Weichteilsubstitution mit Hilfe von injizierten

Präadipozyten-Fibrinkonstrukten

Aus der chirurgischen Universitätsklinik der Albert-Ludwigs Universität Freiburg Abt. Plastische und Handchirurgie

Ärztlicher Direktor: Univ. Prof. Dr. G. B. Stark

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen

Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs Universität

vorgelegt 2007 von Niklas Thomas Baerlecken

geboren in Freiburg im Breisgau

II

Dekan: Prof. Dr. med. Christoph Peters 1. Prüfer: Prof. Dr. med. Jörg Borges 2. Prüfer: PD. Dr. med. Nadir Ghanem

Jahr der Promotion: 2007

Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1

1.1. Weichteilgewebssubstitution 1 1.1.1 Indikation 1 1.1.2 Therapie 21.2. Tissue Engineering 41.3. Fettaugmentation 5 1.3.1 Geschichte 5 1.3.2 Klinik 61.4. Fettgewebe 8 1.4.1 Reifes Fettgewebe 8 1.4.2 Präadipozyten 101.5. Angiogenese 121.6. Zellmatrix 141.7. Fragestellung 15

2. Material und Methoden 18

2.1 Zellkultur 18 2.1.1. Präadipozyten-Isolation 18 2.1.2. CASY-Zellmessung 20 2.1.3. Kultivierung und Passagierung von Präadipozyten 20 2.1.4. Präadipozyten-Differenzierung 21

2.1.5. Isolation human dermal mikrovaskulärer Endothelzellen (HDMVEC)

22

2.1.6. Kultivierung und Passagierung von HDMVEC 23 2.1.7. HDMVEC Sphäroid-Kulturen 23 2.1.8. Isolation von Fibroblasten 24 2.1.9. Kultivierung und Passagierung von Fibroblasten 25 2.1.10. Kryokonservierung von Zellen 26 2.1.11. Auftauen kryokonservierter Zellen 262.2. Histologie 27 2.2.1. Doppelfärbung Hämalaun-Eosin (HE) 27 2.2.2. Oilred-O-Färbung 27 2.2.3. Sudanrot-IV-Färbung 29 2.2.4. Elastica-von Giesson 30 2.2.5. Immunhistochemie 31 2.2.6. Vitalitätsfärbung YoYo 32 2.2.7. In situ Zellproliferationskit, BrdU 32 2.2.8. Gewebeeinbettung und histologische Aufarbeitung 33 2.2.8.1. Kryo-Einbettung 33 2.2.8.2. Paraffin-Einbettung 342.3. Langzeittierversuch 35 2.3.1. Athymische Nacktmaus 35 2.3.1.1. Versuchstiere 35 2.3.1.2. Fibrin 36 2.3.1.3. Transplantation von Zell-Matrix-Konstrukten 37 2.3.1.4. Tätowierung 38 2.3.1.5. Biopsieentnahme 38 2.3.2. Auswertung 39 2.3.2.1. Bewertung der explantierten Proben 39

I

2.3.2.2. Histomorphometrie 40 2.3.3. Magnetresonanztomographie 412.4. Tierversuchsaufbau 422.5. Photographien 432.6. Materialien 44 2.6.1. Gerätschaften 44 2.6.2. Verbrauchsmaterialien 44

3. Ergebnisse 45

3.1. Isolation, Kultivierung, Implantation und Explantation 453.2. Ergebnisse der Versuchsgruppen 46 3.2.1. Gruppe 1: 5 Mill. Präadipozyten in 1ml Fibrin 46 3.2.2. Gruppe 2: 5 Mill. Fibroblasten in 1 ml Fibrin 53

3.2.3 Gruppe 3: 5 Mill. Präadipozyten mit 1 Mill. koimplantierten HDMVEC als Sphäroide in 1 ml Fibrin

58

3.2.4. Gruppe 4: Mehrfachinjektion von 5 Mill. Präadipozyten in 1ml Fibrin

63

3.2.5 Gruppe 5: 30 Mill. Präadipozyten in 1 ml Fibrin 65 3.2.6. Gruppe 6: 1 ml Fibrin ohne Zellen 673.3. Vergleich der Gruppe 1 mit den anderen Gruppen 68 3.3.1. Vergleich zwischen der Gruppe 1 und der Gruppe 2 68 3.3.2. Vergleich zwischen der Gruppe 1 und der Gruppe 3 69 3.3.3. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 4 71 3.3.4. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 5 72

4. Diskussion 74

4.1. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 744.2 Der Aussagewert des Tiermodells 744.3. Präadipozyten und Fibroblasten 75

4.3.1. Potenzial der Präadipozyten im Vergleich zu Fibroblasten für Weichteilgewebesubstitution

75

4.3.2. Vergleich mit anderen Transplantationen von Präadipozyten 77 4.3.3. Fibroblasten als Weichteilsubstitut in anderen Arbeitsgruppen 794.4. Präadipozyten und Angiogenese 80

4.4.1. Effekt der Koimplantation von HDMVECs als Sphäroide und Präadipozyten

80

4.4.2. Weitere Verfahren zur Angiogenese von Weichteilgewebesubstituten

81

4.5. Mehrfachinjektion 834.6. Zusammenspiel von Fibrin- und Präadipozytenkonzentration 84

4.6.1. Der Effekt einer erhöhten Zellzahl von Präadipozyten auf die Persistenz und Steigerung des Volumens

84

4.6.2. Senkung des Fibrins im Verhältnis zu den Präadipozyten 854.7. Aussichten 85 4.7.1. Dermolipektomien und Liposuktionen 85 4.7.2. Spender- und Empfängerregion 86 4.7.3. Einfluß der Kryokonservierung auf die Präadipozyten 87 4.7.4. Übernahme von Techniken aus dem autologen Fetttransfer 874.8. Stellung der vorliegenden Arbeit innerhalb des „Tissue Engineering“ 87

5. Zusammenfassung 89

II

6. Literaturverzeichnis 90

7. Curriculum vitae 99

8. Danksagung 101

9. Veröffentlichungen 102

9.1. Orginalarbeiten 1029.2. Kongressbeiträge 1029.3. Publizierte Abstracts 103

10. Erklärung über die Beteiligung Dritter 104

III

Abkürzungsverzeichnis In Text verwendete Abkürzungen können in der folgenden alphabetischen Auflistung nachgeschlagen werden. Abkürzung Volltext

Abb. Abbildung Aq. bidest. Aqua bidestillata; destilliertes Wasser Aq. deion. Aqua deionisata; deionisiertes Wasser bFGF basic Fibroblast Growth Factor CAM Chorioallantois-Membran DMEM Dulbecco´s Modified Eagle S Medium DMSO Dimethylsulphoxid ECBM Endothelial Cell Basal Medium ECGM Endothelial Cell Growth Medium EGF Epidermal Growth Factor et al. et alteri, und andere (Mitarbeiter) EZM Extrazelluläre Matrix FBS Fetal Bovine Serum; fötales Rinderserum FCS Fetal Calf Serum: fötales Kälberserum Flt-1 FMS-like tyosine kinase-1 GM-CSF Granulocytes-Monocytes-Colony Stimulating Factor HDMVEC Humane Dermale Mikrovaskuläre Endothelzellen HE Hämalaun-Eosin HSA Humanes Serumalbumin K.I.E Kallikrein Inhibierende Einheiten I.E. Internationale Einheiten IGF-1 Insulin-like-Growth-Factor-1

MRT Magnetresonanztomographie PBS phosphate buffer solution PDGF Platelet-derived Growth Factor PGA-PLLA Polyglycolic acid poly-L-lactic acid matrix RGD R-Arginin-Glycin-D-Asparagin pH pH-Wert, pondus hydrogenii; negativer dekadischer Logarithmus

der Wasserstoffionenkonzentration PLGA Poly-(lactic-co-glycolic)-acid; Copolymer Präad Präadipozyten p.t. post transplantationem; nach erfolgter Transplantation Tab. Tabelle VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Vergr. Vergrößerung ZMK Zell-Matrix-Konstrukt

IV

1. Einleitung

1.1. Weichteilgewebssubstitution

1.1.1 Indikation Der Ersatz von Weichteilgewebe spielt in der plastischen und rekonstruktiven

Chirurgie eine wesentliche Rolle. Sowohl angeborene als auch erworbene

Weichteilgewebsdefekte können einer Therapie bedürfen. Zu den angeborenen

Weichteilgewebsdefekten zählen u.a. die angeborene Mammahypoplasie, das

Polland-Syndrom, ein einseitiger Fehlbildungskomplex von Brustdrüse, Brustmuskel,

Haut und Anhangsgebilde mit evtl. Mitbeteiligung von Rippen- und

Handfehlbildungen sowie die Hemiatrophia faciei progressiva (Fokin 2002; Finch

2003; Sadove 2005). Die erworbenen Weichteilgewebsdefekte sind weitaus

vielfältiger. Hier lassen sich traumatische, postoperative, autoimmunreaktive,

medikamentöse, infektiöse und sonstige Ursachen unterscheiden. Infolge eines

Traumas kann z.B. durch Nervenläsion Gewebe atrophieren. Postoperative

Weichteilgewebsverluste entstehen beispielsweise nach Mastektomie bei

Mammakarzinom. Zu den Autoimmunerkrankungen mit Weichteilgewebedefekt

gehören insbesondere Kollagenosen wie Sclerodermia en coup de sabre.

Medikamentöse Ursachen sind zu finden bei HIV-Erkrankten mit High Active Anti-

Retroviral Therapy (HAART)-Assoziation. Diese HIV-Kombinationstherapie aus

Nukleosidalen, nukleotidalen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, nichtnukleotidalen

Reverse-Transkriptase-Inhibitoren sowie Protease-Inhibitoren kann Lipohypotrophien

im Gesicht und an den Extremitäten verursachen. Ansonsten sind noch verschiedene

Pannikulitiden zu nennen, welche durch Entzündungen und Einschmelzungen des

Unterhautfettgewebes gekennzeichnet sind.

Ein weiteres Feld für die Weichteilgewebssubstitution bietet sich in der kosmetischen

Chirurgie. Hier kann die Weichteilgewebsersatz bei der Beseitigung von

eingezogenen Narben, Altersfalten sowie zur Augmentation im Nasolabial-, Lippen-,

Glabella-, Wangen-, Stirn-, Kinn- und Handrückenbereich eingesetzt werden

(Goodstein 1996; Cortese 2000; Hernandez-Perez 2001; Ramirez 2001).

1.1.2 Therapie Plastisch-chirurgische Standardtherapie sind lokalregionale und freie mikrovaskuläre

Lappenplastiken sowie die Transplantation autologen Gewebes ohne

mikrovaskulären Gefäßanschluss. Bei Lappenplastiken entsteht stets ein Hebedefekt

sowie intra- und postoperative Risiken, die zur Infektion, Wundheilungsstörung,

Narbenbildung und bis zum vollständigen Lappenverlust führen können.

Beispielsweise treten bei dem unter den Lappen am häufigsten für die

Brustaugmentation verwendeten freien transversen rectus abdominis

muskulokutanen (TRAM) und dem deep inferior epigastric perforator (DIEP) Lappen

in 11% der Fälle Fettnekrosen, in 3% venöse Kongestion, in 5 % eine abdominelle

Schwellung auf (Nahabedian 2005; Bajaj 2006). Neben diesen Komplikationen sind

noch die hohen Operationskosten zu bedenken und desweiteren sind mit diesen

Techniken bezüglich des Volumens Grenzen gesetzt.

Silikon wird weltweit in der plastischen Chirurgie als Volumensubstitut für die

Brustaugmentation verwendet. Grundsubstanz von Silikon ist Silizium.

Makromoleküle, die abwechselnd Silizium- und Sauerstoffatome enthalten, werden

als Polysiloxane oder Silikon bezeichnet. Die verschiedenen Silikonarten

unterscheiden sich im Wesentlichen durch die Länge der Polymerketten. Flüssiges

Silikon besteht aus linearen Kurzketten und wird in verschiedenen Reinheitsgraden

v.a. in der Industrie verwendet. Silikongel entsteht, wenn die Ketten in einer

dreidimensionalen Struktur gebunden sind. Die Entstehung wird durch die Zugabe

von Platin katalysiert. Silikonelastomere bestehen aus stark verbundenen Ketten.

Alle Brustimplantate, unabhängig von Füllmaterial, haben eine Umhüllung aus

Silikonelastomer.

Cronin und Gerow entwickelten Silikongelimplantate, welche erstmals von Cronin

1962 für die Brustaugmentation verwendet wurden (Brown 2005).

Silikonbrustimplantate existieren in einer Vielzahl verschiedener Grössen und

Formen, rund und anatomisch, mit hohem, mittlerem und flachem Profil. Trotz jener

Vorteile hinsichtlich seiner universellen Verfügbarkeit und Vielfalt birgt Silikon auch

einige Risiken in sich (Ellenbogen 1975; Gerszten 1999). Von 1992 bis 2005 wurden

Silkonimplantate sowie injizierbares Silikon von der Food and Drug Administration

(FDA) in Amerika verboten. Die Entscheidung der FDA beruhte auf gehäuften

Vorfällen von Kapselkontrakturen, Autoimmunreaktionen und Revisionen (Kessler

2

1992). Außerdem finden sich Berichte, dass bei fazialen Injektionen multiple Knoten

und Streifen durch Granulome aufgetreten sind (Shafir 2005).

Kollagen wird in vielfältiger Form angeboten. Am häufigsten wurde bovines Kollagen

in den letzten 20 Jahren eingesetzt. Seine Nebenwirkungen sind allerdings zahlreich,

insbesondere Hypersensibilitätsreaktionen, wie Erythema, Induration oder Pruritus

(Framer 1984) (Cooperman 1985). Neben diesen typischen Nebenwirkungen können

auch lokale Abszesse, Gewebsnekrosen und granulomatöse Fremdkörper auftreten

(Moscana 1993). Bovines Kollagen ist auch in Verruf geraten, da es eine mögliche

Infektionsquelle für BSE sein könnte. Dies wurde jedoch bislang nicht bewiesen und

ist aufgrund der Hygienevorschriften für die Produktion unwahrscheinlich. Vor allem

den Hypersensibilitätsreaktionen kann vorgebeugt werden durch einen zweimaligen

Hautsensibilitätstest im Abstand von 6 Wochen.

Homologes Kollagen wird in Form von Dermatologen® von Collagenesis und

Cymetra® von Life angeboten. Hauptrisiko sind Krankheitsübertragungen;

vorgebeugt wird diesem Risiko durch Suchtests für HIV, Hepatitis B und C sowie

andere Krankheiten (Maloney 2004). Autologes Kollagen namens Autologen® von

Collagenesis sind isolierte dermale Matrixkomponenten aus Hautbiopsien von

Patienten, die wiederum vor allem bei Gesichtsstraffungen, Blepharoplastiken und

Abdominoplastiken anfallen. Hauptvorteil ist das Fehlen von

Hypersensibilitätsreaktionen. Nachteile sind eine hohe Resorptionsrate, ein

Sekundärdefekt durch die Hautbiopsie sowie hohe Kosten (Narins 2005; Eppley

2006).

Auch Hyaluronsäure dient wie Kollagen zur Behebung kleinerer

Weichteilvolumendefizite, wie Augmentation von Lippen und Glättung von Falten.

Hyaluronsäure gehört zu den Makromolekülen der Glycosaminoglycane. Es stellt

eine natürliche Komponente der extrazellulären Matrix dar. Der hydrophile Anteil der

Hyaluronsäure zieht Wasser aus dem Extrazellulärraum und erzeugt auf diese Weise

ein Volumen. Der Vorteil von Hyaluronsäure ist, dass sie in allen Spezies identisch ist

und somit selbst keine Hypersensibilitätsreaktionen hervorrufen sollte. Jedoch sind

die Hyaluronsäurederivate häufig mit Hyaluronsäure-assoziierten Proteinen

ausgestattet, welche wiederum Hypersensibilitätsreaktionen hervorrufen können

(Patel 2006). Ein anderer Vorteil gegenüber anderen Füllmaterialien wie Kollagen

besteht darin, dass Hyaluronsäure das injizierte Volumen weitgehend beibehält.

3

Infolgedessen sind keine Überkorrekturen bei der Injektion nötig. Die Haltbarkeit

beträgt zwischen 4 bis 9 Monate (Matarasso 2006).

1.2. Tissue Engineering

Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Feld aus Ingenieurwissenschaften,

Medizin, Naturwissenschaften sowie Informationswissenschaften, die gemeinsam

versuchen, Gewebesubstitute für verletztes, funktionsloses oder fehlendes

Körpergewebe zu entwickeln. Formell wurde der Begriff „tissue engineering“ 1987

anlässlich des „inaugural tissue engineering meetings at Lake Tahoe, California“

eingeführt (Skalak 1988; Cima 1991; Nerem 1991; Langer 1993; Schultheiss 2000).

Die Anfänge des Tissue Engineering lassen sich im Wesentlichen in der Prothetik,

Transplantationschirurgie sowie in der Zellkulturtechnik finden.

Die Entwicklung von Gewebeersatz kann bis in das frühe 16. Jahrhundert

zurückverfolgt werden. Ambroise Paré (1520-1590), ein bedeutsamer französischer

Militärarzt, beschreibt in seinem Werk „Dix livres de la chirurgie“ von 1564

Zahnersatz durch künstliche Zähne sowie Nasenersatz (Paré 1634). John Hunter

(1728-1793) führte bereits homologe Transplantationen von Zähnen am Menschen

durch, sogenanntes “scion-tooth” (Hunter 1771) (Hunter 1835-1837). Der Chirurg

Johann Friedrich Dieffenbach (1792-1847) führte im Rahmen seiner Doktorarbeit von

1822 „Nonnulla de Regeneratione et Transplantatione“ Hauttransplantationen durch

(Lampe 1934).

Neben diesen frühen chirurgischen Leistungen sind noch jene der

Zellkulturtechnologie zu nennen. Rudolf Virchow (1821-1902) eröffnete mit seinem

Werk „Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische und

pathologische Gewebelehre“ erste Grundverständnisse über die Zelle (Virchow

1858). Leo Loeb schlug als erster in-vitro-Kultivierung in seiner Publikation von 1897

vor (Loeb 1897). Ross G. Harrison (1870-1959) und Alexis Carrel (1873-1944)

trieben wesentlich die Zellkulturtechnik durch Forschung und Verbreitung voran

(Harrison 1907).

Heute hat sich Tissue Engineering zu einem eigenen Gebiet entwickelt, in welches

laut Miller und Patrick mehr als 3,5 Milliarden Dollar seit den frühen 90er Jahren

investiert wurden (Miller 2003). Derzeitig sind zwar nur drei Produkte auf dem Markt,

4

aber aufgrund großer Investitionen werden in den nächsten Jahren wahrscheinlich

noch weitere folgen (Omstead 1998).

1.3. Fettaugmentation 1.3.1 Geschichte Die Fettaugmentation lässt sich mehr als 100 Jahre in die Vergangenheit

zurückverfolgen. Der erste Gebrauch von freiem autologem Fett bei Menschen wurde

von Neuber im Jahr 1893 durchgeführt, bei dem mehrere kleine Transplantate für die

Füllung eines Weichteilgewebsverlustes verwendet wurden. Neuber benutzte nur

suffizientes Fett als Weichteilgewebsersatz und berichtete über exzellente

Ergebnisse (Neuber 1893). Weniger Erfolg hatte er mit größeren Transplantaten

„grafts larger than an almond would not give good results“ (Billings 1989). Ellenbogen

(1886) berichtete einstweilige Ergebnisse bei dem Gebrauch von freien autologen

Fetttransplantaten von der Größe einer Perle für die Korrektur von Aknenarben,

posttraumatischen Defekten, nasolabialen Falten, Gesichtsfalten,

Narbeneinziehungen, Gewebedepressionen an den Augenlidern und

Kinnaugmentationen (Billings 1989). Lexer beschrieb 1909 den ersten erfolgreichen

Gebrauch von größeren Fetttransplantationen. Er entnahm ein 12 x 12 cm großes

autologes Fetttransplantat vom Abdomen für die Therapie einer Gewebedepression

im unteren infraorbitalen Bereich und für ein regredientes Kinn (Billings 1989). Diese

autologen Transplantate hatten einen Durchmesser von 4 bis 6 mm. Czerny

rekonstruierte als Erster 1895 aus einem Lipom eine Brust. Lexer führte 1931

ebenfalls eine Brustrekonstruktion durch; das Fett wurde allmählich resorbiert wegen

ungenügender Blutversorgung. Weitere Persönlichkeiten, die eine

Brustrekonstruktion mit freiem autologen Fettgewebe durchführten, waren May

(1941) und Schorcher (1957).

Jedoch waren die Ergebnisse nicht so gut wie erhofft und die wenigen guten

Ergebnisse ließen sich nur selten wiederholen (Beahm 2003). Implantate wurden

meist progressiv absorbiert und fibröses Gewebe ersetzte allmählich das

Fettgewebe, da die Fettzellen wegen ungenügender Versorgung zugrunde gingen

und das Proliferationsvermögen der wenigen verbliebenden Fettzellen zu limitiert war

(Ersek 1991; Kononas 1993). Die Zell-Überlebens-Theorie von Peer wurde in diesem

Zusammenhang bekannt (Peer 1950). Er ging davon aus, daß die Entwicklung des

5

Fetttransplantates von der Zahl individuell überlebender Fettzellen abhängig ist.

Histologische Veränderungen im Bereich des Transplantates wurden 1956 von Peer

im Detail erläutert. Er beschreibt eine 50%ige Volumenreduktion des

Fettgewebstransplantates innerhalb eines Jahres unter Ausbildung einer

ausgeprägten Fremdkörperreaktion, zentralen Fettzellnekrosen, Ölzysten und einer

nur im Randbereich des Transplantates stattfindenden Vaskularisierung (Peer 1956).

Das Interesse versiegte wegen der hohen Resorption und unvorhersagbaren

Volumenverlusten (Homicz 2004). Mit der Liposuktion entfachte das Interesse wieder

in den 70iger Jahren des letzten Jahrhunderts.

1.3.2 Klinik In der Klinik wird heute mit Hilfe verschiedener Techniken die freie autologe

Fetttransplantation durchgeführt, wobei die autologe Transplantation hauptsächlich

für die Korrektur kleinerer Gewebedefizite oder kosmetischer Mängel gebraucht wird.

Die Fettgewinnung erfolgt meist durch Liposuktion. Alternativ kann auch das

überschüssige Fettgewebe aus Dermolipektomien eingesetzt werden. Bei einer

maschninell extrahierten Reduktionsliposuktion wird das mit

Tumeszenzlokalanästhesie unterspritzte subkutane Fett durch stumpfe Kanülen von

3-4 mm Dicke mittels Fächerförderungstechnik über ein geschlossenes System

mittels Vakuumpumpe aspiriert in einem Behälter aufgefangen (Ramirez 2001). Es

sollte beachtet werden, dass der Unterdruck im Absaugsystem -0,7 bar nicht

überschreitet, da sonst eine zu hohe Schädigung der Fettzellen erfolgt. Findet keine

Reduktionsliposuktion statt, kann das Fett durch den manuell erzeugten Unterdruck

einer Spritze aspiriert werden. Bei der manuellen Aspirationslipektomie erhält man

ein Aspirat aus Fettzellen mit Blutzellen und extrazelluären Bestandteilen, jedoch

ohne größere Bindegewebssepten. Das mit Hilfe dieser Techniken gewonnene Fett

wird dem Patienten injiziert.

Als Indikationen für die freie autologe Fettaugmentation gilt die altersbedingte

Lipoatrophie im Gesicht sowie die Glättung von großen und tiefen Falten im

Nasolabial-, Mundwinkel- und Glabellabereich, des seitlichen Wangenbereichs, an

Stirn, Kinn und Handrücken sowie die Vergößerung der Lippen (Coleman 2006).

Weiterhin finden sich in der Literatur der letzten Jahre Fettaugmentation im

Periorbital-, Gesäß-, Waden-, Knöchel- und Genitalbereich (Hernandez-Perez 2001).

6

Auch wurde versucht bei Sclerodermia circumscripta en coup de sabre mit

Hemiatrophia faciei (Romberg-Syndrom), Pannikulitiden, Lipodystrophien fehlendes

Fettgewebe durch autologen Fetttransfer zu ersetzen (Drake 1996; Cortese 2000;

Fulton 2000).

Vorzug der autologen Fetttransplantation soll aus kosmetischer Sicht eine geringe

Anzahl von Nachbehandlungen sein - meist zwischen 1 bis 3 Nachinjektionen - bei

einem als gut tituliertem Aussehen (Fournier 1998; Eremia 2000; Hanke 2000).

Desweiteren handelt es sich bei der Aspiration des Fettgewebes um einen minimal-

invasiven Eingriff.

Auf der anderen Seite werden auch einige Nebenwirkungen und Komplikationen der

derzeitigen Fetttransplantation beschrieben. Es können leichte Schwellungen

innerhalb von Stunden bis Tagen, Erytheme, Hämatome sowie

Sensibilitätsstörungen auftreten (Sattler 2001; Lenzen 2004).

