xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin...

8/20/2019 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa đông trùng …

http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-phuong-phap-dinh-tinh-dinh-luong-dong-thoi-adenosin 1/105

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN

TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢOBẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

óng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN

TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015







LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáoPGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo viện thực phẩm chức năng và các đồng

nghiệp phòng hóa lý trung tâm kiểm nghiệm viện thực phẩm chức năng đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm thực nghiệm

tại cơ sở.

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học,

các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực

hiện luận văn này.

Cuối cùng tôi gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp

CH18 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn

thành luận văn.

Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm

2015

Học viên

Nguyễn Thị Quế Mai







MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢ NGDANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤ N ĐỀ……………………………………………………... 1Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………….. 31.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo……………………………... 31.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo…………………………… 31.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo………………………………... 31.1.3. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo……………… 41.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo……………………………. 51.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo………………….. 71.2. Tổng quan về adenosin,cordyce pin……………………………

7

1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học………………… 71.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin……………………. 91.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin………………………… 101.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin………………. 111.3.1. Phương pháp sắc ký lớ p mỏng……………………………… 11

1.3.2. Phương pháp đo màu……………………………………….. 121.3.3. Phương pháp điện di mao quản…………………………….. 131.3.4. Phương pháp phổ cộng hưở ng từ hạt nhân 1H-

NMR …………... 13

1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng……………………………………. 131.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao………………………. 161.4.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng…………………………… 161.4.2. Một số thông số đặc trưng…………………………………... 181.4.3. Ứ ng dụng……………………………………………………. 19

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…. 202.1. Đối tượ ng nghiên cứu…………………………………………. 202.2. Hóa chất, dung môi……………………………………………. 212.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu………………………………. 212.4. Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 222.4.1. Nghiên cứu các cách chiết adenosin và cordycepin trongmẫu

21

2.4.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp…………………… 232.4.3. Đánh giá phương pháp phân tích…………………………… 24

2.4.4. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…… 26







2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu………………………………….. 26Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………. 273.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký………………………… 27

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn…………………………………... 273.1.2. Khảo sát lựa chọn bướ c sóng phát hiện…………………….. 273.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động………………………………… 283.1.4. Khảo sát thể tích tiêm mẫu…………………………………. 303.1.5. Khảo sát nhiệt độ cột……………………………………….. 313.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu……………………. 333.2.1. Khảo sát dung môi chiết...………………………………….. 333.2.2. Khảo sát số lần chiết……..…………………………………. 353.2.3. Khảo sát phương pháp chiết………………………………… 353.2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết……………………………………… 373.2.5. Khảo sát thờ i gian chiết…………………………………….. 383.3. Quy trình phân tích…………………………………………… 393.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử………………… 393.3.2. Điều kiện sắc ký…………………………………………….. 403.3.3. Đánh giá kết quả…………………………………………….. 413.4. Đánh giá phương pháp………………………………………… 413.4.1. Độ thích hợ p của hệ thống………………………………….. 413.4.2. Độ đặc hiệu………………………………………………….. 423.4.3. Xây dựng đườ ng chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính…....... 47

3.4.4. Khảo sát độ chính xác……………………………………….. 483.4.5. Khảo sát độ đúng……………………………………………. 513.4.6. Giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lượ ng (LOQ)….. 533.5. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứaĐTHT

54

3.5.1. Định tính…………………………………………………….. 543.5.2. Định lượng…………………………………………………... 56Chương 4. BÀN LUẬN……………………………………………. 58K ẾT LUẬ N VÀ KIẾ N NGHỊ……………………………………... 64

TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT







Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN AcetonitrilAOAC Association of Official

Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà Hóa

phân tíchCE Capillary electrophoresis Điện di mao quản DD Dung dịch DMSO Dimethyl sulfoxideĐTHT Đông trùng hạ thảo EtOH EthanolHL Hàm lượng HPLC High Performance Liquid

ChromatographySắc ký lỏng hiệu năngcao

MeOH MethanolMS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photo diode array Dãy diod quang

ppm Parts per million Phần triệu r Hệ số tương quan RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TB Trung bìnhTPCN Thực phẩm chức năng TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TLTK Tài liệu tham khảo UV Ultraviolet Tử ngoại VIS Visible Khả kiến







DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8]………………… 9Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin 13

Bảng 2.3. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng r ắn………………………………… 20

Bảng 2.4. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng……………………………….. 20

Bảng 2.5. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm…….. 21

Bảng 3.6. Khảo sát thành phần pha động…………………………………... 28

Bảng 3.7. Khảo sát chương trình gradient nồng độ………………………… 29Bảng 3.8. K ết quả khảo sát số lần chiết (n = 3)…………………………….. 35

Bảng 3.9. K ết quả độ thích hợ p của hệ thống ……………………………... 42

Bảng 3.10. K ết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin,

cordycepin và diện tích pic…………………………………………………. 47

Bảng 3.11. K ết quả đánh giá độ lặ p lại của phương pháp vớ i mẫu R1…………... 49

Bảng 3.12. K ết quả đánh giá độ lặ p lại của phương pháp vớ i mẫu L1…….. 49

Bảng 3.13. K ết quả độ chính xác trung gian ……...……………………….. 50

Bảng 3.14. K ết quả khảo sát độ đúng mẫu R1……………………………... 52

Bảng 3.15. K ết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1…………………………. 52

Bảng 3.16. K ết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn…………………………. 53

Bảng 3.17. Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử

và chuẩn hỗn hợp…………………………………………………………… 55

Bảng 3.18. K ết quả định lượ ng các mẫu thử……………………………….. 57







DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1. Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28]…….. 5Hình 1.2. Công thức cấu tạo cordycepin [14]………………………….. 8

Hình 1.3. Công thức cấu tạo adenosin [8]…………………………….... 8

Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28]... 10

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron

của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]…….............. 12

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao…………... 18Hình 3.7. Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)……… 28

Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40

µl (d)……………………………………………………………………. 31

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện

nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện

nhiệt độ cột 25oC………………………………………………………... 32

Hình 3.10. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3)….. 34

Hình 3.11. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3)….. 34

Hình 3.12. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3) 36

Hình 3.13. K ết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3) 36

Hình 3.14. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…… 37

Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3)…… 37

Hình 3.16. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3)….. 38

Hình 3.17. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3)….... 39

Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp………………. 44

Hình 3.19. So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ

cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D)……………………………. 46







Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ

1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2

phút)………….......................................................................................... 47Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện

tích pic (mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin b)…………………….... 48

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất) 54

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)………………………………. 55

Hình 3.24: So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và

mẫu chuẩn tương ứng………………………………………………….. 56







ĐẶT VẤN ĐỀ

Đông trùng hạ thảo là tên gọi một dạng cộng sinh giữa loài nấm có tên

khoa học là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loại côn trùng thuộc chi Hepialus, thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus.

Là một loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến,

đông trùng hạ thảo cùng tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành bộ tứ thần dược.

Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi đông trùng hạ thảo là vị

thuốc dùng để bồi bổ sức khỏe cho người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như

bệnh tim, thận, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, ung thư. Mặt

khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định đông trùng hạ thảo

hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người. Các nghiên cứu Tây y

trên thế giới đều khẳng định đông trùng hạ thảo không chỉ nâng cao hiệu quả

hệ miễn dịch còn giải độc thận, tăng cường chức năng gan, khả năng tình dục

[2]. Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên hai loài chính

người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis và

Cordyceps militaris [2].

Việc sử dụng ngày càng nhiều chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ

thảo đòi hỏi cần có các phương pháp đánh giá chất lượng chúng. Dược điển

Trung Quốc 2010 mới chỉ đưa ra chuyên luận đánh giá dược liệu đông trùng hạ

thảo Cordyceps và viên Bailing capsule với thành phần đánh giá định lượng là

adenosin [30]. Tuy nhiên loài Cordyceps militaris lại có thành phần cordycepin

khá cao chưa được đánh giá. Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp chuẩn

hóa để đánh giá chất lượng dược liệu đông trùng hạ thảo cũng như chế phẩm

chứa thành phần đông trùng hạ thảo, việc xây dựng phương pháp đánh giá hai

thành phần này trong dược liệu và chế phẩm là vô cùng cần thiết.

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng

phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế







Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo:

1.1.1.

