week 1. the post-genome era -genome … · ⑤transcriptomics (전사체학)...

건국대학교 미생물공학과 1

Week 1. The Post-genome Era

1. Post-genome era (후 게놈 시대)

- Genome project의 완성으로 생명체의 DNA 정보가 모두 밝혀진 시대

- 인간을 비롯한 수 많은 organism들의 genome project가 완성되어 post-genome era

에 접어들게 됨

※ Genome (유전체): The entire collection of chromosome in each cell of an organism. The whole

hereditary information encoded in DNA

Genome = coding sequences (genes) + noncoding sequences (junk DNA: intergenic regions +

repeated element)

※ Gene(유전자): Corresponding a DNA sequences to a single protein

2. Post-genome era에서의 생물학 연구의 초점

- Genome era에서는 genome sequence를 밝히는데 주력을 했다면 post-genome era

에는 그 genome의 역할을 밝히는데 연구의 초점을 둠

- Genome project를 통해 얻어진 방대한 DNA 정보를 이용한 생물학

- DNA가 발현되는 단백질에 대한 연구(Proteomics)

- 유전자의 발현 및 기능과 단백질의 3차 구조를 밝혀 생명현상을 이해하기 위한 post-

genome project

- 방대한 양의 게놈 정보 관리 및 분석을 위한 생명정보학(bioinformatics) 비중이 커짐

① Functional Genomics (기능성 유전체학)

인간이 가진 유전자 중 약 30% 정도만이 그 기능이 밝혀져 있음. 기능성유전체학은genome들의 기능과 발현 조절뿐만 아니라 실제로 유전자가 생체 내에서 어떻게이용되는지에 대해 연구하여 해당 genome을 인간생활에 유용하게 이용하고 유전적 질병의 원인을 규명하는 것을 목표로 함. 특히 생물정보학의 발달로 특정 역할을할 것으로 예상되는 유전자들을 분류하여 다양한 분석을 행할 수 있게 되었음.

한 유전자의 기능과 조절 작용을 분석하기 위해서는 위의 그림에 나와있는 6개의조절 단계에 대한 연구가 모두 이루어져야 하고 이들은 모두 기능성 유전체학의 연구범위라 할 수 있음.


Week 1. The Post-genome Era

※ Central dogma

The central dogma of molecular biology was first enunciated by Francis Crick in 1958 and

re-stated in a Nature paper published in 1970

② Comparative Genomics (비교 유전체학)

개인간, 인종간, 생물간의 유전자를 비교 분석하여 그 생체 기능의 차이를 연구하는학문. 사람과 침팬지 등 다른 종들과의 비교뿐만 아니라 사람과 사람간의 차이도 그비교 범주에 들어가기 때문에 유전적 질환이나 약물 연구에도 이용될 수 있는 분야라 할 수 있음. 사람과 타 종간의 유전자 유사성 연구는 사람의 단백질 기능을 밝히는데도 중요한 역할을 함.

③ Structural Genomics (구조 유전체학)

단백질의 삼차원 입체구조에 바탕을 둔 생물학적 기능과 단백질간 상호 작용을 규명하여 생명현상을 기술하고자 하는 접근 방법. 먼저 기능을 전혀 모르는 단백질들의 구조 규명을 하고, 이미 기능이 알려진 유사 분자들과의 구조를 비교하고 목적하는 단백질의 기능을 유추한 뒤 생화학적, 생물학적 검증 실험을 통해 분자의 기능을분석하는 것.

④ Proteomics (단백체학)

단백질 수준에서의 발현수치, 해독후의 변형, 질병 진행에 대한 통합된 관점, 세포진행 등에 관여하는 단백질의 특성 및 기능을 밝히는 학문. Post-genome 시대의연구의 흐름은 유전자가 단백질을 만드는 과정이 어떻게 조절이 되고 단백질이 어떤 기능을 하고 그 활성이 어떻게 조절이 되는지를 밝히는 방향이 됨. 생명의 기본정보를 담고 있는 것은 DNA 이지만 실제로 생명현상을 주관하는 것은 단백질이기때문.

⑤ Transcriptomics (전사체학)

생체내의 특정 세포의 유전자 발현 정도를 분석하는 학문. 전사체는 세포에서 발현중인 모든 RNA를 말하는 것으로 단백질 발현 정도는 mRNA의 양을 측정하여 유추할 수 있음. 전사체학의 주요 기술 중 대표적인 것으로는 DNA Chip과 SAGE (serial analysis of gene expression technology)를 들 수 있음.


Week 2. Human Genome Project

1. What is ‘Genome Project’?- 유기체의 genome 전체의 서열을 분석하여 데이터베이스로 만드는 프로젝트

- 1980년대에 유전적 질환을 일으키는 유전자가 실제 존재하는 것임을 알아내고, 유전

정보가 담겨있는 DNA의 서열을 밝히려는 계획이 수립됨

- Human Genome Project을 포함하여 여러 organism에 대한 genome project가 완성

되거나 진행 중에 있음

- Human Genome Project의 완성으로 post-genome 시대의 도래

“The HGP will be the ability to better diagnose, treat and prevent disease, and most

of those benefits to humanity still lie ahead. With these immense data sets of

sequence and variation now in hand, we are now empowered to pursue those

goals in ways undreamed of a few years ago.” - Francis Collins

2. The history of human genome project

1987 YAC(yeast artificial chromosome) vector 개발 (Science)

1987 400개의 RFLP(restriction fragment length polymorphisms)에 기초한 첫 번째 human genetic map 완성 (Cell)

1988 美 보건성(NIH)과 에너지성(DOE) 간의 Human Genome Project 공동연구 합의. HGP 다국적 팀의 초대 책임자로 James D. Watson 임명.

1991 NIH의 J. Craig Venter에 의해 ESTs를 이용하여 expressed gene을 찾는 방법 발표(Science)

1992 HGP 다국적 팀의 책임자로 James D. Watson이 물러나고 Francis Collins가 임명됨

1994 Human genome의 genetic map 완성 (Science)

1995 December 15,000개의 marker를 포함하는 human genome의 physical map 완성(Science)

1996 Bermuda에서 The second international strategy meeting 개최. "Bermuda Principles"라불리는 genome sequence data의 공유 원칙 확인.

1998 Craig Venter에 의해 Celera Genomics사 설립. HGP 팀과는 별도로 3년 이내에 genome sequencing 완성을 공표.

1999 NIH에서 project의 완성을 2000년으로 앞당김

1999 영국, 일본, 미국의 researcher들에 의해 최초로 인간의 22번 염색체 해독 완료 (Nature)

2000 독일과 일본 researcher들에 의해 21번 염색체 해독 완료 (Nature)

2000 백악관에서 유전자 정보의 무상공개 방침 발표

2001 HGP team과 Celera의 유전자 해독 초안 발표 (Nature, Science)

2003 Human genome project 완성. 99.99%의 정확도를 가짐



※ Bermuda Principles (버뮤다 원칙, 1996년)

HGP 다국적 팀의 과학자들이 ‘정리된 유전자 데이터는 24시간 안에 공개한다’ 는 유전자 정보 사용안

에 동의함

- Automatic release of sequence assemblies larger than 1 kb (preferably within 24 hours)

- Immediate publication of finished annotated sequences

- Aim to make the entire sequence freely available in the public domain for both research and

development in order to maximise benefits to society

3. First publications of human genome sequencing

요약

- The human genome contains 3 billion chemical nucleotide bases (A, C, T, and G)

- The functions are unknown for more than 50% of discovered genes

- The human genome sequence is almost (99.9%) exactly the same in all people

- About 2% of the genome encodes instructions for the synthesis of proteins

Nature (Feb. 15, 2001)

By Human Genome Project

Science (Feb. 16, 2001)

By Celera Genomics

http://www.sciencemag.org/content/vol291/issue5507/cover.dtl



- Repeat sequences that do not code for proteins make up at least 50% of the

human genome

- Repeat sequences are thought to have no direct functions, but they shed light on

chromosome structure and dynamics. Over time, these repeats reshape the

genome by rearranging it, thereby creating entirely new genes or modifying

and reshuffling existing genes

- The human genome has a much greater portion (50%) of repeat sequences than

the mustard weed (11%), the worm (7%), and the fly (3%)

- Over 40% of the predicted human proteins share similarity with fruitfly or worm

proteins

- Genes appear to be concentrated in random areas along the genome, with vast

expanses of noncoding DNA between

- Chromosome 1 (the largest human chromosome) has the most genes (2968),

and the Y chromosome has the fewest (231)

- Genes have been pinpointed and particular sequences in those genes associated

with numerous diseases and disorders including breast cancer, muscle disease,

deafness, and blindness

- Scientists have identified about 3 million locations where single-base DNA

differences occur in humans. This information promises to revolutionize the

processes of finding DNA sequences associated with such common diseases as

cardiovascular disease, diabetes, arthritis, and cancers



4. Genome size

5. Strategies for sequencing the human genome

① Hierarchical shotgun sequencing (Human Genome Project)

BAC clone을 제작하고 contig mapping 과정이 필요

Genomic DNA의 repeat sequence로 인한 misassembly의 위험을 줄일 수 있음

- 100kb~200kb로 genomic DNA 절편을 만들어BAC clone 제작(bacterial artificial chromosome vector carrying a 100kb~200kb DNA insert)

- Chromosome walking으로 contig map 제작

- 각각의 contig를 shotgun sequencing

- Assembly



② Whole-genome shotgun sequencing (Celera Genomics)

사이즈가 작고 repetitive DNA 서열이 적은 genome의 sequencing에 적합한 방법

Hierarchical sequencing과는 달리 BAC clone제작이 필요 없으므로 매우 빠른 방법

으로 sequencing이 가능

Repetitive DNA 서열이 많을 경우 다음과 같은 misassembly 문제가 발생

※ Vector

A vehicle for carrying foreign DNA into a host organism. Vector systems include plasmid,

virus (lambda phage vector), cosmid, BAC, YAC…

※ Chromosome walking

A technique that can be used to assemble a clone contig (Chapter 12)

※ Contig

The result of joining an overlapping collection of sequences or clones

※ Tandem repeat

A pattern of two or more nucleotides is repeated and the repetitions are directly adjacent to each

other. For example would be ATTCATTCATTC.