Konturunregelmäßigkeiten können mit der Zeit entstehen, wenn mehr als 8-10 ml pro

Region injiziiert werden; die Konturunregelmäßigkeiten sind dann Folge von

Einschmelzungen und Entwicklung von makroskopisch sichtbaren oder tastbaren

Lipogranulomen oder Ölzysten (Fournier 1998; Fournier 2000). Ölzysten lassen sich

häufig mikroskopisch nachweisen, haben jedoch für die Gesundheit des Patienten

keine Bedeutung (von Heimburg 2001). Manchmal treten nach Tagen lokalisierte

Indurationen im injizierten Bereich auf, die spontan nach wenigen Wochen

verschwinden. Ganz vereinzelt wurde über Infektionen wie Abszesse oder Erysipele

berichtet (Fournier 1998; De Pedroza 2000). Allerdings können auch schwere

Komplikationen vorkommen, wie das Aufftreten einer Fettembolie in der A. centralis

retinae mit unilateralem Visusverlust nach Injektion in die Glabella (Teimourian 1988;

Shiffman 2001).

Für den Einsatz der Augmentation mit freiem autologen Fett gelten folgende

Kontraindikationen: Akute Entzündungen im Unterspritzungsareal, Schwangerschaft,

Stillzeit, Koagulopathie und therapeutische Antikoagulation (Lenzen 2004).

Außerdem müssen auch Nebenwirkungen und Komplikationen bedacht werden, die

durch die Fettgewinnung entstehen können bzw. bei Liposuktion und

Dermatolipektomien bestehen. So wurden beispielsweise Pulmonalembolien im

Rahmen von Fettreduktionen als ernste Komplikationen beschrieben (Richling 2004;

Matarasso 2005).

7

Durch den Einsatz des Tissue Engineering hofft man auf der einen Seite, die

Nebenwirkungen und Komplikationen zu vermindern und auf der anderen Seite, die

Vorteile der Fettaugmentation, wie das natürliche Gefühl und Aussehen, zu

optimieren, denn die Zahl plastischer und ästhetischer Eingriffe ist relativ hoch und

steogend. Laut der American Society for Aesthetic Plastic Surgery wurden beinahe

8,3 Mill. kosmetisch chirurgische und nicht-chirurgische Prozeduren 2003 in den USA

durchgeführt; dies ist ungefähr eine 299%ige Steigerung gegenüber 1997 (Sarwer

2005).

1.4. Fettgewebe 1.4.1 Reifes Fettgewebe 10-25 % des normalgewichtigen Menschen besteht aus Fettgewebe und bei einem

typisch 70 kg schweren Mann speichert das Fettgewebe ungefähr 565000 kJ Energie

in Form von Triacylglycerinen. Das Fettgewebe wird meist als eine Sonderform des

retikulären Bindegewebes beschrieben. Zwei Arten des fettspeichernden Gewebes

finden sich im menschlichen Körper: Weißes und braunes Fettgewebe.

Braunes bzw. plurivakuoläres Fettgewebe findet sich beim Neugeborenen; das fetale

Fettgewebe unterscheidet sich von dem des univakuolären Fettgewebes, da es nicht

als Energielieferant, sondern als Wärmequelle für den Säugling fungiert.

Im Elektronenmikroskop unterscheidet sich das braune Fettgewebe durch eine

immense Anzahl von Mitrochondrien, was mit ihrer Funktion als Wärmequelle durch

Lipolyse im Zusammenhang steht. Wegen der hohen Dichte an Mitochondrien sind

braune Fettzellen besonders eosinophil und erscheinen so in der H&E-Färbung

bräunlich. Plurivakuoläres Fett verschwindet allmählich während der Entwicklung

vom Kind zum Erwachsenen bis auf Rudimente, z.B. im Mediastinum und an der

Aorta (Kugler 1994).

Das weiße Fettgewebe, auch univakuoläres Fettgewebe genannt, entwickelt sich aus

embryonalem Mesenchym. Es bilden sich aus den mesenchymalen Zellen zunächst

spindelförmige Adipoblasten. Diese Adipoblasten beinhalten zunächst keine

Fettvakuolen, bis sie wiederum zu Präadipozyten reifen und sich schließlich zu reifen

Fettzellen, den Adipozyten, entwickeln. Die Adipozyten speichern Fett als

Energiequelle für andere Körperzellen. In den Fettzellen werden vorwiegend

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Triacylglycerine gespeichert. Das Fettgewebe ist also auf die Veresterung von

Fettsäuren und auf ihre Freisetzung von Triacylglycerinen spezialisiert.

Neben den Fettzellen finden sich im Fettgewebe noch Zellen aus der stromal-

vaskulären Fraktion. Die stromal-vaskuläre Fraktion bildet sich aus den

Makrophagen, Fibroblasten, Perizyten, Mastzellen, mikrovaskulären Endothelzellen,

den Präadipozyten sowie Zellen des lockeren Bindegewebes.

Beim Erwachsenen stellt univakuoläres Fettgewebe die Hauptform des Fettgewebes

dar und fungiert als Energiespeicher, endokrines Organ und auch als

Supportgewebe. Über Rezeptoren an den Adipozyten wird die Aufnahme und

Abgabe von Fett reguliert. Die Rezeptoren sprechen hauptsächlich auf verschiedene

Wachstumsfaktoren, Insulin, Glukokortikoide, Schildrüsenhormone und Noradrenalin

an. Bedeutende Wachstumsfaktoren sind u.a. der platelet-derived growth factor

(PDGF) aus Thrombozyten, Fibroblast Growth Factor (FGF), insulin-like growth

factor, Transforming Growth Factor (TGF). Diese Wachstumsfaktoren werden im

Anschluß an Gewebeschäden sezerniert und induzieren neben der Proliferation von

Fettzellen auch die Entwicklung neuer Blutgefäße. Insulin sorgt durch die

Bereitstellung für den Aufbau der Triglyzeride, indem es eine hormonsensible Lipase

hemmt, weshalb bei niedrigem Insulingehalt die Lipolyse beschleunigt ist. Ein

ausgeprägtes Kapillarbett und das autonome Nervengewebe sind mit dem

Fettgewebe verbunden (Rosell 1979; Crandall 1997). Die örtliche Freisetzung von

Noradrenalin stimuliert die Freigabe von gespeichertem Fett in das Blut; außerdem

ist das Wachstum der Fettzellen von der sympathischen Innervation und von

Neurotransmittern abhängig (Thompson 1986).

An manchen Stellen polstert kollagenfaseriges Gewebe - sogenannte Septen -

jeweils eine größere Anzahl an Fettzellen. Die Septen stellen sowohl morphologisch,

funktionell als auch angiologisch selbständige Einheiten dar. Sie verfügen über eine

terminale Zirkulation. Während die Arterie gewöhnlich in der Achse des Läppchens

verläuft, sammeln paarige Venen das Blut an der Oberfläche der Arterie. Die Septen

wirken als verformbares, stoßdämpfendes Supportgewebe, insbesondere an den

Regionen wie den Fußsohlen, dem Gesäß, den Nierenkapseln und den

retrobulbären Fettkörpern der Augenhöhle.

9

1.4.2 Präadipozyten Die frühesten Vermutungen über die Existenz von Fettzellen wurden von Fleming

1871 geäußert, der vermutete, dass die Adipozyten aus speziellen mesenchymalen

Zellen heranreifen (Johnson 1988).

Wassermann und Hausberger untermauerten mit ihren Versuchen diese Therorie in

den Jahren 1926 und 1938. In einem Leitartikel aus dem Jahre 1948 schrieben

Wertheimer und Shapiro, dass Fettgewebe aus primitiven Vorläuferzellen entsteht

und diese Zellen eine ähnliche Struktur aufweisen wie Fibroblasten (Wertheimer

1948). 1955 veröffentlichte Hausberger schließlich die Theorie, dass der Präadipozyt

bzw. der mesenchymale Vorläufer der Fettzelle sich durch Zelldifferenzierung zu

einer reifen Fettzelle umzuwandeln vermag (Hausberger 1955).

Meilensteine in der frühen Forschung zur Adipozytendifferenzierung unter in vitro

Bedingungen sind die Arbeiten von Smith 1971, der erstmals das Wachstum von in

Kultur befindlichen, fibroblastenähnlichen Zellen aus humanem Fettgewebe

beschrieb (Smith 1971).

1979 entwickelten Green und Kehinde Kulturtechniken, um die Präadipozyten-

Zelllinien (3T3-L1, 3T3-F442A) zu selektionieren, die sich in reife Fettzellen

differenzieren konnten (Billings 1989). Diese Zellen wurden subkutan in Nacktmäuse

injiziert, welche sich nach 6 Wochen in reife Fettzellen entwickelt hatten. Van und

Roncari (1982) konnten ebenso in vivo die Differenzierung von Präadipozyten zu

Adipozyten nachweisen und trugen so zur weiteren Etablierung von Primärkulturen

der stromal-vaskulären Fraktion bei (Van 1976; Van 1977; Van 1978; Cryer 1982).

Slavin (1979) und Cinti et al. (1984) beschrieben durch Versuche an Mäusen und

Ratten, daß Präadipozyten zwischen dem 17. Tag pränatal und dem 3. Tag postnatal

als fibroblastenähnliche Strukturen auftreten (Slavin 1979; Cinti 1984). Die Lipide

werden erst als kleine intrazelluläre Tröpfchen akkumuliert, welche später zu einer

einzigen großen Vakuole verschmelzen. Hausman (1983) stellte weiterhin in

ultrastrukturellen Studien an jungen Ratten die rasche Entwicklung der

Präadipozyten im subkutanen Gewebe dar, welche sich durch große Kapillaren von

mehr als 4 μm Lumendurchmesser und durch eine hohe Lipoproteinlipaseaktivität

auszeichnete (Hausman 1983).

Im Tissue Engineering werden heute zwei verschiedene Ansätze für die

Adipogenese verfolgt (Masuda 2004). Ziel beider ist, durch Neovaskularisation und

10

Akkumulation von Präadipozyten und eine im Anschluß daran erfolgende

Differenzierung zu reifen Adipozyten zu gelangen. Während in Primärkulturen bereits

zur Differenzierung von Präadipozyten junger Spender niedrige Insulin-

Konzentrationen (1-10nM) in Anwesenheit von fötalem Kälberserum (FCS) bzw.

hohen Insulinkonzentrationen (1-10µM) unter serum-freien Bedingungen genügen

können (Deslex 1987; Hauner 1989; Ailhaud 1997), ist die Differenzierung in-vivo

erschwert. Im implantierten Gewebe sind Präadipozyten anfangs wegen Ischämie

bzw. einer inadäquaten Blutversorgung nicht optimalen Voraussetzungen

ausgesetzt, da diese Faktoren Zellnekrose und einen Stillstand der Differenzierung

von Präadipozyten induzieren können (Billings 1989). Wenn die Vaskularisierung

vollständig ist, wandeln sich die Präadipozyten in Adipozyten um. Die drohende

Ischämie bzw. die inadäquate Versorgung kann einerseits durch Nährstoffe aus der

Trägermatrix überbrückt werden und andererseits kann durch angiogenetische und

adipogenetische Faktoren, wie bFGF, Insulin, insulin-like growth factor-I, die Zeit bis

zur physiologischen suffizienten Vaskularisierung verkürzt werden. Solch eine

Adipogenese wurde in-vivo herbeigeleitet durch Injektion einer mit FGF-2 zusätzlich

versehenen rekonstituierten Basalmembran, die aus einem Maussarkom entwickelt

wurde und unter dem Namen Matrigel bekannt ist (Kawaguchi 1998; Tabata 2000).

Matrigel weist jedoch eine hohe Speziesabhängigkeit auf, weshalb ein Matrigel für

den Menschen noch entwickelt werden muß (Beahm 2003).

Ein anderer Ansatz besteht darin, isolierte Präadipozyten in einer Matrix mit oder

ohne Koimplantation eines anderen Zelltyps zu implantieren. Weiterhin können

alternativ zu Präadipozyten auch mesenchymale Stammzellen verwendet werden

(Kim 2005). Derzeitig stehen diploide Präadipozyten von verschiedenen Nagetieren,

vom Schwein sowie vom Menschen zur Verfügung. Anders als diese Zelllinien, die

aus Stammzellen entwickelt werden müssen, können Präadipozyten relativ leicht und

in hoher Stückzahl aus Liposuktionen und Dermolipektomien isoliert werden (Beahm

2003).

Für die Koimplantation kommen Endothelzellen zur Steigerung der Angiogenese und

Differenzierung der Präadipozyten sowie Fibroblasten, also Zellen aus der stromal-

vaskulären Fraktion, in Frage.

11

1.5. Angiogenese Angiogenese spielt bei der Etablierung neuen Gewebes eine wesentliche Rolle.

Vaskulogenese und Angiogenese sind die physiologischen Prozesse zur Bildung von

Gefäßen. Vaskulogenese ist definiert als die Differenzierung von Angioblasten in

Endothellzellen und die De-novo-Formation eines einfachen Gefäßnetzes.

Angiogenese ist das Wachstum neuer Kapillaren aus bereits bestehenden Gefäßen.

Im Embryo bilden sich noch Gefäße durch Vasculogenese und Angiogenese. Im

Erwachsenenalter ist die Bildung neuer Blutgefäße nur bei bestimmten

physiologischen Prozessen anzutreffen, wie im weiblichen Genitaltrakt bei

Schwangerschaft, in der Plazenta bei Schwangerschaft und während der

Wundheilung. Bei dieser Gefäßbildung handelt es sich hauptsächlich um

Angiogenese. Eine Dysregulation der Angiogenese wird bei verschiedenen

Pathogenesen angenommen, wie bei der vaskulären Retinopathie, der rheumatoiden

Arthritis sowie bei Tumoren.

Zwei verschiedene Mechanismen der Angiogenese werden beschrieben: Sprouting

bzw. Gefäßaussprossung und Intussuszeption. Die intussuszeptive Angiogenese

entsteht duch die Insertion interstitieller zellulärer Spalten in das Lumen

präexistierender Gefäße. Das darauf folgende Wachstum dieser Spalten und ihre

Stabilisierung resultiert in der Teilung der Gefäße und der Remodulierung des

lokalen Netzwerkes. Angiogenese duch Gefäßaussprossung setzt sich aus zwei

Phasen zusammen: Wachstum und Stabilisierung neuer Gefäße. Während der

Initialphase verlaufen folgende Prozesse: Ablösung von der Basalmembran des

„Mutter“-Gefäßes und von der umgebenden interstitiellen Matrix, Migration der

Endothelzellen in den geschaffenen Raum durch angiogenetische Faktoren,

Proliferation der Endothelzellen hinter der migrierenden Front, Lumenformation von

Schleifen durch Anastomose der Gefäßsprosse. Die Stabilisierungsphase besteht

aus dem Stillstand der Endothelzellproliferation, Rekonstruktion der Basalmembran

um die neuen Kapillaren sowie Anlage und Bedecken der unreifen Kapillare mit

Perizyten.

Eine wichtige Rolle spielen verschiedene Wachstumsfaktoren. Diese

angiogenetischen Wachstumsfaktoren besitzten die Fähigkeit, Neovaskularisation in

vivo zu induzieren und können in vier Klassen gegliedert werden: vascular

12

endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived

growth factors (PDGF) und transforming growth factors (TGF) (Ahrendt 1998).

VEGF ist ein Endothel spezifisches Mitogen, das von spezifischen Zellen sezerniert

wird (z.B. retinale Zellen, Myokardzellen und Präadipozyten). Vier Isoformen von

VEGF werden exprimiert. Hypoxische Zustände, wie bei Ischämie, stimulieren die

Expression von VEGF aus verschiedenen Zellen und korrespondierenden VEGF-

Rezeptoren auf Endothelzellen. Sowohl auf zellulärer als auch auf Gewebeebene

steigert VEGF mikrovaskuläre Permeabilität und fördert die Extravasation des

Blutplasmas (Sato 1995).

Vier der fibroblast growth factors haben Einfluß auf Zellen des Gefäßsystems: FGF-1

(acidic oder aFGF), FGF-2 (basic oder bFGF), FGF-4 und FGF-5. Alle haben einen

mitogenen Effekt auf Endothelzellen. bFGF stimuliert Endothelzellproliferation und -

migration wird von den Endothelzellen produziert, um Perizyten zu rekrutieren.

PDGF ist ein potenter Stimulator für das Wachstum und die Motilität der Fibroblasten

und der glatten Muskelzellen, aber es wirkt auch auf Endothelzellen und Neurone.

PDGF wird von Thrombozyten, Endothelzellen und Muskelzellen synthetisiert.

TGF-β und seine Rezeptoren sind wichtige Regulatoren der Endothelzellproliferation

sowie für die Etablierung und Beständigkeit der Gefäßintegrität. Der Effekt von TGF-

β auf die Angiogenese beruht wahrscheinlich auf dem Rekrutieren von Makrophagen

und Fibroblasten, die angiogenetische Faktoren sezernieren. TGF-β fungiert

wahrscheinlich weiterhin als Stabilisator neu geformter Gefäße durch Rekrutieren

von glatten Muskelzellen und Perizyten sowie durch Förderung ihrer Proliferation.

TGF-β induziert PDGF-Expression durch Endothelzellen sowie VEGF und bFGF-

Expression in glatten Muskelzellen.

Weiterhin existieren fünf Angiopoeitinproteine: ANG-1, -2, -3, -4 und -5. Angiopoietin-

1 wird von periendothelialen Zellen exprimiert, während die anderen Angiopoietine

von anderen Zellen hergestellt werden, wie Zellen der umbilikalen Venen oder

fetalen Alveolarzellen (Satchell 2001). Angiopoietin-1 initiert und stabilisiert mittels

TIE-2-Rezeptoren das Gefäßwachstum (Stoeltzing 2002).

Im Tissue Engineering wird mit verschiedenen Angiogenesemodellen versucht,

diesen natürlichen Prozess für die Etablierung eines neuen Gewebes zu induzieren

und zu optimieren. Nicht-bradytrophes Gewebe kann nicht allein durch Diffusion

versorgt werden, wenn es mehr als 150-200 μm von der Blutversorgung entfernt ist

13

(Cassell 2002). Zumal Fettgewebe sehr gefäßreich ist; die Anzahl seiner Kapillaren

ist ungefähr 2-3 mal so groß wie die von Skelettmuskeln (Beahm 2003).

1.6. Zellmatrix Einer Zellmatrix sollten bestimmte Eigenschaften zueigen sein, damit die darin

befindlichen Zellen letztlich als Gewebesubstitut zurückbleiben. Die Matrix sollte als

zellulärer Anker sowie als formgebende Struktur für das Konstrukt dienen; weiterhin

sollte sie begünstigende mechanische und chemische Möglichkeiten besitzen. Die

Matrix muß bio- sowie zytokompatibel und biologisch abbaubar sein, vorhersehbare

Resorptionszeiten haben und nur vitales Gewebe zurücklassen. Es darf keine

toxischen Nebenprodukte produzieren, die die Morbidität des Empfängers erhöhen

könnte (Beahm 2003).

Es sollte eine adäquate Porengröße anbieten. Die optimale Porengröße variert je

nach Gewebe. 5 μm sind favorisiert für Neovaskularisation, 5 bis 15 μm steigert das

Einwachsen von Fibroblasten, und größere Porengrößen bis zu 500 μm werden

benötigt für das Überleben von transplantierten Zellen (Whang 1999). Idealerweise

sollte die Matrix mit wachstumssteigernden Faktoren ausgestattet sein, d.h. eine

Quelle für Wachstumsfaktoren sein, Rezeptoren und Adhäsionsmoleküle anbieten

können.

Folgende Matrizes wurden bislang für die Transplantation von Präadipozyten im

Tissue Engineering gebraucht:

Poly L-lactic-co-glycolic acid (PLGA) wurde mit autologen Präadipozyten subkutan in

Ratten transplantiert (Patrick 1999). Das Volumen des neugebildeten Fettgewebes

soll bis zum 2. Monat konstant geblieben sein und danach zu schrumpfen begonnen

haben; nach 5 Monaten war kein Gewebe mehr vorzufinden (Patrick 1999; Patrick

2002). Weiterhin wurden mit Hyaluronsäure und Hyaluronsäure modifizierte Träger

(HYAFF 11) mit humanen Präadipozyten in Mäusen für 3 und 8 Wochen verwendet

(von Heimburg 2001; Hemmrich 2005; Hemmrich 2006).

In unserem Versuchen wurde Fibrin DuoSM von Baxter als Zellmatrix verwendet.

Fibrin hat sowohl den Vorteil berechenbar bezüglich seiner Resorptionzeit zu sein als

auch angiogenetische Eigenschaften zu besitzen (Whang 1999; Cassell 2002).

Im Jahr 1909 gebrauchte Bergel erstmals trockenes Plasma als Quelle für Fibrinogen

und Fibrin Fleeze, um Hämostase zu bewirken (Bergel 1909). Young and Medawar

14

setzten Fibrin bei Nähten von peripheren Nerven im Tiermodel im Jahr 1940 ein

(Young 1940). 1944 benutzten Tidrick and Warner erstmals eine Zusammensetzung

aus Fibrinogen (20–50 g/l) und bovinem Thrombin, um bessere Ergebnisse bei

Hautlappen zu erreichen (Tidrick 1944). In den kommenden Jahrzehnten erfolgten

Weiterentwicklungen und klinische Studien zum Nutzen des Materials (Sprangler

1975; Radosevich 1997).

Das medizinisch genutzte Fibrin beinhaltet im Wesentlichen Fibrinogen, Thrombin,

Fibronektin, Faktor XIII, Aprotinin und Tranexamsäure (Buchtaa 2005; Mosesson

2005). Thrombin reguliert die Polymerisationsrate des Fibrins, indem es das

Fibrinogen in Fibrinmonomere spalten lässt, welche sich spontan quervernetzen.

Möglicherweise soll Thrombin auch mitogene Effekte auf Fibroblasten und

Endothelzellen ausüben (Sierra 1993). Fibronektin ist ein Glykoprotein, welches die

Adhäsion des Fibrinkonstruktes via Faktor XIII steigert. Außerdem soll Fibronektin

eine Rolle bei der Zellmigration spielen (Matras 1985). Aprotinin und Tranexamsäure

verlangsamen die Fibrinolyse. Desweiteren bietet Fibrin eine Bindungsaffinität für

bFGF (Browder T 2000). Bei teils aufgelöster Struktur kann Fibrin als Gleitschiene für

die Endothelzellmigration und die Röhrenformation der Kapillaren fungieren.

Allerdings finden sich während der Fibrinolyse auch Inhibitoren der Angiogenese, wie

z.B. Angiostatin und Plasmin. Angiostatin inhibiert Endothelzellproliferation und

Matrixmetalloproteinasen. Das Zusammenspiel angiogenetischer und

antiangiogenetischer Faktoren wird allerdings auch als notwendig für die

Gefäßentwicklung angesehen (Dallabrida S M 2000). Wenn z.B. Endothelzellen in

Fibrin ausgesät werden, organisieren sich die Endothelzellen zu kapillarähnlichen

Strukturen aufgrund der mechanischen Fähigkeiten und der angiogenetischen

Degradationsprodukte (Vailhe B 1997).

1.7. Fragestellung Diese Arbeit stellt die Weiterführung mehrerer vorangegangener Arbeiten dar. Diese

Arbeiten haben in In-vitro-, Semi-in-vivo- und kurzdauernden In-vivo-Versuchen

Präadipozyten, Fibroblasten, HDMVEC sowie verschiedene Matrizes bezüglich ihres

Potenzials für die Weichteilsubstitution untersucht. Die vorangegangenen Arbeiten

sowie diese haben als Ziel, ideale Weichteilgewebeäquivalente für eine mögliche

15

zukünftige kinische Anwendung zu entwickeln. In diesem Rahmen stellte sich

folgende Fragestellung:

• Mit Hilfe einer Versuchsgruppe mit Präadipozyten in Fibrin und einer

Versuchsgruppe mit Fibroblasten in Fibrin sollte ermittelt werden, inwiefern

sich diese nach 4 Wochen, 3 Monaten und 6 Monaten qualitativ und

quantitativ unterscheiden. In der Dissertation von Dr. Tegtmeier aus der

gleichen Arbeitsgruppe wurden die optimalen Kulturmedien und die

Trägermatrix für Präadipozyten eruiert (Tegtmeier 2004). Ebenso wurde dies

bereits für Fibroblasten im Labor ZKF untersucht. Allerdings wurden

Tierversuche mit Fibroblasten und Präadipozyten in Fibrin nur für einen

Zeitraum von 4 Wochen durchgeführt und ihre Ergebnisse wurden nicht

miteinander in einer Studie verglichen. Ein längerer Zeitraum ist insofern

bedeutsam, da in der Literatur nach 3-5 Monaten ein stetiger Rückgang des

Volumens der Implantate beschrieben wird (Patrick 1999).

