ntnu · web view891-898, 1985). dette transposonet har et gen som koder for resistens mot...

Laboratoriekurs i Molekylær Genetikk

Høsten 2000

av Svein Valla

Institutt for Bioteknologi/ NTNU

2Laboratoriekurs i Molekylærgenetikk

Innholdsfortegnelse:

Emne Side

TIMEPLAN

FORSØK 1. OVERFØRING AV ET GEN SOM SPESIFISERER RESISTENS MOT KANAMYCIN FRA PLASMIDET PUC128KM TIL PBR322.

FORSØK 2. KOPITALLSMUTANTER I SMÅ DERIVATER AV PLASMIDET RK2.

FORSØK 3. HETEROLOG EKSPRESJON AV FOSFOGLUKOMUTASE (PGM) FRA ACETOBACTER XYLINUM.

FORSØK 4. ANVENDELSE AV TRANSPOSONER SOM MUTAGEN.

MEDIER OG LØSNINGER:

Reflecting on the prospects for further advance, one may be tempted to take an attitude of romantic pessimism: all that remains is either applications or epistemological disquisition. Such was the mood in physics around 1900 — after Maxwell and Boltzmann, and just before Curie, Planck, Rutherford, Einstein and Bohr entered the picture. And so there is hope for the young biologists who dream of discovery.


INNLEDNING - KURSPROGRAM.

Arbeidet utføres på studentlaboratoriet i 3. etg. K3. Vi starter hver dag med en liten

gjennomgang. Det er viktig at alle på forhånd har satt seg såpass inn i laboratoriearbeidet at

de vet hva som skal foregå. Hvis alle må spørre "om alt" blir det kaos!

Ordinære forelesninger går som normalt begge ukene..

Forøvrig gjør jeg spesielt oppmerksom på at vi i Norge har en lov som regulerer

forskning og anvendelser innen rekombinant DNA teknologi. I dette kurset er det viktig

å være klar over følgende:

A. Ingen må ta med seg organismer ut av laboratoriet.

B. Bakterier i væske må ikke kastes i vasken. Alt slikt avfall blir autoklavert

av kurslederne. Agarskåler og annet fast avfall som er kontaminert med

celler kastes i de oppsatte risk-avfallsboksene.

C. All spising/drikking er bannlyst i laboratoriet.

E. Alt søl fjernes av den som søler.

F. Er du i tvil om hva du skal gjøre i en situasjon som angår mulig

forurensning med rekombinante organismer: Kontakt en av kurslederne.

Improviser ikke private løsninger!

Jeg har i størst mulig grad prøvd å ta hensyn til når dere er opptatt med andre ting.

Det er imidlertid mye annet å ta hensyn til også (andre skal ha laboratoriet, undertegnede er

opptatt osv.) slik at jeg henstiller til at dere gjør det beste ut av programmet og ikke ber om

ytterligere endringer! Dere vil se at det er tildels mye venting, noe som er normalt når man

arbeider med levende organismer. Fyll tomrommene med å prøve og forstå skikkelig hva

som foregår den i eksperimentelle delen. Forøvrig kan det bli noen demonstrasjoner og

forelesninger i ventetidene. Vær forøvrig klar over at sluttidspunktene er anslått.


Timeplan

ForsøkTidsbruk1

1. Kloning av kan-gen

2.Kopitalls-mutanter

3. PGM-ekspresjon

4.Transposoner som mutagen

Mandag 30.10 / 6.118:30 - 15:00

KuttingGel-elektroforese

TransformasjonPlating

Tirsdag 31.10 / 7.1108:30 - 12:00

QIAquick-rensingLigering

Inokulering

Onsdag1.11 / 8.1108:30 - 15:00

Transformasjon PlasmidisoleringKutting

Torsdag 2.11 / 9.1108:30 - 17:00

PlateinspeksjonKoloni-overføringer

GelkjøringKopitalls-bestemmelse

Lage ekstraktMåle aktivitet Konjugasjon

Fredag 3.11 / 10.11 08:30 - 12:00

Plateinspeksjon Måle protein-konsentrasjon

Beregne frekvenser.Koloni-overføringer

Mandag4.11 / 13.1110 min...

Plate-inspeksjonTolk!

1) Dette er kun anslått tidsbruk!


Forsøk 1. OVERFØRING AV ET GEN SOM SPESIFISERER RESISTENS MOT KANAMYCIN FRA PLASMIDET pUC128Km TIL pBR322.

Dette forsøket er et enkelt kloneforsøk som illustrerer de mest grunnleggende prinsippene i

rekombinant DNA-teknologi. Et gen (Km) som koder for resistens mot antibiotikumet

kanamycin er på forhånd klonet inn i kloningsvektoren pUC128, i setet for

restriksjonsendonukleasen BamHI som sitter i en polylinker i dette plasmidet. Polylinkeren er

et syntetisk laget DNA-fragment bestående av mange ulike restriksjonsseter, og deretter satt

inn i plasmidet. Setene i polylinkeren er vist i Figur 1. I dette forsøket skal vi ta ut Km-genet

fra pUC128Km og deretter klone dette fragmentet inn i plasmidet pBR322. Et kart av dette

plasmidet er vist i Figur 3 side 9.

/ BstXI \/ EagI \ / EcoRI

\/ SacI \ / SacII \ / NotI \/ XbaI

ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCC ACC GCG GTG GCG GCC GCT CTAMet Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Thr Ala Val Ala Ala Ala Leu

\/ SpeI

\/ BamHI \/ SmaI

\/ PstI

\/ EcoRI

\/ EcoRV \/ HindIII \/ ClaI

GAA CTA GTG GAT CCC CCG GGC TGC AGG AAT TCG ATA TCA AGC TTA TCGGlu Leu Val Asp Pro Pro Gly Cys Arg Asn Ser Ile Ser Ser Leu Ser

/ SphI \ \ / SalI \/ XhoI \ / ApaI \/

KpnI \ / NsiI \ / HindIII \

ATA CCG TCG ACC TCG AGG GGG

GGC CCG GTA CCG ATG CAT GCA AGC TTC.

Ile Pro Ser Thr Ser Arg Gly Gly Pro Val Pro Met His Ala Ser Phe.