- Genomic DNA 절편을 만들어 vector에 cloning

- Sequencing 후 overlap region을 이용하여 assembly


Week 3. Bioinformatics Tools

1. What is bioinformatics?

- The field of science in which biology, computer science, and information

technology merge to form a single discipline

- 생명체가 지닌 막대한 양의 정보를 수집, 저장, 분석, 가공

- Human Genome Project를 통해 대량의 염기서열 데이터가 쏟아져 나온 것을 계기로

생물정보학이 급속히 발전

※ More information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/bioinformatics.html

2. Gateways to genome science resources

- All Human Genome Project data and much related information are freely available

on the web

- Various tools are available to investigate genetic disorders, chromosomes,

genome maps, genes, sequence data, genetic variants, and molecular structures

- Major biological web databases to…

① Explore databases of genes associated with diseases

• Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)

• Genome Database (GDB, http://www.gdb.org/)

• GeneCards (http://www.genecards.org/)

② Find a gene’s location on a chromosome map

• NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nih.gov/mapview/)

• GDB Mapview (http://www.gdb.org/gdb/mapviewHelp.html/)

③ View the DNA sequence of a gene or amino acid sequence of a protein

• NCBI Sequence Databases

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)

• SWISS-PROT and TrEMBL (http://expasy.org/sprot/)

• Protein Information Resource–Protein Sequence Database (PIR-PSD,

http://pir.georgetown.edu/pirwww/dbinfo/pir_psd.shtml)

④ Examine protein structures

• NCBI Structure Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/)

• Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/)



3. Genoproteome research를 위한 생물정보학적 접근

- 유전단백체 functional analysis의 in silico 접근



4. 주요 생물정보 데이터베이스 구축 기관

① NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

- 미국국립보건원 산하의 국립생물정보센터

- 유전자 염기서열 데이터를 수집하고 가공하여 웹을 통해 무료로 공개하고 있음

(GenBank)

② EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/)

- 유럽분자생물학연구소 산하 European Bioinformatics Institute

- 스위스생물정보학협회와 공동으로 Swiss-Prot 단백질 데이터베이스를 운영함

③ DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)

- 일본 국립유전학연구소의 DNA Data Bank of Japan

- NCBI, EMBL과 함께 염기서열 데이터베이스 협력체제를 구성하고 있음

5. 유전자 염기서열 및 관련 정보 검색

- NCBI 홈페이지의 검색창을 통해 알고자 하는 유전자의 염기서열 검색

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

- 검색 key word를 포함하는 염기서열 리스트가 출력됨

검색하고자 하는 database Key word (유전자 명칭, 종 명칭 등)



- 염기서열 정보가 출력됨

관련 염기서열 정보

유전자 기능, 특징 요약

유전자 명칭

GenBank accession No.

유전자 출처

관련 문헌 정보

염기서열 길이

Chromosome상의 유전자 위치

Coding sequence 정보

Cellular component에서단백질의 위치

Gene function

Cellular process



- Gene databank에서 검색

-Gene structure

- Related literature information

mRNA sequence

Amino acid sequence

Exon Intron5’-UTR 3’-UTR

Link to PubMed database (literature database)



- Related cellular signaling pathways

- 유전자의 mRNA 서열 및 아미노산 서열 정보

6. 단백질의 도메인 분석 및 구조, 특성 예측

- Swiss-Prot (http://www.expasy.org/sprot/)에서 PLCG1이라는 단백질 검색

- 결과

Link to KEGG pathway database

Link to nucleotide database

Link to protein database



- PROSITE (http://www.expasy.org/prosite/)에서 단백질의 domain, protein

interaction site, post-translational modification site 분석, 예측

- Domain 분석

- Modification site 분석

단백질의 아미노산 서열 또는 Swiss-Prot accession No. 입력



- ExPASy Proteomics tools (http://www.expasy.org/tools/)을 이용하여 protein

identification and characterization, domain search, post-translational

modification prediction, primary, secondary, tertiary structure analysis,

phylogenetic analysis 등을 행할 수 있음

Ex) ProtParam tool (http://www.expasy.org/tools/protparam.html): 단백질의isoelectric point (pI), extinction coefficient, half-life 등을 예측

ProtScale tool (http://www.expasy.org/tools/protscale.html): 단백질의hydrophobicity, primary structure 등을 예측

※ Domain

독립적이고 특징적인 삼차 구조를 가지는 단백질의 한 부분으로 큰 단백질의 경우 보통 여러 개의

domain을 가지고 있으며 각각의 domain은 짧은 polypeptide chain으로 연결되어 있음. Domain은 단

백질의 기능 수행에 중요한 역할을 함(ex. ‘calcium-binding’ domain of calmodulin).

7. 염기서열 또는 아미노산 서열 alignment를 통한 database search

- BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

- 결과

An example of hydrophobicity graph



8. Sequence alignment

- Nucleotide 또는 amino acid 서열을 서로 비교하여 유사성을 알아내는 방법. 유전자

또는 단백질 서열간의 유사성 분석을 통해 기능적, 구조적, 진화적 연관성을 알아낼 수

있음.

- EMBL-EBI의 ClustalW tool을 이용한 sequence alignment 방법

(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)

- 결과Sequence name 및 sequence 입력

두 서열간의 similarity score



9. Analysis of restriction enzyme recognition site

- Nucleotide sequence 내에 존재하는 제한효소 자리 파악

- NEBcutter tool (http://tools.neb.com/NEBcutter2/)

※ Restriction enzyme

Endonuclease that can cleave a DNA molecule at specific short sequences. Extensively used in

recombinant DNA technology.


Week 4. Gene cloning and polymerase chain reaction

1. What is gene cloning?

- PCR과 gene cloning에 기초한 recombinant DNA technology 또는 genetic

engineering의 발달은 genome sequencing과 유전자 기능 및 조절 기작의 연구에

새로운 전환점을 마련함

- The basic steps in a gene cloning experiment

(1) Cloning할 유전자를 포함한 DNA (insert)를

circular DNA인 vector에 insertion하여

recombinant DNA molecule을 제작

(2) Bacteria 등의 living cell (host)에

recombinant vector를 도입시킴

(transformation)

(3) Host cell 내에서 recombinant DNA가

복제됨

(4) Host cell이 분열·증식하면서 recombinant

DNA가 daughter cell로 전달되고

복제가 계속됨

(5) Solid medium에서 생성된 각각의

colony (clone)는 identical multiple copies

of the recombinant DNA를 지니고 있음



2. PCR (Polymerase Chain Reaction)

- 중합효소 연쇄반응(PCR)은 DNA의 특정 부위를 반복 합성하여 in vitro에서 원하는

DNA 분자를 증폭시키는 방법

- 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능

- PCR 25 cycle로 225의 DNA 분자를 얻을 수 있음

- PCR 방법을 개발한 공로로 1993년 노벨 화학상(Kary Mullis)이 주어진 revolutionized

technique in molecular biology

- 증폭하고자 하는 DNA 분자 양

말단에 상보적인 한 쌍의

oligonucleotide (primer)가 필요

- DNA amplification에는 고온에서도

안정한 Thermus aquaticus의 DNA

polymerase I enzyme

(Taq polymerase)이 이용됨

- Genome으로부터 유전자를

효과적으로 분리하여 클로닝 할

수 있음



- PCR 과정

(1) PCR mixture 제조(enzyme, primers,

template DNA, dNTP)

(2) 94℃에서 dsDNA를 detaturation

(3) 온도를 낮추어 primers가 template에

hybridization되도록 유도

(4) Taq polymerase에 의해 새로운

strand가 합성됨 (5’→3’ 방향)

(5) Denaturation-hybridization-

synthesis의 cycle을 반복(25~30회)

- PCR 종료 후 agarose gel

electrophoresis를 통해 product를

확인할 수 있음

3. PCR in more detail

- PCR을 수행하기 전에 고려해야 할 사항으로는 primers, 온도 등이 있음

① Primers

- Primers는 PCR experiment를 성공적으로 수행하기 위한 열쇠

- 증폭하고자 할 template DNA의 target region 양쪽 말단 서열과 상보적이어야 함



- Primers의 길이가 너무 짧을 경우 non-target site에 hybridization이 되어 원하지

않는 PCR 산물이 생성될 수 있음

- DNA의 nucleotide는 4종류. 8-mer primers의 경우 확률적으로 template DNA의

48=65,536bp마다 한 개의 attachment site가 존재. 따라서 3,000,000kb의

human genome의 경우 46,000개의 attachment site가 존재.

- 17-mer primers의 경우 확률적으로 417=17,179,869,184bp마다 한 개의

attachment site가 존재. 따라서 human genome으로부터 특이적인 single PCR

product를 얻을 수 있음.

② Temperature

- Each cycle of PCR마다 온도를 3번 변화시킴

• Denaturation temp.: 보통 94℃이며 dsDNA의 base pair를 분리하여 ssDNA를 만듦

• Hybridization or annealing temp.: Primers가 template DNA에 붙을 수 있는 온도

• Extension temp.: DNA 합성이 일어나는 온도로 보통 74℃이며 Taq polymerase의 최

적 온도보다 약간 낮음.



- DNA-DNA hybridization은 temperature-dependent하므로 annealing temperature는

매우 중요함

- Annealing temp.가 너무 높으면 hybridization이 일어나지 않음

- Annealing temp.가 너무 낮으면 mismatched hybridization이 일어남

- 이상적인 annealing temp.는 primers와 template가 hybridization될 수 있으면서

mismatched hybridization이 일어나지 않는 온도로, melting temperature (Tm) 계산

으로 알 수 있음

- Tm = (4ⅹ[G+C])+(2ⅹ[A+T])℃

[G+C]는 primer 서열의 G and C nucleotide 수

[A+T]는 primer 서열의 A and T nucleotide 수

- 각각의 primer에 대해 Tm을 계산하고 이보다 1~2℃ 낮은 온도가 annealing

temperature

- PCR에 이용되는 두 개 primer의 Tm이 동일해야 함

Sin

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4. PCR primer design

- Mammalian cell의 total genomic DNA를 가지고 PCR 할 경우 약 20nt 길이의

primer가 적당함

- Template DNA의 repetitive DNA sequence와 single nucleotide가 반복된 부분을

피해서 primer를 디자인해야 함

- PCR primer design 시에 고려해야 할 몇 가지 요인

• 길이: 비특이적 hybridization이 일어나지

않도록 충분히 길어야 함

• 염기 구성: 각각의 primer의 GC

contents는 거의 동일해야 함(약 50%)

• Secondary structure: Hairpin 구조가

형성되지 않도록 해야 함

• 3’ end: 두 primer의 3’ 말단에 상보적 염기서열을 피해야 함. 그렇지 않으면

primer dimers가 생성.



- PCR의 specificity를 높이기 위한 전략

• Nested PCR: 첫 번째 PCR로 얻은 산물을 한번 더 내부의 primers를 사용하여 PCR하

는 방법

• Hot-start PCR: PCR 반응 전 PCR mixture를 만들어놓으면 상온에서 mismatched

annealing과 polymerization이 일어날 가능성이 있으므로 Taq polymerase 또는

dNTP 등을 첫 번째 denaturation 이후에 넣어주는 방법

• Touch-down PCR: 최초의 annealing temp.를 Tm보다 높게 설정해주고 2 cycles이

지날 때마다 1℃씩 낮춰주는 방법. PCR 초기 cycle에는 매우 특이적으로 적은 양의

primer가 annealing 되어 정확한 산물이 증폭되어지고, 이 산물들이 이후의 낮은

annealing temp.에서 primer와 annealing되어 증폭됨.