• Der Vergleich einer Versuchsgruppe aus HDMVEC als Sphäroide und

koimplantierten Präadipozyten in Fibrin mit einer Versuchsgruppe aus

Präadipozyten in Fibrin soll zeigen, ob die HDMVEC als Sphäroide

wesentliche Effekte auf die Vaskularisierung und die Differenzierung der

Präadipozyten haben. In Vorarbeiten wurden bereits in einem In-vivo-Versuch

an athymischen Nacktmäusen Koimplantation von HDMVEC mit

Präadipozyten in Fibrin durchgeführt, um die Vaskularisierung und

Differenzierung der Implantate zu verbessern. Jedoch wurden die HDMVEC

nicht als Sphäroide hinzugegeben, sondern als Zellsuspension. In einem

neuen Ansatz mit Hilfe von Sphäroiden wurden die Auswirkungen auf die

Konstrukte, bestehend aus Präadipozyten in Fibrin, untersucht. In einem

Chorionallantois-Membran (CAM) – Zylindermodell sowie an maximal 2

Wochen dauernden Tierversuchen wurde eine verbesserte Vaskularisierung

der Implantate mit HDMVEC-Sphäroiden gegenüber den Implantaten ohne

HDMVEC-Sphäroide vorgefunden (Torio-Padron 2003; Müller 2005).

• Durch die Gegenüberstellung einer Mehrfachinjektion gegenüber einer

Einfachinjektion von Präadipozyten in Fibrin soll ersichtlich werden, ob ein

besseres Ergebnis hinsichtlich des Volumenersatzes bewirkt werden kann. In

anderen Arbeiten wird zahlreich beschrieben, dass erst nach mehrfacher

16

Injektion eines Substitutes mit oder ohne Zellen, wie Kollagen, Isolagen® oder

autologer Fetttransplantation, ein Volumenersatz für einen längeren Zeitraum

erzielt wird (Homicz 2004).

• Letztlich soll auch geklärt werden, ob eine höhere Präadipozytenanzahl in

Fibrin einen beständigeren und größeren Volumenersatz bewirken kann. In

Vorversuchen wurde die Präadipozytenzahl im Verhältnis zur Fibrinmenge

variiert und die in Gruppe 1 verwandte Relation von Präadipozyten zu Fibrin

als das optimale Verhältnis evaluiert. Auch stellt sich die Frage, ob dieses

Verhältnis für längere In-vivo-Versuche ebenso anzunehmen ist.

17

2. Material und Methoden Sämtliche Arbeiten wurden, sofern nicht anderweitig beschrieben, im Tissue

Engineering Labor der Abteilung Plastische und Handchirurgie bzw. im

Gebäudekomplex der Zentralen Klinischen Forschung der Universität Freiburg i. B.,

Breisacherstr. 66, 79106 Freiburg, durchgeführt. Die Arbeiten wurden in Steriltechnik

an einer Reinraumwerkbank durchgeführt. Zellkulturen wurden, soweit nicht

ausdrücklich davon abweichend beschrieben, im Brutschrank bei 37°C. und 5% CO2

inkubiert.

2.1 Zellkultur

2.1.1. Präadipozyten-Isolation Reagentien: PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Fungizone: Amphotericin B 250 µg/ml (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15290-026, Carlsbad, USA) Penicillin/Streptomycin, 10.000 I.E./ml Penicillin G Natriumsalz, 10.000µg/ml Streptomycin Sulfat in 0.85% NaCl (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15140-122, Carlsbad, USA) Kollagenase II (Fa. Sigma, Cat. No. 6885, Deisenhofen, Deutschland) D(+)-Glucose, C6H12O6 Mr= 180.16 g/Mol (Fa. Merck Cat. No. 8337.1000, Darmstadt, Deutschland) BSA, Fraktion V, Pulver, Quelle: Rinderblut (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 11018-025, Carlsbad, USA) HEPES-Pufferlösung 1M (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15630-056, Carlsbad, USA) Tris (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15504-012, Carlsbad, USA) NaCl (Fa. Merck, Cat. No. 159-302-500, Darmstadt, Deutschland) KCl (Fa. Merck, Cat. No. 104935, Darmstadt, Deutschland) CaCl2 (Fa. Merck, Cat. No. 102880, Darmstadt, Deutschland) MgSO4 * 7H2O (Fa. Merck, Cat. No. 105882, Darmstadt, Deutschland) NaH2PO4 (Fa. Merck, Cat. No. 106370, Darmstadt, Deutschland) Na2HPO4 (Fa. Merck, Cat. No. 106585, Darmstadt, Deutschland) NH4Cl (Fa. Merck, Cat. No. 101142, Darmstadt, Deutschland) Endothelial Cell Growth Medium MV (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV, nach Zugabe des Supplement-Mix zum ECGM MV beinhaltete das Medium: FBS 5%, Endothelial Cell Growth Supplement / Heparin 0.004ml/ml, rhuEGF (Epidermal Growth Factor) 10ng/ml, Hydrocortison 1μg/ml, Gentamycinsulfat 50μg/ml, Amphotericin B 50ng/ml und Phenol Rot 0.62ng/ml Medium) Humane Präadipozyten wurden nach einem modifizierten Präparationsprotokoll nach

Hauner et al. (Hauner 1989) aus subkutanem Fettgewebe isoliert. Sämtliche zur

Präparation verwendeten Instrumente und Flüssigkeiten lagen steril vor. Zur Isolation

verwendete Fettgewebsbiopsien stammten von einem Patienten im Alter von 46

Jahren, der sich einer elektiven plastischen Abdominoplastik unterzogen hatte. Der

Patient hatte zuvor sein Einverständnis zur wissenschaftlichen Verwendung des

resezierten Gewebes gegeben. Das Gewebe wurde unter sterilen Bedingungen

entnommen und in sterilen Behältern in PBS, versetzt mit 1% Penicillin /

Streptomycin und 1% Amphotericin B, in das Tissue Engineering Labor verbracht.

18

Primärzellkulturen wurden durch mechanische und enzymatische Dissoziation des

Fettgewebes gewonnen.

In Steriltechnik wurde dabei das Gewebe zunächst manuell zerkleinert, begleitendes

Bindegewebe reseziert und die Gewebeproben in PBS gewaschen, um

kontaminierendes Blut zu entfernen. 25-30g zerkleinerte Fettgewebestücke wurden

in ein 50ml Falcon Tube mit 20ml 3.5%iger Albumin-Phosphatpuffer-Lösung (NaCl

135mM, KCl 4.7mM, CaCl2 2.5mM, MgSO4 7H2O 1.25mM, NaH2PO4 1.25mM,

Na2HPO4 1,25mM, HEPES 10mM, pH 7.4), 0.5mg/ml D-Glucose und 2mg/ml

Kollagenase II überführt und für verschiedene Zeitintervalle in einem

Schüttelwasserbad bei 37.0°C. inkubiert. Jeweils in Zeitabständen von 15-30

Minuten wurden die Digestionsansätze mittels eines Reagenzglasschüttlers gründlich

durchmischt. Das Digestat wurde zentrifugiert (1100 U/min, 10min, 21.0°C.) und der

mehrschichtige Überstand über dem Zellpellet verworfen. Das Zellpellet wurde für

10min in 20ml Lyse-Puffer resuspendiert (Tris 17mM, NH4Cl 16mM in Aq. bidest.),

um die Blutkontamination des aufgearbeiteten Gewebes weiter zu reduzieren.

Anschließend wurde erneut zentrifugiert. Der Überstand über dem resultierenden

Zellpellet wurde verworfen, das Zellpellet in 20ml PBS resuspendiert und mittels

eines Zellsiebes filtriert (Falcon Cell Strainer, 70μm Porengröße). Nach einem

erneuten Zentrifugationsschritt wurde das Zellpellet in Endothelial Cell Growth

Medium MV (ECGM), welchem 100 U/ml Penicillin, 0.1mg/ml Streptomycin und

2.5μg/ml Amphotericin B zur Infektionsprophylaxe zugesetzt sowie Fetales Bovines

Serum (FBS, Hitzeinaktivierung des Komplementsystems bei 56°C. im Wasserbad

über 30 Minuten) zu 10% des Serumanteil im Medium zur Serumsupplementierung

hinzugefügt wurde, resuspendiert, die Zellzahl mittels eines Hämozytometers bzw.

eines Zählautomaten bestimmt und die Zellen mit einer Zelldichte von

2.7x104Zellen/cm2 in einer P75-Kulturflasche ausgesät. Die gesamte Präparation

wurde dabei mittels eines standardisierten Protokolls dokumentiert.

19

2.1.2. CASY-Zellmessung Reagentien: CASY1 Cell Counter + Analyser System Model TT (Schärfe System, Reutlingen, Germany) CASYTON isotone Salzlösung (Schärfe System, Cat. No. 043-90037P Reutlingen, Germany)

Die CASY 1 Technologie von Schärfe System verbindet Verfahren der

Partikelmesstechnik, das „Widerstandsmessprinzip“, mit einer Methode der

Signalauswertung, der „Pulsflächenanalyse“. Zur Messung werden die Zellen in einer

schwachen Elektrolytlösung resuspendiert und mit konstanter

Strömungsgeschwindigkeit durch eine Kapillare definierter Geometrie gesaugt.

Hierzu wird das Zellpellet in 10ml Zellmedium verdünnt und von dieser

Zellsuspension wurden wiederum 100μl entnommen. Die 100μl-Lösung wurde in

10ml isotone Salzlösung CASYTON verdünnt und diese mittels CASY 1 Cell Counter

+ Analyser System Model TT ausgewertet.

2.1.3. Kultivierung und Passagierung von Präadipozyten Reagentien: FBS: Foetal Bovine Serum (fetales Kälberserum), Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Fungizone: Amphotericin B 250 µg/ml (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15290-026, Carlsbad, USA) Endothelial Cell Growth Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV, nach Zugabe des Supplement-Mix zum ECGM MV beinhaltete das Medium: FBS 5%, Endothelial Cell Growth Supplement / Heparin 0.004ml/ml, rhuEGF (Epidermal Growth Factor) 10ng/ml, Hydrocortison 1μg/ml, Gentamycinsulfat 50μg/ml, Amphotericin B 50ng/ml und Phenol Rot 0.62ng/ml Medium) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Penicillin/Streptomycin, 10.000 I.E./ml Penicillin G Natriumsalz, 10.000µg/ml Streptomycin Sulfate in 0.85% NaCl (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15140-122, Carlsbad, USA) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) Trypanblau (Fa. Sigma, Cat. No. T 8154, Deisenhofen, Deutschland) Die Primärkulturen von Präadipozyten wurden in einer Zelldichte von 2.7x104

Zellen/cm2 in einer P75-Kulturflasche ausgesät. Die Zellkulturen wurden mit einem

Volumen von vorbehandelten 12-15ml Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM)

überschichtet, wie dies bereits in dem Abschnitt 2.1.1. beschrieben wurde. Nach ca.

12h wurde das Zellkulturmedium mit nicht adhärenten Zellen abgezogen, die

Kulturflasche durch Zugabe von 10ml PBS unter vorsichtigem Schütteln für 1-2

Minuten gespült und erneut mit Zellkulturmedium überschichtet. Ein Mediumwechsel

wurde jeden zweiten Tag durchgeführt. Bei Erreichen einer Konfluenzrate der

Zellkultur von 85-95% wurde diese passagiert. Primärkulturen wurden dabei als p0-

Kultur bezeichnet, folgende Kulturenpassagen als p1, p2, usw.. Nach Abziehen des

Kulturmediums wurde die Zellkultur zunächst mit PBS gespült, um zurückgebliebene

Serumbestandteile zu eliminieren. Einer Zellkultur wurden 2ml einer auf 37.0°C.

20

vorgewärmten Trypsin-Lösung zugesetzt und die Zellkultur für die Dauer der

Dissoziationszeit der Zellen von 3-5min im Brutschrank inkubiert. Die Trypsinwirkung

wurde phasenkontrastmikroskopisch kontrolliert, die abgerundeten Zellen durch

intermittierendes Klopfen an die Unterseite der Kulturflasche abgelöst und die

Trypsinwirkung durch Zugabe von 8ml einer 10%-igen FCS-PBS-Lösung gestoppt.

Lose anhaftende Zellen wurden mit PBS abgespült. Die resultierende Zellsuspension

wurde in ein Falcon Tube überführt, abzentrifugiert (1100 U/min, 21.0°C., 10 Minuten

Dauer), der resultierende Zellpellet in 10 ml Zellkulturmedium resuspendiert und die

Zellzahl mittels eines CASY-Zellzählers bestimmt. Im Anschluss wurde die

passagierte Zellkultur mit einer Zelldichte von 1.0-2.0x104 Zellen/cm2 ausgesät.

2.1.4. Präadipozyten-Differenzierung Reagentien: Dexamethason ( 9a-Fluoro-16a-Methylprednisolon) (Fa. Sigma, Cat. No. D 4902, Deisenhofen, Deutschland, Stocklösung 5mg/ml (860µM): 7.5mg + 1.5ml Aq. bidest. + 15 µl Eisessig) Endothelial Cell Basal Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22220, Heidelberg, Deutschland, keine Zusätze von Wachstumsfaktoren o. Serum) Insulin, human, rekombinant, Quelle: E. coli, approx. 28 USP Einheiten/mg (Fa. Sigma, Cat. No. I 0259, Deisenhofen, Deutschland, Stocklösung 1mM: 3.9mg + 10ml Ethanol absolut) Mehylisobutylxanthin (3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX)) (Fa. Sigma, Cat. No. I 7018, Deisenhofen, Deutschland, Stocklösung 25 mM: 11mg + 1ml Aqua bidest + 1ml Ethanol absolut) Eisessig (Essigsäure, Fa. Merck, Cat. No. 100056, Darmstadt, Deutschland) Zur Ausdifferenzierung kultivierter Präadipozyten zu Adipozyten wurden konfluente

Zellkulturen mit einem Differenzierungsmedium, basierend auf DMEM/Ham´s F-12

Medium (Mischungsverhältnis 1:1, Bezeichnung dieses Differenzierungsmediums im

folgenden als Medium B) bzw. ECBM behandelt. Diesen wurden 3% FBS, 100nM

Insulin, 1μM Dexamethason und für die ersten drei Tage der Differenzierung 0.2mM

Methylisobutylxanthin beigefügt. Die Stocklösungen wurden aliquotiert, bei -20°C.

gelagert und bei Bedarf aufgetaut. Das Differenzierungsmedium wurde für jede

Differenzierungsreihe frisch angesetzt. Ein Mediumwechsel wurde jeden zweiten Tag

durchgeführt, wobei vorsichtig 50% des Mediumüberstandes abgezogen und ersetzt

wurde. Ein vollständiger Mediumwechsel führte zur Ablösung der differenzierten

Adipozyten von der Kulturflaschenoberfläche. Die Zelldifferenzierung wurde,

entsprechend dem Protokoll, über einen Zeitraum von 16 Tagen durchgeführt.

Hierbei wurde der Vergleich anhand der Morphologie sowie der

Differenzierungsfähigkeit hinsichtlich der Bildung von Fettvakuolen durch Färbung mit

Oil-red-O durchgeführt.

21

2.1.5. Isolation human dermal mikrovaskulärer Endothelzellen (HDMVEC) Reagentien: Dynabeads®M450 (Ziege-anti-Maus IgG, zusätzliche Materialien; DYNAL MPC (Magnetvorrichtung), Dynal Mixers (Mischvorrichtung), Fa. Dynal, Cat. No. 110.05, Hamburg, Deutschland) FBS: Foetal Bovine Serum (fetales Kälberserum), Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Fungizone: Amphotericin B 250 µg/ml (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15290-026, Carlsbad, USA) Endothelial Cell Growth Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV, nach Zugabe des Supplement-Mix zum ECGM MV beinhaltete das Medium: FBS 5%, Endothelial Cell Growth Supplement / Heparin 0.004ml/ml, rhuEGF (Epidermal Growth Factor) 10ng/ml, Hydrocortison 1μg/ml, Gentamycinsulfat 50μg/ml, Amphotericin B 50ng/ml und Phenol Rot 0.62ng/ml Medium) Monoclonal Mouse Anti-Human Endothelial Cell, CD 31 (Klon JC/70A, Maus IgG1, Fa. Dako, Cat. No. M 0823, Carpinteria, USA) Penicillin/Streptomycin, 10.000 I.E./ml Penicillin G Natriumsalz, 10.000µg/ml Streptomycin Sulfate in 0.85% NaCl (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 15140-122, Carlsbad, USA) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich)

Humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMVEC) wurden aus Dermis

mehrerer Spender isoliert. Eine Mischzellkultur eines Dermisbiopsates wurde durch

Trypsin-Digestion, mechanische Separation, Zellfiltration und Zentrifugation nach

einem modifizierten Protokoll nach Hewett et al. (Hewett PW 1993; Hewett PW 1996)

gewonnen, in Endothelial Cell Growth Medium resuspendiert und in Gelatine

beschichteten Kulturflaschen (T25) mit einer Zelldichte von 3.5x104Zellen/cm2

ausplattiert. Das verwendete Endothelial Cell Growth Medium wurde bei allen

Anwendungen vorbehandelt, wie dies auch bei der Isolierung und Kultivierung der

Präadipozyten die Regel war. Bei Konfluenz der Mischzellkultur wurden humane

dermale mikrovaskuläre Endothelzellen unter Verwendung eines Maus-anti-human

CD31 (PECAM1) Antikörpers sowie eines Dynabeads®M450 Systems (Ziege-anti-

Maus IgG gekoppelt an Magnetperlen (magnetic beads)) aus der Mischzellkultur

isoliert und in ECGM kultiviert.

22

2.1.6. Kultivierung und Passagierung von HDMVEC Reagentien: Zellkulturmedien (s.o.) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) Trypanblau (Fa. Sigma, Cat. No. T 8154, Deisenhofen, Deutschland) Endothelial Cell Growth Medium MV (für mikrovaskuläre Endothelzellen) (Fa. Promocell, Cat. No. C-22020, Heidelberg, Deutschland, enthält 1x C-22020 Endothelial Cell Growth Medium MV + 1x C-39225 Supplement-Mix/ Endothelial Cell Growth Medium MV) Die Kultivierung und Passagierung der HDMVEC erfolgte auf ähnliche Weise wie die

Kultivierung und Passagierung der Präadipozyten. Bei 80-90% Konfluenz der

Endothelzellkultur wurden die Zellen passagiert. Nach Abziehen des Kulturmediums

und anschließender Spülung mit PBS wurden der Zellkultur 1.0-1.5ml auf 37°C.

vorgewärmtes Trypsin zugegeben. Die Kulturflasche wurde ca. 10 Mal langsam

gewendet, um eine gleichmäßige Benetzung der Zellkultur mit Trypsin zu erzielen. Im

Anschluß wurden 50% des Trypsins wieder abgezogen. Unter Beobachtung durch

ein Zellkulturmikroskop wurde abgewartet, bis sich ca. 90-95% der Endothelzellen

abgerundet und diese durch intermittierendes Klopfen vom Boden der

Zellkulturflasche gelöst hatten. Die Zellen wurden in 10ml ECGM resuspendiert, um

die Trypsinwirkung zu stoppen. Die Zellsuspension wurde anschließend in ein 50ml

Falcon Tube überführt, die Kulturflasche mit 5ml ECGM nachgespült und die

Zellsuspension zentrifugiert (1000 U/min, 4°C., 8min). Das resultierende Pellet wurde

in 5ml ECGM resuspendiert, die Zellzahl ausgezählt (s. 2.1.2.) und die

Zellsuspension mit einer Zelldichte von 1.0-1.2x104Zellen/cm2 in Gelatine-

beschichteten Kulturflaschen (P75) ausplattiert.

2.1.7. HDMVEC Sphäroid-Kulturen Reagenzien: Endothelial Cell Basal Medium MV (Fa. Promocell, Cat. No. C-22210, Heidelberg, Deutschland) FCS Rundboden-96-Vertiefungen-Platte (Fa. Greiner, Cat. No. 650185, Frickenhausen, Deutschland) Carboxymethylcellulose (Fa. Sigma, Cat. No. M-0512, Steinheim, Deutschland) Sphäroide wurden nach einem modifizierten Protokoll nach Korff et al. hergestellt

(Korff 1998). Dazu wurden in 500 ml Methocel-Konzentrat 6g Carboxymethylcelluose

in 250 ml, auf 60 °C erhitztem, Endothelzellbasalmedium (ECBM) gelöst. Diese

Lösung wurde mit 250 ml ECBM, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin/Streptomycin und

Fungizone beinhaltend, gemischt und bei 4°C für 2 Stunden gerührt. Die

resultierende, geleeartige Lösung wurde bei 5000 g für 4 Stunden zentrifugiert. Der

klare Überstand wurde abgenommen und anschließend für die Versuche verwendet.

23

Endothelzellen einer hochkonfluenten Kultur wurden trypsiniert, die Zellzahl bestimmt

und eine definierte Menge in methocelhaltiges Medium (20% Methocel-Konzentrat,

80 % basales ECBM + 10% FCS) eingebracht, so dass eine Konzentration von 2200

HDMVECs pro 150 μl erreicht wurde. 150 μl der Zellsuspension wurden in jede

Vertiefung einer nicht-adhärenten Rundboden-96-Vertiefungen-Platte gebracht und

bei 37°C (5% CO2, 100% Luftfeuchtigkeit) kultiviert. In jeder Vertiefung bildet sich ein

Sphäroid, bestehend aus ca. 2200 Zellen. Waren die Sphäroide am dritten oder

vierten Tag nach Beginn der Inkubation kugelförmig, wurden sie mit dem Medium

mittels einer Eppendorf-Pipette in ein 50 ml Falcon-Tube transferiert, 3 Minuten bei

350 g zentrifugiert und für die Implantation genutzt. Pro Konstrukt wurden 1 Million

HDMVECs bzw. ca. 454 Sphäroide verwendet.

2.1.8. Isolation von Fibroblasten Reagentien: DMEM (1x) High Glucose (für dermale Fibroblasten) (PAA Laboratories Cat. No. E15-810GmbH Pasching, Austria) ohne Sodium Pyruvat, mit L-Glutamin, Endotoxin getestet, Dispase (Gibco Invitrogen Corporation, Cat.No. 17105-041, Karlsruhe, Deutschland) Ethanol (Fa.J.T. Baker Cat. No. 8006) Kollagenase II (Fa. Sigma, Cat. No. 6885, Deisenhofen, Deutschland) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Die Fibroblasten wurden aus der Haut gewonnen, die bei einer Dermolipektomie

einer Patientin im Alter von 42 Jahren zur Verfügung gestellt wurden. Zuerst wurde

die Subkutis abpräpariert. Daraufhin wurde die Haut abwechselnd mit 70%igen

Alkohol und PBS gesäubert. Die gesäuberte Haut wurde in 1% Dispase über Nacht

bei 4°C und anschließend weitere 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

Dann wurde die Epidermis mit Hilfe einer Pinzette abgelöst. Die restliche Dermis

wurde in kleine Stücke geschnitten und im Anschluß in Kollagenase Typ II für 2

Stunden im Schüttelbad verdaut. Der flüssige Überstand wurde durch ein

Zellnylonnetz filtriert und 10 Minuten lang bei 1200 u.p.m und 4 °C zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in DMEM-Kulturmedium

resuspendiert. Die Zellzahl wurde mittels eines Hämozytometers bzw. eines

Zählautomaten bestimmt und die Zellen mit einer Zelldichte von 2.7x104Zellen/cm2 in

einer P75-Kulturflasche ausgesät. Die gesamte Präparation wurde dabei mittels

eines standardisierten Protokolls dokumentiert.

24

2.1.9. Kultivierung und Passagierung von Fibroblasten Reagentien: Zellkulturmedien (s.o.) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) FBS: Foetal Bovine Serum (fetales Kälberserum), Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) Trypanblau (Fa. Sigma, Cat. No. T 8154, Deisenhofen, Deutschland) Nachdem die isolierten Fibroblasten mit einer Zelldichte von 2.7x104 Zellen/cm2 in

einer P75-Kulturflasche verteilt wurden, wurden die Zellen mit 12-15ml Kulturmedium

überschichtet. Nach ca. 12h wurden die nicht adhärenten Zellen entfernt mittels 10ml

PBS unter vorsichtigem Schütteln für 1-2min und erneuter Zugabe von

Zellkulturmedium. Ein Mediumwechsel wurde jeden 2.Tag durchgeführt. Wenn die

Zellkultur zu 85-95% konfluierte, erfolgte eine erneute Passagierung. Das

Kulturmedium wurde abgezogen und die Zellkultur zunächst mit PBS gespült, um

zurückgebliebene Serumbestandteile zu eliminieren. Die Zellkultur wurde mit einer

2ml auf 37.0°C. vorgewärmter Trypsin-Lösung für die Dauer einer Dissoziationszeit

von 3-5min im Brutschrank inkubiert. Die Ablösung der Zellen wurde durch das

Trypsin mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskopes beobachtet. Die abgerundeten

Zellen vorsichtig von der Unterseite der Kulturflasche abgeklopft. Daraufhin wurde

8ml einer 10%-igen FCS-PBS-Lösung zu den trypsinierten Fibroblasten

hinzugegeben, um den dissoziierenden Effekt des Trypsins zu stoppen. Die

abgelösten Zellen wurden durch eine Pipette aus der Kulturflasche in ein Falcon

übertragen. Die erhaltene Zellsuspension wurde abzentrifugiert (1100 U/min,

21.0°C., 10min Dauer). Aus der Zentrifugation resultierte ein Zellpellet, welches in

10ml Zellkulturmedium resuspendiert und dessen Zellzahl mittels des CASY-

Zellzählers bestimmt wurde. Im Anschluss wurde die passagierte Zellkultur mit einer

Zelldichte von 1.0-2.0x104 Zellen/cm2 ausgesät.