Đặc điể m c ủa đông trùng hạ th ảoĐông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một loại đông dượ c quý có bản chất là

dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensis thuộc nhóm nấm

Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướ m trong chi Thitarodes

trước đây phân loại trong chi Hepialus.

Tên gọi “đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung dongchungxiacao) xuất phát từ

quan sát thực tế khi thấy vào mùa hè nấm Ophiocordyceps sinensis mọc chồi

từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất. Vào mùa đông thì nhìn cặ p cá thể này

giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống như một loài thực vật.

Dượ c liệu đông trùng hạ thảo thu hái gồm phần sâu non dài 2,5 – 3 cm, đườ ng

kính 3 – 5 mm màu vàng nâu hay xám nâu. Sâu có 8 đôi chân, 4 đôi chân ở

giữa thân sâu là trông rõ nhất. Thân nấm hình tr ụ mọc ra từ đầu con sâu, thân

nấm thườ ng dài 3 – 6 cm. Khi nấm đạt đến độ trưở ng thành nhất, nó tiêu thụ

đến 99% chất dinh dưỡ ng từ thân sâu biến sâu thành xác khô. Nấm quả thể

thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh. Cơ chế nhiễm nấm C. sinensis

vào sâu hiện nay chưa biết rõ. Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn

phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu. Nấm phát triển bằng chất dinh dưỡ ng

của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡ ng của sâu làm sâu chết khô. Đến mùa

hè nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất. Thờ i gian

để nấm phát triển thành dạng quả thể trong cơ thể sâu kéo dài từ các tháng mùa

đông đến cuối xuân đầu hè. Tại Trung Quốc, đông trùng hạ thảo thườ ng gặ p ở

vùng r ừng ẩm ướ t thuộc các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng

và nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [2], [4].

1.1.2. Phân lo ại đông trùng hạ th ảo

Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã

tìm thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài đượ c nghiên cứu nhiều nhất và







đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps militaris

(L. ex Fr) Link [2], [29], [30].

1.1.3.

Thành ph ần hóa h ọc trong đông trùng hạ th ảoĐông trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: các

ribonucleotid, mannitol, sterol, các acid hữu cơ, các loại đường mono- , di-,

oligosaccharid và polysaccharid, các protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2,

B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) trong

đó nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng là HEAA (hydroxyl ethyl adenosin

analogs).

a.

Các nucleotid:

Các nucleotid là một trong những thành phần có hoạt tính trong đông trùng

hạ thảo, trong đó adenosin, cordycepin đượ c sử dụng là hoạt chất để đánh giá

chất lượ ng của đông trùng hạ thảo. Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn nhiều

loại nucleotid khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc này được đưa

vào các hợ p chất có hoạt tính antiretrovirus điều tr ị cho bệnh nhân nhiễm HIV

như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt

chất này không thể tìm thấy ở trong các dượ c liệu khác trong tự nhiên.

b.

Các polysaccharid

Đây cũng là thành phần chính góp phần vào các tác dụng sinh học của

đông trùng hạ thảo. Bản đồ saccharid của dượ c liệu này có vai trò trong đánh

giá chất lượ ng. Một số monosaccharid có trong đông trùng hạ thảo như

rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fr uctose…

c. Các sterol

Các phytosterol trong đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β

sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều tr ị ung thư vú, tuyến tiền liệt và

ung thư trực tràng.

d. Các nhóm hoạt chấ t khác







Đông trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic,

acid aspartic, arginin… và các hợ p chất kiểu polyamin như cadaverin,

spermidin, spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A. Các hợ p chấtnày có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus [25], [37].

Cordycepin Adenosin

Guanosin Cytidin

Thymidin Uridin

Hình 1.1. Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28].

1.1.4. Tác d ụng c ủa đông trùng hạ th ảo

Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc đượ c ghi vào tài liệu thuốc đông y từ

giữa thế k ỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765). Theo tài liệu cổ,

đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng ích







phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờ m, dùng chữa hư lao sinh ho, ho ra máu,

liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh.

a. Tác dụng tăng cường sức khỏe Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết cao đông trùng hạ thảo có tác dụng tăng

cường hoạt động các enzym superoxid dismutase, glutathion peroxidase và

catalase (các enzym tham gia loại bỏ gốc tự do trong cơ thể), giảm quá trình

peroxide lipid do đó có tác dụng chống lại các nhân tố có hại như căng thẳng,

tuổi tác.

b. Tác dụng miễn dịch

Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh đông trùng hạ thảo có khả năng

tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể. Cụ thể là

tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự nhiên

(natural killer cell), điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường một

cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể

IgG, IgM trong huyết thanh.

c. Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết cao đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như

quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase.

d. Tác dụng chống ung thư

Thành phần polysaccharides trong nấm đông trùng hạ thảo (cordyglucan (1 3)-

β – glucan) cũng như vài loài nấm khác được cho là có tác dụng ức chế khối u

do hai cơ chế: (1) trực tiếp gây độc cho tế bào ung thư; (2) gián tiếp ức chế

thông qua hệ miễn dịch tự miễn của cơ thể [9].

e. Tác dụng chống viêm

Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây viêm như

gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và phát triển

của bạch cầu.







f. Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan

Đông trùng hạ thảo có công dụng nhanh trong việc phục hồi và làm giảm các

triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau lưng,các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao

phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các men

AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH [7], [23], [25], [37].

1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng hạ

thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm

một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân

sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang,

viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng). Có thể kể tên một vài

chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:

- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken,

bột Cordyceps extract…

- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ

thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước

cốt gà Đông trùng hạ thảo…

1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin

1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Cordycepin và adenosin đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường

ribose (ribofuranose) bằng liên kết β – N9 – glucosid [14], [33].







1.2.1.1. Cordycepin

Hình 1.2. Công thức cấu tạo cordycepin [14].

Tên khoa học: 9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin

Công thức phân tử: C10H13 N5O3

Trọng lượng phân tử: 251,24

Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết.

Điểm chảy: 228 – 231oC

Độ tan: tan trong DMSO, methanol, ethanol

Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm [14].

1.2.1.2. Adenosin

Hình 1.3. Công thức cấu tạo adenosin [8].

Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin

Công thức phân tử: C10H13 N5O4

Trọng lượng phân tử: 267,24

Adenosin dạng bột tinh thể màu trắng.

Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235

o

C.







Độ tan:

Bảng 1.1. Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8].

Dung môi Độ tan (mg/ml) Nước 5Methanol 6Ethanol 131 – propanol 202 – propanol 131- butanol 9Ethylen glycol 8

Phổ hấp thụ UV:

Trong dung dịch nước, HCl 0,1N, NaOH 0,1N adenosin có phổ hấp thụ UVtương tự nhau, bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm với ε = 15185 [8].

1.2.2. Dược động học cordycepin vàadenosin

Cordycepin là chất cấu tạo tương tự adenosin nên có con đường chuyển

hóa tương tự. Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài

tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase

trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vàotrong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenosin kinase tạo thành ATP.

Nếu tế bào không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi

adenosin deaminase trong tế bào. Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính được

tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận. Tương tự như vậy, cordycepin

cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase tạo

hypoxanthinosin [28].







Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28].

1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin

a. Tác dụng của cordycepin

* Ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN và tín hiệu mTOR

Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và

tri phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và

5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin.Do cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN,

enzyme kết hợp cordycepin, gây rối loạn tổng hợp ARN. Các nghiên cứu cũng

chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền,

sinh trưởng phát triển tế bào [17].

* Tác dụng chống sự di căn

Sự di căn thông thường là sự tách tế bào ung thư khỏi vị trí ban đầu, xâmlấn vào các khối ngoại bào khác. Cordycepin có tác dụng ức chế các enzyme

metalloproteinase (bản chất là endopeptidase phụ thuộc kẽm và calci, vai trò

chính trong phân hủy tổ chức ngoại bào) [10].

* Tác dụng chống viêm

Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan đến quá trình ung thư. Các tế

bào ung thư sinh nhiều cytokine, chemokine và các receptor của chúng, các







chất này gây ra phản ứng viêm. Cordycepin được cho rằng làm giảm các tác

nhân gây viêm như NO, PGE2, TNF α và IL 1β [33].