5. Studying PCR products

- PCR 산물을 이용하여 gene cloning 및 DNA analysis를 수행할 수 있음

- 다음 3가지 테크닉이 주로 사용됨

• Gel electrophoresis of PCR products

• Cloning of PCR products

• Sequencing of PCR products

- Gel electrophoresis는 agarose gel상에서 DNA fragment를 사이즈 별로 분리한 후

visible하게 확인하는 방법

- Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis는 PCR product를

restriction endonuclease로 처리한 후 전기영동으로 DNA fragment의 size를 비교하

여 분석하는 방법. Genome map 제작, genetic disease 분석, forensic science 분야

의 DNA profiling 등에 이용됨.

- PCR 산물을 쉽게 cloning하기 위해 사용되는 방법

• TA cloning: 일부 Taq polymerase의 경우 DNA 합성 시

strand의 3’ end에 adenosine을 하나 더 붙이기 때문에

T-tailed vector에 손쉽게 ligation 시킬 수 있음

- PCR 산물을 cloning한 후에 sequencing을 통해

PCR 산물의 염기서열을 확인할 수 있음

Lane #1: Restricted PCR product

Lane #2: Unrestricted PCR product

Lane #3: PCR product contains region of insertion



6. Problems with the error rate of Taq polymerase

- PCR을 통해 합성되는 DNA가 항상 template DNA의 정확한 copy는 아님

- Taq polymerase의 lack of proofreading activity (3’→5’ exonuclease activity)로

인한 inserting an incorrect nucleotide into growing DNA strand

- 평균적으로 PCR시에 9,000 nucleotides마다 1개의 mistake가 일어남. 만약 PCR

30 cycle일 경우 300bp마다 1개의 mistake 확률.

- Random position에 error를 가지는 PCR 산물들을 cloning하여 bacteria에 도입할

경우 각각의 colony는 동일한 error를 가지는 recombinant DNA를 지니게 됨

- Magnesium as a cofactor for Taq polymerase activity

Taq polymerase 활성을 위해 Mg2+ 이온이 필요. Mg2+ 농도는 polymerization rate과

accuracy에 영향을 미침.


Week 5. Cloning vectors and isolation of DNA

1. Vectors for gene cloning

- Host cell내로 유전자를 도입할 수 있는 vehicle로서의 역할

- Host cell내에서 독립적으로 복제되어 많은 수의 copy를 만들 수 있음 (origin of

replication을 가짐)

- 대표적으로 plasmid와 bacteriophage가 이용됨

① Plasmid vector

- Circular molecule of DNA로서 bacterial cell

내에서 독립적으로 존재함

- 하나의 plasmid vector는 여러 유전자를 지니며

host cell의 표현형에 영향을 줌(ex. Antibiotic

resistant gene used as a selectable marker)

※ Selectable marker

외부 유전자를 host cell에 도입 후 유전자가 도입된 clone과 artificial clone을 가려내기 위해 사용

하는 것. 대체로 cloning vector의 antibiotic resistant gene를 이용함. Antibiotic이 포함된 배지에서는

외부 유전자가 도입된 colony만이 자랄 수 있으므로 선택하여 이용할 수 있음.

- Episome: Host cell의 chromosome에 integration될 수 있는 plasmid. 수많은 cell

division 후에도 안정적으로 host 내에 존재할 수 있음.



- Plasmid vector의 사이즈는 cloning의 목적에 따라 10.0kb~250kb로 다양함.

- Copy number는 한 host cell내에서 존재하는 plasmid copy 수로 plasmid vector마다

고유함. Plasmid copy number가 높아야 많은 양의 recombinant DNA를 얻을 수

있으나 유전자 산물이 host cell에 toxic한 경우에는 copy number가 낮은 것이

유리함.

- Incompatibility: 한 세포 내에서 다른 종류의 plasmid가 공존할 수 없는 경우

- Bacteria 간의 conjugation으로 plasmid가 전달될 수 있음.

- Plasmid classification

• F plasmid (fertility): Pilus 생성 및 gene transfer를 조절하는 tra genes만을 가지고

있어 conjugation에 의한 plasmid transfer 능력 외에는 다른 특성이 없음

• R plasmid (resistance): Bacteria가 antibacterial agent에 내성을 갖도록 하는

유전자를 지닌 plasmid. 이와 같은 plasmid는 bacterial infection에 큰 문제를 야기함.

• Col plasmid: E. coli의 ColE1. 다른 bacteria를 죽이는 colicin을 coding함.

• Degradative plasmid: Pseudomonas putida의 TOL과 같이 대부분의 생물이

이용하지 못하는 toluene이나 salicyclic acid와 같은 물질을 대사에 사용할 수 있게 함

• Virulence plasmid: Host bacterium에 병원성(pathogenicity)을 부여함



- Plasmid vectors that fuse a gene with various tags

Cloning된 gene과 c-myc gene이

fusion되어 세포 내에서

myc-tagged fusion protein이 만들어짐.

Myc antibody로 western blot하여 fusion

protein을 확인 가능.

6XHistidine tag은 nickel 이온과 강한 affinity를

가지므로 fusion protein을

nickel ion-charged bead로 분리할 수 있음

EGFP (enhanced green fluorescent protein)와

fusion되어 만들어진 단백질은 형광 현미경을 통해

세포 내 위치를 확인할 수 있음



② Bacteriophage

- Host cell에 infection되어 외부 유전자 도입이 가능

- Lytic infection

- Lysogenic infection

Adsorption and penetration

Replication

Maturation and release



- Lysogenic infection에서는 phage DNA가 host bacteria내에 계속 존재하며 함께

division 함

- Lysogenic infection되어 host chromosomal DNA에 삽입된 phage DNA를

prophage라 함

- Prophage를 가지고 있는 bacteria (lysogen)은 정상 세포와 구분이 되지 않으며,

prophage가 host chromosome에서 방출되면 lytic mode로 변함

- Gene cloning에 이용되는 lysogenic phage에는 lambda (λ) phage와 M13 phage가

대표적

- λ phage DNA는 양 말단 cos sites는 cohesive ends이므로 linear form에서 circular

form 형성이 가능하고 따라서 bacteria 내부로 도입이 가능

- Bacteria 내부에서 circular form λ phage는 rolling circle mechanism에 의해

catenane (λ phage DNA가 여러 개 결합된 형태)을 복제하고 이후 endonuclease에

의해 cos site가 잘리고 phage particle이 조립됨



2. Preparation of total cell DNA

- Gene cloning의 소스를 얻기 위함

- The basic steps in preparation of total cell DNA from bacteria

① Growing and harvesting a bacterial culture

- Bacterial culture시에는 defined medium (ex. M9 medium) 또는 undefined medium

(ex. LB medium) 등을 이용.

- LB (Luria-Bertani) medium은 미지 성분이 포함된 complex medium으로서 tryptone,

yeast extract, NaCl로 구성됨

- E. coli를 37℃의 LB medium에서 150~250rpm으로 shaking incubation할 경우,

일반적으로 20분에 한번씩 division하며 2~3ⅹ109cells/mL까지 증식함

- 증식 정도는 600nm에서 optical density를 특정하여 알 수 있음. One OD unit은

약 0.8ⅹ109cells/mL에 해당

- 배양 후 centrifuge하여 pellet을 작은 volume으로 resuspension하여 cell extract를

만듦

② Cell extraction preparation

- 세포 내용물을 꺼내기 위해 세포벽을 제거해야 함

- 물리적 방법 또는 화학적 방법으로 cell envelope를 breaking하며 bacteria에는 주로

화학적 방법이 이용됨

- E. coli에 대한 chemical lysis에는 lysozyme과 EDTA가 이용됨

- Lysozyme은 egg white에 존재하는 bacterial cell wall polymer를 분해하는 효소

- EDTA (ethylenediamine tetraacetate)는 chelating agent로서 cell envelope

안정성에 필요한 Mg2+이온을 제거하고 또한 DNA를 분해하는 효소의 활성을 억제함



- 주로 SDS (sodium dodecyl sulphate)와 같은 detergent를 사용, 세포막의 lipid

molecule을 제거하여 세포막 disruption 시킴

- Cell lysis 후 insoluble cell debris를 제거하고 DNA를 분리함

③ Purification of DNA from a cell extract

- Bacterial cell extract에는 DNA뿐만 아니라 많은 양의 protein과 RNA가 존재

- 단백질을 제거하기 위해서는 phenol and chloroform mixture를 이용하거나

proteinase K를 이용

- RNA를 제거하기 위해서는 ribonuclease를 이용

- DNA를 분리를 위해 ion-exchange 등의 column chromatography를 이용할 수 있음

Phenol extraction:

Cell extraction과 phenol을 혼합하고

원심분리하여 단백질 제거



④ Concentration of DNA sample

- DNA를 원하는 농도로 농축시키기 위해 ethanol precipitation method를 이용

- Monovalent cation (Na+)와 ethanol 첨가하면 -20℃ 이하의 온도에서 DNA가 침전

- Na+는 DNA의 negative charge를 상쇄하고 ethanol은 H2O의 polarity를 감소시켜

DNA의 solubility를 낮춤

- Glass rod를 이용해 DNA를 회수하거나 원심분리한 후 원하는 농도로 redissolve 할

수 있음

⑤ Measurement of DNA concentration

- DNA 농도는 260nm의 UV 파장으로 측정

- A260=1.0 이면 dsDNA의 농도는 50㎍/ml

- A260/A280 ratio는 pure DNA가 1.8, protein 및 phenol 오염 시 1.8미만, RNA 오염

시 1.8 이상



※ DNA purification by column chromatography

Cell extract를 anion-exchange resin에 통과시키면 강한 negative charge를 지니는 DNA 분자가 resin에

결합하고 다른 물질은 빠져 나옴. Resin에 결합한 DNA는 물과 같은 극성 용액으로 elution하여 회수.

Guanidium thiocyanate 존재 하에서 DNA 분자는 silica에 결합.

Chemical structure of positively charged

DEAE groups of QIAGEN Resin, and

negatively charged groups of the DNA backbone

which interact with the resin.



3. Preparation of plasmid vector

- Cloning한 유전자를 지닌 plasmid vector를 bacteria로부터 분리

- 많은 양의 bacterial chromosomal DNA로부터 plasmid DNA만을 분리해야 함

- Plasmid DNA와 bacterial chromosomal DNA의 physical difference에 근거하여 분리

→ size & conformation

- Plasmid DNA는 매우 작은 circular 형태. Bacterial DNA는 size가 매우 커서 분리과정

에서 대부분 부숴져 linear한 형태.