25

2.1.10. Kryokonservierung von Zellen Reagentien: DMSO (Dimethylsulphoxid, Fa. Sigma, Cat. No. D 2650 , Deisenhofen, Deutschland) FBS: Foetal Bovine Serum, Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Zur Kryokonservierung von Zellkulturen wurde zunächst entsprechend dem Protokoll

zur Zellpassagierung vorgegangen. Nach erfolgter Zellauszählung wurden die Zellen

erneut zentrifugiert (1100 U/min, 4°C., 10min) und in auf 4°C. temperierten

Einfriermedium (Zellkulturmedium mit 50% FBS Anteil) mit einer Zielzellkonzentration

von 3.6-4.0x106Zellen/ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in Cryo Tubes

aliquotiert (500μl Zellsuspension, ≅ 1.8–2.0x106 Zellen) und mit 500μl

Einfriermedium, 20% DMSO beinhaltend, überschichtet. Die Endkonzentration von

DMSO betrug 10% (vol/vol). Aliquotierung und Überschichtung wurden auf Eis

durchgeführt und die Zellproben in einem Nalgene® Cryo 1°C Freezing Kontainer bei

–80°C eingefroren. Hierdurch ließ sich ein langsames Einfrieren der Zellen (1°C./min)

erzielen. Nach 24h wurden die Zellproben in flüssigen Stickstoff für eine bis zu

einjährige Lagerung überführt.

2.1.11. Auftauen kryokonservierter Zellen Reagentien: FBS: Foetal Bovine Serum, Herkunftsland: Australien (Fa. GIBCO BRL, Cat. No. 10099-141, Carlsbad, USA) Zellkulturmedien (s.o.) Die Cryo Tubes mit den Zellproben wurden bis zum Auftauen auf Eis gelagert. Die

Zellproben wurden im Wasserbad bei 37.0°C. unter leichtem Schwenken (Dauer: 40-

50s) aufgetaut bis nur noch ein stecknadelkopfgroßes Eisklümpchen zurückblieb.

Anschließend wurden sie sofort in 20ml Kulturmedium (20-50% FBS-Anteil)

resuspendiert, um eine Verdünnung des zytotoxischen DMSO zu erzielen. Nach

Zentrifugation (1100 U/min, 21°C., 10min) wurden die Zellen in 12-15ml

Kulturmedium resuspendiert und in einer Zellkulturflasche (P75) mit einer Zelldichte

von ca. 1.8-2.6x104Zellen/cm2 ausplattiert. Nach 24h wurde das Kulturmedium mit

nicht adhärenten Zellen abgezogen, die Kulturflasche mit PBS gespült und erneut mit

Kulturmedium überschichtet.

26

2.2. Histologie

2.2.1. Doppelfärbung Hämalaun-Eosin (HE) Reagentien: Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Roti®Histokit (Fa. Roth, Cat. No. 6638.1, Karlsruhe, Deutschland) Rotihistol (Fa. Roth, Cat. No. 6640.1, Karlsruhe, Deutschland) Mayer´s Hämalaun (Fa. Merck, Cat. Nr. 1092490500, Darmstadt, Deutschland) Eosin (Fa. Shandon Inc., Cat. Nr. 6766007, Pittsburgh, USA) 2-Propranol (Fa. Merck, Cat. No. 159191, Darmstadt, Deutschland) Die HE-Färbung ist eine einfache, rasch durchzuführende Übersichtsfärbung. Es

wurde nach folgendem Arbeitsprotokoll vorgegangen:

1. Hämalaun-Färbung, Dauer: 2 min

2. Bläuen des Präparates, Dauer: 2x5min H2O (Temperatur: 21°C.)

3. Eosin-Gegenfärbung, Dauer: 90s

4. Differenzierungsreihe:

5. 70%iger Alkohol, Dauer: 30 s (Propranolol)

6. 80%iger Alkohol, Dauer: 60 s (Propranolol)

7. 96%iger Alkohol, Dauer: 60 s. (Propranolol)

8. 99%iger Propranolol, Dauer: 60 s

9. Rotihistol (variable Länge)

10. Eindeckeln mit Roti®Histokit

2.2.2. Oil-red-O-Färbung Reagentien: Oil-Red-O (C.I. 26125, Solvent Red 27, C62H24N4O) (Fa. Sigma, Cat. No. O-0625, Deisenhofen, Deutschland) Kaisers Glyceringelatine (kaiser´s glycerol gelatin, Fa. Merck Cat. No. 1.09242.0100, Darmstadt, Deutschland) Aquatex (Fa. Merck, Cat. 1.08562, Darmstadt, Deutschland) Formaldehydlösung min. 37% pro analysi (Fa. Merck, Cat. No. 1.04003.1000, Darmstadt, Deutschland) Mayer´s Hämalaun (Fa. Merck, Cat. Nr. 1092490500, Darmstadt, Deutschland) CaCl2 (Fa. Merck, Cat. No. 102880, Darmstadt, Deutschland) Die Oil-red-O-Färbung ist eine Färbung zur allgemeinen Lipiddarstellung. Der

Färbemechanismus beruht auf der besseren Löslichkeit des Fettfarbstoffes in den

Lipiden des Gewebes gegenüber dem Lösungsmittel, in dem es angeboten wird.

Empfohlen wird die Verwendung von Gefrierschnitten von in Bakers Formol-Kalzium

fixiertem Material, obwohl auch mit dieser Methode eine Fixierung der Lipide nicht

garantiert werden kann. Es wurde nach einem Arbeitsprotokoll nach Romeis

vorgegangen:

27

Herstellung von Formol-Kalzium nach Baker: 1. Lösen von 1g CaCl2 in 80ml Aq. bidest.

2. Zugabe von 10ml Formol (ca. 37%)

3. Neutralisation durch Zugabe von Ca2HCO3

Herstellung der Oil-red O-Färbelösung:

1. Herstellung einer Stammlösung: Lösen von 0.5g Oil-red-O in 100ml 99%igem

Isopropylakohol

2. Herstellung der Gebrauchslösung: Mischung von 6 Teilen der Stammlösung

mit 4 Teilen Aq. bidest.

3. Stehen lassen der Gebrauchslösung für 24h und anschließende Filtration

Oil-red-O-Färbung:

1. Trocknung der unfixierten Gefrierschnittpräparate

1. Spülung der Gefrierschnittpräparate bzw. der Zellkulturen in Chamber Slides

(vorherige Fixierung mit Bakers Formol-Kalzium) in H2O

2. Einbringen in 60%igen Isopropylalkohol, Dauer: 5min

3. Färbung in frisch filtrierter Oil-red-O-Gebrauchslösung, Dauer: 10-12min

4. Differenzierung in 60%igen Isopropylalkohol, Dauer: 4-6s

5. Auswaschen in Aq. bidest.

6. Kernfärbung mit Mayer´s Hämalaun, Dauer: 1-2min

7. Abspülen mit Aq. bidest. und Bläuen unter fließendem Wasser, Dauer: 5-

10min

8. Eindeckeln mit Kaisers Glyceringelatine oder Aquatex

Nach erfolgter Färbung stellen sich Lipide kräftig rot, Kerne blau dar.

28

2.2.3. Sudanrot-IV-Färbung SudanIV Sigma-Aldrich Chemie GmbH Cat. No. 064K3710 Steinheim, Germany Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Kaisers Glyceringelatine (kaiser´s glycerol gelatin, Fa. Merck Cat. No. 1.09242.0100, Darmstadt, Deutschland) Aceton pro anlysi ( CH3COCH3) (Fa. Merck, Cat. No. 1000141011, Darmstadt, Deutschland) Die Sudanrot-IV-Färbung stellt eine Alternative zur Oil-red-O-Färbung dar. Neutrales

Fett wird hierbei orange bis orangerot und Kerne blau angefärbt. Es werden

Gefrierschnitte mit einer Schnittdicke von 7-9μm verwendet. Eine Gegenfärbung

erfolgt mit Hämalaun nach Mayer.

Ansezten der Färbelösungen - Sudanrot:

Je 1 g von trockenem Sudan IV in einer trockenen Flasche mischen. 200 ml der

Herxheimer Mischung (= gleiche Teile 70%iger Alkohol und Aceton) zugeben und gut

schütteln.

Einige Tage ruhen lassen.

Färbetechnik:

1. 70%iger Alkohol 5 Min.

2. Sudanmischung 1 Min.

3. 50%iger Alkohol, um die Reaktion zu stoppen

4. 70%iger Alkohol

5. kurz in Brunnenwasser spülen

6. Hämalaun nach Mayer 2 Min.

7. Bläuen in kaltem Brunnenwasser 10 Min.

8. Eindeckeln (Kaiser Glyceringelatine)

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2.2.4. Elastica-Van Giesson Reagentien: GIEMSA: Accustain GIEMSA Stain Modified (Fa. Sigma, Cat. No. GS-500) Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Rotihistol (Fa. Roth, Cat. No. 6640.1, Karlsruhe, Deutschland) Die Elastika van Gieson- Färbung wurde mit dem Accustain GIEMSA Stain Modified

durchgeführt. Die Gewebeschnitte werden mit einer Hämatoxylin-Jod-Eisen-(III)-

Chloridlösung gefärbt. Der positive geladene Farblack wird an das stark saure

Elastomuzin, eine Komponente der elastischen Fasern, angelagert. Anschließend

wird differenziert und mit einer van Gieson-Lösung gegengefärbt.

Herstellung der Lösungen:

1. 20 ml alkoholische Hämatoxylinlösung (Cat. No. HT25-1)

2. 3 ml Eisen-(III)-chlorid-Konzentrat (Cat. No. HT25-2)

3. 8 ml Jodlösung nach Weigert (Cat. No. HT25-3)

4. 5 ml Aq. dest.

5. Gut mischen

Differenzierungslösung:

1. 37 ml Aqua dest.

2. 3 ml Eisen-(III)-chlorid-Konzentrat (Cat. No. HT25-2)

3. gut mischen, täglich frisch ansetzen

Färbevorschrift

1. Entparaffinierte Schnitte in Aqua dest.

2. Färbelösung 10 Min.

3. Aqua dest. gut spülen

4. Differenzierung einige Sek.

5. Leitungswasser, fließend 5 Min.

6. 95% Alkohol kurz spülen

7. Aqua dest. kurz spülen

8. van Gieson-Lösung 2 min.

9. 95% Alkohol kurz spülen

10. abs. Alkohol, Xylol, in Rotihistol eindeckeln

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2.2.5. Immunhistochemie Reagentien: Mouse-on-Mouse Immunodetection Kit (M.O.M.® Kit, Fa. Linaris, Cat. No. EMP 2200, Wertheim-Bettingen, Deutschland) Monoclonal Mouse Anti – Vimentin (Fa. Dako, Cat. No. M7020, Clostrup, Denmark) H2O2 (35%-ige Lösung, Fa. Merck, Cat. No. 1.08600.1000, Darmstadt, Deutschland) Pferde-Serum (Fa. Gibco, Cat. No. 16050-130, Carlsbad, USA) Ziegen-Serum (Fa. Sigma, Cat. No. G 9023, Deisenhofen, Deutschland) Peroxidase Blocking Reagent (Fa. Dako, Cat. No. S 2001, Carpinteria, USA) DAB (Liquid DAB + Substrate-Chromogen System, Fa. Dako, Cat. No. K 3467, Carpinteria, USA) AEC (Liquid AEC + Substrate-Chromogen System, Fa. Dako,, Cat. No. K 3461, Carpinteria, USA) Kaisers Glyceringelatine (kaiser´s glycerol gelatin, Fa. Merck, Cat. No. 1.09242.0100, Darmstadt, Deutschland) Dako EnVision™+, Ziege Anti-Maus, Peroxidase (Fa. Dako, Cat. No. K4000, Carpinteria, USA) Monoclonal Mouse Anti-Human Endothelial Cell, CD 34 (Fa. Dako, Cat. No. M 0823, Carpinteria, USA, Klon JC/70A, monoclonal mouse IgG1) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Immunhistochemische Analysen wurden an 10µm dicken Gefrier- und

Paraffinschnitten von Präparaten aus allen Versuchsgruppen durchgeführt. Es

kamen dabei monoklonale Antikörper spezifisch für Vimentin (1:50) und CD 34 (1:50)

zum Einsatz. Bei allen immunhistochemischen Färbungen wurde jeweils eine Positiv-

(humane Haut) und eine Negativkontrolle (murine Haut) angefertigt. Es wurde ein

Mouse-on-Mouse Immunodedection Kit (Fa. Linaris) für die Färbungen verwendet.

Ziel war die Blockierung endogener Maus-Immunglobuline im Mausgewebe vor

Inkubation mit dem Sekundärantikörper, um so das Problem der starken

Hintergrundfärbung bei Verwendung monoklonaler Maus-Primärantikörper und anti-

Maus IgG Sekundärantikörper zu vermeiden. Wesentliche Bestandteile des

M.O.M.™-Immunodetection Kit sind das IgG-Blockierungs-Reagenz, ein Protein-

Verdünnungspuffer, biotinylierte anti-Maus IgG Sekundärantikörper und ein

VECTASTAIN Elite ABC-Reagenz mit HRP-gekoppelten Antikörpern. Es wurde nach

dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. Alle Präparate wurden vor bzw.

zwischen den Inkubationsschritten mit PBS gespült. Alle Inkubationsschritte erfolgten

bei 21°C. in einer Feuchtkammer, um ein Austrocknen der Präparate zu verhindern.

Die endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubation der Präparate für 10min in

PBS, beinhaltend 1% H2O2 und 1% Pferdeserum, reduziert. Pro Objekträger wurden

125μl des mit einem im Kit enthaltenen Puffer (M.O.M. diluent) verdünnten

Primärantikörpers aufgetragen und für 30min inkubiert. Zur Entwicklung wurde das

HRP-Substrat AEC bzw. DAB wie oben beschrieben zugegeben.

31

2.2.6. Vitalitätsfärbung YoYo Reagentien YOYO-1iodide Molecular Probes Lot. No. 4971-13 Leiden, Netherlands PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland)

Bei der Vitalitätsfärbung werden nur intakte Nukleinsäuren angefärbt, so dass keine

denaturierten Nukleinsäuren markiert werden. Auf diese Weise kann nekrotisches

Gewebe von vitalem Gewebe differenziert werden. Hierzu wird YoYo 1:1000 mit PBS

verdünnt und auf die Schnitte pipettiert. Nach 9 Minuten Inkubation wird mit PBS

gewaschen und anschließend mit Aquatex eingedeckelt. Parallel erfolgte eine H&E-

Färbung des jeweiligen Schnittes. Unter dem Fluoreszenzmikroskop erfolgt die

Analyse, welche zusätzlich mit der histologischen Färbung in H&E verglichen wird.

2.2.7. In situ Zellproliferationkit, BrdU

Reagentien In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS (Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Cat.No. 1810740, Penzberg, Germany) Trypsin: Viralex ™ Trypsin/EDTA (1x), 0.5 g Trypsin (1:250)/l in PBS (1x) (Fa. PAA, Cat. No. L11-660, Linz, Österreich) HCl MERCK KgaA Cat. No. 100319 Darmstadt, Germany

Mit Hilfe des In Situ Zellproliferationskit für die Detektion von 5-Bromo-2´-Deoxyuridin

(BrdU) können DNA synthetisierende Zellen von ruhenden Zellen differenziert

werden. BrdU ist analog zu Thymidin und kann statt Thymidin in die DNA von Zellen

in der S-Phase eingebaut werden. Der Assay ist eine immunhistochemische Technik,

die einen monoklonalen Antikörper aus der Maus gegen BrdU nutzt. Die Prozedur

besteht aus folgenden Schritten:

a. Das BrdU gelabelte Reagenz wird in das Tier injiziert. Dann wird das Tier

getötet und das Fettgewebe für Schnitte präpariert.

b. Die Präparate werden mit Trypsinlösung bedeckt und für 5-15 Min bei 37°C

inkubiert.

c. Die DNA im fixierten BrdU gelabelten Gewebe wird durch HCl-Säure

denaturiert.

d. Es folgt die Detektion des inkorporierten BrdU mit einem Fluoreszenzfarbstoff

konjugierten anti-BrdU monoklonalen Antikörper.

e. Die Proben können letztlich unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert

werden.

32

Die Detektion von Zellen in der S-Phase kann einen Hinweis geben, ob die

vorliegenden Zellen möglicherweise Tumoreigenschaften besitzen.

2.2.8. Gewebeeinbettung und histologische Aufarbeitung 2.2.8.1. Kryo-Einbettung Reagentien: Tissue Freezing Medium ™ (Fa. Jung, Cat. No. 0201 08926, Karlsruhe, Deutschland) Kryotom (Fa. Leica, CM 3050) Saccharose (Sucrose), C12H22O11, Mr= 342.30 g/Mol (Fa. Merck, Cat. No. 1.07687.1000, Darmstadt, Deutschland) K2HPO4 (Fa. Merck, Cat. No. 105099, Darmstadt, Deutschland) KH2PO4 (Fa. Merck, Cat. No. 105108, Darmstadt, Deutschland) Super Frost®Plus Objektträger (25x75x1.0 mm Fa. Menzel-Gläser, Cat. No. 041300, Heidelberg, Deutschland) Zur Cryo-Einbettung von Gewebebiopsaten wurden diese nach Biopsatentnahme in

Saccharose-Kaliumhydrogenphospatpuffer eingelegt und später in Tissue Freezing

Medium eingebettet. Es wurde nach folgendem Arbeitsprotokoll vorgegangen:

Ansetzen des Kaliumhydrogenphospatpuffers: Ansatz: Stammlösung KH2PO4/K2HPO4 Puffer 0,2 M

• 1,088 g K2HPO4 in 40ml Aqua bidest lösen

• 13,92 g KH2PO4 in 400 ml Aqua bidest lösen

Beide Lösungen mischen und pH-Wert auf pH 7.4-7.8 einstellen. Zur Herstellung der

Gebrauchslsg. (0.1 M): 100 ml 0,2 M KH2PO4/K2HPO4 Puffer mit 100 ml Aqua bidest

verdünnen

Ansetzen des Saccharose-Kaliumhydrogenphospatpuffers: Zu 100 ml 0,1 M KH2PO4/K2HPO4 Puffer 15 g Saccharose ( Fa. Merck) zugeben.

Einbettung: 1. Biopsieentnahme

2. Explantat in 4-5ml 15%ige Saccharose-Kaliumhydrogenphospatpuffer-Lsg.

geben, Einwirkzeit ca. 15 min., Explantat aus Lösung entnehmen, abtropfen

lassen und in Tissue Freezing Medium (Fa. Leica) überführen (in vorbereiteter

würfelförmiger Aluform), Einwirkzeit bei Raumtemperatur ~15min.

3. Aluform mit Explantat auf Kühlplattform (in flüssigem Stickstoff (–80° C.)

stehend) stellen und langsame Aushärtung des Tissue Freezing Mediums

abwarten.

33

4. Aluform für 24h in –20°C. Gefrierschrank überführen (weitere Verfestigung,

optimale Schneidetemperatur der Objekte im Cryostat bei –22 bis –25°C.

Objekttemperatur)

Histologische Aufarbeitung:

Die Präparate wurden mit einem Kryotom (Fa. Leica, CM 3050) bei -24°C.

Objekttemperatur geschnitten. Zum Schneiden wurde die Aluform entfernt, das

Objekt nach Wunsch orientiert und mittels eines Tropfens Tissue Freezing Mediums

auf der Objektplatte fixiert. Es wurden Schnitte mit 5-15µm Schnittdicke hergestellt,

auf Objektträger aufgezogen und diese bis zur Verwendung bei -20°C. eingefroren.

2.2.8.2. Paraffin-Einbettung Reagentien: Paraplast Tissue Embedding Medium 1kg (Tyco Healthcare Group LP, Cat.No. 0120388895010064, Mansfield, USA) Coultergefäße (Coulter Electronics Ltd., Cat.No. 5634220003 Fullerton, USA) Ethanol ( C2H5OH) (Fa. Merck, Cat. No. 100986, Darmstadt, Deutschland) Isopropranol (Fa. Merck, Cat. No. 159191, Darmstadt, Deutschland) Leica EG1160 Paraffinausgießstation (Leica Instruments GmbH, Cat.No. 070637101, Nußloch, Deutschland) Leica TP1020 Histokinette (Leica Microsystem GmbH, Wetzlar, Germany) Memmert Wärmeschrank Modell 400 (Fa. Memmert GmbH + Co. KG Schwabach, Deutschland) Mikrotom RM 2165 Rotationsmikrotom (Leica Instruments GmbH, Cat.No. 070037105, Nußloch, Deutschland) Rotihistol (Fa. Roth, Cat. No. 6640.1, Karlsruhe, Deutschland) Die Hautbiopsien wurden in einer 3,5%ige Formalinlösung für mindestens 8 Stunden

aufbewahrt. Im Anschluß wurden die Hautbiopsien in Histokinette-Kassetten

eingespannt.

Folgende Schritte erfolgten im Infiltrationsautomaten bzw. Histokinette:

1. Station: 70%ige Ethanol 1Std.

2. Station: 96%ige Ethanol 1Std.

3. Station: 96%ige Ethanol 1Std.

4. Station: 100%ige Ethanol 1Std.

5. Station: 100%ige Ethanol 1,5Std.

6. Station: Isopropanol + Rotihistol 1:1 2Std.

7. Station: Rotihistol 2Std.

8. Station: Rotihistol 1Std.

9. Station: Paraffin 2Std.

10. Station: Paraffin 1,5Std.

11. Station: Paraffin 1Std.

Die Biopsien wurden aus den Kassetten entfernt und mit Hilfe der

Paraffinausgießstation eingeblockt.

34

Die ausgehärteten Blöcke wurden mit Hilfe des Rotationsmikrotoms geschnitten und

auf die Objektträger fixiert.

2.3. Langzeittierversuch

2.3.1. Athymische Nacktmaus

2.3.1.1. Versuchstiere Männliche athymische Nacktmäuse (Fa. Charles River Laboratories, Balb/cnu/nu-

Mäuse von Iffa Credo, Frankreich, Alter: 49-56 Tage) dienten als Versuchstiere. Die

Tiere waren in der Versuchstierhaltung der Abteilung Chirurgische Forschung des

Universitätsklinikums Freiburg untergebracht, lebten in einem regelmäßigen

zwölfstündigen Hell-Dunkel-Zyklus und hatten freien Zugang zu Standardfutter (Fa.

Sniff, Deutschland) und Trinkwasser, dem ein Oxytetracyclin/Vitaminpräparat

beigemischt wurde. Es wurde ein ‚laminar air flow’ Käfigsystem (Duoflo, Fa. Bioclean

Lab Procedures, Inc., Maywood, NY, USA) zur Haltung verwendet. Präoperativ

wurden 5-6 Tiere in einem Käfig auf Spreu gehalten, postoperativ wurden die Tiere

einzeln auf Zellstoffunterlagen gesetzt. Die Eingriffe wurden in tiefer

Inhalationsnarkose (Halothan 2.5%, 2-3l/min NO2) nach Desinfektion der Rückenhaut

unter sterilen Kautelen durchgeführt. In der postoperativen Phase wurde der

Gesundheitszustand der Tiere täglich durch das Tierpflegepersonal, alle 2-3 Tage

durch die Operateure selbst überprüft. Eine deutliche Verschlechterung des

Allgemeinzustandes der Tiere bzw. Infektionen im Bereich des Operationsgebietes

hätte zu einem vorzeitigen Studienabbruch geführt. Alle Tierversuche waren von dem

Tierschutzbeauftragten des Universitätsklinikums Freiburg (Hr. Dr. Roth) und dem

Amt für Öffentliche Ordnung – Veterinärbehörde (Fr. Dr. Dietrich) – genehmigt

(Tierversuchsvorhaben „Transplantation kultivierter Präadipozyten und

Endothelzellen zum Ersatz von Weichteilgeweben“; Registrier-Nummer: G-02/03,

Aktenzeichen : 35-9185.81/1/597).