Figur 1 pUC128 polylinker.


Dag 1.

1. Plasmidene pUC128Km og pBR322 utleveres som ferdig renset DNA. Lag følgende

blandinger i eppendorfrør (tilsettes i den rekkefølge de står):

Blanding A: 16.5 l dest. H2O

5.0 l pUC128Km (ca. 1 g)

2.5 l 10 x konsentrert BamHI-buffer.

1.0 l enzym (BamHI).

Blanding B: Samme som blanding A bortsett fra at

pUC128Km erstattes med pBR322 (samme volum).

Sett blandingene til inkubasjon ved 37C i to timer.

2. Tilsett 2.5 l loadingbuffer til prøvene. Appliser begge blandingene på hver sin 0.7 %

agarose-gel. La elektroforesen (70-100 V) gå i 1.5 timer i TAE-buffer (40 mM Tris, 20

mM eddiksyre, 1mM Na2EDTA, pH 8.0). Etterpå farges gelen med ethidium-bromid

(interkalerer mellom DNA-trådene og gir rød farge ved UV-bestråling).

3. Visualiser DNA ved å bestråle med langbølget UV (lite DNA-skader). Skjær ut

agarosebitene som inneholder Km-genet og pBR322. Dette utføres av kursansvarlig.


Dag 2

QIAquick prosedyre

Dette er en prosedyre for å isolere DNA fragmenter fra agarosegeler.

1. Tilsett 300 l buffer QG til gelbiten (som befinner seg i et eppendorfrør).

2. Inkuber ved 50OC i 10 min. Lengre inkubering kan være nødvendig hvis gelbiten ikke er smeltet. Vortex rørene et par ganger i løpet av inkuberingstiden.

3. Tilsett 100 l isopropanol til rørene og bland ved å vippe på rørene.

4. Plasser to QIAquick kolonner i hvert sitt oppsamlingsrør. Merk rørene så dere vet hva som er vektor og hva som er Km-gen.

5. Overfør agarose/DNA/isopropanol blandingen til kolonnene, og sentrifuger i 2 min. I dette trinnet vil DNA-fragmentene bindes til kolonnematerialet, mens oppløst agarose og isopropanol vil sentrifugeres igjennom.

6. Kast væsken i oppsamlingsrørene og plasser kolonnene tilbake i de samme rørene.

7. Tilsett 500 l buffer QG i kolonnene og sentrifuger i 2 min. Kast væsken i oppsamlingsrørene og sett kolonnene tilbake.

8. Tilsett 750 l buffer PE (inneholder etanol) og la kolonnene stå i 5 min. før sentrifugering i 2 min. Kast væsken i oppsamlingsrørene og sett kolonnene tilbake.

9. Sentrifuger i 2 min. Dette er et viktig trinn for å få fjernet all etanol.

10. Plasser kolonnene i to rene sterile eppendorfrør. Merk rørene godt! Tilsett 30 l H2O til kolonnene. Pass på at vannet dekker kolonnematerialet. La stå i 5 min.

11. Sentrifuger i 2 min. I dette trinnet elueres DNA-fragmentene ut fra kolonnene, og vil nå være løst i vannet. DNA-løsningene kan nå brukes videre til ligering.

Sett opp følgende tre ligeringsrør.A. 5 l Km-DNA + 12 l dest. H2O + 2 l 10 x kons. ligeringsbuffer + 1 l

T4 DNA ligase.

B. Samme som A bortsett fra at Km-DNA erstattes med samme volum BamHI-

kuttet pBR322 DNA.

C. 16 l Km-DNA + 1 l BamHI-kuttet pBR322 DNA + 2 l

10 x kons. ligeringsbuffer + 1 l T4 DNA ligase.

Merkes og leveres til veilederne, som setter dem til ligering ved romtemp over natt.


Dag 3. Transformasjon.

1. Transformer hver av blandingene inn i E. coli DH5 (utleveres), som beskrevet i øvelsen

med kopitallsmutanter (Forsøk 2, side 12, pkt. 4-6, bruk 10 l av ligeringsblandinga).

2. Plat ut på følgende skåler fra hver av de tre transformasjons-blandingene:

LA + amp (ufortynnet, 10-1 og 10-2 ganger fortynnet).

LA + kan (ufortynnet og konsentrert).

LA (10-5 og 10-6) ganger fortynnet.

Inkuber over natt ved 37C. Forklar resultatene.

-------------------------------------------------------------------------------------------

Dag 4. Inspeksjon av plater og vurdering av resultater.

Inspiser platene fra Dag 3. Plukk minst 10 kolonier (gjerne flere) fra LA + amp og 10

kolonier fra LA + kan med tannpirker og overfør til LA + amp, LA + kan og LA + tet. Dvs.

hver enkelt koloni dere plukker skal avsettes på tre ulike plater. Merk av slik at du holder

styr på hvilken plate de enkelte koloniene kom fra. Inkuber over natt ved 37C.

--------------------------------------------------------------

Dag 5. Inspeksjon av plater og vurdering av resultater.

Inspiser plater fra Dag 4 og forklar resultatene.

--------------------------------------------------------------

Antibiotika-konsentrasjoner i agarmediet:

Ampicillin: 200 g/ml

Kanamycin: 50 g/ml

Tetracyclin: 15 g/ml


Forsøk 2. KOPITALLSMUTANTER I SMÅ DERIVATER AV PLASMIDET RK2.

Bakgrunn.

Plasmidet RK2 (60 kilobaser) har blitt studert i flere laboratorier, hovedsaklig på

grunn av dets evne til å replikere i tilnærmet alle bakterie-arter (Gram-positive er lite

studert). RK2 er konjugativt og inneholder tre gener for resistens mot antibiotika, mange

gener for konjugativ overføring og kompliserte reguleringssystemer av tildels ukjent

funksjon.

I likhet med mange andre komplekse plasmid-systemer er det mulig å benytte

rekombinant DNA-teknologi til å fjerne gener som ikke er absolutt nødvendige for

plasmidets replikasjon. Ved å lage slike delesjons-derivater blir det vesentlig enklere å

studere de basale mekanismene som ligger til grunn for replikasjonen. I dette forsøket skal vi

benytte et slikt mini-derivat av RK2. Figur 2 viser et kart av dette plasmidet, som har fått

betgnelsen pFF1.