① Separation on the basis of size

- Sucrose 존재 하에서 bacteria에 lysozyme과 EDTA를 처리하면 세포벽이 부분적으로

파손된 sphaerplast가 형성

- Triton X-100 등의 non-ionic detergent를 처리하여 cell lysis (ionic detergents

cause too much chromosomal breakage)

- 원심분리하여 size가 작은 plasmid가 포함된 cleared lysate를 얻음

② Separation on the basis of conformation

- Plasmid는 double-strand가 온전할 경우

supercoiled (covalently closed-circular)

형태로 세포 내에서 존재

- Nick이 있을 경우 open-circular 형태

- Supercoiled plasmid는 분리과정에서

linear 형태로 된 chromosomal DNA로부터

쉽게 분리해 낼 수 있음



- Alkaline denaturation method

• NaOH를 cell extract에 첨가,

pH 12~12.5에서 non-supercoiled

DNA의 hydrogen bond가 파괴됨

• Sodium acetate를 첨가, pH가 중성이

되어 ssDNA가 reaggregation.

• 원심분리로 supercoiled DNA만을 분리

- Caesium chloride density gradient centrifugation

• CsCl 용액을 centrifuge하여 gradient를 만들

수 있음

• Cell extract를 넣어 protein, DNA, RNA를

크기에 따라 분리

• EtBr (ethidium bromide)는 dsDNA의

base pairs 사이에 intercalation하는데,

supercoiled DNA는 free ends가 없으므로

제한된 양의 EtBr만이 DNA에 결합할 수

있음

• EtBr을 첨가하면 linear DNA와 supercoiled

DNA간에 density 차이가 생겨 분리 가능

• EtBr을 n-butanol로 제거

• CsCl을 dialysis tubing으로 제거


Week 6. Manipulation of DNA

1. DNA manipulative enzymes

- DNA manipulative enzymes는 세포 내에서 DNA replication, transcription, repair,

recombination, breakdown 등에 관여함

- 이러한 enzymes를 추출하여 gene cloning 및 genetic engineering에 사용함

① Nuclease

- Cut, shorten or degrade nucleic acid molecules

- Nucleotide간의 phosphodiester bond를 끊음

• Exonuclease removes nucleotides one at a time from the end of a DNA molecule

• Endonuclease is able to break internal phosphodiester bonds within a DNA

molecule



- Exonuclease인 Bal31은 both strands를 cleavage함. E. coli exonuclease III는

single strand (3’ terminus)에만 작용.

- S1 endonuclease는 single strand를 cleavage하고, DNase I (deoxyribonuclease I)

은 종류에 따라 single strand 또는 double strand에 non-specific하게 작용

- Restriction endonuclease는 dsDNA의 특정 염기 서열을 인식하여 작용



② Ligase

- Join nucleic acid molecule together

- Repair of single-stranded breakage, join double-stranded DNA fragment

③ Polymerase

- Synthesize a new strand of DNA complementary to an existing DNA or RNA

molecule

- Template에 primer로서 역할을 하는 double-stranded region을 필요로 함

DNA polymerase I은 5’→3’ exonuclease

활성을 지님

Klenow fragment는 DNA polymerase I의

Exonuclease 활성부위를 제거한 것

Reverse transcriptase는 RNA template로부터

상보적인 DNA strand를 합성함



- DNA labeling with various polymerases

• Nick translation

Pancreatic DNase I으로 nick을 만든 후 E. coli DNA polymerase I의 5’→3’

exonuclease activity 및 5’→3’ polymerase activity를 이용하여 DNA를 labeling함

• Random primed labeling

Random hexanucleotides를 primer로서 annealing하고 Klenow fragment에 의한

polymerization으로 DNA labeling



④ DNA modifying enzymes

- Modify DNA molecules by addition or removal of specific chemical groups

• Alkaline phosphatase

From E. coli, calf intestinal tissue or arctic shrimp. Removal of phosphate groups

at 5’ terminus of DNA molecule.

• Polynucleotide kinase

From E. coli infected with T4 phage. Adding phosphate groups onto 5’ terminus.

• Terminal deoxynucleotidyl transferase

From calf thymus tissue. Adding one or more deoxyribonucleotides onto 3’

terminus of DNA molecule



2. Restriction endonuclease

- Gene cloning을 위해 circular 형태의 vector를 restriction enzyme처리로 linear

형태로 만들고, insertion할 DNA molecule 역시 restriction enzyme으로

양 끝을 digestion 함

- 특정 염기 서열만을 인식하여 cleavage하므로 DNA의 다른 부위에 손상을 주지 않고

원하는 부위만을 자를 수 있음

- Restriction enzyme을 gene cloning에 이용하는 technique의 발견으로 W. Arber 등

에게 Nobel Prize가 주어짐(1978)



- Restriction endonuclease는 bacteria에 infection된 phage DNA를 제거하는

방어기작. Bacterial DNA의 recognition sequence는 methylation되어서 보호됨

- Restriction endonuclease는 3가지 타입이 있음

• Type I and III

제한효소가 특정 염기 서열을 인식하나 실제 cleavage site는 인식 서열에서

떨어진 부위임

• Type II

특정 인식 서열 내부를 cleavage하므로 genetic engineering에 사용됨. 많은 제한

효소들은 hexanucleotide sequence를 인식함. 인식하는 nucleotide sequence 길이

는 4개에서 8개 이상까지 다양함. 대부분의 인식 서열은 DNA서열이 역방향으로 동일

하게 반복된 palindrome 구조.



- 제한효소에 의한 cleavage 후 dsDNA는 sticky end (cohesive end) 또는 blunt end를

지니게 됨

- Blunt end의 경우 DNA간의 ligation 효율이 좋지 않으므로 gene cloning에는 주로

sticky end를 이용함

- BamHI, BglII, Sau3A와 같이 다른 염기서열을 인식하면서 동일한 sticky end를

만드는 제한효소들을 이용해 동일 인식서열이 없는 DNA molecule을 잘라 붙일 수

있음



- DNA에 제한효소에 대한 recognition sequence가 존재할 확률은 4개의 nucleotides

가 동일하게 존재한다고 가정할 때(GC=50%), hexanucleotide의 경우(ex. GAATTC)

46=4096 nucleotides마다 한번임

- 제한효소의 인식 서열이 길수록 나타날 인식 서열이 나타날 확률이 적어 genomic

DNA cleavage 시 large fragment를 얻을 수 있음

- 실험적으로 DNA molecule을 digestion할 경우 제한효소의 maximal activity를

유지하는 condition을 만드는 것이 중요(ionic strength, temperature, cofactor 등)

- 반응 후에는 제한효소를 heat inactivation시키고 다음 조작을 위해 pure DNA만을

추출해야 함



- Analyzing the result of cleavage by gel electrophoresis

• 제한효소에 의해 cleavage된 DNA fragment의 수와 사이즈를 확인하기 위해

전기영동을 이용

• DNA의 negative charge로 인해 electric field내에서 positive pole쪽으로 이동

• DNA의 molecular weight이 작을 수록 멀리 이동함

• 0.5cm 두께의 0.5% agarose gel의 경우 1~30kb의 DNA fragment 사이즈 확인이

가능(large pores)

• 0.3mm 두께의 40% polyacrylamide gel의 경우 1~300bp의 DNA fragment 사이즈

확인이 가능(small pores)

• 전기영동 후 gel을 staining하여 DNA를 visible하게 확인

• EtBr (ethidium bromide)로 agarose와 acrylamide gel을 staining하여 UV로 확인

• EtBr과 UV light은 강한 mutagen이므로 사용에 유의



• Autoradiography로 32P-labeled DNA를 sensitive detection할 수 있음

• DNA molecule의 radioactive labeling은 nick translation, end filling labeling 또는

random primed labeling 등의 방법을 이용



- Restriction mapping

• Double digestion으로 잘린 DNA fragment들의 크기를 확인하고 recognition

sequence의 상대적인 위치를 알아냄

• Full length DNA의 restriction map을 알아내면 원하는 유전자를 얻기 위해 어떤

제한효소가 필요한지 알 수 있음

3. Ligation

- Restriction enzyme으로 잘린 vector와

insert DNA를 서로 ligation하여

recombinant DNA molecule을 제작함

- T4 DNA ligase를 이용

(purified from E. coli infected with T4 phage)

- Nucleotide간의 phosphodiester bond를 형성



- Sticky-ended DNA molecule의 경우 base간의 상보적인 결합이 이루어지므로

ligation of blunt-ended molecule보다 ligation 효율이 높음

- Sticky end를 DNA molecule의 양 말단에 도입하기 위해 제한효소 인식 서열을 가진

linker를 ligation 후 제한효소 처리. DNA의 internal region에 제한효소 인식부위가

존재할 경우 이 방법 사용 못함.



- Linker를 사용하지 못할 경우에는 이미 sticky end 형태로 합성된 adaptor를 ligation

하여 이용. Adaptor간에 서로 ligation되는 것을 막기 위해 sticky end의 3’ 말단의

phosphate group를 제거함. Ligation 후 polynucleotide kinase로 다시

5’-phosphate group 생성.



- Terminal deoxynucleotidyl transferase를 이용한 homopolymer tailing으로 vector와

insert DNA에 sticky end를 도입. Klenow fragment로 vector와 insert DNA tail의

base 수를 맞춰주고 ligase로 repair함.


Week 7. Gene transfer and clone identification

1. Transformation

- The introduction of DNA molecule into living cells

- Ligation된 소량의 recombinant DNA molecule을 bacteria내로 도입하여 많은 양의

copy를 만들 수 있음

- Recombinant plasmid가 도입된 bacteria로부터 recombinant protein을 생산,

정제하여 이용할 수 있음



- Bacteria로 도입할 ligation mixture에는 recombinant DNA molecule뿐만 아니라

다음의 것들이 포함되어 있음

• Unligated vector molecule

• Unligated DNA fragment

• Self-ligated vector (vector molecule that have recircularized without new DNA

being inserted)

• Recombinant DNA molecules carry the wrong inserted DNA fragment

- Unligated molecule의 경우 bacteria로 도입되더라도 bacteria내에서 분해되고 복제

되기 어려우므로 문제가 안됨

- Self-ligated vector molecule 또는 incorrect recombinant plasmid의 경우 bacteria

내에 도입되어 정상적으로 복제되어 문제

- Transformation 후에 나타난 각각의 single colony 중 일부는 cloning되지 않은

plasmid를 지니고 있음

- 원하는 recombinant plasmid를 지닌 bacteria와 self-ligated plasmid를 지닌

bacteria를 가려낼 수 있어야 함



- Bacillus와 Streptococcus속의 경우 foreign DNA를 uptake하는 것이 용이하지만,

보통의 E. coli는 외부 유전자를 받아들이는 능력이 매우 적음. 따라서 인위적인

physical or chemical treatment로 foreign DNA molecule을 받아들이는 능력을

만들어주어야 하며 이러한 처리를 거친 bacteria를 competent하다고 말함.