* Tác dụng giảm đường huyết: Li Ma và cộng sự nghiên cứu tác dụng cordycepin trên chuột gây tiểu

đường bởi alloxan. Kết quả cho thấy cordycepin không làm tăng nồng độ

insulin trong máu nhưng làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng

làm tăng nồng độ glycogen tại gan. Đồng thời cordycepin có tác dụng bảo vệ

thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường [22].

b. Tác dụng của adenosin

* Tác dụng chống viêm

Adenosin được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ

thể của adenosin A2A. Nồng độ adenosin ngoại bào ở tế bào bình thường khoảng

300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng nâng lên

600 – 1200 nM.

* Tác dụng trên tim

Adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch

vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền

nút nhĩ thất. Adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim.

* Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương

Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến

bệnh viêm đường hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosin có

tác dụng tốt đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thoái

hóa thần kinh…[11], [27].

1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin

1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

MA King Wah và các cộng sự đã tiến hành xác định cordycepin và 7

nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa đông







trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lý bằng

hỗn hợp Na2HPO4 0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ

sấy 8 phút ở 60

o

C để hoạt hóa. Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform:ethylacetat : isopr opanol : nước (8 : 2 : 6 : 0,6 theo thể tích) với 2 giọt amoniac

cho mỗi 10 ml hỗn hợp. Quãng đường triển khai dung môi 18 cm, chạy lượt hai

9 cm trong hỗn hợp dung môi cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước :

dimethylfomamid (10 : 2 : 8 : 0,5 : 2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại

bước sóng 254 nm. Phương pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09%, độ thu hồi

của adenosin là 97,88% [21].

1.3.2. Phương pháp đo màu

Nicholas M. Kredich và Armand J. Guarino đã nghiên cứu chỉ ra phương

pháp đo màu định lượng cordycepin sử dụng thuốc thử anthron để tạo hợp chất

có màu đỏ cherry. 5,0 ml thuốc thử anthron (0,2 g anthron trong 100 ml H2SO4

90%) phản ứng với 1,0 ml dung dịch thử có lượng cordycepin từ 1 – 135 μg/ml,

trộn đều và đặt trong nước đá. Mẫu trắng tiến hành tương tự thay 1,0 ml nước

cho 1,0 ml dung dịch thử. Sau đó các ống nghiệm được đặt trên cách thủy 100oC

trong 10 phút, làm nguội, đo màu bằng thiết bị đo màu sử dụng kính lọc số 52,

hỗn hợp màu tạo thành bền sau vài giờ phản ứng [15].

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron của

cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15].







1.3.3. Phương pháp điện di mao quản

Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã định tính và định lượng cordycepin

trong Cordyceps militaris bằng phương pháp điện di mao quản với điều kiện:dung dịch đệm borat 0,02 M với 28,6% methanol, pH = 9,5, điện thế 20 kV,

nhiệt độ 25oC, bước sóng 254 nm. Đường chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/ml,

độ thu hồi từ 82% đến 107% [24].

1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR

Seul Gi Lee và cộng sự đã định lượng cordycepin trong Cordyceps

militaris bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sử dụng chất chuẩn

nội muối natri của acid 3 – (trimethylsilyl) – propionic – 2,2,3,3 – d4. Các tác

giả so sánh phương pháp định lượng này với phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao, kết quả cho thấy không có sự khác biệt kết quả định lượng cordycepin

giữa 2 phương pháp này [18].

1.3.5 . Phương pháp sắc ký lỏng

Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin.

Cột Pha động Tốc độ dòng Detector TLTKC18 (250 x4,6 mm)

Đệm phosphat pH 6,5 :methanol (17 :3)

1,0 ml/phút UV 260nm

[31]

C18 (250 x4,6 mm)

Methanol (A) và Nước (B)0 – 2 phút: 100 – 85% B; 2

– 5 phút: 85 – 70% B; 5 – 10 phút: 70 – 55% B; 10 – 12 phút: 55 – 85% B; 12 – 15 phút: 85 – 100% B


[1]

EclipseXDB-C18(250 x 4,6mm, 5 µm)

A: dung dịch NaH2PO4 0,02M và Na2HPO4 0,02 MB: methanol0 – 5 phút: 0% A5 – 15 phút: 0 – 5% A15 – 40 phút: 5 – 40% A40 – 50 phút: 40% A


[32]

ShimadzuVP-ODS

A: dung dịch amoni acetat0,04M pH 5,2

B: methanol

0,2 ml/phút ESI-MS[M + H]+

tại m/z

[34]







150 x 2,0mm

0 – 6 phút: 85% A6 – 12 phút: 85 – 80% A12 – 17 phút: 80% A

17 – 20 phút: 95% A

127, 136,268, 252và 302

ProtoSIL250 x 4,6mm, 5 µm

Methanol : H2O (20 : 80) 1,0 ml/phút UV 254nm

[16]

WatersSheild RP18 (150 x4,6 mm, 5µm)


[12]

EclipseXDB-C18(150 x 4,6mm, 5 µm)

A: nước có 0,1% acidaceticB: acetonitril có 0,1% acidacetic0 – 2,5 phút: 2% B2,5 – 12,5 phút: 2 – 12% B2,5 – 14 phút: 12 – 96% B.


[26]

C18 (150 x4,6 mm, 5µm)


[32]

Zorbax300SB – C18 250 x4,6 mm, 5µm

A: H2OB: Methanol0 – 3 phút: 2% B3 – 10 phút: 2 – 10% B10 – 22 phút: 10 – 22% B22 – 30 phút: 22% B30 – 40 phút: 22 - 100% B40 – 41 phút: 100 – 2% B41 – 50 phút: 2% B


[35]

Theo dược điển Trung Quốc 2010, dược liệu đông trùng hạ thảo đượcđánh giá hàm lượng adenosin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Dược liệu được chiết tách bằng đun hồi lưu 30 phút trong dung môi methanol

90%. Chuyên luận yêu cầu hàm lượng adenosin không ít hơn 0,01% đối với

dược liệu khô kiệt [31].

Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7

nucleobase trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD.







Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B

(đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat

0,02M). Đường chuẩn xây dựng 5 – 300 μg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạnđịnh lượng của cordycepin và adenosin là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml. Độ thu hồi

của phương pháp đối với cordycepin là 98,3%, với adenosin là 100,6% [36].

Jian – Wei Xie và cộng sự đã tiến hành định lượng các nucleosid chính trong

Cordyceps sinensis (thymin, adenine, adenosin, cordycepin) bằng phương pháp

sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI – MS. Phương pháp sử dụng pha động A (amoni

acetat 0,04M pH 5,2) và B (methanol). Đường chuẩn cordycepin xây dựng từ

0,5 – 107,5 μg/ml, adenosin 0,6 – 114,0 μg/ml . Độ thu hồi của cordycepin 99,3

– 104,0%, độ thu hồi adenosin 98,0 – 101,5% [34].

Lei Huang và đồng nghiệp đã nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện phân tích

adenosin và cordycepin trong dược liệu ĐTHT loài C. sinensis và C. militaris.

Phương pháp cho kết quả pha động tối ưu methanol và nước tỷ lệ 92 : 8, bước

sóng phát hiện 254 nm. Đường chuẩn của cordycepin được xây dựng từ 2,85

đến 130 μg/ml, của adenosin từ 2,50 – 120 μg/ml, giới hạn phát hiện cordycepin

là 0,25 μg/ml, của adenosin là 0,30 μg/ml [12].

Jiang – Feng Song cùng đồng nghiệp đã nghiên cứu tối ưu cách chiết xuất

cordycepin từ loài Cordyceps militaris bằng phần mềm tối ưu hóa, phân tích

bằng phương pháp sắc ký lỏng. Pha động sử dụng A (nước có 0,1% acid acetic)

và B (acetonitril có 0,1% acid acetic) theo tỷ lệ gradient. Kết quả tối ưu hóa

chiết xuất cho điều kiện chiết: dung môi chiết ethanol 20,21%, thời gian chiết

101,88 phút, tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu: 33,13 ml/g [26].