Figur 2: Gener og noen restriksjonsseter angitt for plasmidet pFF1

Figur 3: Gener og noen restriksjonsseter angitt for plasmidet pBR322

Det er ett gen og ett sete ("site") i pFF1 DNA som er nødvendige for replikasjon. DNA-setet

(oriV) koder ikke for et protein, men representerer startpunktet for DNA-replikasjonen. For

at replikasjonen skal kunne initieres fra oriV må først et bestemt protein binde seg der. Dette

proteinet kodes av replikasjonsgenet trfA. mRNA fra trfA-genet inneholder to alternative

translasjonsstarter (AUG). De to startkodonene er i ramme i forhold til hverandre slik at det

produseres to polypeptider hvor det ene er lengre enn det andre, men hvor begge har en stor

pFF15873 bps

SalI,65

Bpu10I,912

NcoI,1441

BstBI,1669SbfI,1713PstI,1714

NdeI,1993BsgI,2100

SfiI,2550EcoRI,2935

AflIII,3218

Eco47III,3564

PsiI,3726

NotI,4162

XhoI,4332

NruI,4427BglII,4451

BssHII,4531

BanII,4662

AhdI,5013BsaI,5085

Alw44I,5685Eco57I,5700

oriT

cat

trfA

Pneo

oriV

bla

pBR3224361 bps

ClaI,23HindIII,29

EcoRV,185NheI,229

BamHI,375SgrAI,409

SphI,562EcoNI,622SalI,651

PshAI,712

Eco52I,939NruI,972

BspMI,1063

BsmI,1353StyI,1369

AvaI,1425MscI,1444

Bpu10I,1580BsgI,1650AccIII,1664BsaBI,1668

PvuII,2064BsmBI,2122

Tth111I,2217BsaAI,2225

Bst1107I,2244NdeI,2295

SapI,2350AflIII,2473

BspLU11I,2473

AlwNI,2884

AhdI,3361

BsaI,3433

VspI,3537PstI,3607

PvuI,3733

ScaI,3844

SspI,4168AatII,4284

ApoI,4359EcoRI,4359

Tc

ROPori

Ap


del som er identisk. Det er vist at både det lille og det store proteinet hver for seg kan initiere

replikasjon i E. coli, mens dette ikke er tilfelle i Pseudomonas aeruginosa (bare det store

proteinet fungerer). Foruten oriV og trfA, har pFF1 et gen som koder for resistens mot

ampicillin, et som koder for resistens mot kloramfenikol og et sete på DNA (oriT) som

benyttes som startpunkt ved konjugative overføringer av plasmidet til andre celler.

TrfA-proteinet har vist seg å ha minst tre forskjellige funksjonelle egenskaper: Det

kan binde seg til DNA, bidra til initiering av replikasjon (ukjent mekanisme) og regulere

plasmidets kopitall. De to første egenskapene kan til en viss grad være overlappende. Det har

blitt isolert mutanter i trfA-genet som medfører at plasmidet mister evnen til å replikere, og

slike mutanter kan bare holdes "i live" ved å tilføre intakt TrfA fra for eksempel et annet

plasmid i samme celle. En alternativ type mutanter, som også har blitt isolert, er av en slik

karakter at mutant-proteinet er funksjonelt opp til en viss temperaturgrense, mens aktiviteten

tapes ved høyere temperaturer. Slike mutanter kalles temperatur-sensistive (ts), og den

biokjemiske basis er at mutasjonen har medført en endring i proteinet slik at det undergår en

konformasjonsendring (med påfølgende tap av funksjonalitet) ved forhøyet temperatur.

Kjemisk sett kan man for eksempel tenke seg at en viss interaksjon mellom to aminosyrer

holder proteinet sammen i en bestemt foldet struktur som er nødvendig for funksjonen.

Dersom den ene av aminosyrene blir skiftet ut (ved mutasjon) med en annen som medfører at

interaksjonen mellom aminosyrene svekkes kan man tenke seg at den foldede strukturen

"rakner" når termisk energi tilføres (temperaturheving).

En annen type mutanter (cop-mutanter) som har blitt isolert i trfA-genet fører til at

plasmidets kopitall (gjennomsnittelig antall plasmidmolekyler/celle) øker, for eksempel fra

fem til hundre. Det er isolert et stort antall forskjellige slike mutanter, og lokaliseringen av

disse (+ flere andre) i trfA-genet er vist i Figur 4.


Figur 4: Oversikt over karakteriserte mutasjoner i trfA-genet

Mekanismen for regulering av kopitallet i villtypen er ikke fullstendig klarlagt, men en

modell med betydelig eksperimentell støtte innebærer at plasmidets replikasjon hindres ved

at TrfA/DNA-komplekser kan danne replikativt ufunksjonelle aggregater når antallet

plasmid-molekyler i cellen blir høyt (se Figur 5). Dannelsen av disse kompleksene beror i

følge modellen på at visse områder av TrfA-proteinet har affinitet for hverandre, og

kopitallsmutantenes fenotype kan derfor forklares ved å anta at mutasjonen har medført

svekkelse av denne affiniteten. Replikasjonen blir dermed mindre hindret eller blir eventuelt

bare begrenset av initieringskapasiteten. Med den kunnskap vi har i dag tyder det meste på at

de mutantene vi har tilgang på bare har en nedsatt grad av kopitallsregulering. Dette betyr at

affiniteten mellom replikasjons-kompleksene ikke er eliminert, men bare redusert. Mutanter

som er slik at affiniteten er helt borte vil initiere replikasjon med så høy frekvens at cellene

drepes.


Figur 5: Koblingsmodell for kopitallsregulering av plasmider


--------------------------------------------------------------

Dag 1. Transformasjon for etablering av intern kopitallsmarkør.

De tre E. coli-stammene DH5(pFF1), DH5(pFF1cop254D) og DH5(pFF1cop271C)

utlevers. Stammene skal transformeres med plasmidet pBR322 (bærer av resistens mot

tetracyclin, se Figur 3, s.9) som skal fungere som en internmarkør for semikvantitativ

kopitallsbestemmelse. Kopitallet til pBR322 er (så langt vi vet) upåvirket av kopitallet til

pFF1 og dets derivater. Transformasjonen utføres på følgende måte [Chung et al., (1989).

Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2172-2175]:

1. Inokuler fra de tre stammene 1% (0.1:10 ml) i forvarmet (37C) LB-medium.

2. Dyrk ved 37C rysting i 2.5 timer, og avkjøl på is 5 min.

3. Sentrifuger 5 ml kultur i falconrør (3000 rpm, 15 min.) og resuspender forsiktig (cellene

blir "skjøre") i 0.5 ml kald TSS (LB med 10% Polyethylenglycol 6000, 5%

dimetylsulfoksyd, 30 mM MgCl2), og sett på is.

4. Overfør 100 l TSS-celler til hvert av tre eppendorfrør og la cellene stå i 30 min. på is.

5. Tilfør 10 l pBR322 DNA (utleveres) til hvert av rørene og inkuber videre på is i 30 min.

6. Tilsett hvert av rørene1 ml LB og inkuber ved 37oC i 1 time.

7. Plat ut (-fra hvert av rørene) på LA-plater tilsatt kloramfenikol (25 g/ml) + tetracyclin

(15 g/ml) fra ufortynnet og oppkonsentrert kultur. Inkuber platene over natt ved 37C.

Fortynn hver av de tré utleverte kulturene (se øverst, Dag 1) 10-4 og 10-6 ganger i LB. Fra

begge fortynningene avsettes 5 l på LA-plate uten antibiotika og LA-plater med følgende

konsentrasjoner av ampicillin: 0.4 mg/ml, 1 mg/ml og 4 mg/ml og 8 mg/ml. Benytt bare en

plate fra hver av ampicillin-konsentrasjonene til alle tre kulturene (totalt 5 plater, 6 dråper på

hver plate). La dråpene trekke inn i agaren og inkuber skålene ved 37oC over natt. NB!

Dråpene skal ikke strykes ut!


--------------------------------------------------------------

Dag 2. Inokulering for plasmid-isolering avlesning av reistensnivåer.

1. Inspiser platene hvor de tre forskjellige stammene fra Dag 1 ble platet ut på medier med

varierende konsentrasjoner av ampicillin. Hvordan forklarer du resultatene?

2. På ettermiddagen: Inokuler 1 koloni (-steril tannpirker) fra hver av de tré stammene som

ble transformert med pBR322 i 3 ml LB-medium i reagensrør. LB-mediet skal være

tilsatt kloramfenikol (25 g/ml) og tetracyclin (15 g/ml). Inkuber over natt ved 37C.

--------------------------------------------------------------

Dag 3. Plasmidisolering – ved hjelp av Wizard Minipreps DNA Purification System:

Plasmidene fra pBR322-transformantene skal isoleres og preparatene skal brukes til en

semikvantitativ bestemmelse av kopitallet til de to pFF1-mutantene (relativt til villtypen).

1. Sentrifuger ca. 1.5 ml av hver kultur i eppendorfrør (7000 rpm, 5 min.)

2. Resuspender pelleten i 200 l resuspenderingsløsning, bruk Whirl-mixer.

3. Tilsett 200 l lysisløsning og bland ved å snu rørene opp ned flere ganger (-ikke Whirl-

mixer!). Cellesuspensjonen skal nå bli mindre turbid.

4. Tilsett 200 l nøytraliseringsløsning og bland på samme måte som i pkt. 3.

5. Sentrifuger ved 15000 rpm i 10 min. i kjølesentrifuge.

6. Overfør den klare supernatanten til nye eppendorfrør (merk rørene!). Tilsett 600 l

isopropanol.

7. Sentrifuger ved 15000 rpm, 20 min. i kjølesentrifuge. Sug av supernatanten. Vær

forsiktig så ikke DNA-pelleten blir med.

8. Tilsett 500 l 70 % etanol og sentrifuger ved 15000 rpm, 5 min. Sug av all

supernatanten.


9. Lufttørk pelleten 15 min og løs DNA i 50 l MQ-vann.

Sett opp kutting med restriksjonsendonukleasen EcoRI. Dette gjøres på samme måte med

hver av de tre prøvene: Bland 21 l dest. vann + 3 l 10 x konsentrert restriksjonsbuffer + 5

l DNA + 1 l enzym. Surr parafilm rundt lokket og inkuber rørene over natt ved 37C.

--------------------------------------------------------------

Dag 4.

Sett opp følgende tre rør med utgangspunkt i hvert av rørene fra Dag 3 (totalt 9 rør):

1. 18 l prøve

2. 6 l prøve + 12 l dest. vann

3. 2 l prøve + 16 l dest. vann

Tilsett 2 l "loading buffer" til hvert av rørene og appliser prøvene på gel. Gelen kjøres i ca.

tre timer. Ta bilde av gelen og prøv å estimere kopitallet til de to kopitallsmutantene av

pFF1. Kopitallet til villtypeplasmidet er ca. 5/celle. Ser du noen korrelasjon mellom

ampicillin-resistensen og kopitallet ?


Forsøk 3. HETEROLOG EKSPRESJON AV FOSFOGLUKOMUTASE (PGM) FRA Acetobacter xylinum.

PGM er et enzym som inngår i et tidlig trinn i metabolismen av glukose. Opptak av

glukose er i mange bakterier koblet til en fosforyleringsreaksjon slik at sukkeret kommer inn

i cellen som glukose-6-fosfat (G-6-P), og denne forbindelsen går så videre i katabolismen

(oftest glykolysen, se lærebok i biokjemi). Alternativt kan G-6-P bli omsatt til glukose-1-

fosfat (G-1-P), og denne forbindelsen er en forløper for syntese av intracellulær amylose,

ekstracellulære polysakkarider eller lipopolysakkarider (LPS). Omsettingen av G-6-P til G-1-

P katalyseres reversibelt av PGM. Ved UNIGEN har vi studert dette enzymet delvis fordi det

er nødvendig for polysakkaridsyntese og delvis fordi det representerer et forgreiningspunkt i

metabolismen. Det siste har betydning ved at enzymet får "innflytelse" på hvilken vei tilført

karbonkilde (glukosen) tar i det metabolske nettverket. Som et enkelt eksempel kan nevnes at

man ikke vil ønske at sukkeret går til polysakkarid dersom man skal produsere et

antibiotikum. Omvendt ønsker man at sukkeret skal gå til polysakkarid dersom dette er det

produkt man vil framstille (for eksempel xanthan, som er et viktig tilsetningsstoff i

næringsmidler).