- Preparation of competent E. coli cells

• Chemically competent cell

0℃에서 CaCl2과 같은 divalent cation (Ca2+)을 처리하면 E. coli membrane외부에

plasmid가 붙게 되고 42℃의 heat shock으로 세포 내부로 plasmid가 도입됨

• Electrocompetent cell

Electric shock로 E. coli 세포에 hole을 만들어 plasmid를 도입시킴

- Cloning vector는 항생제를 detoxify하는

유전자를 지니고 있으므로 항생제 배지에서

transformed colony만이 나타나고

normal colony는 나타나지 않음

(ex. ampR gene codes for β-lactamase)



2. Identification of recombinants

- pBR322 vector의 경우 두 개의 antibiotics resistance gene (ampR , tetR)을 지니며

cloning site가 tetR 내부에 존재. Ampicillin 배지에서 transformed cell을

selection하고 tetracycline 배지에 replica plating하여 insertion 여부를 가려냄.

tetR gene disrupted



- pUC8 vector의 경우, lacZ’ gene (coding for β-galactosidase)내부에 cloning site가

존재. Lactose 유사체인 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-

galactopyranoside)과 IPTG (inducer of lacZ’, isopropylthiogalactosidase)를 배지에

넣어주면 β-galactosidase에 의해 X-gal이 분해되어 deep blue colored colony를

형성함. Recombinant vector는 β-gal- 이므로 white colony를 생성하여 selection이

가능함(Lac selection).



- LacZ gene을 이용한 blue/white screening 원리

Lactose가 inhibitor에 결합하여

Lac Z gene의 발현

IPTG에 의해 inhibitor가 억제되어

Lac Z gene이 발현.

E. coli chromosome으로부터

만들어진 ω-fragment와

Lac Z gene으로부터 만들어진

α-fragment가 결합하여 온전한

β-galactosidase가 형성됨.



3. Introduction of phage DNA into bacteria

- Phage vector로 cloning한 recombinant DNA molecule을 bacteria내로 도입하기

위해 다음의 방법을 사용

① Transfection

- Transformation과 동일한 방법으로 heat shock으로 E. coli에 purified recombinant

phage DNA를 도입시킴

② In vitro packaging

- λ cloning vector 등을 직접 bacteria로 도입시키는 것은 어렵기 때문에, head-and-

tail 구조의 λ virus에 recombinant DNA를 packing하여 phage particle을 bacteria에

감염시킴

- Single-strain system 또는 two-strain system으로 in vitro packing하여 만든 phage

particle을 bacteria에 감염시켜 recombinant DNA 도입

• Single-strain system

감염성 λ phage를 E. coli SMR10에

도입시키면 packaging에 필요한

단백질들이 bacteria내에 생산·축적되어

in vitro packaging에 이용됨. 사용되는

λ phage는 cos site가 mutation되어

있음. 따라서 λ DNA catenane이

endonuclease에 의해 잘려지지 않아

복제 및 조립되지 않고 packaging에

필요한 단백질만을 생산함.

• Two-strain system

Packaging에 필요한 protein E를 생산하지

못하는 E. coli BHB2688과 protein D를

생산하지 못하는 E. coli BHB2690에 각각

λ phage를 감염시킴. 각각의 E. coli내에서

packaging에 필요한 단백질이 없으므로

capsid를 형성하지 못하고 packaging에

필요한 단백질이 축적됨. 두 E.coli 배양액

lysate를 섞어서 in vitro packaging을 함.



- Phage에 감염된 bacteria를 agar plate에 도말하면 cell lysis로 인한 plaque가 형성됨

- Insertion inactivation of lacZ’ gene을 통해 plaque의 blue/white screening이 가능


Week 9. Production of protein from cloned gene

1. Expression of foreign genes in E. coli

- 유전적 조작이 편리하고 빠른 증식 속도를 가진 E. coli를 host로 주로 사용함

- E. coli로부터 재조합 단백질을 빠른 시간 내에 대량으로 생산하여 research material

이나 pharmaceutical product로 사용함

- E. coli와 같은 prokaryotic gene은 intron이 없고 그것을 제거하는 processing

step이 없으므로 도입되는 recombinant gene은 intron이 없는 상태여야 함

- Expression vector는 E. coli에서 foreign gene expression을 위해 다음 조건을 갖춤

• Promoter, transcription initiation site의

upstream에 존재하는 부위로 E. coli RNA

polymerase의 σ subunit이 인식하여

결합하는 부위. E. coli RNA polymerase는

eukaryotic promoter를 인식할 수 없으므로

recombinant gene의 발현을 위해서는 E. coli가 인지할 수 있는 promoter

(ex. lac promoter)를 지닌 vector에 cloning

필요

• Terminator, stem-loop 구조를 만들 수 있는

nucleotide sequence로 전사 종료 부위를

나타냄

• Ribosomal binding site, ribosome이 결합하는

mRNA의 한 부분으로 initiation codon의

upstream에 위치

Promoter sequences

Pribnow box (TATA box)Gilbert box



① Promoter in expression vector

- Promoter is a critical component of an expression vector

- E. coli promoter들의 경우 서로 비슷한 consensus sequence를 지님 (ex. TTTACA,

TTGACA)

- Small variation in consensus sequence may have a major effect on transcription

efficiency. It can be ‘strong promoter’ or ‘weak promoter’.

- Examples of promoters used in expression vector

• lac promoter, IPTG에 의해 induction

되어 downstream gene을 발현시킴

• trp promoter, tryptophan 합성에 관련된

gene을 발현시키는 promoter로서

tryptophan에 의해 repression되고 3-β-

indoleacrylic acid에 의해 induction됨

• tac promoter, lac과 trp promoter의

hybrid로서 IPTG에 의해 induction됨

• λPL promoter, λ DNA를 발현시키는

promoter로서 30℃ 이상의 온도에서

cI repressor가 temperature-dependent

inactivation되며 induction됨

• T7 promoter, phage의 T7 RNA polymerase

coding gene을 지닌 E. coli에서 사용하며 T7

RNA polymerase gene의 upstream에 lacpromoter를 도입하여 IPTG에 의해

induction시킴



- Use of T7 and lac promoter in recombinant protein expression

• Expression vector는 inserted gene의 upstream에 T7 promoter와 lac operator

sequence를 지님 (T7lac promoter)

• Recombinant protein 발현에 사용되는 E. coli는 λDE3 lysogen이며 chromosome에

T7 RNA polymerase gene을 가지고 있음. E. coli chromosome상에서 lac promoter

에 의해 T7 RNA polymerase의 발현이 조절됨.

• lac repressor (binding to lac operator)에 의해 T7 RNA polymerase의 발현이

억제되어있고 배지에 IPTG를 첨가함으로써 induction되어 E.coli RNA polymerase에

의하여 T7 RNA polymerase gene이 전사, 발현됨

• T7 RNA polymerase가 recombinant plasmid의 T7 promoter를 인식하여 결합,

downstream gene이 발현됨

• T7 RNA polymerase의 발현을 lac promoter로 조절하고 target gene의 발현을 T7

promoter 및 lac operator를 이용하여 조절함으로써 very tight control of protein

expression 가능



② Gene fusions

- Foreign gene (especially eukaryotic gene)을 E. coli에서 발현시킬 경우, 만들어진

단백질이 host cell내에서 불안정하여 분해되거나 또는 host cell에 toxic한 경우가

있음. 매우 hydrophobic한 단백질을 생산할 경우 incorrect folding 또는 hydrophobic

interaction으로 인해 세포질에서 inclusion body 축적, 정제 시 문제 발생.

- Bacterial peptide를 target protein 앞에 fusion

시켜 host cell에 의해 분해되는 것을 방지할 수 있음

- 세포질 내에서의 재조합 단백질의 solubility를 증가

시키기 위해 NusA, GST (glutathione S-

transferase), MBP (maltose-binding protein) 등을

target protein의 N-termini 앞에 fusion시킬 수 있음

- 단백질과 fusion된 tag에 친화성을 가지는 물질을

이용하여 발현된 재조합 단백질을 cell extract로부터

정제하기 위한 affinity chromatography 수행 가능

• GST-tagged protein has affinity to glutathione

GSTTarget Protein

Protease (thrombin or factor Xa) Cleavage Site

Sepharose Bead

Glutathione

GST-tagged fusion protein

Sepharose bead coupled with glutathione

that has high affinity to GST



• 6X histidine-tagged protein has affinity to Ni-NTA

③ Problems with production of recombinant protein in E. coli

- Due to sequence of foreign gene

• Foreign gene이 intron을 포함하고 있을 때

• 다른 host에서는 정상이나 E. coli에서 termination

signal로 작용하는 서열을 포함할 경우 전사가

조기 종결됨

• Codon bias가 다를 경우. 모든 organism의

genetic code는 동일하지만 eukaryote와

prokaryote의 선호하는 codon이 다를 수 있음.

- Due to limitation of E. coli

• E. coli는 post-translational modification을 하지

않으므로 eukaryotic protein의 경우 biological

activity에 영향을 받을 수 있음

• 재조합 단백질의 incorrect folding로 인한 활성 결핍

HistidineNi2+-NTA (nitriloacetic acid)

matrix

Elution with imidazole or EDTA



④ Recombinant protein production in eukaryotic cells

- E. coli를 이용한 재조합 단백질 생산의 문제점을 피하기 위한 시스템

- 재조합 단백질의 번역 후 glycosylation 등의 modification 능력이 animal cell과 유사

- Yeast Saccharomyces cerevisiae, fungi Kluyveromyces lactis 등을 host로 이용

- S. cerevisiae의 경우 GAL promoter의 조절 하에 foreign gene을 발현시킴.

- GAL promoter는 galactosidase에 의해 induction됨. 다른 promoter로는 PHO5

(regulated by phosphate level), CUP1 (induced by copper) 등이 있음.

⑤ Recombinant protein production in insect cells

- Insect cells provide an alternative to mammalian cells to produce animal protein

- Mammalian cell과 유사한 단백질 발현과 높은 수율의 단백질 생산이 가능

- Insect에 흔하게 감염되는 baculoviruse의 genome을 이용한 cloning vector 사용

An example of cloning vector for S. cerevisiae


Week 10. Studying gene location and structure

1. Studying the location of a gene

- Plasmid와 같은 작은 DNA molecule 또는 chromosome과 같이 큰 DNA molecule

에서의 유전자 위치를 알아내는 여러 방법이 있음

• Southern hybridization

Restriction enzyme 처리한 DNA fragment를 전기영동 후 labeled probe를

hybridization하여 size를 확인하고 restriction mapping을 통해 유전자의 위치를 알아

내는 방법. RNA molecule의 경우도 마찬가지의 방법으로 실험할 수 있으며

이는 Northern hybridization이라 함.