35

2.3.1.2. Fibrin Reagenzien: Aprotinin Aprot. Bay 5 ml 3000 KIE/ml (Cat. No. B20142 Fa. Baxter AG Wien Austria) Baxter Thrombin-Verdünnungspuffer, 40mM CaCl2 . 2H2O, 171mM NaCl, 40mM Glycin, 50g HSA/l (Baxter Hyland Immuno, Heidelberg, Deutschland) CaCl2 * 2H2O (Fa. Merck, Cat. No. 102880-100, Darmstadt, Deutschland) Verdünnungspuffer Calciumcl. USA 40 mmol/Liter 2ml (Cat. No. B20821 Fa. Baxter AG Wien Austria) Fibrinkleber Tissucol DuoS Immuno (Fa. Baxter Hyland Immuno, 0,5 ml Cat. No. B1330520110616, 1ml Cat. No. B1331020110614, 2ml Cat. No. B1332020110601, Tissucol Kit (lyophilisierte Komponenten) 2ml Cat. No. B193224011060, Baxter Hyland Immuno, Heidelberg, Deutschland) NaCl (Fa. Merck, Cat. No. 159-302-500, Darmstadt, Deutschland) Na3Citrat (Fa. Merck, Cat. No. 106446-500, Darmstadt, Deutschland) Thrombin Human (Pulver) 500 IE/ml 5ml (Cat. No. B205521 Fa. Baxter AG Wien Austria) Die Fibrinogenlösung wurde unter Rühren aus 1ml 70-110mg/ml Fibrinogenpulver,

1ml Aprotinin und 2ml 0,9%iger NaCl hergestellt. Die Thrombinlösung setzte sich aus

Thrombin Human 500 IE/ml der Fa. Baxter, 1ml CaCl2 und 6ml Verdünnungspuffer,

so dass eine 1ml Lösung ca. 70 I.E. Thrombin enthält. Die angesetzten

Gebrauchslösungen der einzelnen Komponenten wurden in Spritzen aufgezogen und

in die Applikationsvorrichtung eingepasst. Die Zellfraktion (10-60 Millionen

Zellen/1000μl Thrombinvolumen) wurde dabei in die Thrombin-Komponente

eingebracht, mehrfach resuspendiert und unverzüglich eingesetzt, um eine möglichst

gleichmäßige Verteilung der Zellen innerhalb der Fibrinmatrix zu erzielen. Es

mussten hierbei die final erwünschten Thrombinkonzentrationen pro 1ml

Konstruktvolumen berücksichtigt werden. Zur Applikation der Zellen wurde ein Zwei-

Spritzen-Applikationssystem zur simultanen Einbringung beider Fibrinkleber-

Komponenten (Thrombin, Fibrinogen) eingesetzt (Abb. 1.). Nach Aufsetzen des

Verbindungsstückes und der Applikationsnadel wurde das Zell-Matrix-Konstrukt mit

einem Gesamtvolumen von 1ml in die Flanke der Maus gespritzt. Ein

Applikationssystem konnte so für 2 Zell-Matrix-Konstrukte eingesetzt werden.

36

37

S

Abb. 1. Doppelspritzeninjektionssystem für Fibrinkleber. Bestehend aus einer Halterung für zwei identische Spritzen und einem gemeinsamen Stempel, mit dem Volumina beider Fibrinkleberkomponenten (Fibrinogenfraktion, Thrombinfraktion mit Zellresuspendat) über ein gemeinsames Anschlußstück in einer Kanüle gleichmäßig durchmischt und injiziert werden können. In in vitro Untersuchungen wurde eine annähernd gleichmäßige Verteilung der Zellen innerhalb der Fibrinmatrix gefunden.

2.3.1.3. Transplantation von Zell-Matrix-Konstrukten Die Rückenhaut wurde durch eine Sogvorrichtung angehoben. Diese ist ähnlich einer

von Marler et al. (Marler JJ 2000) beschriebenen Applikationsmethode zur

Standardisierung der vom Transplantat eingenommenen Grundfläche, Form und

Lokalisation an der Mausflanke. Durch Applikation eines definierten, lokal begrenzten

Unterdrucks auf der Haut und seitlicher subkutaner Injektion unter diesen Bereich

kann das Zell-Matrix-Konstrukt auf diesen Bereich begrenzt werden. Dieser Sog

wurde erzeugt durch eine Spritze, dessen Ende entfernt wurde und die Ränder

abgeschliffen wurden. Mit Hilfe dieser präparierten Spritze konnte ein Unterdruck

hergestellt werden bei gleichzeitigem Ziehen am Kolben und Anlegen an die Haut.

Neben Vorteilen im Tierversuch ermöglicht diese Technik u.a. die Applikation von

Fibrinkleberzusammensetzungen mit niedriger Thrombinkonzentration und

langsamer Aushärtungskinetik.

Unter Verwendung eines Zwei-Spritzen-Applikationssystems zur zeitgleichen

Injektion wurden die Zell-Fibrinogen-Fraktion und die Thrombinkomponente unterhalb

des Panniculus carnosus injiziert.

Innerhalb jeder Versuchsgruppe wurden an jeder Maus zwei Transplantationen

durchgeführt. Transplantationsorte waren die rechte und linke Flanke.

Transplantationsort, Gruppen-zugehörigkeit, Besonderheiten während der

Transplantation und Transplantationsverlauf wurden streng protokolliert.

pritzenhalterung

Anschlußstück

Einlumige Kanüle

Fibrinogenkomponente

ThrombinkomponenteThrombinkomponente

2.3.1.4. Tätowierung Material: Spezialtätowierfarbe Hauptner Herberholz Germany

Die Tätowierung wird mit einer sterilen chirurgischen Pinzette und einer speziellen

Tätowierfarbe vorgenommen. Mit Hilfe der Pinzette werden kleine Stiche entlang des

Randes von dem injezierten Konstrukt appliziert. Dann wird ungefähr eine

Fingerspitze der Tätowierpaste auf die erzeugten Stichmale einmassiert. Diese

Prozedur erfolgt stets nach Injektion der Konstrukte in die linke und rechte Flanke der

Maus. Die Maus wurde währenddessen narkotisiert. Die Tätowierungen mussten

gelegentlich nach 2 bis 4 Wochen wiederholt werden.

2.3.1.5. Biopsieentnahme Nach Ablauf der jeweils vorab festgelegten Versuchsdauer erfolgte vor

Biopsatentnahme die tierschutzgerechte Tötung der Versuchstiere entsprechend den

Forderungen durch Kohlendioxid-Inhalation (CO2) in einem Euthanasiekasten und

anschließender Luxation der Halswirbelsäule (Okzipitalgelenkluxation). Die Biopsien

der gesamten Körperwand von 1.5cmx1.5cm Größe wurden im Bereich der

Transplantationsorte entnommen. Die Biopsien wurden dem Protokoll für

Gewebeeinbettung folgend vor Ort in zwei gleiche Teile geschnitten. Die eine Hälfte

wurde in Tissue Freezing Medium überführt und bis zur histologischen Aufarbeitung

bei –20°C. gelagert. Die andere Hälfte wurde zunächst in 4%iger Formalinlösung

über einen Zeitraum von 15h fixiert und später in Paraffin eingebettet. Durch diese

Vorgehensweise konnten die Vorzüge der Kryo- und der Paraffineinbettung für die

histologische Analyse genutzt werden.

38

39

2.3.2. Auswertung 2.3.2.1. Bewertung der explantierten Proben Vor der Explantation wurden die entnommenen Proben bezüglich ihrer Größe

bewertet. Die Skala der Bewertung reichte von 0 bis 4. Null bedeutet, dass kein

implantiertes Gewebe vorgefunden werden konnte. Mit 1 wurden die Proben

beziffert, bei denen nicht mit Sicherheit ein Implantat verneint oder bejaht werden

konnte. Proben mit der Bewertung 2 waren kleine Implantate, d.h. sie ließen sich

noch von dem umgebenden Gewebe abgrenzen. Sie waren flächig von ungefähr

einem halben bis ganzen Zentimeter Durchmesser und ohne Erhabenheit. Mit 3

wurden Proben bewertet, welche leicht erhaben und von mittlerer Größe waren.

Proben mit der Bezifferung 4 waren ungefähr 3 mm erhaben und in der Fläche einen

Durchmesser von 1 cm (Abb.2.).

Für die Untergruppen 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, 3.3, 6.1 ,6.2, 6.3 sowie

für die Gruppen 4 und 5 wurden jeweils 8 Mittelwerte errechnet. Der einzelne

Mittelwert resultierte aus Quersumme aus der Beurteilung des einzelnen

Konstruktes. Jede dieser Gruppen wurde in Form von BoxPlots und auch als

Stabdiagramm für ein besseres Verständnis der Daten dargestellt. Die Gruppen

wurden untereinander wiederum mit Hilfe des Mann-Whitney-Wilcoxon-Test

Skala

0 Kein Implantat sichtbar

1 Implantat, welches nicht mit Sicherheit von der Umgebung abgegrenzt werden konnte

2 Implantat mit einem Durchmesser von 0,5-1cm und mit flacher Oberfläche

3 Implantat mit einem Durchmesser von 0,5-1cm und mit erhabener Oberfläche bis zu 3mm

4 Implantat mit einem Durchmesser von mind. 1cm und mit erhabener Oberfläche von 3mm

Abb.2. Schema für die Bewertung der explantierten Proben

bezüglich ihrer Signifikanz untersucht. Zur Erstellung der BoxPlots und des Mann-

Whitney-Wilcoxon-Tests wurde das Programm SPSS verwendet.

2.3.2.2 Histomorphometrie Material: DatInf Measure Version 1.0 (DatInf GmbH, Tübingen, Deutschland) SPSS Version 13.0 für Windows (SPSS Incorporation, Chicago, USA) Die morphometrische Analyse histologischer Präparate der Tierversuchsgruppen

wurde mit dem computergesteuerten Image-Analyse-Programm DatInf Measure

Version 1.0 der DatInf GmbH in Tübingen durchgeführt. Hierzu wurden

standardisierte Digitalaufnahmen der einzelnen Präparate (Weißabgleich,

Lichttemperatur 3200 K, standardisiertes Aufnahmefenster in 25facher

Vergrößerung) mit einer hochauflösenden Digitalkamera angefertigt. Das Programm

kann nicht mit Bildern im TIF-Format arbeiten, sondern nur mit Bildern im JPEG-

Format. Daher ist die Bildqualität nicht so gut wie bei anderen mikroskopischen

Bildern.

Von jedem Konstrukt wurde jeweils das Bild mit der größten Fläche herausgesucht.

Es wurden nur Flächen von Konstrukten verwertet, die in der Immunhistologie ein

positives Ergebnis vorweisen konnten. Mit Hilfe des DatInf Measure-Programm

wurde auf einem Bild die markierte Fläche errechnet. Hierzu mußte die gewünschte

Fläche mit dem Cursor markiert werden und auf der Photographie ein Maßstab

angegeben werden (Abb. 3. u. 4.). Auf diese Weise wurde sichergestellt, dass nur die

Fläche des neugebildeten humanen Gewebes ausgemessen wurde. Konstrukte ohne

eine positive Immunhistologie wurden bei der späteren Berechnung der

Abb.3. Beispiel für die histomorphometrische Messung bei einem Bild der Gruppe 5

Abb.4. Beispiel für die histomorphometrische Messung bei einem Bild der Gruppe 5

40

Durchschnittsfläche mit 0 angegeben, wobei die Gesamtzahl n konstant blieb. Für die

Untergruppen 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3, 3.1, 3.2, 3.3, 6.1 ,6.2, 6.3 sowie für die

Gruppen 4 und 5 wurden jeweils 8 Maximalwerte errechnet. Jede dieser Gruppen

wurde in Form von BoxPlots dargestellt. Die Gruppen untereinander wiederum

wurden mit Hilfe des Mann-Whitney-Wilcoxon-Test bezüglich ihrer Signifikanz

untersucht. Zur Erstellung der BoxPlots und des Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests

wurde das Programm SPSS verwendet.

2.3.3. Magnetresonanztomographie Material und Reagentien: Magnetom Trio, ein Ganzkörper 3 Tesla Magnetresonanzsystem (Siemens AG München, Germany) 2,2,2 Tribromoethanol 99% 25g (Fa. Sigma-Aldrich, Cat. No. T48402, Deisenhofen, Deutschland ) + tert – Amylalkohol 99% 100ml (Fa. Sigma-Aldrich Cat. No. W205605, Deisenhofen, Deutschland ) PBS Dulbecco, Instamed 9.55g/l w/o Ca2+, Mg2+ (Fa. Biochrom KG, Cat. No. L182-10, Berlin, Deutschland) Avertinlösung: 1g Tribromoethanol gelöst in 1 ml Amylalkohol = 100%iges Avertin (Stammlösung) 1ml 100%iges Avertin in 40 ml steriles PBS lösen = 2,5%iges Avertin Anwendung: 1 μl/ g Maus intraperitoneal Bei einem Versuchstier der Gruppe 1.4 wurden von dem rechten Konstrukt MRT-

Bilder aufgenommen, um einen Eindruck von der Morphologie des implantierten

Gewebes im noch intakten Organismus zu gewinnen. Die MRT-Aufnahmen wurden

in den Einrichtungen der Radiologie in der Uniklinik Freiburg unter Anleitung von

Prof. Dr. M. Uhl durchgeführt. Mit Hilfe der Immunhistologie wurde nach Explantation

verifiziert, dass es sich um humanes Gewebe handelte. Für die Aufnahmen musste

das Tier in eine tiefe Narkose gebracht werden; hierzu wurde Avertin verwendet. Das

narkotisierte Tier wurde nach den Aufnahmen von ca. 10 Minuten Dauer mit Hilfe von

körperwarmen Gelpacks gewärmt, da die Gefahr der Entstehung einer Hypothermie

infolge der tiefen Narkose bestand. Die Explantation erfolgte 5 Stunden nach den

MRT-Aufnahmen, sodass ein direkter Vergleich zwischen den MRT-Aufnahmen und

den histologischen Schnitten möglich war.

41

2.4. Tierversuchsaufbau Insgesamt gliedert sich der Versuch in 6 Gruppen. Die Gruppe 1 ist in 4

Untergruppen untergliedert und die 2. Gruppe sowie die 3. Gruppe sind jeweils in

drei Untergruppen unterteilt.

Gruppe 1: Injektion von 5 Mill. Präadipozyten mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und

linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c

Nacktmaus.

Gruppe 1.1: Explantation von 8 Konstrukten nach 4 Wochen (n = 8)

Gruppe 1.2: Explantation von 8 Konstrukten nach 3 Monaten (n = 8)

Gruppe 1.3: Explantation von 8 Konstrukten nach 6 Monaten (n = 8)

Gruppe 1.4: Explantation von 8 Konstrukten nach 9 Monaten (n = 8)

Gruppe 2: Injektion von 5 Mill. Fibroblasten mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und

linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c

Nacktmaus.

Gruppe 2.1: Explantation von 8 Konstrukten nach 4 Wochen (n = 8)

Gruppe 2.2: Explantation von 8 Konstrukten nach 3 Monaten (n = 8)

Gruppe 2.3: Explantation von 8 Konstrukten nach 6 Monaten (n = 8)

Gruppe 3: Koimplantation von 5 Mill. Präadipozyten und 1 Mill. HDMVECs als

Späroide mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und linke Flanke unterhalb des

Panniculus carnosus einer athymischen balb/c Nacktmaus.

Gruppe 3.1: Explantation von 8 Konstrukten nach 4 Wochen (n = 8)

Gruppe 3.2: Explantation von 8 Konstrukten nach 3 Monaten (n = 8)

Gruppe 3.3: Explantation von 8 Konstrukten nach 6 Monaten (n = 8)

Gruppe 4: Mehrfachinjektion von 5 Mill. Präadipozyten mit 1 ml Fibrin jeweils in die

rechte und linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c

Nacktmaus. Injektionen erfolgten nach der Implantation 4 Wochen und 3 Monate

später. Insgesamt wurden 15 Mill. Präadipozyten in jeweils eine Flanke injeziert (n =

8).

42

Gruppe 5: Injektion von 30 Mill. Präadipozyten mit 1 ml Fibrin jeweils in die rechte

und linke Flanke unterhalb des Panniculus carnosus einer athymischen balb/c

Nacktmaus (n = 8).

Gruppe 6: Injektion von 1 ml Fibrin jeweils in die rechte und linke Flanke unterhalb

der Panniculus carnosus einer athymischen balb/c Nacktmaus mit Explantation nach

4 Wochen (n = 8)

2.5. Photographien Aufnahmen histologischer Schnittpräparate wurden mit einem Zeiss Axioplan

Durchlichtmikroskop unter Verwendung des Photosystems AxioVision durchgeführt.

Von allen relevanten Präparaten wurden Digitalaufnahmen mit einer

hochauflösenden Digitalkamera Axiocam color VDC12 angefertigt. In die originalen

Digitalbilder wurden lediglich mittels Adobe Photoshop® z.T. Buchstaben,

Größenmaßstäbe und Legenden eingefügt. Bei unscharfen oder verwaschenen

Bildern wurde der Bildkontrast erhöht. Eine weitere digitale Bearbeitung der

Aufnahme fand nicht statt.

43

2.6. Materialien

2.6.1. Gerätschaften accu-jet® Pipettierhilfe (Fa. Brand GmbH, Cat. No. 265 04, Wertheim, Deutschland) Autoklav Dampfsterilisator Ventilab HP669-H (Fa. MMM (Münchner Medizin Mechanik GmbH, Planegg, Deutschland) Brutschrank BSS 160 Brutgerät (Fa. Grumbach Brutgeräte GmbH, Aßlar, Deutschland) Kryotom CM 3050 (Fa. Leica Mikroskopie Systeme, Heerbrugg, Niederlande) Digitalkamera Mikroskop, Axiocam color 12VDC (Fa. Carl Zeiss, Jena, Deutschland) Eppendorf Research® Pipetten 0,1-2,5μl, 0,5-10μl, 2-20μl, 10-100μl, 100-1000μl (Fa. Eppendorf, Deutschland) Feder Histologie Einmalklingen S3 (Fa. Leica Mikroskopie Systeme, Heerbrugg, Niederlande) Gefrierschrank (-20° C.) Ökoplus Elektronik (Fa. Siemens, München, Deutschland) Gefrierschrank (-80° C.) (Fa. Forma Scientific, Deutschland) Glasswaren Pyrex® (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Inverses Mikroskop Axiovert 25 (Fa. Carl Zeiss Jena, Jena, Deutschland) Laminar air flow, Mikrobiologische Sicherheitswerkbank, Klasse II, Serie SE, Modell 51424/5 (Fa. Microflow, Andover, Großbritannien) Leica TP1020 Histokinette (Leica Microsystem GmbH, Wetzlar, Germany) Leica EG1160 Paraffinausgießstation (Leica Instruments GmbH, Cat.No. 070637101, Nußloch, Deutschland) Memmert Wärmeschrank Modell 400 (Fa. Memmert GmbH + Co. KG Schwabach, Deutschland) Mikrotom RM 2165 (Fa. Leica Mikroskopie Systeme, Cat.No. 070037105, Heerbrugg, Niederlande) Mikroskope (Fa. Carl Zeiss, Standard 20; Axioplan 2, Axiovert 100, Jena, Deutschland) Mikroskop-Software (Fa. Carl Zeiss, Aufnahme-Software AxioVision, Image-Analyse Software KS 300, Jena, Deutschland) Millipore– Anlage: Milli – Q PF PLUS (MILLIPORE Corp, Cat. Nr. PF03292, Bedford, USA) Nalgene® Cryo 1° C. Freezing Container “Mr. Frosty” (Fa. Nalgene, Cat. No. 5100, Wiesbaden, Deutschland) Neubauer-Zählkammer / Hämocytometer (Fa. Roth, Cat. No. T728.1, Karlsruhe, Deutschland) Paraffinausgießstation Leica EG1160 (Fa. Leica Instruments GmbH Cat No. 070637101, Nussloch, Deutschland) Reagenzglasschüttler Reax control (Heidolp-Elektro, Kelheim, Deutschland) Schüttlerwasserbad SWB 20 (Fa. Haake, Karlsruhe, Deutschland) Stickstofftank Chronos 100 (Fa. MG-Messer Griesheim GmbH, Krefeld, Deutschland) Trockenschrank Modell 400 (Fa. Memmert GmbH, Schwabach, Deutschland) Vakuumpumpe ME 25 (Fa. Vacuubrand, Wertheim, Deutschland) Zellkulturbrutschrank HeraCell (Fa. Heraeus (Kendro), Cat. No. 51013569, Berlin, Deutschland) Zentrifugen (Fa. Sorvall (Kendro), Berlin, Deutschland)

2.6.2. Verbrauchsmaterialien Cyogenic Vials (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Bottle Top Filters (Fa. Corning Costar, Cat. No. 430513, Bodenheim, Deutschland) Coultergefäße (Coulter Electronics Ltd., Cat.No. 5634220003 Fullerton, USA) Deckgläser (Fa. Roth, 24 x 40 mm Cat. Nr. H875.1, 24 x 24 mm Cat. Nr. H1870, Fa. Roth, Karlsruhe, Deutschland) Falcon®Cell Culture Inserts (Fa. Falcon, Cat. No. 3104, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Falcon®Companion TC Plate (Fa. Falcon, Cat. No. 3504, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Falcon®Cell Strainer (Fa. Falcon, Cat. No. 2350, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Falcon®Blue Max™ Conical Centrifuge Tubes (Fa. Falcon, 15ml, 50ml, hergestellt für: BD Labware, Franklin Lakes, USA) Fibrinkleber Tissucol DuoS Immuno (Fa. Baxter Hyland Immuno, 0,5 ml Cat. No. B1330520110616, 1ml Cat. No. B1331020110614, 2ml Cat. No. B1332020110601, Tissucol Kit (lyophilisierte Komponenten) 2ml Cat. No. B193224011060, Baxter Hyland Immuno, Heidelberg, Deutschland) Filterpapier, Porengröße 320 mm. (Folded Filters Fa. Schleicher & Schnell, Dassel, Deutschland) Incidin, Incidin Perfekt (Fa. Henkel Hygiene GmbH, Düsseldorf, Deutschland) Injektionsspritzen (Fa. Braun, 2ml Cat. No. 09066500, 5ml Cat. No. 09066527, 10 ml Cat. No. 09066535, Melsungen, Deutschland) Kanülen 100 Sterican (Braun, 0,40 x 20 mm G20 Cat. No. 9013601, 0,60 x 30 mm G14 Cat. No. 9013318, 0,80 x 40 mm G2 Cat. No. 9013105, 0,90 x 70 mm G1 Cat. No. 9012001, Melsungen, Deutschland) Kulturflaschen p25 (Cat. No. 430639), p75 (Cat. No. 430641) (Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Millex®-GV Sterilizing Filter Unit (Fa. Millipore, SLGV 025 LS, 0.22μm Durapore® membrane filter, Bedford, USA) Parafilm Pasteur-Pipetten pH-Papier: PH – Fix 0,0 – 6,0 (Fa. Macherey-Nagel, Cat. Nr. 92115, Düren, Deutschland) Serologische Pipetten (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml, 50ml, Fa. Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) Einmalskalpelle (Fa. Feather, Tokio, Japan)

44

45

3. Ergebnisse

3.1. Isolation, Kultivierung, Implantation und Explantation Aus dem Fett- und Hautgewebe der Dermolipektomien konnten die Zellen

entsprechend den Protokollen isoliert werden. Die Isolation und Kultivierung

gestalteten sich bei den Präadipozyten und Fibroblasten ohne Schwierigkeiten, da

beide Zellen zum einen in hoher Anzahl im Gewebe der Dermolipektomien

vorhanden sind und zum anderen in ihren Kulturmedien gut proliferieren können. Die

Isolierung und vor allem die Kultivierung der HDMVECs sind im Vergleich zu den

Präadipozyten und Fibroblasten erschwert durch zusätzliche Arbeitsschritte.

Die Implantation verlief bei allen Gruppen ohne größere Komplikationen. Mit Hilfe der

Vakuumspritze konnte eine präformierte Höhle erzeugt werden, in die das Fibrin

injiziert werden konnte (Abb. 5). In manchen Fällen musste durch leichten Druck mit

den Fingern das injizierte Fibrin unterhalb der Haut nachmodeliert werden.

Abb. 5. Subkutane Injektion einer Fibrinmatrix. In Inhalationsnarkose wurde jedem Tier beidseitig paravertebral 1ml Fibrinmatrix subkutan injiziert. Dazu wurde die Rückenhaut mittels Vakuumspritze angehoben und die Fibrinmatrix in die Subcutis unterhalb des Panniculus carnosus eingespritzt.

46

Bei der Explantation konnte die Injektionsstelle wegen der Tätowierung bei

Implantation leicht aufgefunden werden. Die Explantation verlief bei jeder Gruppe

ohne Probleme.