Li Yu và đồng nghiệp đã nghiên cứu định lượng đồng thời 11 nucleosid

trong dược liệu ĐTHT được thu hái tại Trung Quốc. Pha động sử dụng dung

môi methanol và nước theo chương trình gradient. Mẫu dược liệu được chiết

tách bằng dung môi methanol 70% theo phương pháp siêu âm 15 phút ở nhiệt







độ phòng. Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với adenosin và cordycepin

là 0,057 và 0,099 µg/ml [35].

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao1.4 .1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên

cột tách dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng

tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích

được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho

các tín hiệu được ghi trên sắc đồ.

a. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Pha tĩnh hay dùng nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà

trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên

kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân

cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết:

- Si-O-Si -R

Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl

và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).

Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là

dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật

RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau,

thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế. Cột thông dụng là cột

ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10m. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm

dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào







ứng dụng rộng rãi. Trong UPLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7

– 2,2 m) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm).

b. Pha động trong sắc ký lỏng Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân

tích trong quá tr ình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải

riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt. Pha động có hai loại phân cực và ít

phân cực thường dùng cho sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận. Tuy nhiên pha

động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta

thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp

đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời

gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.

c. Detector trong sắc ký

Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân

tích mà lựa chọn detector cho phù hợp:

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khảnăng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến.

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh

quang. Đối với các chất không phát huỳnh quang cần phải dẫn xuất hóa chất

phân tích để tạo sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường.

- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa.

Ngoài ra còn tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối

(MS)... trong đó detector chuỗi diode (PDA) cho phép thay đổi bước sóng theo

chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký.

d . Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:







- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu.

- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ.

- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính)

[3].

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1.4.2. Một số thông số đặc trưng

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột

(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

N =16(

)2 = 5,54(

/)2

Trong đó: tR : thời gian lưu chất phân tích

W: Độ rộng pic

W1/2: độ rộng pic ở ½ chiều cao pic.

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta

thườ ng sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 píc

(píc số 1 và số 2) đượ c tính theo công thức sau:

R =2(− )

+ =

1,177(− )

,

+ ,

Trong đó: tR : Thời gian lưu







W: Độ rộng đáy píc.

W1/2: Độ rộng đáy pic ở ½ chiều cao pic.

Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều. R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.

Hệ số bất đối AF (assymetry factor)

AF =/

2

Trong đó: W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20.

a là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước

của pic ở 1/20 chiều cao pic [3].

1.4.3. Ứng dụng

a. Định tính

Sự giống nhau về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ dungdịch chuẩn và dung dịch thử là cơ sở của phép thử định tính. Với detector PDA

hệ số Match khi chồng 2 phổ của chuẩn và thử cũng là cơ sở để định tính chất

phân tích.

b. Định lượng

Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch

chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện

sắc ký xác định là cơ sở của phép định lượng.

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng:

- Phương pháp dùng chuẩn ngoại.

- Phương pháp dùng chuẩn nội.

- Phương pháp thêm chuẩn.

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích [3].







Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Chất chuẩn: Adenosin (Adenosin 100%, chất chuẩn Sigma Aldrich prodructcode: A9251, lot: SLBG2403V); cordycepin (Cordycepin from Cordyceps

militaris 99,0% chất chuẩn Sigma Aldrich, product code: C3394, lot:

043M4030V).

- Chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo:

Mẫu dạng rắn:

Bảng 2.3. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn.

STT Tên mẫu Số lô Hạn dùng Công ty sảnxuất/công ty phânphối

Mẫu R1 Pure cordyceps 152501 01/01/2017 Công ty MedinamMẫu R2 Cordypower

capsule150315 01/03/2017 Công ty Mushtech

Việt Nam Mẫu R3 Pure cordyceps

Aloha capsule200315CSS Tháng 3/2018 Aloha Mecicinals

Inc.

Mẫu R4 Aweto capsule 20140401 29/04/2017 Shenzhen Allnature biotechnologyCo.Ltd

Mẫu R5 Bột ĐTHT sấykhô

010515 Tháng 5/2018 Công ty dược thảoThiên Phúc

Mẫu R6 Hong-cho gold Tháng 1/2017 Công ty dược phẩmĐông Á

Mẫu dạng lỏng:

Bảng 2.4. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng.

STT Tên mẫu Số lô Hạn dùng Công ty sảnxuất/công typhân phối

Mẫu L1 Rượu ĐTHT 204367 Tháng12/2017

Công ty Văn DuyPhương

Mẫu L2 Nước yến ĐTHT 2604140156 26/04/2016 Công ty TribecoMẫu L3 Cordypower

Cordycepsmilitaris extract

drink

20150410 10/04/2018 Công ty MushtechViệt Nam







Mẫu L4 Trùng thảo nhânsâm Cordyceps

pao sam extract

Tháng1/2018

Wei Shan(Malaysia)

Mẫu L5 Cordyceps extract 010315TC Tháng3/2018 Công ty SunchagXingfulai HealthProducts Co. Ltd

Mẫu L6 Korea silkwormcordyceps

CS7615 Tháng3/2017

Công ty TNHH kinhDoanh thực phẩmAn Minh

- Mẫu placebo dạng rắn (placebo 1): bao gồm các thành phần sau trộn đồng

lượng

Bột dược liệu nhân sâm

Bột dược liệu tam thất

Bột tổ yến.

- Mẫu placebo dạng lỏng (placebo 2): bao gồm các thành phần sau trộn đồng

lượng:

Dịch chiết xuất nhân sâm (hàm lượng ginsenosid tổng 5% kl/tt)

Dịch chiết xuất tam thất (hàm lượng notoginsenosid R1 5% kl/tt)

Nước yến ngân nhĩ (0,007g/L)

2.2. Hóa chất, dung môi

Bảng 2.5. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm.

TT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Ethanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích 2 Methanol Merck, Đức Dùng cho HPLC3 Methanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích 4 Acetonitril Merck, Đức Dùng cho HPLC5 Nước cất 2 lần Việt Nam Dùng cho HPLC

2.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 (Nhật) với detector PDA,

phần mềm điều khiển EZChromlite.

- Cân phân tích Sartorius (Đức).

- Cân kỹ thuật Shimadzu (Nhật).







- Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức).

- Nồi cách thủy Memmert WNB14 (Đức).

- Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức). - Bộ lọc hút chân không.

- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, màng lọc mẫu (syringe filter), sinh

hàn hồi lưu…

2.4. Phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý phân tích: Mẫu được chiết theo phương pháp thích hợp, dịch

chiết được định mức, lọc qua màng lọc 0,45 μm, tiêm vào hệ thống HPLC, ghi

lại sắc ký đồ.

Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp

HPLC.

2.4 .1. Nghiên cứu chiết adenosin và cordycepin trong mẫu

Quy trình xử lý mẫu:

- Đồng nhất mẫu.

- Cân chính xác lượng mẫu thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu dạng rắn)

hoặc bình định mức (đối với mẫu dạng lỏng), thêm dung môi chiết.

- Chiết mẫu theo cách thích hợp.

- Đối với mẫu dạng rắn: ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch. Chiết lặp

mẫu với dung môi trên. Gộp dịch chiết mẫu, thêm dung môi chiết vừa đủ đến

vạch, lắc đều.

Đối với mẫu dạng lỏng: thêm dung môi chiết vừa đủ đến vạch, lắc đều,

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm.

- Tiêm vào hệ thống sắc ký.

a. Khảo sát các phương pháp chiết:

Khảo sát hai phương pháp chiết: chiết bằng siêu âm và đun hồi lưu cách thủy.

b. Khảo sát điều kiện chiết :







- Dung môi chiết: khảo sát các dung môi chiết là hỗn hợp nước – ethanol, nước

– methanol với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi chiết phù hợp

nhất. Trên cùng một nền mẫu tiến hành chiết theo quy trình chiết trên với cácloại dung môi tỷ lệ khác nhau, mỗi loại tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.

-Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút,

120 phút.

- Khảo sát số lần chiết: cùng một nền mẫu chiết lặp lại 1, 2, 3 lần, so sánh kết

quả giữa các mẫu.

- Khảo sát nhiệt độ chiết: cùng một nền mẫu, chiết theo một phương pháp siêu

âm, khảo sát nhiệt độ thường, 40oC, 50oC, 75oC, 100oC. Mỗi mức nhiệt độ làm

3 lần, lấy kết quả trung bình để đánh giá.