Ved UNIGEN har vi klonet og sekvensert PGM-genet (kalt celB) fra Acetobacter

xylinum. I denne organismen er enzymet nødvendig for cellenes evne til å produsere

ekstracellulær cellulose, og mutanter defekte i pgm produserer følgelig ikke cellulose (men

overlever). Vi har klonet pgm i to plasmider nedstrøms for de regulerbare promotorene Pm

og Pu, som har sin opprinnelse i et plasmid (TOL) i Pseudomonas putida. I denne

organismen fungerer Pm og Pu i forbindelse med uttrykk av gener som koder for enzymer

involvert i nedbrytning av aromatiske forbindelser som for eksempel toluen. Av den grunn

aktiveres promotorene av slike forbindelser (inducere), og aktiveringen skjer ved at

induceren binder seg til et protein (XylS for Pm og XylR for Pu, begge kodet av TOL-

plasmidet) som er en positiv regulator av Pm/Pu (forutsatt at induceren er bundet). Symbolet

som ser ut som den greske bokstaven omega er en transkripsjons-terminator. Figur 6

nedenfor viser hvordan vektorene med Pm/Pu og xylS/xylR er oppbygd. Se forøvrig forsøket

med kopitallsregulering for informasjon om funksjonen til de andre genene i vektoren.

I dette forsøket skal vi måle ekspresjon av rekombinant PGM i E. coli-celler som

inneholder pJBRCelB eller pJBScelB. Det vil bli benyttet en mutant av E. coli som mangler

egen PGM, slik at all PGM-aktivitet vi måler skriver seg fra det rekombinante enzymet.


Som utgansgspunkt for målingene vil vi lage cellefrie protein ekstrakter av E. coli-celler med

disse plasmidene, og så måle PGM-aktivitet i disse ekstraktene. Prinsippet for målingen av

enzymaktiviteten er at man måler hastigheten i omsettingen av G-1-P til G-6-P i et såkalt

koblet assay. En ”assaymix” tillages hvor substratet G-1-P tilsettes i overskudd, og blir

omsatt til G-6-P av PGM. G-6-P som dannes blir konvertert videre til glukonolakton-6-fosfat

katalysert av et tilsatt (-i overskudd) hjelpeenzym G-6-P dehydrogenase. Denne siste

reaksjonen krever tilsats av NADP, som blir redusert til NADPH. Genereringen av NADPH

kan måles spektrofotometrisk ved 340 nm, og dette gjør det mulig å beregne hvor mye G-1-P

som er blitt omsatt (per minutt). Den spesifikke aktiviteten kan så beregnes i forhold til den

totale proteinmengde i ekstraktet. Av hensyn til nøyaktigheten i målingen må tilsatt mengde

ekstrakt være slik at PGM er den begrensende faktor i reaksjonen. PGM krever dessuten

magnesium for full aktivitet, og glukose-1,6-difosfat (G-1,6-diP) spiller en rolle i forbindelse

med fosforylerinegen av enzymet. Begge disse komponentene tilsettes derfor også assaymix.

PGM-reaksjonen er forøvrig beskrevet på side 454 i Stryer (tredje utgave).

Figur 6. Oversikt over plasmidene pJBRCelB og pJBSCel B.


Av praktiske grunner (mange studenter) vil forsøket bli delt opp slik at det i sum (for

alle gruppene) illustrerer de viktigste poengene. Alle gruppene må derfor notere

samtlige resultater og beskrive dem som en enhet. Gruppeinndelingen blir som følger:

Gruppe 1: Celler (pgm-) uten plasmid

Gruppe 2: Celler med pJBRcelB uten induksjon av Pu.

Gruppe 3 og 4: Celler med pJBRcelB og induksjon av Pu.

Gruppe 5: Celler med pJBScelB uten induksjon av Pm.

Gruppe 6 og 7: Celler med pJBScelB og induksjon av Pm.

-------------------------------------------------------------

Dag 1. Tillaging av enzymekstrakt og måling av PGM-aktivitet.

1. Hver gruppe får tildelt 1 kolbe med 10 ml eksponentielt voksende E. coli-celler (30oC)

med det aktuelle plasmid. De gruppene som skal tilsette inducer tilsetter 3 mM

(sluttkonsentrasjon) 3-metyl-benzylalkohol (Pu) eller 1 mM (sluttkonsentrasjon) toluat

(Pm) til cellene. Ved tilsats av inducer: Unngå å ta kolben ut av ryste-badet, og tilsett

raskt slik at du i minst mulig grad påvirker cellenes fysiologiske tilstand. Inkuber videre i

4 timer.

2. Sentrifuger cellene (6000 rpm, 5 min.) og resuspender i 10 ml kald Imidazol-buffer (40

mM Imidazol-HCl, pH 7.4).

3. Sentrifuger igjen (som i pkt. 2) og resuspender i 3 ml kald Imidazol-buffer.

4. Soniker suspensjonen under følgende betingelser: Tid, 2 min. Duty cycle, 25%. Output

control, 3.

5. Sentrifuger 1 ml av sonikatet i eppendorfrør, 12000 rpm, 5 min.

6. Ta vare på supernatanten (= cellefritt proteinekstrakt), som inneholder PGM. Sett på is!


7. For måling av PGM-aktivitet er det på forhånd tillaget en assaymix bestående av

følgende komponenter (per ml):

A. 400 l Imidazol-HCl (0.1 M, pH 7.4).

B. 50 l MgCl2 (0.1 M).

C. 74 l NADP+ (6.2 mM).

D. 10 l G-6-P dehydrogenase (100 u/ml).

E. 8 l G-1,6-diP (1 mM).

F. 20 l G-1-P (0.1 M).

G. H2O til 1ml.

Forsøk å forklare alle komponentene i assayet (f. eks lag en skisse)

8. 1 ml assaymix overføres en kvarts-kyvette og brukes til å nullstille spektrofotometeret.