3.2. Ergebnisse der Versuchsgruppen 3.2.1. Gruppe 1: 5 Mill. Präadipozyten in 1ml Fibrin Die Gruppe 1 setzt sich aus vier Untergruppen zusammen. Die Untergruppe 1.1

wurde nach 4 Wochen explantiert. Bei den 8 injizierten Zellmatrix-Konstrukten

bestehend aus Fibrin und Präadipozyten konnten 3 makroskopisch und 5

histologisch beim geplanten Explantationszeitpunkt (nach 4 Wochen) identifiziert

werden. Die histologischen Untersuchungen zeigten unterhalb des Panniculus

carnosus ein kleines Fibrinkonstrukt (rechter Kasten in Abb. 6) und oberhalb der

Skelettmuskulatur (Pfeil in Abb. 6). Reife Fettzellen sind ebenso auf der im rechten

Kasten auf der Abb. 6, in der Vergrößerung Abb. 7 sowie in der Oil-red-O-Färbung

(Abb. 8) erkennbar; allerdings deutlich geringer vertreten im Vergleich zum restlichen

Gewebe. Auf den Abb. 9 u. 10 ist der immunhistologische Nachweis zu beobachten.

Abb. 6. G1.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25

47

In der Gruppe 1.2 nach 3 Monaten Implantationszeit ließen sich makroskopisch die

implantierten Zellmatrix-Konstrukt in ähnlicher Weise abgrenzen wie bei der

Explantation nach 4 Wochen. Es konnten vier Konstrukte makroskopisch und

mikroskopisch festgestellt werden. Ferner zeigten manche Konstrukte auf

mikroskopischen Aufnahmen einen hohen Differenzierungsgrad im Sinne einer

Neubildung von Fettgewebe und zusätzlich eine Volumenzunahme. Wie auf

Abbildung 11 und 12 ersichtlich, kann unterhalb des Panniculus carnosus teils reifes,

gut ausdifferenziertes Fettgewebe erkannt werden. In der Vergrößerung (Abb. 13-14)

sind Fettzellen mit ihrer typischen univakuolären Struktur zu beobachten. In der Anti-

Vimentin-Färbung (Abb. 15-16) wird deren humaner Ursprung bestätigt. Die Zellen

Abb. 7. G1.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x200 Abb. 8. G1.1 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x400

Abb. 9. G1.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x200 Abb. 10. G1.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x200

48

imponieren jeweils durch den rötlichen Schimmer des humanen Vimentins im

Übergang zwischen Zellwand und Extrazellulärmatrix.

Abb. 11. G1.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb.12. G1.2 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x25

Abb. 13. G1.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x200 Abb.14 . G1.2 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x200

Abb. 15. G1.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25 Abb. 16. G1.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

49

In der Gruppe 1.3 waren die meisten Konstrukte, von denen 4 auffindbar waren,

makroskopisch vor der Explantation erhabener als die der Gruppen 1.1 und 1.2.

Mikroskopisch ähnelten die Konstrukte, von denen sechs identifiziert werden

konnten, hinsichtlich ihrem Differenzierungsgrad der Gruppe 1.2 (Abb. 17-20), jedoch

war das Gewebe hier deutlich homogener organisiert und das vorhandene

Fettgewebe voluminöser.

Die Gruppe 1.4 wies makroskopisch 6 Explantate nach 9 Monaten auf, jedoch

konnten von diesen nur 5 histologisch wieder aufgefunden werden (Abb. 21 u. 22.).

Hinsichtlich der Größe und des Differenzierungsgrades zeigten sich histologisch

geringe Unterschiede im Vergleich zu der Gruppe 1.3. Die Implantate wiesen von

einem hohen Differenzierungsgrad und ließen sich von ihrer Umgebung leicht

abgrenzen (Abb. 23-25). Zusätzlich wurden bei dieser Gruppe noch eine MRT und

eine BrdU-Färbung angefertigt. In der MRT ließ sich an der lebenden Maus wenige

Stunden vor der Explantation deutlich abgrenzbares Fettgewebe an der

Abb. 17. G1.3 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25 Abb. 18. G1.3 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100

Abb. 19. G1.3 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100 Abb. 20. G1.3 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

50

Implantationsstelle identifizieren (Abb. 26). Die BrdU-Färbung sicherte, dass sich

kein Liposarkom oder ein anderes Malignom im Laufe der Implantationszeit gebildet

hatte. Die Anzahl der sich in der S-Phase befindlichen Zellen im Implantat entspricht

denen im gesundem humanem und murinem Fettgewebe (Abb. 27 - 29).

1 cm

Abb. 25. G1.4 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

Abb. 24. G1.4 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100

Abb. 23. G1.4 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 21. G1.4 Maus vor Explantation Abb. 22. Explantat der G1.4 Maus

51

Innerhalb der Gruppe 1 konnten im Verlauf der Implantation keine signifikanten

Unterschiede bezüglich der makroskopischen Bewertung bei Explantation sowie der

histomorphometrischen Untersuchung vorgefunden werden (Abb. 30 - 31). Allerdings

Abb.26. MRT-Bild von G1.4, oben der Rücken von der athymischen Nacktmaus, markiert ist das reife humane Fettgewebe auf der rechten Seite

Abb.28. G1.4 Paraffin-Schnitt, BrdU-Färbung von murinen Adipozyten in der athymischen Nacktmaus , x100 Abb.27. G1.4 Paraffin-Schnitt, BrdU-Färbung von humanen

Adipozyten in der athymischen Nacktmaus , x100

Abb. 29. G1.4 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung entsprechender Abschnitt des BrdU-Bildes von den humanen Adipozyten in der athymischen Nacktmaus, x100

52

kann nach Wilcoxon für unverbundene Stichproben von einer signifikanten

Größenzunahme bei allen Untergruppen der Gruppe 1 im Vergleich zu der

Kontrollgruppe 6, deren Konstrukt nur aus Fibrin bestand, nachgewiesen werden.

Eine Tendenz hinsichtlich einer Größenzunahme könnte in Anbetracht des

steigenden Medians und des Maximalwertes bei der makroskopischen wie auch bei

der mikroskopischen Bewertung angenommen werden. Zwar kann keine signifikante

Größenzunahme dargestellt werden, jedoch kann durchaus von einer

Größenkonstanz im Zeitraum von 4 Wochen bis 9 Monaten ausgegangen werden.

Ska

la

Abb. 30: Makroskopische Bewertung der Gruppe 1

Abb. 31: Histomorphometrie der Gruppe 1

53

Im Laufe der Implantationszeit haben sich die humanen Präadipozyten deutlich zu

adultem Fettgewebe entwickelt. Wie auf den obigen Bildern zu erkennen, nimmt der

Anteil von Fettzellen innerhalb des Implantates von 4 Wochen auf 3 Monate und von

3 Monaten auf 6 Monaten deutlich zu, so dass in den Gruppen 1.3 und 1.4 reifes

Fettgewebe anzutreffen war. Ferner konnten keine Ölzysten oder Nekrosen in der

Nähe des relativ gut strukturierten univakuolären Fettgewebes beobachtet werden.

3.2.2. Gruppe 2: 5 Mill. Fibroblasten in 1 ml Fibrin Die Gruppe 2 beinhaltet drei Gruppen mit Explantationszeitpunkten nach 4 Wochen,

3 und 6 Monaten. Der Aufbau der Gruppe 2 entspricht dem der Gruppe 1; die

Gruppe 2 verwendet statt humaner Präadipozyten humane Fibroblasten.

Bei der Gruppe 2.1 konnten vier Konstrukte am Tag der Explantation an der

Injektionsstelle makroskopisch identifiziert werden. Mikroskopisch zeigten sich

Konstrukte von kleinerer bis mittlerer Dimension unterhalb des Panniculus carnosus

im Vergleich zu den Konstrukten der anderen Versuchsgruppen (Abb. 32 u. 33). Von

diesen konnten vier immunhistologisch nachgewiesen werden (Abb. 34 und 35). Wie

auf der Abbildung ersichtlich ist, fand eine Vaskularisierung des Konstruktes durch

murine Gefäße statt (Pfeile in Abb. 33). Mit einer Oil-Red-Färbung konnte die

Neubildung von Fettgewebe ausgeschlossen werden.

Abb. 32. G2.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung , x25 Abb. 33. G2.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x100

54

Auch in der Gruppe 2.2 war die makroskopische Abgrenzung schwieriger als nach 4

Wochen (Gruppe 2.1), da sich bei Explantation scheinbar 6 Konstrukte fanden, von

denen in der Histologie nur 3 bestätigt werden konnten. Wie nach 4 Wochen waren

die Fibrinmatrix-Konstrukte nach 3 Monaten von mittlerer Dimension (Abb. 36).

Trotzdem zeigten sich histologisch deutliche Unterschiede bezüglich der Qualität des

ausgebildeten Gewebes im Vergleich zu den Präadipozyten-Konstrukten. Zum

Beispiel zeigten sich im Zentrum sowie in der Peripherie Kalzifikationen (Abb. 36 u.

37). Auf der YoYo-Färbung (Abb. 38) war die Kalzifikation nahezu ausgespart von

dem fluoreszierenden Marker, so dass anscheinend kaum Zellen mit intakten

Ribonukleitiden vorhanden waren. Innerhalb und in der Peripherie dieser

Kalzifikationen fanden sich positive humane Fibroblasten in der Immunhistologie

(Abb. 39 u. 40). Dies sagt jedoch nichts bezüglich der Vitalität dieser Fibroblasten

innerhalb der Kalzifikation aus. Wahrscheinlich handelt es sich hierbei um

dystrophische Kalzifikationen aufgrund ungenügender Versorgung der im Zentrum

befindlichen Zellen. Eine metaplastische Kalzifikation kann nicht gänzlich

ausgeschlossen werden. Hinsichtlich der Differenzierung der Fibroblasten zu

Fibrozyten sollte die Elastika-Färbung Aufschluß geben (Abb. 41), jedoch konnten

die typischen Charakteristika, wie die beiden länglich ausziehenden Enden mit Zelle

im Zentrum sowie die elastischen Fasern, nicht eindeutig nachgewiesen werden.

Abb. 34. G2.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25 Abb. 35. G2.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

55

Abb. 36. G2.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25 Abb. 37. G2.2 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x100

Abb. 38. G2.2 Kryo-Schnitt, YoYo-Färbung, x25

Abb. 39. G2.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100 Abb. 40. G2.2 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x200

56

In der Gruppe 2.3 wurden insgesamt 5 Konstrukte makroskopisch und ebenso 5

histologisch erkannt. Auf der dermalen Seite und im Zentrum ist hauptsächlich

Bindegewebe anzutreffen (Abb. 42 - 44). Auf der muskulären Seite hingegen lassen

sich den adipozyten-ähnliche Zellen erkennen, welche aber im Gegensatz zu

humanen Adipozyten einen größeren Durchmesser aufweisen, andere Zellwände

haben und ein dickflüssigeres Zytoplasma aufweisen. Diese Orientierung ist

allerdings nicht für alle Explantate typisch; in anderen Explantaten war das lockere

Bindegewebe mit den Adipozyten-ähnlichen Zellen durchmischt. Auch in dieser

Gruppe konnten Explantate mit dystrophischen Verkalkungen, wie in der Gruppe 2.2,

vorgefunden werden.

Abb. 41. G2.2 Kryo-Schnitt, Elastica-Färbung, x100

Abb. 42. G2.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 43. G2.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x100

57

Hinsichtlich der Größe können bei den makroskopischen sowie

histomorphometrischen Bewertungen keine wesentlichen Unterschiede zwischen den

Gruppen der Fibroblasten in Fibrin nachgewiesen werden (Abb. 46 u. 47.). Für die

Gruppe 2 kann also auch im Verlauf von 4 Wochen bis 6 Monaten eine

Volumenkonstanz angenommen werden. Die Untergruppen zeigen zwar keinen

signifikanten Unterschied untereinander, jedoch sind fast alle Messungen außer der

histomorphometrischen Auswertung von Gruppe 2.2 signifikant höher gegenüber der

Kontrollgruppe.

Abb. 44. G2.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25

Abb. 45. G2.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

Ska

la

Abb. 46. Makroskopische Bewertung der Gruppe 2

58

Zusammenfassend kann bezüglich der Gruppe 2 gesagt werden, daß die

Fibroblasten in Fibrin für einen Zeitraum von 6 Monaten persistieren können. Jedoch

fanden sich innerhalb der Fibroblasten und dem reifen Bindegewebe in der

histologischen Auswertung auch jene Inhomogenität der Implantate in Form von

Kalzifikationen und atypischen Fettzellen.

3.2.3 Gruppe 3: 5 Mill. Präadipozyten mit 1 Mill. koimplantierten

HDMVEC als Sphäroide in 1 ml Fibrin

Die Gruppe 3 gliedert sich in drei Untergruppen mit Explantationszeitpunkt nach 4

Wochen (G3.1), 3 Monaten (G3.2) und 6 Monaten (G3.3). In der Gruppe 3.1 waren

vier Konstrukte beim Explantationszeitpunkt leicht abgrenzbar, aber nur drei ließen

sich histologisch finden. Histologisch zeigten sich undifferenzierte Konstrukte ohne

Anzeichen einer Ischämie (Abb. 48 und 49). In der Mitte von 2 Konstrukten schienen

die Zellen unterhalb des Panniculus carnosus dichter gedrängt zu sein als in der

Peripherie (Abb. 50 und 51). Hinsichtlich der Morphologie unterschieden sich die

Zellen im Zentrum und in der Peripherie nicht. Evtl. könnte dies jedoch mit einer

besseren Versorgung in der Peripherie in Zusammenhang stehen.

Abb. 47. Histomorphometrische Bewertung der Gruppe 2

59

Bei der Gruppe 3.2 konnten makroskopisch 4 und histologisch 2 Konstrukte

festgestellt werden. Die Konstrukte waren bezüglich ihrer Größe gering bis mäßig

ausgebildet. Im Allgemeinen waren die Präadipozyten gering differenziert, d.h., es

konnten wenige Zellen mit Vakuolen bzw. vakuolen-ähnlichen Strukturen erkannt

werden (Abb. 52 - 54). Ausgeprägte Anzeichen für Kapillar- bzw. Gefäßbildung

waren nicht anzutreffen.

Abb. 48. G3.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 49. G3.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25

Abb. 50. G3.1 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x400

Abb. 51. G3.1 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x400

60

In der Gruppe 3.3 zeigen sich makroskopisch 2 und histologisch 5 positive

Explantate. Histologisch haben sich nur wenige Präadipozyten differenziert (Abb. 55

und 56). Unterhalb der Maushaut liegt größtenteils faserreiches Gewebe. Die

wenigen differenzierten Adipozyten sind gut durch angrenzende Gefäße

vaskularisiert (Abb. 57 - 60). Zeichen für eine bessere Differenzierung der

Präadipozyten oder einer Größenzunahme des implantierten Konstrukts können im

Vergleich zu der Gruppe 3.2 nicht festgestellt werden. Abb. 61 zeigt ein Beispiel für

die CD34-Immun-Färbung zum Nachweis humaner Endothelzellen. Obwohl dieses

Konstrukt im Vergleich zu anderen noch relativ gut ausgeprägt war, konnten keine

Zeichen humaner Endothelzellen aufgefunden werden, wie auch in den anderen

Konstrukten von G3.1 bis G3.3.

Abb. 53. G3.2 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 52. G3.2 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 54. G3.2 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

61

Abb. 55. G3.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 56. G3.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25

Abb. 57. G3.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x100

Abb. 58. G3.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

Abb. 59. G3.3 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x200

Abb. 60. G3.3 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x200

62

Abb. 61. G3.3 Kryo-Schnitt, CD34-Färbung, x100

Ska

la

Abb. 62. Makroskopische Bewertung der Gruppe 3

Abb. 63. Histomorphometrische Bewertung der Gruppe 3

Die Gruppe 3 zeigt einen signifikanten Unterschied zu der Kontrollgruppe bei der

makroskopischen Begutachtung (Abb. 62). Bei der Histomorphometrie unterscheidet

sich einzig die Gruppe 3.3 signifikant zu der Kontrollgruppe (Abb. 63). Gruppe 3.3

kann nämlich im Gegensatz zu den anderen zwei Subgruppen zum Zeitpunkt der

Explantation genügend Konstrukte mit positiver Histologie aufweisen. Allerdings

konnten diese bei der subjektiven Begutachtung meist nicht mit Sicherheit erkannt

werden, weshalb die anderen drei positiven Explantate meist mit 1 beziffert wurden.

Bezüglich der Größe kann eine Persistenz angenommen werden; eine Tendenz zur

Zunahme des Implantates besteht nicht. Die leichte Zunahme bei der Gruppe 3.3

nach 6 Monaten im Vergleich zu den Gruppe 3.1 und 3.2 ist eher durch die erhöhte

Anzahl positiver Explantate als durch eine Volumensteigerung der Konstrukte zu

begründen.

3.2.4. Gruppe 4: Mehrfachinjektion von 5 Mill. Präadipozyten in 1ml

Fibrin Gruppe 4 weist sowohl makroskopisch als auch histologisch gut ausgeprägte

Konstrukte auf. Bei der Explantation wurden 5 Konstrukte entdeckt, später in der

Histologie konnten insgesamt 6 Fettgewebe-ähnliche Strukturen identifiziert werden.

Die Präadipozyten haben sich zu adulten Adipozyten entwickelt (Abb. 64 und 65).

Die Bilder zeigen ein gut strukturiertes Fettgwebe ohne Zeichen von Zelluntergängen

(Abb. 66 - 67). In den Abb. 68 und 69 lassen sich die morphologischen Unterschiede

verschiedener Entwicklungstadien der humanen Fettzelle (Pfeil links oben und unten)

sowie der morphologische Unterschied von humanen und murinen Fettzellen (Pfeil

rechts oben) beobachten. Während rechts in den Bildern die ausdifferenzierten

humanen Adipozyten mit einem Zelldurchmesser von 80 – 130 μm betrachtet werden

können, finden sich links Fettzellen auf dem Weg von ihrem Präadipozyten- zum

Adipozytenstadium. Rechts oben in den Bildern befinden sich oberhalb des

Panniculus carnosus die murinen Adipozyten, welche im Vergleich zu den reifen

humanen Fettzellen einen deutlich kleineren Zelldurchmesser aufweisen.

Die makroskopische Bewertung und die Histomorphometrie der Gruppe 4 sind

signifikant höher im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Abb. 70 u. 71). Zu einem

späteren Explantationszeitpunkt hätte die makroskopische und

histomorphometrische Bewertung vielleicht noch bessere Ergebnisse geboten, da

63

64

zum Zeitpunkt der Explantation nicht alle injizierten Präadipozyten zu Fettzellen

ausgereift waren (Abb. 68 und 69).

Abb. 64. G4 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25 Abb. 65. G4 Kryo-Schnitt, Oil-Red-Färbung, x25

Abb. 66. G4 Paraffin-Schnitt, H&E -Färbung, x25 Abb. 67. G4 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin- Färbung, x25

Abb. 68. G4 Paraffin-Schnitt, H&E -Färbung, x100 Abb. 69. G4 Paraffin-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

65

3.2.5 Gruppe 5: 30 Mill. Präadipozyten in 1 ml Fibrin Bei Gruppe 5 ließen sich 6 Konstrukte makroskopisch und 7 histologisch erkennen.

Die sechsfache Zellzahl hat sich sowohl auf die Größe als auch die Qualität des

neugebildeten Fettgewebes positiv ausgewirkt (Abb. 72 - 73). Trotz der insgesamt

der großen Volumina des vorzufindenden Gewebes im Vergleich zu den anderen

Vergleichsgruppen sind peripher und zentral liegende Zellen gut entwickelt und

zeigen keine Anzeichen von Zelluntergängen, Ölzysten oder Kalzifikationen. In

zahlreichen Fällen konnte die Zusammenlagerung einzelner Fettzellen und ihre

Umrahmung durch Bindegewebssepten in einer Form nachgewiesen werden, wie sie

Ska

la

Abb. 70. Makroskopische Bewertung der Gruppe 4

Abb. 71. Histomorhometrische Auswertung der Gruppe 4

66

für matures humanes Fettgewebe histologisch typisch ist. Die Immunhistologie hat

zudem auch erhärtet, daß es sich um humane Adipozyten handelt (Abb. 74 u. 75).

Hinsichtlich der Größe sind beide Auswertungen signifikant gegenüber der

Kontrollgruppe (Abb. 76 u. 77); außerdem zeigt die Gruppe auch im Vergleich mit

allen anderen Gruppen, außer mit Gruppe 4, einen signifikanten Größenunterschied.

Abb. 73. G5 Kryo-Schnitt, Oil-red-O-Färbung, x25Abb. 72. G5 Kryo-Schnitt, H&E-Färbung, x25

Abb. 74. G5 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x25

Abb. 75. G5 Kryo-Schnitt, Anti-Vimentin-Färbung, x100

67

3.2.6. Gruppe 6: 1 ml Fibrin ohne Zellen Die Gruppe 6 diente als Kontrollgruppe für die Gruppen 1 bis 5. Nach 4 Wochen konnten unterhalb der Panniculus carnosus kein Fibrin und keine Zellen vorgefunden

werden (Abb. 78). Nur Reste der Faszie zwischen dem Panniculus carnosus und der

Skelettmuskulatur fanden sich in manchen Schnitten. Aufgrund dessen wurde bei der

Statistik die Gruppe 6 im Vergleich mit den anderen Gruppen immer gleich Null

gesetzt, da in der subjektiven makroskopischen Bewertung und in der

Histomorphometrie kein Volumen ersichtlich und messbar war. Fast alle Gruppen

Ska

la

Abb. 76. Makroskopische Bewertung der Gruppe 5

Abb. 77. Histomorphometrische Auswertung der Gruppe 5

68

waren signifikant im Vergleich zu Gruppe 6, einzig die Gruppen mit weniger als 5

positiven Explantaten konnten keine Signifikanz vorweisen.

3.3. Vergleich der Gruppe 1 mit den anderen Gruppen 3.3.1. Vergleich zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 Nach 4 Wochen ließ sich noch kein wesentlicher Unterschied zwischen den beiden

Gruppen feststellen. Die Gruppe 2 schien subjektiv geringfügig mehr Volumen

aufzuweisen, während die Präadipozyten anfingen sich zu differenzieren. Bei den

Gruppen 1.2 und 2.2 fanden sich deutlichere Unterschiede. Die Gruppe 1.2 hatte

einen höheren Anteil differenzierter Zellen als die Gruppe 2.2 aufzuweisen (Abb. 11

u. 32). Die Gruppe 2.2 schien subjektiv an Volumen abzunehmen und in einigen

Implantaten konnten Kalzifikationen angetroffen werden. Hierbei handelt es sich

wahrscheinlich um dystrophische Kalzifikationen aufgrund ungenügender

Gefäßversorgung der Fibroblasten im Zentralbereich des Implantates. Nach 6

Monaten treten diese Unterschiede stärker hervor. Zudem finden sich in den

Explantaten der Gruppe 2.3 neben den Fibroblasten untypische Adipozyten

humanen Ursprungs. Der Volumenunterschied nach 6 Monaten ist zwar nicht

signifikant, aber der Maximalwert der Gruppe 2.3 ist bei Histomorphometrie ca. 40%

geringer als der Maximalwert der Gruppe 1.3 (Abb. 79 u 80).

Abb. 78. G6 Paraffin-Schnitt, H&E-Färbung, 25x

69

3.3.2. Vergleich zwischen der Gruppe 1 und der Gruppe 3 Nach 4 Wochen unterscheiden sich die beiden Gruppen nicht wesentlich. Die Gruppe

1 zeigte tendenziell mehr sich differenzierende Präadipozyten mit multi- oder

univakuolärer Struktur. Nach 3 Monaten fanden sich bei Gruppe 1 subjektiv deutlich

mehr differenzierte Präadipozyten (Abb. 11 u. 42). Die Gruppe 1.3 nach 6 Monaten

bot ein homogenes Bild differenzierter Fettzellen, während bei der Gruppe 3.3 nach 6

Monaten nur einige wenige adulte Fettzellen anzutreffen waren. Statt differenzierter

Zellen konnten einige fibroblasten-ähnliche Zellen humanen Ursprungs und häufig

auch ein ausgeprägter Randsaum aus murinen Bindegewebe vorgefunden werden.

Signifikant ist der Unterschied bei der Histomorphometrie und bei der

Ska

la

Abb. 79. Makroskopische Bewertung von G1 und G2

Abb. 80. Histomorphometrische Auswertung von G1 und G2

70

makroskopischen Bewertung der Konstrukte bei der Explantation nicht, aber die

histomorhometrischen Maximalwerte liegen bei der Gruppe 3.3 mit dem Wert 3,44

mm² und bei der Gruppe 1.3 mit dem Wert 4,68 mm² relativ weit auseinander (Abb.

81 u. 82).

Ska

la

Abb.81. Makroskopische Bewertung von G1 und G3

Abb. 82. Histomorphometrische Auswertung von G1 und G3

71

3.3.3. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 4 Beide Gruppen weisen differenzierte Adipozyten humanen Ursprungs auf (Abb. 20 u.