2.4.2. K hảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp:

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 detector

PDA để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin:

- Khảo sát thành phần pha động: nước và methanol, nước và acetonitril

- Khảo sát tỷ lệ pha động.

- Quan sát phổ đồ, lựa chọn bước sóng phát hiện.

- Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu.

- Khảo sát nhiệt độ cột.

Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê.

Thông số đánh giá: thời gian lưu, độ cân đối của pic sắc ký, hệ số phân giải của

2 pic adenosin và cordycepin.

Yêu cầu: pic sắc ký gọn, cân đối, 2 pic adenosin và cordycepin tách nhau hoàn

toàn, hệ số phân giải Rs > 2.

2.4.3. Đánh giá phương pháp phân tích







Chiết mẫu nghiên cứu theo cách chiết đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch

thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ

tiêu: tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện,giới hạn định lượng.

* Tính thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian

lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị

ở trên, ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic.

Yêu cấu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích ≤ 2,0%,

hệ số phân giải Rs >2.

* Độ đặc hiệu: Tiêm lần lượt mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn hỗn hợp, chuẩn

đơn vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Trên sắc ký đồ mẫu placebo phải

không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của hai chấ t

chuẩn.

* Tính tuyến tính: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương

quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ

thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X).

Xây dựng đường chuẩn 6 điểm X1 đến X6 của dung dịch chứa chất chuẩn

adenosin, cordycepin ở trong khoảng nồng độ phù hợp. Tiến hành sắc ký theo

điều kiện đã lựa chọn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ

từng chất và diện tích pic chất đó.

Yêu cầu: hệ số tương quan r ≥ 0,995.

* Khảo sát độ chính xác:

Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ

nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều

kiện xác định.

- Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một

quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian

ngắn. Tiến hành: chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử đã xây







dựng, tiêm vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Xác định độ lệch tương đối

RSD% của hàm lượng mỗi hoạt chất.

- Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào ngày khác nhau. Yêu cầu: RSD đối với mỗi

hoạt chất không lớn hơn 5,3% [6] đối với 18 mẫu tiến hành vào 3 ngày khác

nhau.

* Khảo sát độ đúng: Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm

thu được với giá trị thực của kết quả.

Tiến hành: cân chính xác lượng mẫu thử thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu

rắn) và bình định mức (đối với mẫu lỏng), thêm lượng chuẩn hỗn hợp thích hợp

sao cho tổng hàm lượng mỗi chất trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính,

thêm dung môi, chiết mẫu theo quy trình chuẩn bị mẫu thử đã xây dựng. Tiến

hành ở 3 mức nồng độ, mỗi nồng độ làm 3 lần. Tiêm dung dịch thử thêm chuẩn

vào hệ thống sắc ký, xác định hàm lượng mỗi hoạt chất. Độ đúng xác định bằng

hệ số thu hồi lượng chuẩn tìm được so với lượng chuẩn thêm vào.

Yêu cầu: độ thu hồi nằm trong khoảng 90 – 107% đối với mẫu hàm lượng hoạt

chất ≥ 0,01% [6].

* Giới hạn phát hiện (LOD):

Giới hạn phát hiện là hàm lượng thấp nhất của chất phân tích có thể phát hiện

về mặt định tính.

Cách xác định: chuẩn bị các dung dịch placebo 1, placebo 2, thêm các dung

dịch chuẩn pha loãng vào các mẫu placebo được các dung dịch có hàm lượng

khoảng 0,5, 0,25, 0,2, 0,1 µg/ml mỗi chất, tiến hành sắc ký, xác định tỷ lệ tín

hiệu chia cho nhiễu nền (S/N). S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là

nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền, bề rộng mỗi bên tối

thiều gấp 10 lần chiều rộng của pic tại ½ chiều cao. LOD xác định tại nồng độ

có tỷ lệ S/N bằng 3 [5].

* Giới hạn định lượng (LOQ): được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [5].







2.4.4. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

- Thu thập một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn.

- Tiến hành phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong chế phẩm theoquy trình đã xây dựng.

2.4 .5. Phương pháp xử lý số liệu

* Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các

hàm số trong Microsoft Excel.

Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE.

Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV.

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):100

X %

* Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và

nồng độ chất phân tích:

Y = aC +b

Hệ số góc a: Hàm SLOPE.Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT.

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL.







Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc adenosin: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chuẩn

adenosin vào bình định mức dung tích 50,0 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu

âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc k ỹ (dung dịch 1) bảo quản

ở 2- 8oC dùng trong 1 tháng.

- Dung dịch chuẩn adenosin: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc

adenosin pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50,0 ml thu đượ c dung

dịch chuẩn adenosin nồng độ 20 µg/ml tiến hành khảo sát tại nồng độ 20 µg/ml.

- Dung dịch chuẩn gốc cordycepin: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chất

chuẩn cordycepin vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm khoảng 30 ml

MeOH, lắc siêu âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc kỹ (dung

dịch 2), bảo quản ở 2 -8oC dùng trong 1 tháng .

- Dung dịch chuẩn cordycepin: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc

cordycepin pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50 ml thu được dung

dịch chuẩn cordycepin nồng độ 20 µg/ml tiến hành khảo sát tại nồng độ 20

µg/ml.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch gốc

cordycepin và 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc adenosin cho vào bình định mức

50,0 ml, thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH được dung dịch chuẩn hỗn hợp có

hàm lượng mỗi chất khoảng 20 µg/ml.

3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện:

Qua tham khảo các tài liệu với điều kiện của phòng thí nghiệm và thực

nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích lần lượt dung dịch chuẩn adenosin và

cordycepin nồng độ khoảng 20 µg/ml trên hệ thống HPLC, detector PDA với

các điều kiện như sau:

-

Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).







- Detector PDA bướ c sóng 190 – 400 nm.

- Pha động: MeOH : H2O (1:1 tt/tt).

-

Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.- Nhiệt độ cột: 25⁰C.

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

Tiến hành quét phổ của pic adenosin và cordycepin trên sắc ký đồ dung

dịch chuẩn adenosin và dung dịch chuẩn cordycepin cho kết quả như hình 3.8.

Từ phổ đồ thu được, chúng tôi quyết định lựa chọn bước sóng đo là 260 nm.

(a) (b)

Hình 3.7. Phổ hấ p thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b).

3.1.3. Kh ảo sát l ự a ch ọn pha động

- Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể

ảnh hưởng tớ i độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân

giải, độ rộng của pic sắc ký…

- Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: Kênh A là H2O, kênhB là dung môi ACN hay MeOH, cố định các điều kiện phân tích khác. Quá

trình khảo sát cho kết quả như sau:

Bảng 3.6. Khảo sát thành phần pha động.

Thành phần pha động (92: 8) Thời gian lưu (phút) Kênh A Kênh B Adenosin CordycepinH2O ACN 5,6 7,0

H2O MeOH 16,7 22,6







Nhận xét: Mặc dù chương trình chạy sử dụng H2O và ACN cho pic đẹp,

gọn nhưng thời gian lưu ngắn < 7 phút, do vậy có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt

chất trong thành phần khác của mẫu thử. Mặt khác hệ số phân giải của pha độngsử dụng ACN là 2,5 nhỏ hơn so với pha động sử dụng MeOH và H2O, đồng

thời sử dụng dung môi ACN tốn kém hơn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng thành

phần pha động gồm methanol và nước, tiến hành khảo sát chương trình gradient

tỷ lệ thành phần pha động.

- Tiến hành chạy 3 chương trình gradient, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.7. Khảo sát chương trình gradient nồng độ.

Chương trìnhgradient 1



Thờ igian(phút)

MeOH(%)

Dungdịchđệm(%)

Thờ igian(phút)

MeOH(%)

H2O(%)

Thờ igian(phút)

MeOH(%)

H2O(%)

0 0 100 0 0 100 0 2 985 0 100 2 15 85 3 2 9815 5 95 5 30 70 10 10 9040 40 60 10 45 55 22 22 7850 40 60 12 85 15 28 100 0

15 100 0 31 2 9840 2 98

Thời gian lưu (phút): - Adenosin: 21,52- Cordycepin: 21,83



Nhận xét: Với chương trình gradient 1 và 2, pic của 2 chất gọn nhưng

chưa tách nhau hoàn toàn. Còn đối với chương trình gradient 3 thì pic adenosin

và cordycepin rất gọn, cân đối, thời gian lưu ổn định, lặp lại với thời gian lưu

hợp lý. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chương trình gradient 3 để tách và

định lượng chất phân tích.







