ng/ml HGF に培地交換7. 5 days culture (毎日培地交換)

（7）肝細胞への分化.2 (day 14 ～ day 25)6. HCM + 20 ng/ml OsM に培地交換7. 11 days culture (48 時間毎に培地交換)

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