69). In keinem Explantat beider Gruppen fanden sich atypische Auffälligkeiten im

Sinne von Zelluntergängen, Kalzifikationen oder Infektionen. Tendenziell konnte

sowohl in der Histomorphometrie als auch bei der makroskopischen Bewertung ein

Unterschied hinsichtlich der Größe der beiden Gruppen bemerkt werden (Abb. 83 u.

84). Der Median bei der makroskopischen Bewertung der Gruppe 4 beträgt 3 und der

Median bei der Histomorhometrie 2,9 mm², während die Gruppe 1.3 die Mediane 1

und 0,75 mm² vorweist. Ebenso unterschiedlich sind auch die Maximalwerte bei der

Histomorphometrie. So konnte bei der Gruppe 1.3 eine Maximalfläche von 4,68 mm²

gemessen werden, bei der Gruppe 4 ein durchschnittlicher Maximalwert von 9,6

mm². Auch wenn dieser Unterschied nicht signifikant ist, so lässt sich zumindest eine

Tendenz erahnen.

Ska

la

Abb.83. Makroskopische Bewertung von G1.3 und G4

72

3.3.4. Vergleich zwischen der Gruppe 1.3 und der Gruppe 5 Hinsichtlich der Differenzierung der Präadipozyten unterscheiden sich die beiden

Gruppen kaum; beide weisen einen Zellverband aus reifen Fettzellen auf. Auch

fanden sich beiden Gruppen keine Zeichen von Zelluntergängen oder Infektionen

(Abb. 17 u. 72). Signifikante Unterschiede finden sich sowohl bei der

Histomorphometrie als auch bei der makroskopischen Bewertung der Explantate

(Abb. 85 u. 86). Während der Median und der Maximalwert bei der

Histomorphometrie für die Gruppe 1.3 bei 0,75 mm² und 4,68 mm² liegt, betragen sie

für die Gruppe 5 4,55 mm² und 16,38 mm². Zumal hier nur eine durchschnittliche

Flächenmessung vorliegt und der Median der Gruppe 5 mehr als das Siebenfache

über dem Wert der Gruppe 1.3 und der Maximalwert der Gruppe 5 beinahe 2,5 mal

so groß ist wie der Maximalwert der Gruppe 1.3, könnte vermutet werden, dass die

sechsfache Zellzahl der Gruppe 5 sich beinahe proportional auf die Ausbildung des

Endvolumens ausgewirkt haben könnte. Die Volumenzunahme wurde jedoch

weniger durch ein vermehrtes Tiefenwachstum erreicht, sondern vielmehr durch ein

Wachstum im horizontalen Verlauf zur Haut und Skelettmuskulatur; die maximale

Tiefe eines Implantates betrug ca. 2,5 mm, welche in der Gruppe 5 gemessen

werden konnte.

Abb. 84. Histomorphometrische Auswertung von G1.3 und G4

73

Zudem wies die Gruppe 5 einen signifikanten Größenunterschied in der

Histomorphometrie gegenüber allen Gruppen, außer der Gruppe 4, auf.

Ska

la

Abb. 85. Makroskopische Bewertung von G1.3 und G5

Abb. 86. Histomorphometrische Auswertung von G1.3 und G5

4. Diskussion

4.1. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit Ziel dieser Arbeit soll die Entwicklung eines alternativen Verfahrens zur

Weichteilsubstitution verschiedener Defektarten mit Hilfe der Verwendung von Tissue

Engineering sein. Diese Technik soll ermöglichen, auf synthetische Ersatzmaterialien

und invasive bzw. risikoreiche Operationen zu verzichten. Die Rekonstruktion oder

Augmentation soll mit autologem Gewebe erfolgen, sodass fehlendes Gewebe nicht

nur plastisch, sondern auch bezüglich seiner qualitativen Eigenschaften ohne

Unterschied ersetzt wird.

Forschungsschwerpunkte wurden in folgenden Bereichen des Tissue Engineering

gesetzt: (a) Vergleich zwischen Präadipozyten und Fibroblasten; (b) Vergleich

zwischen Präadipozyten und Präadipozyten mit HDMVEC als Sphäroide; (c)

Vergleich zwischen Einfachinjektion und Mehrfachinjektion von Präadipozyten; (d)

Vergleich zwischen einfacher Zellzahl und erhöhter Zellzahl von Präadipozyten.

4.2. Der Aussagewert des Tiermodells Die athymische Nacktmaus als Versuchstier hat sowohl Vor- wie auch Nachteile. Ihre

Vorteile sind die Immuninkompetenz gegenüber xenogen Zellen, wie die hier

verwendeten humanen Präadipozyten, Fibroblasten und HDMVECs, und ihre leichte

Pflegbarkeit. Zudem sind ethisch-moralische Bedenken bei einer größeren Anzahl an

Versuchstieren geringer anzusehen als bei Affen oder Menschen.

Nachteilig ist ihre Größe, da aufgrund ihrer geringen Körpergröße 1 ml Fibrin schwer

in eine bestimmte anatomische Struktur appliziert werden kann, wie z.B. der Brust,

der Lippe oder im Verlauf eines bestimmten Gefäßes, zumal 1 ml bei einer 28 g

schweren Maus ungefähr 2 – 3 Litern bei einem Menschen entsprechen würde. Ein

genereller Nachteil bei Tierversuchen ist zudem, dass Beobachtungen und

Messungen während der Implantationszeitraumes sich schwierig und häufig auch

kostspielig gestalten, wie PKH gelabelte Zellen, MRT-Aufnahmen oder regelmäßige

Gewichtskontrollen. Aufgrund dieser Untersuchungen kann häufig kaum eine

Aussage getroffen werden hinsichtlich endokriner oder supportiver Einflüssen, die auf

die implantierten Zellen einwirken.

Auch kann keine definitive Aussage getroffen werden, ob ein autologer Transfer

humaner Präadipozyten in Fibrin den gleichen, einen positiveren oder negativeren

74

Verlauf auf die Entwicklung vitalen Fettgewebes als Weichteilgewebeersatz nehmen

würde. Die bestehende Immunkompetenz bei einer autologen Transplantation sollte

keinen Effekt auf das Resultat haben. Sehr wohl könnte beispelsweise humanes

Insulin und humane Wachstumsfaktoren auf injizierte humane Präadipozyten in

Fibrin einen anderen Effekt ausüben als murines Insulin und murine

Wachstumsfaktoren, da humanes Insulin sich einerseits durch seine Struktur

unterscheidet und andererseits auch in anderen Mengen sezerniert wird als in

anderen Organismen. Ähnliche Aussagen können wahrscheinlich auch bezüglich der

Geschwindigkeit der Vaskularisierung getätigt werden.

4.3. Präadipozyten und Fibroblasten

4.3.1. Potenzial der Präadipozyten im Vergleich zu Fibroblasten für Weichteilgewebesubstitution

Drei Aspekte spielen eine wesentliche Rolle bei der Diskussion um die Fragestellung,

ob Präadipozyten oder Fibroblasten in Fibrin besser für die Weichteilsubstitution

geeignet sind:

1. Größe des erzielten Volumens bei gleicher Ausgangszahl

2. Histologische Qualität

3. Für welchen Defekt eignet sich welche Zelle am besten?

Zu 1.: Beide Gruppen zeigen im Zeitraum von 4 Wochen bis 6 Monaten keinen

signifikanten Unterschied bezüglich des erzielten Volumens. Allerdings weist die

Gruppe 1 mit den Präadipozyten über diesen Zeitraum eher eine Tendenz zur

Volumenzunahme auf, während die Gruppe 2 mit Fibroblasten zu einer

Volumenabnahme tendiert.

Zu 2.: Die Gruppe 1 entwickelte sich zu ihrem Vorteil im Gegensatz zu der Gruppe 2.

In der Gruppe 1 differenzierten sich die Präadipozyten ohne Zeichen von Nekrosen,

Ölzysten und Kalzifikationen zu reifen Adipozyten; die Fibroblasten differenzierten

sich zwar ebenso, jedoch neigte ein Anteil bei einigen Implantaten mit Fibroblasten

zu dystrophischen Verkalkungen und es fanden sich Adipozyten-ähnliche Zellen.

Letzteres ist für die Weichteilsubstitution kein Nachteil, die dystrophischen

Verkalkungen sind jedoch störend für eine Weichteilsubstitution.

75

In Anbetracht von Aspekt 1 und 2 ließe sich vermuten, dass sowohl die Verkalkungen

als auch die mögliche Tendenz zu einer Volumenabnahme auf eine geringere

Vaskularisation der Implantate mit Fibroblasten zurückzuführen sein könnte.

Zu 3.: Unabhängig von der zu erreichenden Volumensubstitution und der Qualität der

verwendeten Zellen stellt sich auch die Frage, welcher Weichteildefekt sollte mit

Fibroblasten oder Präadipozyten korrigiert werden. Die Konsistenz von reifem

Bindegewebe ist straffer und stärker als die von adultem Fettgewebe. Wird

Weichteilgewebe beispielsweise für die Konturverluste durch muskuläre Atrophie

benötigt, wäre ein straffes und festes Weichteilgewebesubstitut wie Fibroblasten in

Fibrin oder Isolagen statt Präadipozyten in Fibrin oder autologem Fetttransfer

überlegenswert. Für die Augmentation von Lippen oder der Brust wären wiederum

die Präadipozyten wegen ihrer weicheren Konsistenz von Vorteil. Desweiteren liegt

bei den Patienten in der Regel eine größere Quelle für Präadipozyten vor, so dass

größere Areale mit autologen Zellen therapiert werden könnten.

Sowohl Fibroblasten als auch Präadipozyten sind zur Weichteilsubstitution geeignet.

In dieser Studie stellten sich die Präadipozyten in Fibrin als besserer

Weichteilgewebeersatz als die Fibroblasten in Fibrin heraus. Im Gegensatz zu den

Fibroblasten entwickelten sich die Präadipozyten zu einem morphologisch

äquivalenten Fettgewebe ohne Zeichen von Zellnekrose oder atypischen Zellen. Dies

soll nicht bedeuten, dass Fibroblasten prinzipiell als Weichteilgewebesubstitut zu

verwerfen wären. Vielleicht können die Mängel, welche in dieser Studie bei den

Fibroblasten aufgetreten sind, durch eine andere Trägermatrix wie Hyaluronsäure,

Kollagen oder eine Mischung verschiedener extrazellulärer Bestandteile behoben

werden. Schließlich ist das Ziel, für jeden Weichteilgewebedefekt möglichst das

beste Weichteigewebeäquivalent als Therapie anwenden zu können.

76

4.3.2. Vergleich mit anderen Transplantationen von Präadipozyten Die ersten Implantationen von Präadipozyten in Tiere dienten v.a. als Beweis für die

Existenz von Präadipozyten (Green H 1979; Van 1982). Für diese Implantationen

wurden jedoch noch keine Matrizes verwendet oder adipogene Faktoren hinzugefügt.

Bisher zur Transplantation von humanen Präadipozyten eingesetzte Biomatrizes sind

Alginate (Halberstadt C 2002), Fibrin (Wechselberger 2002; Cho 2005),

Mikrosphären aus Gelatine (Kimura Y 2003), poröse, bioabbaubare

Polymerschwämme (PLGA) (Patrick 1998; Patrick 1999; Yuksel E 2000) sowie

Kollagen- und Hyaluronsäureschwämme (von Heimburg 2001; Hemmrich 2005). In

der Literatur finden sich nur wenige Langzeittierversuche. Die meisten Tierversuche

weisen eine Spanne von 2 bis 8 Wochen auf. Nach dieser Zeit sind Aussagen

hinsichtlich der Differenzierung und der Volumenpersistenz eingeschränkt zu

betrachten, da z.B. die Präadipozyten nach 8 Wochen meist noch nicht vollständig

differenziert sind. Die wenigen Langzeittierversuche haben Implantationszeiten von 3

bis 12 Monaten. Der Vergleich dieser Versuche ist wiederum nur begrenzt möglich,

da autologe und xenogene Präadipozyten, verschiedene Matrizes, unterschiedliche

Zellzahlen pro Injektionsvolumen sowie andere Faktoren variieren.

Studien zur Eignung von Fibrinkleber zur Transplantation von Präadipozyten wurden

von Schöller et al. sowie von Cho et al. publiziert (Schoeller 2001; Cho SW 2005).

Die Gruppe von Schöller et al. transplantierte epididymale Präadipozyten von Ratten

innerhalb einer Fibrinmatrix in präformierte, hochvaskularisierte, intramuskuläre

Kapseln mit gutem Erfolg. Ihre Implantationsdauer betrug maximal 12 Monate, die

implantierte Zellzahl ist jedoch reduziert und das Vaskularisierungspotential der

Empfängerstelle unterhalb des Musculus rectus abdominis erhöht.

In der Gruppe von Cho et al. wurden 8 Mill. humane Präadipozyten in 200 μl Fibrin

athymischen Nacktmäusen implantiert (Cho SW 2005). Das Fibrin wurde mit PGA-

PLLA- [polyglycolic acid poly-(L)-lactic acid] Fasern modifiziert. Der Versuch dauerte

6 Wochen und wies eine signifikante Steigerung der Differenzierung und der

Volumenpersistenz bei dem modifizierten Fibrin mit PGA-PLLA gegenüber dem

einfachen Fibrinkonstrukt nach.

In der Gruppe von Kimura et al. wurden auch humane Präadipozyten in weibliche

BALB/c Mäuse für 6 Wochen implantiert, jedoch diente als Matrix eine mit bFGF

bestückte Mikrosphäre aus Gelatine (Kimura Y 2003). Eine Versuchsgruppe hatte die

77

gleiche Zellzahl mit 5 Mill. Präadipozyten wie die Gruppe 1.3 aus der vorliegenden

Versuchsreihe. In der Histomorphometrie betrug der Maximalwert 3mm² in der

Gruppe von Kimura et al., während der Maximalwert in Gruppe 1.3 sich bei ca. 2,5

mm² befand. Jedoch wurden bei Kimura et al. mit 1 Mill. Präadipozyten fast

identische Werte erreicht. Auf den Bildern erschienen die Präadipozyten mit 50-100

μm Vakuolendurchmesser deutlicher differenziert zu sein, was vielleicht auf das

bFGF in der Matrix zurückzuführen ist.

Bei Halberstadt et al. wurden Alginate mit und ohne RGD, die mit autologen

Präadipozyten besiedelt waren, in den Nacken von Schafen für 3 Monate

transplantiert (Halberstadt 2002). RGD bezeichnet eine R-Arginin-Glycin-D-

Asparagin-Sequenz, welche die Adhäsion von Zellen an Proteinbestandteile von

Alginaten, Fibronektin und dergleichen erhöhen soll. Ein Alginat von Halberstadt

beinhaltete ca. 30 Mill. Präadipozyten. In der Histomorphometrie konnte explantiertes

Fettzellgewebe mit einer Fläche von 45 bis 55 mm² gemessen werden. Jedoch

konnte nicht geklärt werden, ob es sich bei diesen Fettgewebeexplantaten um die

eingebrachten Präadipozyten oder um eingewachsene Fettzellen handelte.

Versuche von von Heimburg et al. dienten zur unterschiedlichen Eignung

verschiedener Trägermatrizes wie Kollagen und HYAFF zur Transplantation von

Präadipozyten in athymische Nacktmäuse (von Heimburg 2001). Die Dauer betrug 3

und 8 Wochen, während dieser Zeit nahmen die Kollagenkonstrukte an Gewicht ab

und die HYAFF-Schwämme an Gewicht zu. In beiden Matrizes fanden sich kaum

differenzierte Zellen (Hemmrich 2005).

Patrick et al. benutzten PLGA-Matrizes, die mit humanen Präadipozyten besiedelt

wurden, zur Augmentation von Fettgewebe in Wistar-Ratten. Nach einem

anfänglichen Volumenanstieg innerhalb der ersten 2 Monate schrumpften die

Implantate zunehmend, so dass am Ende des Langzeittierversuches nach 6

Monaten kaum humane Präadipozyten oder humane Adipozyten angetroffen werden

konnten. Als Ursache wird eine zu geringe Vaskularisation des implantierten

Konstruktes vermutet (Patrick 1998; Patrick 1999; Patrick CW 2000; Patrick 2002).

78

4.3.3. Fibroblasten als Weichteilsubstitut in anderen Arbeitsgruppen

Ein alternativer Tissue-Engineering-Ansatz zur Rekonstruktion von Weichteilgewebe ist die Transplantation von Fibroblasten-Kulturen. Auf zwei andere

Langzeittierversuche mit Fibroblasten möchte ich hier eingehen. In der Arbeitsgruppe

von Marler et al. wurden Alginatgele in Verbindung mit und ohne RGD-Sequenzen

verwandt, welche eine bessere Adhäsion der Zellen an den Alginatgelen ermöglichen

sollen (Marler JJ 2000). Diese wurden jeweils mit 20 Mill. allogene Fibroblasten

besiedelt und für einen Zeitraum von 8 Wochen in männliche Lewisratten implantiert.

Marler beschreibt eine Volumenpersistenz sowie Volumenzunahme der Konstrukte.

Von ähnlichen Vorkommnissen wie die Kalzifikation der Konstrukte in dieser Arbeit

findet sich nicht in Malers Studie. Jedoch schließt dies nicht aus, dass sich

Kalzifikationen nicht noch nach 8 Wochen hätten bilden können. Zumal sich in der

hier vorliegenden Studie sich auch erst nach 3 Monaten die ersten Kalzifikationen

zeigten. Die in der Studie verwendeten modifizierten Alginatgele könnten jedoch

auch für Tissue-Engineering-Ansätze mit Präadipozyten von Interesse sein.

In der Arbeit von Masuda et al. wurden Gelatinematrizes, die mit bFGF und IGF-I

modifiziert wurden, verwendet (Masuda 2004). Diese Konstrukte wurden in 6

Wochen alte Wistar-Ratten implantiert. Durch die Wachstumsfaktoren wurden lokale

autologe Fibroblasten stimuliert, in die Matrix zu immigrieren und zu proliferieren.

Nach 6 Wochen waren die Matrizes besiedelt und es wurde ein Volumenanstieg

verzeichnet. Auch hier ist der Implantationszeitraum relativ kurz. Es wäre interessant,

ob eine zusätzliche Implantation von Fibroblasten einen additiven Effekt bezüglich

des Volumenanstiegs hätte und ob bFGF und IGF-I eine Kalzifikation sowie andere

negative Verläufe verhindern könnte.

Im Gegensatz zu Präadipozytenmodellen für den Weichteilgewebeersatz werden

Fibroblasten in Form des Isolagens bereits seit 6 Jahren klinisch an Patienten für die

Behebung kleinerer Weichteilgewebsdefekte erprobt (Watson D 1999; Weiss 2005).

Klinische Studien von Watson D. et al. sowie Weiss R.M. et al. berichten von guten

Ergebnissen in Zeiträumen von 1 bis 2 Jahren. Auch wenn bei den klinischen

Versuchen und den Tierversuchen keine Kalzifikationen oder andere

Zellveränderungen bislang zu beobachten, kann durchaus die Frage gestellt werden,

warum mit den Präadipozytenmodellen bislang noch kein klinischer Versuch

durchgeführt wurde. Bei den vorliegenden Tierversuchen mit Präadipozyten traten

79

keine potenziellen Risiken für den Patienten auf. Der Einsatz autologer

Präadipozyten z.B. bei eingesunkenen Narben oder Falten sowie anderen kleineren

Weichteilgewebeverlusten und –konturdeformitäten wäre durchaus denkbar.

4.4. Präadipozyten und Angiogenese 4.4.1. Effekt der Koimplantation von HDMVECs als Sphäroide auf

Präadipozyten

Bei der Gruppe 3 wurde beabsichtigt, durch Koimplantation von HDMVEC als

Sphäroide eine bessere Vaskularisation des Konstruktes und einen positiven Einfluß

auf die Differenzierung der Präadipozyten zu erreichen. Weder konnte eine bessere

Vaskularisation noch eine bessere Differenzierung festgestellt werden. In der

Immunhistologie der Gruppe 3 mit Hilfe eines spezifischen CD34 – Antikörpers ließen

sich zu keinem Explantationszeitpunkt HDMVECs innerhalb des Implantates

feststellen. Die Präadipozyten entwickelten sich im Vergleich zu denen aus Gruppe 1

nur spärlich zu adulten Fettzellen. Zum spätesten Explantationszeitpunkt fand sich

zudem auch zunehmend murines Bindegewebe um und in dem Implantat.

Das Sphäroidmodell fußt auf der Erkenntnis, dass ein interzellulärer Kontakt der

Endothelzellen nötig ist, um deren Zelluntergang zu verhindern und die Formation

eines neuen Gefäßsystems zu erzeugen. Werden Endothelzellen in

Einzellsuspension in Konstrukte auf der Basis extrazellulärer Matrizes eingebracht,

erfolgt innerhalb kurzer Zeit ihr Zelluntergang (Schechner 2000). In Fibringelen

bewirken Wachstumsfaktoren das Überleben und die Proliferation von

Endothelzellen, aber nicht deren Differenzierung. Unentbehrliche Voraussetzung für

die Differenzierung scheint das Bestehen von Zell-Zell-Kontakten zu sein (Kadish J L

1979; Nehls V 1995; Koolwijk P 1996; Bach 1998), welche durch die Akkumulation

der HDMVECs in dem Sphäroid gewährleistet wird.

In CAM - Versuchen konnten zwar zunehmende Vaskularisation und eine Anbindung

der Gefäße der CAM an die aus HDMVEC gebildeten Gefäßen nachgewiesen

werden (Borges 2003), aber diese Ergebnisse ließen sich im Langzeittierversuch

nicht reproduzieren. Möglicherweise wurden diese Effekte bezüglich Vaskularisation

und Differenzierung durch das Methocel, welches ein Bestandteil des Sphäroides ist,

verhindert, da Methocel toxisch auf Zellen wirken kann. Dieser zelltoxische Effekt tritt

80

vielleicht erst nach längerer Zeit auf, so dass dieser in kürzer dauernden Versuchen

wie bei dem CAM-Versuch nicht zu Tage treten konnte. Eine andere Möglichkeit

wäre, dass sich das Verhältnis von HDMVECs, Präadipozyten und Fibrin negativ

ausgewirkt hat. Ein Überschuss angiogenetischer Faktoren kann sich auch als

hinderlich für die Vaskularisation erweisen, da Gefäßbildung aufgrund einer

Disbalance verschiedener angiogenetischer Faktoren eine verstärkte Migration der

Endothelzellen eine Formation derselben zu einem Gefäß verhindern kann (Browder

T 2000).

4.4.2. Weitere Möglichkeiten für die Angiogenese von

Weichteilgewebesubstituten

In Anbetracht der Ergebnisse aus dem vorliegenden in-vivo Versuch und aus dem

CAM-Versuch sollte das Sphäroidmodell nicht verworfen, sondern überarbeitet

werden. Beispielsweise könnte das Methocel durch einen anderen chemischen Stoff,

welcher keinen zelltoxischen Effekt aufweist, ersetzt werden. Neben dem

Sphäroidmodell wären auch noch andere Modelle zur Steigerung der Vaskularisation

denkbar. Durch Anastomosen oder Einbringen eines Gefäßastes aus einem anderen

Versorgungsgebiet könnte an der Implantationsstelle die Gefäßvernetzung bzw. die

Durchblutung gesteigert werden (Cronin 2004). Neben konventionellen chirurgischen

Interventionen könnte mit den Präadipozyten in Fibrin ein oder mehrere resorbierbare

Röhrchen koimplantiert werden, die mit Endothelzellen und glatten Muskelzellen

ausgekleidet sind (Niklason 1997; Soker 2000; Cassell 2002; Berglund 2003; Unger

RE 2004). Eine Anastomose, das Einbringen eines Gefäßastes oder die

Koimplantation eines oder mehrerer resorbierbarer Röhrchen würden jedoch einen

chirurgischen Eingriff erfordern, so dass es sich nicht mehr um einen minimal-

invasiven Eingriff handeln würde, wie die Injektion von Präadipozyten in dieser

Arbeit.

Neben den bioartifiziellen Gefäßen wäre auch eine therapeutische Angiogenese oder

eine therapeutische Vaskulogenese, auch Arteriogenese genannt, denkbar. Die

therapeutische Angiogenese induziert mit Hilfe von angiogenetischen Faktoren, wie

bFGF, aFGF oder VEGF, ein Gefäßnetz. Diese angiogenetischen Faktoren können

über die Matrix lokal an die innewohnenden Zellen und das angrenzende Gewebe

abgegeben werden, systemisch appliziert oder durch Transfektion der implantierten

81

Zellen produziert werden (Bauters 1994; Takeshita 1994; Asahara T 1996; Isner JM

1996; Takeshita 1996; Schumacher 1998). Bei der therapeutischen Vaskulogenese

werden durch GM-CSF die hämapoetische Stammzellproduktion, insbesondere

Makrophagen, stimuliert (Takahashi 1999). Bei GM-CSF handelt es sich um den

Kolonie stimulierender Faktoren der Granulozyten- und Makrophagenzelllinie. Hierbei

wirkt GM-CSF chemotaktisch auf die Makrophagen, so dass diese sich an Gefäße in

dem Areal anhaften, in welchem das GM-CSF appliziert wird, und dort durch

sekretierte Substanzen die Arteriogenese beschleunigen. Therapeutisch wurde GM-

CSF v.a. hinsichtlich der Arteriosklerose untersucht (Schaper 2003).