Tilsett så 20 l enzym-ekstrakt og start programmet. Absorbansendring ved 340 nm blir

registrert hvert 10. sek. i 2 min. Tilsatsen av enzym-ekstrakt må være slik at PGM

representerer den begrensende faktoren. Dette vil være tilfelle dersom

absorbansendringen er mindre enn 0.2/min. For de gruppene der det blir nødvendig å

fortynne enzym-ekstraktet, gjøres dette i 40 mM Imidazol-buffer (fortynn for eksempel

10 ganger).

-------------------------------------------------------------------------------------------

Dag 2. Måling av protein i ekstraktene.

1. Fortynn enzymekstraktet 50-100 ganger i 40 mM Imidazol-buffer. Totalt sluttvolum 1

ml.

2. Tilsett 0.25 ml BIORAD protein-farge reagens. Bland kraftig på Whirl-mixer og la stå i

minst 5 min. ved romtemperatur.

3. Lag samtidig en tilsvarende blankløsning uten tilsats av protein-ekstrakt.

4. Nullstill spektrofotometeret med blankprøven. Bølgelengde 595 nm.

5. Les av verdien for prøven. Denne verdien bør være mellom 0.2 og 0.6. Dersom verdien

ligger utenfor dette området lages en ny fortynning av enzym-ekstraktet som måles på

tilsvarende måte.


6. Beregn mengde protein i opprinnelig prøve ved å benytte den utleverte standardkurven

for proteinet bovine serum albumin (BSA).

7. Regn ut den spesifikke PGM-aktiviteten som nmol G-1-P omsatt per minutt per mg

protein. En absorbans på 1.0 tilsvarer 178 M NADPH. I reaksjonen omsettes 1 molekyl

NADP+ per 1 molekyl G-1-P. Prøv å klare denne beregningen i gruppa uten hjelp av

veiledere!

Hint:

Beregn først antall mg protein som ble tilsatt assaymix (PS, fortynnet dere ekstraktet før

det ble tilsatt??)

Bestem OD340 per minutt (-skal ligge mellom 0-0.2)

Beregn antall nmol G-1-P omsatt per min med utgangspunkt i kjent molar absorbans for

NADPH (se ovenfor!). PS; 178 M tilsvarer 178 nmol per ml. Husk; vår assaymix var på

1 ml.

Beregn så spesifikk PGM-aktivitet (nmol G-1-P/min/mg protein)


Forsøk 4. ANVENDELSE AV TRANSPOSONER SOM MUTAGEN.

Bakgrunn.

Transposoner er spesialiserte DNA-sekvenser som kan forflytte seg innen et replikon

eller mellom forskjellige replikons. Forflytningen kan skje ved at det syntetiseres en kopi av

det opprinnelige transposonet, og kopien setter seg så inn i et nytt sete. Alternativt skjer

forflytningen uten kopiering (transposonet "forlater" sitt opprinnelige sete). Etterhvert som

flere og flere organismer har blitt studert genetisk, synes det klart at transposoner er en

naturlig del av genomet til de fleste eller alle organismer, inkludert eukaryote.

Oppdagelsen av at DNA kan forflytte seg har ført til en endring i synet på

mekanismen bak evolusjon. Tidligere ble DNA oppfattet som en statisk struktur som bare

kunne endre seg i relativt små og tilfeldige steg, mens vi nå vet at arvematerialet snarere er et

dynamisk stoff i stadig endring.

Transposoner har vist seg å være særdeles nyttige som verktøy for genetisk forskning,

og i denne øvelsen vil det bli illustrert hvordan transposonforflytninger kan detekteres og

analyseres. Resultatene fra øvelsen vil også kunne brukes til å diskutere hvordan slike

forflytninger kan anvendes som metodeverktøy i genetisk analyse, selv om dette ikke blir

demonstrert eksperimentelt.

I eksperimentet vil vi benytte oss av et transposon (Tn3E.F. = 5 kb) som er en

videreutviklet (ved Unigen, E. Fjærvik) utgave av et tidligere publisert transposon (Tn3-

HoHo1, Stachel et al., EMBO J. 4: 891-898, 1985). Dette transposonet har et gen som koder

for resistens mot penicilliner (derivatet ampicillin vil bli brukt i denne øvelsen), et gen som

koder for en transposase (nødvendig for transposonets forflytning), og et gen som reduserer

aktiviteten til transposase-genet ved at det koder for en repressor. (For andre sider av

funksjonen til Tn3-type transposoner henvises til kapittel 5 i Mobile DNA,(1989) Berg, D. E.

& Howe, M. M. ed. American Society for Microbiology, Washington D.C.) Prinsippet bak

eksperimentet er som følger: Mål-replikonet for transposonet i vårt eksperiment er plasmidet

pRK311.1 (-resistent mot tetrasyklin, tetr), som er et rekombinant plasmid som kan

komplementere en defekt i cellulose-biosyntesen i bakterien Acetobacter xylinum (se Figur

7). Vi vil i dette eksperimentet illustrere hvordan man kan lage et sett av pRK311.1-derivater

som har fått insersjoner av Tn3E.F. i forskjellige lokaliseringer i plasmidet. Ved UNIGEN

har vi brukt slike insersjoner til å kartlegge hvor de komplementerende genene er lokalisert i

pRK311.1.


Figur 7. Restriksjonskart av pRK311.1. HindIII-setet sitter i en polylinker i vektor, og det samme er tilfelle for EcoRI-setet ved 27.4 kb. Insertet (tykk strek) er altså klonet mellom disse to setene. Den åpne delen er følgelig vektor-sekvenser.