DNA를 agarose gel로부터 nitrocellulose 또는 nylon membrane로 transfer하는 방법



• OFAGE (orthogonal field alternation gel electrophoresis)

- 50kb 이상의 큰 DNA molecule의 경우 일반적인 전기영동으로 migration되지 않음

- Eukaryotic chromosomal DNA에서 원하는 유전자의 위치를 알아내기 위해서는

OFAGE 등의 방법을 사용

- 두 방향의 electric field를 번갈아 가며 걸어줌으로써 큰 DNA molecule의 migration이

가능

- 비슷한 방법으로는 CHEF (contour clamped homogeneous electric field), FIGE

(field inversion gel electrophoresis) 등이 있으며 이를 통해 chromosome을 gel에서

분리하여 gene library 구축을 할 수 있음



• Fluorescence in situ hybridization (FISH)

- Higher eukaryotes의 50,000kb 이상의 chromosome의 경우 OFAGE로 DNA를

migration 시킬 수 없음

- FISH는 metaphase의 chromosome에 radioactive isotope- 또는

fluorescence-labeled probe를 직접 hybridization하여 autoradiography 또는

형광현미경을 통해 유전자의 위치를 확인하는 방법

- Gene deletion, translocation 등으로 인한 유전적 질환 가능성을 알아낼 수 있음



2. DNA sequencing

- DNA의 nucleotides 배열을 알아내는 방법으로 chain termination method와

chemical degradation method가 있음

① The Sanger-Coulson method (chain termination method)

- Single-strand recombinant DNA의 vector 부위에 상보적인 primer를 annealing하고

complementary strand를 합성함. 이때 dNTP (radioactive isotope-labeled)와 함께

ddNTP (dideoxynucleotide)를 첨가하여 합성이 더 진행되지 않도록 함. ddNTP는

3’ hydroxyl group이 없으므로 다음에 올 nucleotide가 결합하지 못함. Chain

termination된 fragment들을 polyacrylamide gel에서 전기영동하고 autoradiography

하여 크기가 작은 밴드부터 읽어나감.



- dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)와 ddATP를 일정 비율로 넣어주고 polymerase에

의한 complementary strand 합성을 진행하면 주형의 thymidine 자리에서 합성이

종결됨. 반응 시 정상적인 dATP가 ddATP 대신 결합할 수 있으므로 말단에 ddATP가

존재하는 길이가 다른 여러 strand가 합성됨.

- Automated sequencing의 경우 각기 다른 fluorescent dye로 labeling된 ddNTP를

이용해 Sanger-Coulson method법을 수행. 4가지(A, T, G, C) 반응 산물을 하나의

lane에 전기영동하여 이동하는 DNA fragment가 laser beam에 의해 detection됨.



② The Maxam-Gilbert method (chemical degradation method)

- Sequencing하고자 하는 dsDNA의 5’ 말단을 labeling한 후 denaturation하여

전기영동 하면 두 single strand의 purine 함량이 다르므로 band가 서로 분리됨

- Gel상에서 single strand DNA중 하나를 추출하고 nucleotide간의 결합을 화학적으로

끊어 전기영동 후 autoradiograph를 통해 서열을 읽음

- Methyl sulfate는 DNA의 purine (guanine, adenine)을 methylation함. Methylated

purine의 glycosidic bond (purine-ribose)는 매우 불안정하여 DNA strand의

purine 자리는 alkali 조건의 고온에서 cleavage 됨.

- DNA strand의 adenine 자리는 약산성의 조건에서 cleavage됨

- Pyrimidine (cytosine, thymine)은 hydrazine (N2H4)에 의해 cleavage

- Cytosine은 piperidine (C5H11N)에 의해 cleavage


Week 11. Studying gene expression and function (1)

1. Studying transcript

- All genes have to be expressed in

order to function

- Transcription, translation 과정을 거쳐

유전자가 발현

- Eukaryotes의 경우 transcript에서

intron을 제거하는 processing을 거침

- 유전자의 전사 개시 및 종결 부위와 실제

유전자 산물이 만들어지는 부위를 아는

것이 중요

- 많은 transcript analysis에서 유전자의

DNA 단편과 RNA transcript간의

hybridization을 이용함

① Electron microscopy of nucleic acid

- 유전자를 지니고 있는 DNA strand와

그 유전자의 RNA transcript를

hybridization시켰을 때 유전자의 intron

부위는 hybridization되지 않으므로

전자현미경 상에서 고리를 형성하여 보임

- Intron의 위치와 수를 알아낼 수 있음



② Analysis of DNA-RNA hybrids by nuclease treatment

- DNA-RNA hybrid를 S1 nuclease 처리

- S1 nuclease는 single-strand의 intron 부위만을 digestion함

- Alkali 처리로 RNA strand를 제거하여 intron이외의 DNA fragment를 얻어 분석

③ Nuclease S1 protection assay

- 유전자의 전사 개시 부위를 알기 위함

- 유전자의 전사 개시 부위를 포함하는 DNA와

RNA transcript를 hybridization시키면 전사 개시

부위 앞의 5’-UTR이 single-strand로 남음

- S1 nuclease로 single-strand 부위를 digestion

하고 hybridization된 DNA의 길이를 확인.

S1 nuclease 처리하지 않은 DNA의 길이와

비교하여 전사 개시 부위의 위치를 알 수 있음.

- Gel로부터 single-strand DNA를 추출하여 Maxam-

Gilbert method로 염기 서열을 알아낼 수 있음



④ Primer extension assay

- Nuclease S1 protection assay와 같은 목적으로 이용될 수 있음

- RNA transcript보다 짧은 DNA fragment를 RNA transcript와 hybridization시킨 후

reverse transcription으로 DNA의 3’을 extension

- Reverse transcription한 DNA와 그렇지 않은 DNA fragment의 사이즈를 전기영동으

로 비교

- 이후 gel로부터 single-strand DNA를 추출하여 Maxam-Gilbert method로 염기 서열

을 알아낼 수 있음

※ Reverse transcription (역전사 반응)

Single-strand RNA를 template로 하여 complementary DNA를 합성하는 반응. HIV1,

M-MLV, AMV와 같은 retrovirus의 역전사효소를 이용함. 역전사 반응으로 얻은

single-strand cDNA를 PCR하여 dsDNA를 얻을 수 있으며(RT-PCR) RT-PCR을

통해 유전자의 발현 정도를 알아내거나 gene cloning에 이용할 수 있음.



⑤ Rapid amplification of cDNA ends (RACE)

- Used to identify the 5’ and 3’ termini (especially

unknown region of 5’ UTR) of RNA transcript or

obtain full length of cDNA

- 다양한 기법의 RACE method가 존재함

역전사 반응으로 RNA의 5’ termini까지 cDNA 합성

cDNA의 3’ 말단에 poly-A tailing

cDNA의 3’ 말단 (RNA의 5’ 말단에 상보적 서열)의 서열을 알지 못함

Poly-T primer와 gene specific primer를 사용하여 PCR 수행

Nested PCR 후 PCR product를 cloning하여 sequencing할 수 있음



2. Studying gene expression

- 세포내의 모든 유전자가 항상 발현되는 것은 아님

- 유전자의 발현 수준은 세포 내에서 엄격히 조절되며 필요할 때만 switched on

- 특정 환경 변화 시 세포 내 유전자 발현 변화를 분석함으로써 질병 표지 인자 발굴

① Northern hybridization

- 전기영동한 RNA extract를 nylon 또는 nitrocellulose membrane에 blotting하고

확인하고자 하는 RNA transcript에 상보적 서열을 가진 labeled-cDNA probe를

hybridization하여 autoradiograph 등으로 확인하는 방법

- RNA transcript의 size 및 유전자의 expression level을 알아낼 수 있음

② Tissue in situ hybridization

- 얼린 조직을 wax로 고정 및 microtome으로 얇게 자른 후 (5μm thick) labeled-

antisense RNA probe를 hybridization시켜 현미경을 통해 gene expression pattern

을 관찰하는 방법. 조직 대신 whole embryo를 이용하여 발생 과정에서의 gene

expression을 확인 가능.

Tissue in situ hybridization using

β-myosin heavy chain probe in the

heart of 13 day embryonic mouse

Tissue in situ hybridization using

HoxB specific probe in the

embryonic mouse



③ Whole genome expression screening using DNA chip

- Glass wafer에 cDNA clones 또는 gene-specific oligonucleotides가 코팅된 DNA

chip (microarray)을 이용하여 gene expression screening

- Reverse transcription으로 세포에서 추출한 RNA를 cDNA로 변환, fluorescent tag으

로 labeling하고 DNA chip에 hybridization

- 한 organism내의 모든 gene들의 발현 정도를 동시에 확인 가능

- Possible applications below..

• Inducible gene expression – 세포가 환경 변화에 어떻게 반응하는지 확인 (ex.

exposure to specific hormone, signaling molecule, or irradiation)

• Tissue- and cell type-specific gene expression

• Developmental stage-specific gene expression

• Gene expression during differentiation

• Gene expression during tumorigenesis

④ Serial analysis of gene expression (SAGE)

- Method for multiplex gene expression screening which depends on very short

tags located at specific sites within individual transcripts

- 모든 gene들의 발현 정도를 동시에 알아낼 수 있음

- 복잡하고 값비싼 장비를 필요로 하지 않음

82K DNA microarray containing

82,944 different probes

Oligonucleotide microarray containing over

65,000 different probes for 1,641 unique genes



- SAGE is based on two principle• A short nucleotide sequence tag은 각각의 transcript내의 특정 위치만을 uniquely identification 할 수

있어야 함. 예를 들어, sequence tag의 길이가 9bp라면 확률적으로 49=262,144개 이하의 각각 다른

transcript를 인식하는데 있어서 충분한 정보를 가짐.

• Sequence tag들의 concatenation으로 transcripts 분석을 연속적이고 효율적으로 시행 할 수 있음.

각각 다른 transcripts의 tag들을 한 clone내에서 covalently link하고 sequencing을 수행.

Poly (A)+ RNA를 세포로부터 추출하고

biotinylated oligo (dT) primer를 이용하여

cDNA 합성

Restriction nuclease (anchoring enzyme)

으로 잘라 3’ overhanging ends를 만들고

streptavidin bead에 결합시킴(using affinity

between biotin group and streptavidin)

anchoring enzyme site 및 tagging

enzyme (인식부위에서 20bp 떨어진

곳을 자름) site를 포함한 linker에 연결

Tagging enzyme으로 자르고

blunt-end ligation

Anchoring enzyme으로 자르고

sequence tag들의 concatenation.

Linker A-, B-specific primer를 이용,

PCR로 증폭 후 anchoring enzyme으로 자름.