Auch wenn sich die erfolgreichsten Implantate ohne einen zusätzlichen Stimulus zu

reifem Gewebe entwickelten, so könnte durch eine forcierte Angiogenese das

Resultat noch verbessert werden. Wie in dem Abschnitt 3.2.4. vermerkt, vermochten

die Implantate, maximal 2 bis 3 mm in die Tiefe zu wachsen. Bei den größeren

Implantaten siedelten sich die Zellen vor allem in der Ebene ab und weniger in die

Tiefe. Vielleicht wäre durch eine der oben genannten Methoden für eine geförderte

Vaskularisation des entstehenden neuen Fettgewebes eine Möglichkeit gegeben, die

Distanz von 2 bis 3 mm zwischen Haut und Skelettmuskulatur deutlich zu

vergrößern. Bioartifizielle Gefäße in Kombination mit einer angiogen wirkenden

Matrix wäre wahrscheinlich die viel versprechendere Lösung, da diese den

Präadipozyten nicht nur eine verbesserte Vaskularisation ermöglichen würden,

sondern auch den Präadipozyten als Leitschiene die Wachstumsrichtung vorgeben

könnte.

82

4.5. Mehrfachinjektion

Bei der Gruppe 4 wurden am Implantationszeitpunkt, 4 Wochen und 3 Monate nach

Implantation jeweils 5 Mill. Präadipozyten in 1 ml Fibrin injiziert. Es wurden also

insgesamt 15 Mill. Präadipozyten in die gleiche Stelle appliziert. Im Vergleich mit der

Gruppe 1.3 erscheint der Größenunterschied zwar deutlich zu sein, jedoch ist dieser

nach Mann-Whitney-U-Test nicht signifikant (Abb. 86 u. 87). Während in der

Histomorphometrie der Gruppe 4 der Median 2,9 mm² und Maximalwert 9,34 mm²

beträgt, liegen diese bei 0,75 mm² und 4,68 mm² in der Gruppe 1.3. Hierbei muß

auch bedacht werden, dass in manchen Implantaten auch noch nicht völlig

differenzierte humane Fettzellen der letzten Injektion vorzufinden waren, welche

wahrscheinlich noch zu einem weiteren Volumenwachstum zu einem späteren

Zeitpunkt beigetragen hätten, wie in dem Abschnitt 3.2.4. näher ausgeführt wurde.

Trotz fehlender statistischer Signifikanz erscheint die Mehrfachinjektion einen

Volumenzuwachs zu bewirken. Es finden sich hinsichtlich Differenzierungsgrad und

sonstigen qualitativen Merkmalen keine Unterschiede zwischen der Gruppe 1.3 und

Gruppe 4.

Die Mehrfachinjektion hat zudem weitere Vorteile für den Patienten und für die

Zellzüchtung. Beispielsweise kann dem Patienten eine geringe Menge bei der ersten

Injektion verabreicht werden, so dass nach Ablauf der Differenzierung der Zellen

durch den Patienten und den Operateur entschieden werden kann, ob mehr injiziert

werden soll oder Konturen nachgebessert werden müssen. Bei größeren

Weichteildefekten und insbesondere bei Weichteilaugmentationen wird der Patient

durch kleine allmähliche Applikationen weniger belastet. Durch ausreichende

Intervallzeiträume wird den entstandenen Kapillaren eine Remodelierung und das

Enstehen größerkalibriger Gefäße gestattet (Nor 2001). Für das Labor bedeutet eine

Mehrfachinjektion in Abständen von Wochen oder Monaten mehr Zeit, um die nötige

Zellzahl zu isolieren und zu kultivieren.

Bei der Mehrfachinjektion traten zwar keine Probleme auf, jedoch könnte die Frage

gestellt werden, wie groß die Abstände zwischen den Injektionen für eine optimale

Volumenvergrößerung sein sollten. In unserem Versuchsaufbau wurde ein Abstand

von 4 Wochen und von 2 Monaten gewählt. Bei den Routinebeobachtungen der

Mäuse zeigte sich tendenziell, dass die erste Nachinjektion weniger effektiv war als

die zweite Nachinjektion.

83

4.6. Zusammenspiel von Fibrin- und Präadipozytenkonzentration

4.6.1. Der Effekt einer erhöhten Zellzahl von Präadipozyten auf die

Persistenz und Steigerung des Volumens

Die Gruppe 5 zeigte ein signifikant größeres Explantationsvolumen als alle anderen

Gruppen, abgesehen von der Gruppe 4. Wie bereits in dem Abschnitt 3.3.5.

dargelegt, liegt im Vergleich zu Gruppe 1.3 fast ein proportionales Verhältnis

zwischen erhöhter Zellzahl und erreichter Substitution vor. Interessant ist

desweiteren, dass auch in dieser Gruppe 1ml Fibrin für die Zellsuspension und die

Injektion der Zellen verwandt wurden. Dies würde erlauben wesentlich weniger Fibrin

zu verwenden. Auf diese Weise könnten die Präadipozyten präziser an eine

bestimmte Stelle appliziert werden und die Differenz zwischen Injektionsvolumen und

Endvolumen wäre deutlich kleiner.

Anscheinend müssen die angiogenetischen Faktoren der Präadipozyten und des

Fibrins ausgereicht haben, um eine frühzeitige Vaskularisation zu bewirken.

Schließlich finden sich auch in der Gruppe 5 keine Anzeichen von Zellnekrose,

Fibrose und Entzündungsreaktionen, die auf eine irreguläre Entwicklung der

Präadipozyten hinweisen würden.

In dieser Gruppe konnte das größte Explantat angetroffen werden mit einer Fläche

von 16 mm². Übertragen auf eine 70 kg schwere Person wäre dies ungefähr ein 7 cm

durchmessende Kugel. Sicherlich kann das vorliegende Ergebnis nicht eins zu eins

von der Maus auf den Menschen übertragen werden, aber auch nur ein Bruchteil

dieser Kugel könnte in der plastischen und ästhetischen Chirurgie Verwendung als

Weichteilgewebeersatz dienen.

84

4.6.2. Senkung des Fibrins im Verhältnis zu den Präadipozyten Aufgrund der Ergebnisse der Gruppe 5 wäre es möglich, die Fibrinmenge zu

reduzieren. In der Gruppe 5 war das Verhältnis von Fibrin zur Anzahl der

Präadipozyten um das sechsfache geringer als bei den anderen Gruppen, trotzdem

hat sich diese Gruppe äußerst vorteilhaft entwickelt. Eine geringere Menge Fibrin

würde eine bessere Applikation erlauben, da einerseits insbesondere bei

Tierversuchen an Mäusen oder Ratten das Fibrinkonstukt gezielter in eine bestimmte

anatomische Struktur injiziert werden könnte und andererseits das Injektionsvolumen

mehr dem Endvolumen der implantierten Zellen entsprechen würde.

4.7. Aussichten 4.7.1. Dermolipektomien und Liposuktionen

Im weiteren Verlauf könnten Präadipozyten aus Dermolipektomien und

Präadipozyten aus Liposuktionen in einem mindestens 3 Monate dauernden

Tierversuch verglichen werden, da in der vorliegenden Studie ausschließlich

Präadipozyten aus Dermolipektomien verwendet wurden. In der Literatur finden sich

meist nur Vergleiche von adulten Fettzellen aus Dermolipektomien und Liposuktionen

(Nguyen A 1990; Kononas 1993; Boschert MT 2002; Butterwick 2002; Rohrich RJ

2003). Fettzellen aus Liposuktion sollen die gleiche strukturelle Integrität besitzen,

aber eine geringere zelluläre Aktivität als Fettzellen aus Dermolipektomien (Pu 2005).

Diese Feststellungen können allerdings nicht übertragen werden auf Präadipozyten,

da die adulten Fettzellen beispielsweise einen stärkeren Metabolismus und eine

geringere mechanische Widerstandskraft als Präadipozyten besitzen.

Von Heimburg et al. berichtet von der Überlegenheit der Liposuktion gegenüber der

Dermolipektomie hinsichtlich der Überlebensfähigkeit der Präadipozyten nach 24

Stunden (von Heimburg 2004). Huss et al. wiederum untersuchten Präadipozyten

aus Zellkulturen, Dermolipekomien und Liposuktionen (Huss 2002). Als Kriterien

wurde Anzahl der gesunden Zellen durch Trypan-Blau in der Neubauer-Zählkammer,

die Expression von Glyzerol-3-Phosphatase-Dehydrogenase (G3PDH) sowie die

histologische Bewertung herangezogen. Lediglich bezüglich der G3PDH-Expression

wiesen die liposuktionierten Präadipozyten eine geringere Ausprägung auf, so dass

die Präadipozyten aus Dermolipektomien als überlegen angesehen wurden.

85

Beide Arbeiten klären jedoch nicht, wie sich Präadipozyten aus Dermolipektomien

und Liposuktionen nach mehreren Passagierungen in Zellmedien verhalten. Auch

wurde nicht die Differenzierungfähigkeit der Präadipozyten in-vitro oder in-vivo aus

Liposuktion und Dermolipektomie überprüft; schließlich entwickeln sich

Präadipozyten vor allem in-vivo über einen längeren Zeitraum, wie in dieser Arbeit

ansatzweise gezeigt werden konnte. Derzeitig wird in unserer Arbeitsgruppe u.a.

versucht, diesen Fragen näher zu kommen.

4.7.2. Spenderregion und Empfängerregion

Die Aussagen bezüglich der Spenderregion sind in der Literatur verschieden.

Manche Autoren präferieren Fett aus dem Gesäß und der Lende, da dieses

gegenüber den Ernährungszustand relativ resistent sei (Markey AC 2000), andere

Fettgewebe vom inneren und äußeren Oberschenkel oder das abdominelle Fett

(Coleman 1995). Eine andere Studie wiederum berichtet, dass keine spezifische

Spenderregion nötig wäre, denn die Fähigkeit für die Fettaugmentation wäre bei allen

Spenderregionen im gleichen Maße vorhanden (Rohrich RJ 2003).

Außerdem könnten verschiedene Lokalisationen für die Injektion miteinander

verglichen werden, wie z.B. die Schädelkalotte, die Hüften, der Bauch, die Brust, etc..

Die Injektionspunkte sollten sich unterscheiden bezüglich ihrer Durchblutung, ihres

Weichteilgewebeanteils und anderer Kriterien. Auch hierzu finden sich in der Literatur

nur Aussagen über reife Fettzellen, die wiederum nicht einheitlich sind (De Pedroza

2000). Für diesen Versuch würde man von Mäusen wegen ihrer geringen Größe

abraten, stattdessen würden sich Ratten empfehlen.

86

4.7.3. Einfluß der Kryokonservierung auf die Präadipozyten

Weiterhin könnte der Einfluß des Einfrierens auf die Präadipozyten in diesem

Rahmen untersucht werden. Das Einfrieren von Fettzellen erlaubt mehrere

Implantationstermine über einen längeren Zeitraum mit einer einmaligen

Fettentnahme, was das Wohlbefinden des Patienten steigern sowie Kosten und Zeit

reduzieren würde. Auf adulte Fettzellen hat Einfrieren keinen signifikanten negativen

Effekt, da adulte Fettzellen wahrscheinlich wegen ihres Lipidspeichers gegenüber mit

Wasser gefüllten Zellen nur geringen Volumenveränderungen ausgeliefert sind

(MacRae JW 2004). Wie Präadipozyten auf Einfrieren reagieren bzw. inwiefern sie

nach dem Auftauen differenzieren können, ist noch nicht detailliert untersucht. In

diesem Versuchsaufbau konnte kein negativer oder positiver Effekt vermutet werden,

da die nach mehr als einem Jahr aufgetauten Präadipozyten, für die Gruppe 1.4

verwendet wurden, weder hinsichtlich ihrer Kultivierung noch hinsichtlich ihrer

Implantatbeständigkeit gegenüber frisch isolierten Zellen im Nachteil gestanden

hatten.

4.7.4. Übernahme von Techniken aus dem autologen Fetttransfer Während bei dem Weichteilgewebsersatz durch Präadipozyten bislang vor allem die

Isolation, Zellkulturtechnik sowie die Trägermatrix optimiert wurde, wurde parallel die

Liposuktions- und Applikationstechnik bei der autologen Transplantation von

Fettgewebe in mehrerer Hinsicht optimiert. In Zukunft wäre es durchaus interessant,

dieses Wissen für den klinischen Einsatz zu kombinieren (Fournier 2000; Markey

2000).

4.8. Stellung der vorliegenden Arbeit innerhalb des „Tissue Engineering“ Kleinere Weichteilverluste sowie Konturunebenheiten könnten durch Injektion von

humaner Präadipozyten in Fibrin behoben werden. Die humanen Präadipozyten

scheinen in Fibrin fähig zu sein, ein suffizientes Gefäßnetz zu induzieren und sich so

zu reifen Fettgewebe zu entwickeln. Jedoch wäre eine geringe Überkorrektur und

eventuell auch Mehrfachinjektionen nötig.

Für größere Volumina, welche eine größere Distanz zwischen der Gefäßversorgung

und der implantierten Zellen aufweisen, müssen Techniken entwickelt werden, die

87

die Vaskularisation des neu entstehenden Gewebes schnell vorantreiben oder einen

stetigen Aufbau des Gewebes erlauben.

Es müsste zudem auch gesichert werden, ob die Isolation der Präadipozyten statt

aus Dermolipektomien auf eine andere Weise für eine Weichteilsubstitution möglich

ist. Schließlich würde es sich nicht anbieten eine Dermolipekomie durchzuführen, um

z.B. eine Lippe zu augmentieren. Der Einsatz von Liposuktionen zur Gewinnung von

Präadipozyten wäre diesbezüglich sicherlich eine interessante alternative Methode.

Trotz der letzteren Punkte würde die Injektion von Präadipozyten in Fibrin eine

interessante Alternative zu derzeitigen Methoden , wie die Injektion von

Hyaluronsäurepräparaten und Kollagen sowie Silikonimplantaten, darstellen da diese

Methode einen minimal-invasiven Eingriff mit geringen Risiken und Gewebe durch

autologes Gewebe ersetzen würde.

88

5. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene injizierbare Fibrin-Konstrukte an Mäusen für

den Weichteilgewebeersatz getestet. Es sollte geklärt werden, ob Präadipozyten und

Fibroblasten reifes, stabiles Fett- bzw. Bindegewebe bilden können. Durch eine Koimplantation

von Präadipozyten und Sphäroiden aus human dermalen mikrovaskulären Endothelzellen sollte

die Vaskularisierung und das verbleibende Volumen des Konstruktes verbessert werden. Eine

Mehrfachinjektion von Präadipozyten sollte einen sukzessiven Gewebeaufbau ermöglichen.

Zudem sollte der Einfluss einer erhöhten Zellzahl von Präadipozyten geprüft werden.

Die Zellen wurden aus Dermolipektomien isoliert, kultiviert und mit Fibrin in athymische BALB´c

Nacktmäuse injiziert. Präadipozyten mit und ohne Sphäroide aus HDMVECs sowie Fibroblasten

wurden nach 4 Wochen, 3 und 6 Monaten explantiert, bei den Präadipozyten erfolgte eine

weitere Explantation nach 9 Monaten. Die Explantation erfolgte nach 6 Monaten in diesen

Gruppen. Als Kontrolle dienten zelllose Fibrinkonstrukte. Die Fallzahl je Gruppe betrug n=8. Die

Explantate wurden histologisch und morphometrisch ausgewertet.

Zu allen Explantationszeitpunkten konnte neugebildetes Gewebe in allen Gruppen außer in der

Kontrolle festgestellt werden. Die Präadipozyten differenzierten und bildeten reifes Fettgewebe

ohne Nekrosen oder Ölzysten. Die Fibroblasten konnten zwar aufgefunden werden, jedoch

entwickelten diese nach 3 Monaten Kalzifikationen und fettähnliche Zellen. Die Gruppe mit

HDMVEC zeigte weniger reife Fettzellen und keine verbesserte Vaskularisierung. Die

Präadipozyten der Mehrfachinjektion entwickelten sich zu einem homogenen fettähnlichen

Gewebe. Diese Gruppe wies nicht signifikant, aber tendenziell größere Konstrukte auf. Die

erhöhte Zellzahl war signifikant größer gegenüber fast allen Gruppen, ohne dabei qualitative

Einschränkungen aufzuweisen.

Hinsichtlich der Differenzierung und Stabilität erwiesen sich die Präadipozyten als Alternative für

den Weichteilgewebeersatz. Aufgrund der Kalzifikationen und fettähnlichen Zellen erschienen

Fibroblasten in Fibrin als Alternative nicht geeignet zu sein; jedoch könnten durch andere

Matrizes die Nachteile beseitigt werden. HDMVEC-Sphäroide optimierten weder die Größe

noch die Vaskularisierung, so dass das Modell weiter ausgearbeitet werden müsste. Ein

sukzessiver Aufbau sowie nachträgliche Korrekturen können durch Mehrfachinjektion

ermöglicht werden. Anhand der erhöhten Zellzahl konnte dargelegt werden, dass in-vivo höhere

Zellvolumina bei konstanter Fibrinmenge ohne Nekrosen implantiert werden können.

Die Arbeit legt dar, daß alternativ zu gängigen Methoden mit Hilfe von Präadipozyten eine

Weichteilgewebesubstitution möglich ist. Sie bieten Persistenz, können in verschiedenen

Zellzahlen und zu mehreren Zeitpunkten injiziert werden. Für Fibroblasten und HDMVECs

müssen wegen der Kalzifikationen und geringeren Differenzierung der injizierten Zellen andere

Methoden zur Differenzierung entwickelt werden.

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7. Curriculum vitae

50996 Köln, 3 Mai 2007 Im Park 4 Tel. 0221 35 21 88 nithoba@gmx.de

1. PERSÖNLICHE DATEN • geb. 17.7.1980 in Freiburg im Breisgau

• ledig • Eltern:

Stefan Baerlecken, Dipl. Volkswirt, Marie-Luise Baerlecken, geb. Müller, Juristin

• Geschwister: Daniel Baerlecken, Dipl. Architekt

2. AUSBILDUNGSDATEN • Abitur am Friedrich-Wilhelm-Gymnasium Köln 2000

• Humanmedizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. 2007 WS2000/01-WS2006/07

• August 2002 Ablegung des Physikums • August 2003 Ablegung des 1. Staatsexamens • März 2006 Ablegung des 2. Staatsexamens • Mai 2007 Ablegung des 3. Staatsexamens • Fremdsprachen: Englisch

3. FAMULATUREN

Februar bis April 2003 Dr. I. Säckler, Köln

• Orthopädische Praxis • Dauer 30 Tage

Februar bis März 2004 Prof. Dr. M. Zeitz, Berlin

• Abteilung Rheumatologie der Benjamin-Franklin-Universitätsklinik der Charité

• Dauer 30 Tage

Juli bis September 2005 Prof. Dr. W. L. Gross, Bad Bramstedt

• Abteilung Rheumatologie, Innere Medizin, Klinikum der Universität Lübeck und Kiel in Bad-Bremstedt

• Dauer 30 Tage

Oktober bis November 2005

Prof. Dr. G. R. Burmester, Berlin

• Abteilung Rheumatologie, Innere Medizin, Universitätsklinikum Berlin Charité Mitte

4. PRAKTISCHES JAHR

2006 - 2007

1. Tertial Hautklinik der Universitätsklinik Freiburg 2. Tertial Innere Medizin Kreiskrankenhaus Lörrach

• 5 Wochen Onkologie Station Kandertal • 3 Wochen Kardiologie Station Schwarzwald • 4 Wochen Ambulanz und Notaufnahme • 3 Wochen Intensivstation

3. Tertial Chirurgie Kreiskrankenhaus Lörrach

• 10 Wochen Allgemein- und Viszeralchirurgie • 5 Wochen Unfallchirurgie

5. DOKTORARBEIT „Weichteilsubstitution mit Hilfe von injizierten Präadipozyten“ Beginn einer

experimentellen Doktorarbeit im Tissue Engineering Labor Stark der Abteilung Plastische und Handchirurgie der Universität Freiburg bei Prof. Dr. J. Borges; März 2003 bis Juli 2005,

6. HILFSWISSENSCHAFT-

LICHER ASSISTENT Entwicklung und Evaluation von Klassifikationsmethoden, Validierung

medizinischer Klassifikationen und Thesauren für das DIMDI in Köln von November 2004 bis Dezember 2006. Kodierrichtlinien und Verschlüsselungshilfen für Diagnosen und Prozeduren in Zusammenarbeit mit dem InEK in Siegburg. Mitwirkung bei der Entwicklung einer internationalen Klassifikation für Prozeduren durch die WHO.

Projektmanager: Dr. Albrecht Zaiß und Dr. Susanne Hanser

7. BERUFSBEGINN Seit dem 1.6.07 Assistenzarzt in der Abteilung Klinische Immunologie und Rheumatologie der medizinischen Hochschule Hannover

Freiburg, den 02. November 2007

(Niklas Thomas Baerlecken)

100

8. Danksagung

Ich möchte mich bei allen bedanken, die mir diese Arbeit ermöglicht haben:

Herrn Prof. Dr. med. Jörg Borges und Herrn Prof. Dr. med. G.B. Stark danke ich für

die Vergabe, Betreuung und Diskussion der Arbeit. Dr. med. Torio danke ich für die

interessanten Ideen sowie für die freundliche und anregende Hilfsbereitschaft.

Den Mitarbeitern und Doktoranden des ZKF möchte ich herzlich für die freundliche

und hilfsbereite Arbeitsatmosphäre danken. Ein ganz besonderer Dank geht dabei an

Frau Heide Marniga und Frau Beate vom Hövel für ihre Unterstützung im Labor, die

mir mit Rat und Tat stets zur Seite standen Desweiteren wünsche ich den derzeitigen

und zukünftigen Doktoranden viel Erfolg für die Zukunft.

Ein ganz besonderer Dank geht an meine Eltern, die mir das Medizinstudium

ermöglicht haben, und an meinen Bruder, der mir stets in der Vergangenheit wie

auch heute geholfen hat. Meinen Freunden möchte ich für ein nettes Privatleben

neben Studium und Doktorarbeit danken.

101

9. Veröffentlichungen

9.1. Originalarbeiten

• Classification of Medical Procedures: Comparison of ICHI and Basic Coding

System of CCAM. Susanne Hanser, Niklas Baerlecken, Albrecht Zaiß,

Germain medical science (gms), e-journal , 2005: 85-87

• Engineering of adipose tissue by injection of human preadipocytes within fibrin

glue, Torio-Padron N, Baerlecken N, Momeni A, Stark G.B., Borges J.,

Aesthetic Plastic Surgery 2007 Mar 22

9.2. Kongressbeiträge • Classification of Medical Procedures: Comparison of ICHI and Basic Coding

System of CCAM Susanne, Hanser, Niklas Baerlecken, Albrecht Zaiß 50.

GMDS Jahrestagung

• Classification of Medical Procedures: Comparison of ICHI and CCAM Basic

Coding System, Zaiß A, Hanser S, Baerlecken N, WHO Newsletter, 2005; 3

(2): 1 (WHO-FIC Meeting 2005, 16-22.10.2005, Tokyo)

• Injection of human preadipocytes within fibrin glue, an alternative for volume

augmentation in plastic surgery? Baerlecken N, Torio-Padron N, Momeni A,

Stark G.B., Borges J., 9. Chirurgische Forschungstage, 19-21. September

2005, Frankfurt am Main

• Langzeituntersuchungen nach subkutaner Injektion humaner Präadipozyten

bzw. Fibroblasten zum Weichteilgewebeersatz, Torio-Padron N, Baerlecken N,

Momeni A, Stark G.B., Borges J., 36. Jahreskongress VDPC Vereinigung der

Deutschen Plastischen Chirurgen, 27.9-1.10.2005, München und Starnberg

• Weichteil-Tissue-Engineering: Der potentielle Einsatz von Präadipozyten-

Fibrin-Konstrukten in der Mamma-Chirurgie, Torio-Padron N, Baerlecken N,

Momeni A, Stark G.B., Borges, 24.Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft

für Senologie, 2.-4.9.2004, Freiburg

102

9.3. Publizierte Abstracts • Weichteil-Tissue-Engineering: Der potentielle Einsatz von Präadipozyten-

Fibrin-Konstrukten in der Mamma-Chirurgie, Torio-Padron N, Baerlecken N,

Momeni A, Stark G. B., Borges J, Onkologie 2004;27(suppl 2):1-66

103

10. Erklärung über die Beteiligung Dritter

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und

ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus

anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter

Angabe der Quelle gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht entgeldliche

Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere

Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar

geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt

der vorgelegten Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher

Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Freiburg, den .......................... ................................................. (Niklas Thomas Baerlecken)

104