Transponeringen skjer i E. coli-stammen S17.1, som i tillegg inneholder plasmidene

pHoHo1E.F.(bærer transposonet, men mangler transposase, resistent mot ampicilin, ampr),

pSShe (koder for transposasen, resistent mot kloramfenikol; chlr) og pRK311.1. Poenget med

å separere transposase-funksjonen fra transposonet, er å hindre at det skjer nye

transponeringer etter at den første har skjedd (se nedenfor). Siden transponering er en sjelden

hendelse (finner sted i f.eks 1 av 10.000 celler) må vi ha et seleksjonssytem for å "finne" de

cellene hvor transponering har skjedd (fra pHoHo1E.F til pRK311.1). Til dette formål brukes

E. coli-stammen C2110 (defekt i DNA polymerase I; polA- , og resistent mot nalidixinsyre;

nalr ) som en "hjelpe-celle".

Vår problemstilling er altså å vise hvordan vi kan selektere for celler som inneholder

pRK311.1-plasmider med insersjoner av Tn3E.F. Prinsippet for denne seleksjonen er

følgende: Når man dyrker S17.1(pHoHo1E.F., pSShe, pRK311.1) vil transponering skje bare

i en minoritet av cellene (f.eks 1 av 10.000). Blant de få cellene hvor transponering har

skjedd, vil det dessuten kunne ha skjedd transponeringer til bakteriekromosomet, og disse er

ikke av interesse i vårt tilfelle. Det finnes altså ingen metoder for å få transposonet til å sette

seg inn bare der vi ønsker. Man har derfor blitt nødt til å utvikle metoder som gjør det mulig


å identifisere de cellene hvor transponering har funnet sted, og også den subfraksjon av disse

hvor den ønskede transponering har funnet sted. Dette gjøres ved å konjugere plasmidet

pRK311.1 over i en annen stamme (C2110-stammen) og samtidig selektere for ampicillin-

resistens, som sitter på transposonet. Selve overføringen blir mulig ved at den spesielle

stammen (S17.1) har gener integrert i bakterie-kromosomet som bidrar til opprettelse av

konjugasjonsbroer (pili) og mobilisering av overførings-origo (oriT) i pRK311.1.

Siden C2110-stammen er resistent (spontan-mutant) mot nalidixinsyre, og pRK311.1

bærer resistens mot tetracyclin, kan vi selektere for overføring av pRK311.1 med insersjon

av Tn3E.F. ved å tilsette ampicillin, tetracyclin og nalidixinsyre til det selektive mediet.

Seleksjon av stammer som har fått overført både pRK311.1 og pHoHo1E.F. (og som dermed

blir resistente mot alle tre antibiotika uten at det har funnet sted transponering) er ikke

nødvendig da pHoHo1E.F. (i motsetning til pRK311.1) ikke kan replikere i C2110-stammen.

Dette beror på at pHoHo1E.F. krever et funksjonelt polA-gen hos verten, noe C2110-

stammen mangler. Ved denne type eksperimenter vil vi ofte i tillegg være interessert i bare

de insersjoner som har funnet sted i det klonede DNA i pRK311.1, og ikke i vektor-

sekvensene. Disse to gruppene skilles dels ved seleksjonskriterier og dels ved

restriksjonsanalyse av de forskjellige pRK311.1E.F.-derivatene.

-------------------------------------------------------------

Dag 1. Konjugasjon.

1. Inokuler E.coli S17.1(pHoHo1E.F., pSShe, pRK311.1) (ampr, tetr, chlr) og C2110 (nalr) i

nytt medium ved å overføre 0.1 ml fra utleverte kulturer til kolber med 10 ml LB. Dyrk

ved 30C på rysting til ca 108 celler/ml (1-2 timer). Plat ut 0.1 ml fra hver av kulturene

(ufortynnet) på LA + ampicillin + tetracyclin + nalidixinsyre. Inkuber ved 30C over natt.

2. Sentrifuger (5000 rpm) 1-1.5 ml av hver av kulturene i Eppendorfrør og resuspender hver

i 15 l LB.

3. Bland suspensjonene og avsett hele blandingen på ei LA-skål uten antibiotika. Ikke stryk

ut! Inkuber i 5 timer ved 37C. Tilsett 5 ml LB på skåla og rør ut cellene med en flambert

glasstav. Sug av suspensjonen med en pipette og overfør til et sterilt falkonrør. Bland

godt og stryk deretter ut 1 skål hver av:


Ufortynnet, 10-1, 10-2 og 10-3 fortynning på;

LA + ampicillin + nalidixinsyre, og

LA + ampicillin + tetracyclin + nalidixinsyre.

10-2, 10-4 og 10-6 fortynning på LA + tetracyclin + nalidixinsyre.

10-6 og 10-7 fortynning på LA med nalidixinsyre.

10-6 og 10-7 fortynning på LA uten antibiotika.

-------------------------------------------------------------

Dag 2. Inspeksjon av transkonjuganter og beregning av overføringsfrekvenser.

Noter resultatene fra skålene fra dagen før (tabell side 26). Forklar hvilke celler som vokser

opp på de forskjellige platene. Hvor stor har overføringsfrekvensen av pRK311.1 vært, og

hvor stor andel av de overførte plamidene hadde fått en transposon-insersjon? Overfør 10

kolonier fra LA + ampicillin + nalidixinsyre og 10 kolonier fra LA + tetracyclin +

nalidixinsyre til LA og LA + ampicillin + tetracyclin + nalidixinsyre og inkuber platene over

natt ved 37C.

--------------------------------------------------------------

Dag 3. Inspeksjon av plater fra Dag 2 og tolkning av et sett av utleverte resultater.

1. Inspiser platene fra Dag 2. Forklar resultatet.

2. Det forsøket som du nå har utført har tidligere vært videreført ved UNIGEN. Dette ble

gjort ved å isolere plasmidet fra celler som vokste opp på LA + ampicillin + tetracyclin +

nalidixinsyre. Disse plasmidene ble behandlet med restriksjonsendonukleasene HindIII og

EcoRI (eventuelt i kombinasjon). Fragmentene ble deretter separert ved agarose

gelelektroforese. Du får utlevert bilder av noen av de tilsvarende gelene. Prøv å finne ut

om det har skjedd en pHoHo1E.F.-insersjon, og hvor denne insersjonen eventuelt er

lokalisert. Bygg dine konklusjoner på vedlagte restriksjonskart av pRK311.1. Benytt også

den informasjon at transposonet er ca. 5 kb stort, har et unikt HindIII-sete ca. 100 basepar

fra den ene enden, og at det mangler seter for EcoR1.