다른 sequence tag들을 ligation하여

plasmid vector에 cloning, sequencing하여

short sequence tag의 개수로 발현 수준을 확인



3. Studying the regulation of gene expression

- 유전자의 upstream region에 regulatory protein이 결합하는 promoter region 및

control sequence가 존재하여 유전자 발현이 조절됨

- Gene regulatory protein의 DNA-binding site는 특정 DNA 서열을 인식하여 결합함

- DNA에 regulatory protein이 결합하는지의 여부를 알아내는 방법

① Gel retardation of DNA-protein complex

- Also known as electrophoretic mobility shift assay (EMSA)

- Labeled-DNA fragment (genomic clone or synthetic oligonucleotide)에 단백질이

결합하여 전기영동(PAGE) 시 mobility를 감소시키므로 free DNA fragment와

비교하여 DNA-protein 결합 여부를 알 수 있음

- 경우에 따라 DNA에 결합하는 단백질의 antibody를 함께 결합시켜 supershifting

assay 할 수 있음

- Suspected regulatory sequence에 regulatory protein이 결합하는지 여부를 알아낼

수 있음

+ + + +

- + + +

- - + -

- - - +

Oligonucleotide

Nuclear extract

Antibody (Anti-Oct-1)

Competitor

DNA-protein-antibody complex

DNA-protein complex

Free DNA



② DNase I footprinting

- Regulatory protein이 결합한 DNA 부위는 DNase I에 의해 cleavage되지 않는 원리를

이용

- Labeled-DNA를 pancreatic DNase I으로 partial digestion하고 전기영동하면

size-fractionation되고 단백질이 결합한 부위는 DNase I으로부터 보호되어

gel상에서 gap (footprint)을 나타냄



③ Reporter gene assay (deletion analysis)

- Regulatory sequence의 위치를 정밀하게 알아낼 수 있음

- Regulatory sequence의 일부를 제거했을 때 유전자 발현의 차이가 있는지 관찰함

- Regulatory sequence at upstream of a gene 및 일부 서열이 제거된 regulatory

sequence 뒤에 reporter gene을 융합시켜 reporter gene의 발현 변화를 확인

조절 서열의 enhancer 부위를

제거하면 발현이 감소함

조절 서열의 silencer 부위를

제거하면 발현이 증가함



- Luciferase를 reporter gene으로 사용할 경우, regulatory sequence를 luciferase

reporter vector에 cloning. Recombinant plasmid를 세포에 transfection한 후

bioluminescence activity를 비교함.

Regulatory sequence

Reporter gene

An example of luciferase reporter vector

An example of deletion analysis by luciferase reporter assay



④ Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

- Gene regulatory protein이 DNA에 항상 결합하는 것은 아니며 세포 외 환경 변화

등에 의한 적절한 신호를 전달받았을 때 결합함

- ChIP은 세포가 어떠한 조건에 주어졌을 때 chromatin의 어떤 부위에 regulatory

protein이 결합하는지의 여부를 in vivo 상에서 알아보는 방법

Formaldehyde는 세포막을 통과하여 핵 내의

DNA-protein을 covalently cross link 시킴

Cell lysis 후 sonication으로 chromatin을

일정 길이로 fragmentation

특정 regulatory protein에 대한 항체로 코팅된 bead를

이용해 DNA-protein complex의 immunoprecipitation

Reverse cross-linking (heating)으로

DNA-protein dissociation

Precipitation된 DNA를 PCR로 확인

Specific condition과 normal condition의 세포 내에서

regulatory protein의 DNA 결합 여부를 비교


Week 13. Functional analysis of proteome

1. Introduction

- The proteome is the entire collection

of proteins in a cell

- 동일한 단백질이라도 post-translational

modification에 의해 chemical group이

더해지면 그 기능이 달라지게 됨

(ex. phosphorylation)

- 단백질의 동정 및 단백질 간의 상호작용,

modification 등의 연구가 필요

2. Identification of the proteome

① Two-dimensional electrophoresis

- Polyacrylamide gel electrophoresis를

통해 세포나 조직 내의 단백질들을

size에 의해 분리 후 다시 단백질

고유의 전하에 따라 분리

- 단백질의 molecular mass와 isoelectric

point에 의한 분리

② MALDI-TOF

- Matrix-assisted laser desorption

ionization time-of-flight

- 분리된 단백질 샘플의 동정이 가능

- Protease 처리로 polypeptide를 자른 후

pulse laser를 쏘아 샘플을 이온화시킴

- 이온화된 샘플을 일정한 전위차로

가속시켜 detector까지 비행(flight)시킴

- Ionization source로부터 detector까지의

‘time-of-flight’을 측정, 이를 통해

mass-to-charge ratio를 알 수 있음

- Mass-to-charge ratio를 이용해

단백질의 분자량 및 peptide의 amino

acid composition를 알 수 있음



③ Western blotting (immunoblotting)

- One of the most powerful methods for detecting a particular protein in a complex

mixture

- SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해

단백질을 분리하고 nitrocellulose 또는 PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane에

옮겨 1차 및 2차 항체를 이용하여 검출

- Primary antibody는 목적 단백질에 대해 특이적 결합

- Secondary antibody는 특정 animal source로부터 만들어진 primary antibody에 대해

특이적 결합. Enzymatic activity를 가진 물질이 secondary antibody에 결합되어 있어

단백질의 검출 가능.

- Secondary antibody에 연결된 HRP (horseradish peroxidase)에 의해

chemoluminescent substrate가 산화되며 에너지를 방출, 필름에 감광되어 단백질

밴드 확인



④ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

- Enzyme-linked antibody를 이용한 단백질의 검출 및

정량 방법

- 목적 단백질에 대한 항체를 plate에 고정,샘플을 넣어주면

목적 단백질(antigen)이 결합

- 목적 단백질에 대한 enzyme (ex. HRP)-linked

antibody를 결합시키고 chemoluminescent substrate가

반응하며 생성된 빛의 강도를 측정하여 단백질 정량



3. Studying protein-protein interactions

- 세포 내에서 단백질은 다른 단백질과 상호작용하여 기능을 수행, biochemical

pathway 또는 multiprotein complex를 구성

① Yeast two hybrid system

- Saccharomyces cerevisiae에서 transcription factor들의 상호작용에 의한 gene

expression에 기초한 시스템

- Reporter gene의 발현 여부로 protein-protein interaction을 확인

- 상호작용을 보고자 할 단백질과 DNA-binding domain, activation domain을 fusion

시켜 bait과 prey 제작. Bait과 prey가 interaction하면 reporter gene이 발현.

Prey Bait

Bait

Prey

Expression of reporter gene

GAL promoter Reporter gene



② Phage display

- Viral coat protein에 단백질을 fusion, M13 phage의 표면에 target protein

display 됨

- 여러 종류의 유전자를 M13 vector에 cloning하여 phage display library 제작

- Target protein을 microtitre tray에 고정하고 phage display library를 섞어주면 target

protein과 interaction하는 단백질을 display하는 phage만이 남음

③ Co-immunoprecipitation

- Immunoprecipitation (면역침강법)은 항원과 항체의 affinity를 이용하여

cell lysate로부터 항원을 특이적으로 분리하는 방법

- 특정 단백질과 상호작용하여 결합하는 다른 단백질들을 함께 분리, 전기영동하여 분석

항체-항원 결합

Protein A/G bead와 항체 결합

Protein complex의 co-immunoprecipitation



④ Pull-down assay

- GST- 또는 6X histidine-tagged fusion protein 등을 cell lysate와 반응시켜 특정

단백질과 결합하는 단백질들을 알아내는 방법

- Taq에 친화성을 가진 물질을 이용하여 분리, 이후 전기영동으로 확인

Fusion tag에 친화성을 가진

물질로 코팅된 bead를 이용해

tagged protein을

cell lysate로부터 분리

Bead에 결합하지 않은

단백질들 제거

Tagged protein이 결합된 bead와

cell lysate를 반응시켜 tagged protein과

결합하는 단백질 분리(pull-down)

Bead에 결합하지 않은

단백질들 제거

Glutathione 또는 imidazole을

이용하여 bead로부터

protein complex 분리

SDS-PAGE로 확인


Week 14. Applications of recombinant technology (1)

1. Production of recombinant pharmaceuticals

- 인체에서 만들어지는 단백질의 기능 결핍 시 질병을 초래하며, 올바른 단백질을 공급

함으로써 치료가 가능함

• Some of the human proteins that have been synthesized from genes cloned in

bacteria and/or eukaryotic cells or by pharming

※ Pharming

Genetic modification of a farm animal so that the animal synthesizes a recombinant

pharmaceutical protein, often in its milk

Protein Used in the treatment of

Insulin Diabetes

Somatostatin Growth disorders

Somatotrophin Growth disorders

Factor VIII Haemophilia

Factor IX Christmas disease

Interferon-α Leukemia and other cancers

Interferon-β Cancers, AIDS

Interferon-γ Cancers, rheumatoid arthritis

Interleukins Cancers, immune disorders

Granulocyte colony stimulating factor Cancers

Tumor necrosis factor Cancers

Epidermal growth factor Ulcers

Fibroblast growth factor Ulcers

Erythropoietin Anemia

Tissue plasminogen activator Heart attack

Superoxide dismutase Free radical damage in kidney transplants

Lung surfactant protein Respiratory distress

α1-Antitrypsin Emphysema

Serum albumin Used as a plasma supplement

Relaxin Used to aid childbirth

Deoxyribonuclease Cystic fibrosis



① Synthesis of human growth hormones in E. coli

- 신체의 성장을 조절하는 호르몬인 somatostatin의 결핍 및 기능에 문제가 있을 경우

왜소증 및 비대증 등의 질환이 유발됨

- Somatostatin은 E. coli에서 합성된 최초의 human protein

- Somatostatin은 14개의 아미노산만을 가진 매우 작은 단백질이므로 artificial gene

합성이 쉬움

- pBR322-type vector의 lacZ’ gene segment뒤에 artificial somatostatin gene을

ligation

- E. coli에 recombinant vector를 도입하여 배양 및 단백질 발현 유도,

β-galactosidase segment와 somatostatin의 fusion protein 생산

- Somatostatin과 fusion된 β-galactosidase segment는 단백질 발현 및

E. coli내에서의 단백질 안정성을 증가시킴

- Cyanogen bromide로 β-galactosidase segment와 somatostatin 사이의

methionine residue를 잘라내고 somatostatin 분리



② Synthesis of recombinant factor VIII

- Factor VIII는 혈액 응고에 관여하는 주요 인자임

- 인체에서 factor VIII의 합성 능력이 결핍될 경우 haemophilia (혈우병) 유발

- Donor의 혈액으로부터 factor VIII를 얻어 환자에게 주사할 수 있으나 혈액으로부터

분리하는 것이 어렵고 virus particle 오염 위험이 있음

- Factor VIII gene은 186kb의 길이로 매우 크며 26개의 exon과 25개의 intron으로

구성되어 있음

- Primary translation product는 2,351개의 아미노산으로 구성되며, post-translational

processing을 통해 primary product의 앞부분 polypeptide와 뒷부분 polypeptide가

17개의 disulfide bonds를 통해 dimer를 형성하여 mature factor VIII가 됨

- 활성을 가진 recombinant factor VIII의 발현은 E. coli에서는 불가능하므로 hamster

cell에서 발현시킴

- Factor VIII의 large subunit과 small subunit에 대한 cDNA fragments를 각각

expression vector에 cloning

- Cloned gene 앞뒤로 Ag promoter (hybrid between chicken β-actin and rabbit

β-globin sequences)와 SV40 polyadenylation signal을 넣어 recombinant factor

VIII의 발현 수율을 높임



③ Synthesis of recombinant vaccine for hepatitis B virus

- 백신은 virus의 감염으로부터 보호하기 위해 bloodstream으로 주사, 면역 시스템을

자극하여 항체를 만들도록 하는 것

- 백신의 antigenic material은 보통 virus의 inactive form을 이용함

- B형 간염은 열대지방에서 주로 발생하는 풍토병이며 간 질환 및 간암을 유발할 수

있음

- Hepatitis B virus의 coat protein 중의 하나인 HBsAg (hepatitis B surface antigen)을

백신으로 사용하여 hepatitis B virus에 대한 면역력을 생성

- HBsAg gene를 expression vector에 cloning하여 S. cerevisiae 또는 CHO (Chinese

hamster ovary) cell에서 많은 양의 HBsAg 단백질을 생산할 수 있음

- Recombinant viral coat protein 생산 시 정제 및 post-translational modification의

문제로 inactive 할 수 있음. 이 경우 live recombinant virus vaccine 이용.