3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm mẫu

Tiến hành khảo sát trên dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký như sau,

thể tích tiêm mẫu thay đổi các giá trị: 5 µl, 10 µl, 20 µl, 40 µl.- Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).

- Detector PDA bướ c sóng 260nm.

- Pha động:

Thời gian (phút) MeOH (%) H2O (%)

0 2 98

3 2 98

10 10 90

22 22 78

28 100 0

31 2 98

40 2 98

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

- Nhiệt độ cột: 25⁰C.

K ết quả cho thấy vớ i thể tích tiêm mẫu 5 hoặc 10 µl, pic adenosin và

cordycepin đều gọn, cân đối, tách tốt, trong khi đó thể tích tiêm mẫu 20 µl và

40 µl pic hai chất đều bị chẻ đôi. Do đó chúng tôi lựa chọn thể tích tiêm mẫu

10 µl đảm bảo pic sắc ký cân đối, đảm bảo độ chính xác buồng tiêm mẫu.







(a)(b)

(c) (d)

Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm mẫu 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40

µl (d).

3.1.5. Khảo sát nhiệt độ cột

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký.

Điều kiện sắc ký tiến hành như mục 3.1.4, thể tích tiêm mẫu 10 µl, nhiệt độ cột

khảo sát: 25oC (tương ứng nhiệt độ phòng) và 40oC.

Đối tượng khảo sát:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin hàm lượng 20 µg/ml.

- Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 0,50 g bột mẫu R1 vào ống ly tâm, thêm

khoảng 15 ml MeOH, siêu âm 30 phút, ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 5







phút, lọc dịch chiết qua giấy lọc thô, dịch lọc trong tập trung vào bình định mức

25 ml. Rửa giấy lọc bằng 7 – 8 ml MeOH, tập trung dịch rửa vào bình định mức

trên. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Kếtquả thu được như sau:

(a)(b)

(c) (d)

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện nhiệt độ

cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện nhiệt độ cột 25oC.

Nhận xét: trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp, nhiệt độ cột ở 40oC, cả hai

chất đều rửa giải nhanh hơn (16,5 và 18,5 phút) so với nhiệt độ cột 25o

C (20,0







và 22,1 phút), hệ số phân giải Rs đều lớn hơn 5. Tuy nhiên sắc ký đồ dung dịch

thử cho thấy adenosin chưa được tách ra khỏi nền mẫu khi sử dụng pha động

với nhiệt độ cột 40

o

C, trong khi đó nhiệt độ cột 25

o

C, pic tách rõ ràng ra khỏinền mẫu. Do đó chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cột kiểm soát ở 25oC để đảm bảo

tách được hai chất ra khỏi nền mẫu.

3.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu

- Yếu tố khảo sát: dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết,

phương pháp chiết.

- Đối tượng khảo sát:

Mẫu dạng rắn: mẫu bột Pure Cordyceps do công ty Medinam cung cấp (mẫu

R1).

Mẫu dạng lỏng: mẫu rượu đông trùng hạ thảo do công ty Văn Duy Phương

cung cấp (mẫu L1).

- Thông số đánh giá: hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu chiết được.

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết

Do adenosin và cordycepin tan trong H2O, MeOH và EtOH, chúng tôi

dùng các dung môi này làm dung môi chiết, khảo sát thành phần dung môi, tỷ

lệ dung môi chiết. Thông số đánh giá: hàm lượng adenosin và cordycepin trong

mẫu. Các điều kiện chiết cố định: phương pháp chiết siêu âm, thời gian chiết:

30 phút, nhiệt độ chiết: không kiểm soát, số lần chiết: 1 lần. Mỗi điều kiện khảo

sát lặp lại 3 lần, lấy kết qủa trung bình.

Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình sau







Hình 3.10. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

Nhận xét: Kết quả cho thấy đối với mẫu R1 dạng rắn, khi sử dụng dung

môi chiết là H2O hoặc MeOH : H2O = 1 : 9 hoặc MeOH : H2O = 1 : 1, lượng

adenosin và cordycepin chiết được đều cao hơn hẳn khi sử dụng các dung môi

còn lại nhưng H2O có khả năng chiết cả hai chất cần phân tích cao nhất. Vì vậy,

60.65

29.91

6.68

60.86

61.74

2.6

8.13

57.29

62.78

21.47

10.93

6.56

16.63

17.65

1.18

2.34

4.11

3.98

0 10 20 30 40 50 60 70

H2O

MeOH

MeOH:H2O=9:1

MeOH:H2O=1:1

MeOH:H2O=1:9

EtOH

EtOH:H2O=9:1

EtOH:H2O=1:1

EtOH:H2O=1:9

Hàm lượng (mg/100g)

D u n g m ô i c h i ế

t

adenosin cordycepin

23.05

19.7

20.46

20.91

21.74

20.43

20.26

3.68

2.68

2.08

1.44

3.33

1.32

1.56

0 5 10 15 20 25

MeOH 100%

MeOH:H2O = 1:1

MeOH: H2O=1:9

H2O

EtOH

EtOH:H2O=1:1

EtOH:H2O=1:9


D u n g m ô i c h i ế t

Adenosin Cordycepin







chúng tôi quyết định sử dụng dung môi chiết là H2O đối với mẫu dạng rắn vì

không độc hại, không gây ô nhiễm môi trường, không dễ cháy nổ và tiết kiệm

hơn các loại dung môi khác.Đối với mẫu L1, khi sử dụng dung môi MeOH và EtOH, hàm lượng

adenosin và cordycepin đều cao hơn hẳn khi sử dụng các dung môi còn lại ,

nhưng dung môi MeOH cho hàm lượng cả hai chất cần phân tích đều cao nhất,

mặt khác khi sử dụng dung môi EtOH nền mẫu khá xấu do hòa tan nhiều tạp

chất. Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng dung môi chiết là MeOH đối với

mẫu dạng lỏng để đảm bảo hiệu suất chiết cao nhất.

3.2.2. Khảo sát số lần chiết

Việc khảo sát số lần chiết được tiến hành trên mẫu dạng rắn. Tiến hành chiết

lặp lại 3 lần để khảo sát khả năng chiết, cố định những thông số còn lại (dung

môi chiết: H2O, phương pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết:

40⁰C). Tại mỗi lần chiết chúng tôi làm lặ p 3 lần song song, lấy kết quả trung

bình. Kết quả thu được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.8. K ết quả khảo sát số lần chiết (n=3).

Số lần chiết HL Adenosin(mg/100 g) (TB ± sd)

HL cordycepin(mg/100 g) (TB ± sd)

1 22,01 ± 0,05 60,05 ± 0,122 22,13 ± 0,08 60,32 ± 0,153 22,20 ± 0,06 60,36 ± 0,10

Nhận xét: Hàm lượng của adenosin và cordycepin thu được trong mẫu

thay đổi không đáng kể khi tăng số lần chiết. Vì vậy, chúng tôi quyết định tiếnhành chiết một lần vẫn đảm bảo hiệu suất và tiết kiệm thời gian.

3.2.3. Khảo sát phương pháp chiết

Chúng tôi tiến hành khảo sát hai phương pháp chiết: siêu âm và đun hồi lưu

cách thủy, cố định các thông số chiết khác: thời gian chiết 30 phút, số lần chiết:

01 lần, dung môi chiết: H2O đối với mẫu R1, MeOH đối với mẫu L1. Mỗi







phương pháp chiết tiến hành lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được

thể hiện trong hình sau:

Hình 3.12. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

Hình 3.13. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

Nhận xét: Đối với cả hai dạng mẫu rắn và lỏng, lượ ng adenosin và cordycepin

chiết được bằng phương pháp siêu âm đều cao hơn so với phương pháp hồi lưu

vì siêu âm có tác dụng tăng mạnh khả năng khuếch tán nhờ tác dụng của sóngsiêu âm: làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng

thành những hạt nhỏ, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp, có tác dụng làm

nóng tại chỗ. Do đó, chúng tôi lựa chọn phương pháp siêu âm để chiết chất cần

phân tích ra khỏi nền mẫu.