3. Svar spesifikt på følgende spørsmål:

Bilde A: Hvilke av plasmidene har fått insersjon i vektor-delen, og hvilke har fått i insertet?

En av prøvene er pRK311.1 uten insersjon av transposon. Hvilken er det.

Bilde A. Plasmider med (11 stk.) eller uten (1 stk.) transposon-insersjon. DNA er kuttet med HindIII + EcoRI. De to sporene på ytterkanten er molekylvekt-standarder og verdiene i kb er: 12.2, 11.2, 10.2, 9.2, 8.1, 7.1, 6.1, 5.1, 4.1, 3.1, 2.0 og 1.6. Ett av de andre sporene (hvilket?) er også en standard, og molekylvektene er 23.1, 9.4, 6.6, 2.3 og 2.0. Av hensyn til problemer med fotokopieringen er negativ av gelen tatt med (til høyre). Dette viser klart hvor båndene er lokalisert.

Bilde B: Dette bildet viser noen av plasmidene hvor insersjonen er i insertet. I hvilken grad

er det mulig å fastslå lokaliseringen av insersjonene basert på dette bildet?

Bilde C: DNA fra gelen i bilde B er blottet over på en membran og hybridisert med hele

transposonet som probe. Hvordan bidrar dette til å verifisere tolkningen av dataene? Hint:

Husk at transposonet kan sette seg inn i to orienteringer. Hvordan tror du det er mulig å

bestemme orienteringen? Har transposonet spesielle preferanser når det gjelder hvor det

setter seg inn? Dette er en oppgave som krever god forståelse og gjennomtenkning. Gi ikke

opp før du har prøvd hardt (jeg vet at det kan være fristende!).


Bilde B (venstre) og C (høyre). I B er plasmidene kuttet med bare HindIII. De som er med på bildet er utvalgt med basis i at de alle hadde insersjon av transposonet i insert. Dette ble påvist ved å kutte med både HindIII og EcoRI, som i bilde A. I bilde C er det foretatt Southern blotting og hybridisering med transposonet som probe mot DNA i bilde B. Spor 1, 5, 8 og 11 er standarder (se bilde A).


Dag 1. pkt3 Fortynninger. NB!! Bland godt mellom hver fortynning!!Nummer

Fortynning

Preparering

1 100 1 ml kultur2 10-1 0,1 ml nummer 1 + 0,9

ml LB3 10-2 0,1 ml nummer 2 + 0,9

ml LB4 10-3 0,1 ml nummer 3 + 0,9

ml LB5 10-4 0,1 ml nummer 4 + 0,9

ml LB6 10-5 0,1 ml nummer 5 + 0,9

ml LB7 10-6 0,1 ml nummer 6 + 0,9

ml LB8 10-7 0,1 ml nummer 7 + 0,9

ml LB

Plat ut 0,1 ml per plate som følger:Fortynning

Platetype Resultat Kommentar. Hva vokser?

100 Amp/NalAmp/Tet/Nal

10-1 Amp/NalAmp/Tet/Nal

10-2 Amp/NalAmp/Tet/NalTet/Nal

10-3 Amp/NalAmp/Tet/Nal

10-4 Tet/Nal10-5 -10-6 Tet/Nal

NalUten antibiotika

10-7 Nal


Uten antibiotika

Dag 2. Overfør 10 kolonierFra TilAmp/Nal Amp/Tet/Nal

Uten antibiotika

Tet/Nal Amp/Tet/NalUten antibiotika


Medier og løsninger:

LB: 0.5% gjærekstrakt, 1% trypton, 1% NaCl

LA: LB + 2% agar

Stockløsninger, antibiotika:

Antibiotikum Stockløsning Utveid Løst iAmpicillin 200 mg/ml 10 g 50 ml s.i.v. sterilfiltrertKanamycin 100 mg/ml 1,0 g 10 ml s.i.v. sterilfiltrertTetracyclin 15 mg/ml 0,150 g 5ml s.i.v.

+ 5 ml EtOHKloramfenikol 30 mg/ml 0,300 g 10 ml EtOHNalidixinsyre 50 mg/ml 0,500 g 10 ml s.i.v sterilfiltrert


Plater

Beregnet ut fra 15 grupper

ukedagAntibiotika Man Tir Ons Tor Fre Sum

platerMengde medium 1

Mengde av antibiotikastock i den oppgitte mengden medium

Amp, 200 g/ml

135 15 150 4,5 L 4,5 mL(1 mL/L)

Amp, 0,4 mg/ml

15 15 0,45 L 0,9 mL(2 mL/L)

Amp, 1,0 mg/ml

15 15 0,45 L 2,25 mL(5 mL/L)

Amp, 4,0 mg/ml

15 15 0,45 L 9 mL(20 mL/L)

Amp, 8,0 mg/ml

15 15 0,45 L 18 mL(40 mL/L)

Amp2

Nal60 60 1,8 L 4,5 mL (2,5mL/L)

1,8 mL (1 mL/L)Amp2

TetNal

90 15 105 3,15 L 7,875 mL (2,5 mL/L)3,15 mL (1 mL/L)3,15 mL (1 mL/L)

TetNal

45 45 1,35 L 1,35 mL (1 mL/L)1,35 mL (1 mL/L)

Tet 15 15 0,45 L 0,45 mL (1 mL/L)Nal 30 30 0,9 L 0,9 mL (1 mL/L)ChlTet

90 90 2,7 L 2,7 mL (1 mL/L)2,7 mL (1 mL/L)

Kan 90 15 105 3,15 L 3,15 mL (1 mL/L)Uten 15 90 45 15 165 4,95 L

SUM:780

SUM: 23,4 L

1) Antar omtrent 30 ml medium pr. plate2) Sluttkons. av ampicillin skal være 500 g/ml hvis ikke annet er presisert.

Sluttkonsentrasjon av de andre antibiotikaene:

Nal: Nalidixinsyre: 50 g/mlTet: Tetracyclin: 15 g/mlChl: Kloramfenikol: 30 g/mlKan: Kanamycin: 100 g/ml

ntnu · web view891-898, 1985). dette transposonet har et gen som koder for resistens mot...

Documents