- Vaccinia (우두) virus의 경우 사람에게는 해가 없으며 smallpox virus에 대한 면역을

만들 수 있음

- Recombinant vaccinia virus genome과 다른 viral coat protein gene을 ligation하여

여러 virus에 대한 live recombinant vaccine으로 이용



2. Gene therapy

- 유전적 질환은 몇몇 유전자의 결핍에 의해 유발됨

- 질환에 대한 genotype은 질병으로서 나타나거나 또는 일생 동안 발현되지 않는

경우도 있음. Phenotype은 개개인의 genotype과 환경적 요인에 의해 결정됨.

- Cystic fibrosis is expressed early in life, Alzheimer’s and Huntington’s disease are

expressed elderly

- 유전적 질환 발병 가능성을 미리 예측, 진단하여 발병 예상자의 lifestyle

management로 환경적 발병 요인을 피하는 것이 필요

- Why identifying the gene responsible for a genetic disease important is that…

• Gene identification은 질병에 대한 생화학적 지식 및 치료에 대한 접근 방법을

제공하며 gene therapy를 위한 선행 조건

• 유전자의 돌연변이 유무를 검사하여 질환 발병 가능성을 예측. 환자에 대한

counseling 및 precaution으로 질병이 발현될 위험을 줄임



- Germline therapy의 경우 microinjection으로 somatic cell의 핵을 oocyte로 이식함

- Somatic cell therapy의 경우 골수의 stem cell을 organism으로부터 추출하고 형질

조작하여 다시 몸 안으로 도입시킴. Haemophilia (혈우병) 및 thalassaemia (빈혈)와

같은 inherited blood disease의 경우 치료가 가능함.



- Most cancers result from activation of an oncogene that leads to tumor formation,

or inactivation of a gene that normally suppresses formation of a tumor

- 암 발병을 유도하는 oncogene의 발현을 막기 위해 oncogene에 대한

antisense RNA를 도입

- Oncogene의 reverse orientation으로 cloning하여 세포에 도입하면 oncogene의

mRNA에 상보적인 RNA transcript인 antisense RNA가 만들어짐

- Antisense RNA는 oncogene의 mRNA와 hybridization되어 발현을 직접적으로 억제함



1. DNA analysis in forensic science

- Identifying individuals or relationship by genetic fingerprinting or DNA profiling

- 머리카락, 혈흔 등으로부터 얻은 적은 양의 DNA를 PCR를 이용하여 증폭할 수

있으므로 DNA 분석이 가능해짐

- 쌍둥이를 제외한 모든 개개인의 유전체의 intergenic DNA 서열은 다름

- 유전체에 많은 polymorphism들을 포함하고 있으며 DNA marker로 사용됨

• RFLPs (restriction fragment length polymorphisms)

A mutation that results in alteration of a restriction site and hence a change in the

pattern of fragments obtained when a DNA molecule is cut with a restriction

endonuclease

• STRs (short tandem repeats / microsatellites)

Tandem copies of repeat units (two- to five-nucleotides)

• SNPs (single nucleotide polymorphisms)

A point mutation that is carried by some individuals of a population

① Genetic fingerprinting by hybridization probe

- Human genome의 hypervariable dispersed repetitive sequence를 이용

- 유전체 상에서 다형성을 지닌 서열의 위치는 개개인마다 다름

- 제한효소로 digestion한 DNA sample을 전기영동 후 다형성 서열을 포함한 labeled

probe (주로 GGGCAGGANG 이용)를 이용한 Southern blot으로 밴드 패턴(genetic

fingerprint)을 분석함

- 개인마다 genetic fingerprint가 다르므로 identification of individual 가능



- Legal and forensic use of genetic fingerprinting

- Limitations of genetic fingerprinting

• Hybridization analysis에 의존하므로 많은 양의 DNA 샘플이 필요함. 머리카락과

혈흔으로부터 얻은 적은 양의 DNA로는 fingerprinting 분석이 어려움.

• Hybridization signal이 좋지 않거나 재현성이 적을 경우 fingerprint 결과의 해석이

어려움

• 연관성 없는 사람들간에 fingerprint가 비슷하거나 같을 확률이 존재함

(A) Paternity test. Fingerprints are shown from the

Mother (M), child (C), and two possible fathers (F1, F2).

Allows indicate paternal bands in the child.

F1 contains all the paternal bands found in the child.

(B) A rape case. The fingerprint of suspect 1 exactly matches

That from the semen sample from victim. As a result of this

Evidence, suspect 1 was charged with rape and found guilty.



② DNA profiling by PCR of short tandem repeats

- PCR을 이용하여 STR 서열을 증폭, 그 길이를 알아냄으로써 paternity test 및 crime

suspect를 알아낼 수 있음

- 매우 적은 양의 DNA 샘플로도 빠른 분석이 가능함

- 가장 흔한 타입의 STR은 dinucleotide repeat [CA]n, n은 반복 횟수로 보통 5~20번

- 모계와 부계로부터 물려받은 각각 다른 길이의 STR band가 PCR 결과로 나타남

- PCR 결과를 전기영동 또는 automated DNA sequencer로 확인

- STR allele (대립유전자)는 부모로부터 유전되므로 kinship analysis에 이용됨



③ PCR directed at Y chromosome-specific sequences

- Y chromosome의 repeated sequence를 PCR로 증폭하여 성별을 밝혀내는 방법

- 남성의 경우 Y chromosome-specific DNA sequence를 PCR을 통해 확인할 수

있으며 여성의 경우 band가 나타나지 않음

④ PCR of amelogenin gene

- Amelogenin gene은 tooth enamel을 구성하는 단백질을 coding하며 X 및 Y

chromosome에 모두 존재함

- Amelogenin gene에는 여러 개의 indel (a position where a DNA sequence inserted

or deleted)이 존재하므로 X chromosome과 Y chromosome의 amelogenin gene은

길이가 다름

- Indel을 포함한 부위를 PCR하면 남성의 경우 다른 길이의 두 개의 band (from X and

Y chromosomes)가 확인되고 여성의 경우 한 개의 band (from X chromosome)가

확인됨



2. Genetic manipulation of animals

- 실험 동물을 이용한 주요 연구 분야는 다음과 같음

• Gene function

동물에 유전자를 도입시키거나 제거 또는 변형시키고 표현형을 관찰함으로써

유전자의 기능을 밝히는 연구에 이용

• Animal models of disease

인간의 특정 유전자에 대한 동물 모델의 analogous gene을 이용. Gene deletion 및

mutation을 통해 인간 질병의 표현형과 유사하게 동물 모델을 만듦

- 유전적으로 조작된 동물을 만들기 위해서는 germline cell의 DNA를 조작함

- Totipotent fertilized oocyte 또는 embryonic stem cell (ES) cell과 같은 early stage

embryo의 형질 전환

- Foreign DNA molecule을 인위적으로 동물의 세포에 도입하여 transgenic animal을

제작함

① Modification of fertilized oocyte

- Foreign DNA molecule을 fertilized oocyte의 chromosome에 integration시킴

- 암컷의 난관(oviduct)으로부터 fertilized oocyte를 추출하여 male pronucleus

(because it is bigger)에 DNA molecule을 microinjection 후 대리모의 난관에 이식함



② Modification of embryonic stem (ES) cell

- Genetically modified ES cells as a route for transferring foreign DNA or specific

mutations into the mouse germline

- Embryo의 수정 후 3.5~4.5일 후 blastocyst (배반포)가 형성되며 blastocyst로부터

inner cell mass (ICM)을 추출하여 ES cell을 in vitro에서 배양하고 genetic

modification

- ES cell은 개체의 모든 조직으로 분화될 수 있는 능력을 지님

- Genetically modified ES cell을 blastocyst에 microinjection하고 대리모에 이식

- Offspring은 chimera (derived from zygotes of blastocyst and implanted ES cell)

이므로 부분적으로 형질전환 된 동물임

- Chimera를 교배시켜 다음 세대에서 fully transgenic animal을 얻음



③ Potential of animals for modeling human disease

• Primates

Great apes (gorillas, chimpanzees, bonobos)는 인간과 유전적, 생리적, 해부학적,

발생학적으로 매우 유사하므로 인간 질병에 대한 가장 좋은 모델이 될 수 있음.

약리학적 평가 또는 새로운 질병 치료법의 테스트에 사람을 대신하여 이용될 수 있음.

사육을 위해 높은 비용이 요구되고 offspring을 만드는데 오랜 기간이 소요되는 단점이

있음.

• Mice

인간의 질병 모델로 가장 널리 사용되어옴. 사육 및 조작이 쉽고 짧은 수명(to 2~3

years)과 짧은 generation time (to 3 months)을 가지며 prolific (to 4~8 pups)함.

따라서 pathogenic mutation의 진행을 여러 세대에 걸쳐서 확인하는 것이 가능함.

X-ray, chemical mutation 또는 gene targeting으로 돌연변이를 만들어 유전적

질환의 원인 유전자를 연구할 수 있음

• Rats

Mice보다 크기가 크고 생리학적, 약리학적, 동물행동학적 연구에 적합함. 특히 심혈관

질환, 행동발달장애, 신경정신학 연구에 널리 이용됨.

• Zebrafish

Embryo가 투명하므로 발생학 연구에 적합함. Large-scale chemical mutagenesis를

통해 심장과 같은 internal organ의 development abnormality를 확인 가능함.

week 1. the post-genome era -genome … · ⑤transcriptomics (전사체학)...

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