58.20

18.01

61.12

23.04

0

10

20

30

40

50

60

70

Cordycepin Adenosin H à m l

ư ợ n g ( m g / 1 0 0 g )

Phương pháp chiết

Đun hồi lưu Siêu âm

20.36

2.89

22.35

3.15

0

5

10

15

20

25

Cordycepin Adenosin H à m l

ư ợ n g ( m g / 1 0 0 g )

Phương pháp chiết

Đun hồi lưu Siêu âm







3.2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết

Tiến hành khảo sát chiết mẫu với các thông số chiết cố định: phương pháp chiết

siêu âm, thời gian chiết 30 phút, dung môi chiết: H2O đối với mẫu R1, MeOHđối với mẫu L1, số lần chiết: 01 lần. Thông số khảo sát: nhiệt độ chiết (nhiệt

độ phòng, 40oC, 50oC, 75oC, 100oC). Mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 3 lần, lấy

kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở hình sau:

Hình 3.14. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

57.73

59.86

59.26

60.77

58.37

21.1

25.04

24.47

20.35

19.3

0 10 20 30 40 50 60 70

25

40

50

75

100


N h i ệ t đ ộ c h i ế t ( o C )

adenosin cordycepin

20.35

22.65

22.69

22.79

21.57

2.35

2.60

2.58

2.67

1.89

0 5 10 15 20 25

25

40

50

75

100


N

h i ệ t đ ộ c h i ế t ( o C )

adenosin cordycepin







Nhận xét: Đối với mẫu dạng rắn R1, hàm lượng cordycepin không chênh

lệch nhiều giữa các mức nhiệt độ chiết, hàm lượng adenosin tăng khi tăng nhiệt

độ chiết đến 40

o

C (25,04 mg/100 g) sau đó khi tăng nhiệt độ chiết hàm lượngadenosin thu được giảm dần, thấp nhất ở nhiệt độ 100oC (19,30 mg/100 g). Do

đó chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 40ºC để chiết adenosin và cordycepin đối với

nền mẫu rắn.

Đối với mẫu dạng lỏng L1, khi nhiệt độ tăng từ 25 oC lên 75oC lượng

adenosin và cordycepin chiết được đều tăng lên, khi chiết ở 100oC lượng hai

chất chiết được giảm một lượng nhỏ so với hàm lượng khi chiết ở 75oC. Do vậy

chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu lỏng ở 75oC.

3.2.5. Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến, cố định các thông số: phương

pháp chiết siêu âm, nhiệt độ chiết 40oC đối với mẫu rắn R1 và 75oC đối với

mẫu lỏng L1, dung môi chiết: H2O đối với mẫu rắn R1 và MeOH đối với mẫu

lỏng L1, số lần chiết: 01 lần. Thông số khảo sát: thời gian chiết (15 phút, 30

phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút). Mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 3 lần, lấy kết

quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở hình sau:

Hình 3.16. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

21.17

22.56

22.32

22.45

22.58

61.04

61.46

62.35

62.72

62.15

0 10 20 30 40 50 60 70

15

30

60

90

120


T h ờ i

g i a n c h i ế t ( p h ú t )

Cordycepin Adenosin







Hình 3.17. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

Nhận xét: Đối với cả 2 mẫu rắn và lỏng, khi tăng thời gian chiết từ 15

phút đến 120 phút, hàm lượng cordycepin trong mẫu chiết được không có sự

chênh lệch đáng kể, hàm lượng adenosin tăng khi tăng thời gian chiết từ 15

phút đến 30 phút (2,69 mg/100g đến 3,05 mg/100g đối với mẫu L1; 21,17

mg/100g đến 22,56 mg/100g đối với mẫu R1), sau đó khi tăng thời gian chiết

đến 120 phút thì hàm lượng chất này thay đổi không đáng kể. Do vậy chúng tôi

lựa chọn thời gian 30 phút để chiết adenosin và cordycepin ra khỏi nền mẫu vì

nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp ảnh hưởng tới kết quả

phân tích.

3.3. Quy trình phân tích

Qua khảo sát quy trình phân tích và điều kiện sắc ký, chúng tôi đưa ra

quy trình định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa

đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn như sau:

3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Dung dịch chuẩn: Cân và pha adenosin và cordycepin trong methanol để

đượ c dung dịch chuẩn hỗn hợ p có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/ml mỗi

chất, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

2.69

3.05

2.99

2.97

3.06

22.02

22.46

22.3

21.99

22.25

0 5 10 15 20 25

15

30

60

90

120


T h ờ i g i a n c h i ế t ( p h ú t )

Cordycepin Adenosin







Dung dịch thử:

Mẫu thử dạng r ắn: Cân chính xác lượ ng mẫu dạng r ắn thích hợp (tương

ứng vớ i 0,30 – 0,50 g ĐTHT) vào ống ly tâm, thêm khoảng 15 ml H2O, lắc đều,siêu âm ở 40oC trong 30 phút, lọc qua giấy lọc thô, dịch lọc chuyển vào bình

định mức 25 ml, dùng H2O r ửa phần cắn trên giấy lọc, dịch r ửa tậ p trung vào

bình định mức 25 ml trên, thêm H2O vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng

lọc 0,45 µm.

Mẫu thử dạng lỏng: Cân chính xác lượ ng mẫu lỏng thích hợp (tương ứng

vứi 0,30 – 0,50 g ĐTHT) vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH,

lắc đều, siêu âm ở 75oC trong 30 phút, để dung dịch về nhiệt độ phòng, thêm

MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

3.3.2. Điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).

- Detector PAD bướ c sóng 260nm.

- Pha động:

Thờ i gian (phút) MeOH (%) H2O (%)0 2 983 2 9810 10 9022 22 7828 100 031 2 9840 2 98

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

- Nhiệt độ cột: 25⁰C.

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

- Thứ tự r ửa giải: adenosin cordycepin.

Tiến hành tiêm dung dịch thử và dung dịch chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký,

ghi lại sắc ký đồ.







3.3.3. Đánh giá kết quả

- Định tính: Định tính thành phần adenosin và cordycepin trong mẫu thử dựa

vào so sánh thời gian lưu và phổ UV của các pic xuất hiện trong sắc ký đồ củadung dịch mẫu thử với thời gian lưu và phổ tương ứng của các pic này trong

sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn.

- Định lượ ng:

Hàm lượ ng adenosin (cordycepin) trong mẫu thử (mg/g) được xác định dựa vào

đườ ng chuẩn theo công thức sau:

X =

(−) 25 0,001

Trong đó:

- AT: diện tích pic của adenosin (cordycepin) trong sắc ký đồ của dung dịch

mẫu thử (mAU.s).

- mt: khối lượ ng mẫu thử (g).

- a, b: hệ số của phương trình đườ ng chuẩn adenosin (cordycepin)

y = ax +b biểu diễn sự phụ thuốc tuyến tính giữa diện tích pic và hàmlượ ng chất chuẩn.

3.4. Đánh giá phương pháp

3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin có nồng độ chính

xác khoảng 20 µg/ml mỗi chất theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.3.2),

ghi lại sắc ký đồ. Kết quả được trình bày ở bảng sau:







Bảng 3.9. Kết quả độ thích hợp của hệ thống.

Thờigian lưu

(phút)

Diệntích pic

(mAU.s)

Hệ sốbất đối

xứng

Độ phângiải

Số đĩa lýthuyết

A d e n o s i n

C3.1 20,080 2740860 0,98 54230C3.2 20,087 2775004 1,00 53497C3.3 20,087 2751945 1,01 53881C3.4 20,100 2757071 1,03 53909C3.5 20,107 2769706 1,01 53752C3.6 20,093 2799351 1,01 52932

Trung bình 20,09 2765656SD 0,010 20570,25

RSD (%) 0,049 0,744

C o r d y c e p i n

C3.1 22,153 2200453 1,02 6,13 71230C3.2 22,167 2220244 1,02 6,11 70516C3.3 22,173 2204457 1,00 6,16 71764C3.4 22,180 2207623 1,03 6,12 70994C3.5 22,187 2208372 1,03 6,11 70784C3.6 22,180 2231010 0,99 6,10 70384

Trung bình 22,17 2212027SD 0,012 11418,32

RSD (%) 0,054 0,516 Nhận xét:

Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu, diện tích

pic đều nhỏ hơn 1%, pic cân đối với hệ số bất đối xứng xấp xỉ 1, số đĩa lý thuyết

> 5000 đối với cả 2 chất, độ phân giải giữa hai pic adenosin và cordycepin > 6,

đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượng với cả hai chất adenosin và

cordycepin.

3.4.2. Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu được đánh giá qua phân tích các mẫu thử, mẫu placebo và mẫu

chuẩn:

- Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn adenosin và cordycepin trong

MeOH có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/ml mỗi chất.







- Dung dịch mẫu placebo 1:

Cân chính xác khoảng 0,50 g bột hỗn hợp các dượ c liệu đã trộn theo tỷ

lệ đồng lượ ng (bột dượ c liệu nhân sâm, bột dượ c liệu tam thất, bột tổ yến) vào ống ly tâm, thêm khoảng 15 ml H2O, lắc đều, tiến hành chiết và

phân tích theo quy trình đã lựa chọn đối vớ i mẫu dạng r ắn (mục 3.3.1).

- Dung dịch mẫu placebo 2:

Cân chính xác khoảng 1,00 g hỗn hợ p các dịch chiết dượ c liệu đã trộn

theo tỷ lệ đồng lượ ng (dịch chiết xuất nhân sâm, dịch chiết xuất tam thất,

nướ c yến) vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều,

tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã lựa chọn đối vớ i mẫu thử

dạng lỏng (mục 3.3.1).

- Dung dịch mẫu R1: đồng nhất mẫu, cân chính xác khoảng 0,30 – 0,50 g

chế phẩm vào ống ly tâm, tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã

lựa chọn đối vớ i mẫu thử dạng r ắn (mục 3.3.1).

- Dung dịch mẫu L1: cân chính xác khoảng 1,00 g chế phẩm vào bình định

mức 25 ml, tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã lựa chọn đối

vớ i mẫu thử dạng lỏng (mục 3.3.1).

Tiến hành: tiêm dung dịch mẫu placebo 1, mẫu placebo 2, dung dịch thử các

mẫu R1 và L1, mẫu chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.3.2). Kết quả thu được như hình sau:







a. Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo 1

b. Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo 2

c. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn adenosin

d. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn cordycepin







e. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp

f. Sắc ký đồ dung dịch mẫu R1

g. Sắc ký đồ dung dịch mẫu L1

Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp. Lấy phổ của adenosin và cordycepin tại thời gian lưu tương ứng trong sắc ký

đồ dung dịch chuẩn và các dung dịch thử, tiến hành so phổ. Kết quả thu được

như hình sau:







(A)

(B)

(C)

(D)

Hình 3.19. So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ

cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D).

Nhận xét:

Trên sắc ký đồ của dung dịch placebo tương ứng không xuất hiện pic nào tại

thời gian lưu tương ứng của các pic adenosin và cordycepin.

Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử có các pic tương ứng với các pic của các

chất nghiên cứu trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn với phổ tương ứng, so phổ







các chất này cho hệ số Match lớn hơn 0,99. Do đó có thể kết luận phương pháp

có độ đặc hiệu cao.

3.4.3. Xây dựng đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính Chúng tôi tiến hành khảo sát tính tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký và nồng

độ các chất phân tích:

- Dung dịch chuẩn gốc: chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc trong MeOH

adenosin 1000 µg/ml, cordycepin 1000 µg/ml.

- Dung dịch chuẩn làm việc: từ các dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha

loãng với MeOH để có các dung dịch chứa chất chuẩn adenosin và

cordycepin ở trong khoảng nồng độ 1 µg/ml – 40 µg/ml.

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn (mục 3.3.2), ghi lại sắc ký

đồ. K ết quả đượ c trình bày trong hình 3.21 và bảng 3.10:

Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ 1 - 40

µg/ml (pic adenosin tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2 phút)

Bảng 3.10. K ết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin,cordycepin và diện tích pic.

Nồng độ (µg/ml) Diện tích (mAU.s) Adenosin Cordycepin

1 145234 1152092 292199 2302434 651285 44663110 1410235 1119984

20 2863410 2324907







40 6203678 5050020Phương trình hồi quy y = 153969x - 48266 y = 126124x - 70764Hệ số tương quan (r) 0,999 0,999

(a)

(b)

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện tích pic

(mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin (b).

Nhận xét: K ết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy trong khoảng nồng độ từ 1

đến 40 µg/ml có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic (hệ số tương

quan r > 0,995).

3.4.4. Kh ảo sát độ chính xác

3.4.4.1. Độ l ặ p l ại của phương pháp

y = 153969x - 48266

R² = 0.998

0

2000000

4000000

6000000

8000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D i ệ n t í c h p i c ( m A U . s

)

Nồng độ (µg/ml)

Đường chuẩn adenosin

y = 126124x - 70764

R² = 0.9982

0

10000002000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 D i ệ n t í c h

p i c ( m A U . s

)

Nồng độ (µg/ml)

Đường chuẩn cordycepin







Độ lặ p lại của phương pháp đượ c tính trên k ết quả phân tích các mẫu độc lậ p

trong cùng một điều kiện phân tích. Tiến hành định lượ ng 6 lần độc lậ p trên mẫu thử

R1, mẫu thử L1 theo quy trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn (mục 3.3). Tính

k ết quả hàm lượ ng adenosin và cordycepin trong mẫu thử, độ lệch chuẩn tương đối,

k ết quả thu được như sau:

Bảng 3.11. K ết quả đánh giá độ lặ p lại của phương pháp vớ i mẫu R1.

Lần Lượngcân (g)

Adenosin CordycepinDiện tích

pic (mAU.s)Hàmlượng

(mg/100g)

Diện tíchpic (mAU.s)

Hàm lượng(mg/100g)

1 0,3125 407705 23,34 1059456 61,702 0,3292 420146 22,31 1060365 62,203 0,3191 402896 21,41 1005896 61,894 0,3285 422596 22,33 998561 59,135 0,2925 402156 22,91 1015687 64,076 0,2892 400012 23,51 975241 62,45

TB 22,64 61,74RSD

(%)3,14 3,17

Bảng 3.12. K ết quả đánh giá độ lặ p lại của phương pháp vớ i mẫu L1.

Lần Lượngcân (g)

Adenosin CordycepinDiện tích

pic (mAU.s)Hàmlượng(mg/g)

Diện tíchpic (mAU.s)

Hàm lượng(mg/g)

1 0,9416 140122 0,028 1042890 0,2232 1,0353 157893 0,029 1140293 0,222

3 1,0999 169278 0,029 1223490 0,2244 1,0460 163256 0,030 1189357 0,2295 1,0724 178345 0,031 1250378 0,2356 1,0353 165417 0,030 1092376 0,212

TB 0,030 0,224RSD(%)

3,93 3,34

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ ≥ 0,01%, độ lặp lại của phương

pháp (RSD %) phải đạt < 5,3%. Kết quả phân tích cho thấy độ lặp lại của







phương pháp đối với cả adenosin và cordycepin trên 2 nền mẫu đều đạt yêu

cầu. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [6].

3.4.4.2. Độ chính xác trung gian Tiến hành định lượng 6 lần lặp lại song song đối với mẫu thử R1 v à L1 theo

quy trình chiết và phân tích đã lựa chọn ở mục 3.3 nhưng tiến hành vào 3 ngày

khác nhau.

Kết quả được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian.

Adenosin Cordycepin

Mẫu R1

Ngày 1Trung bình(n=6)

22,64 mg/100g 61,74 mg/100g

RSD (%) 3,14 3,17


22,23 mg/100g 61,12 mg/100g

RSD (%) 2,89 3,56


22,79 mg/100g 62,10 mg/100g

RSD (%) 3,43 2,34Trung bình (n=18) 22,65 mg/100g 61,71 mg/100gRSD (%) 3,12 2,79

Mẫu L1


0,030 mg/g 0,224 mg/g

RSD (%) 3,93 3,34


0,029 mg/g 0,217 mg/g

RSD (%) 4,73 3,67

Ngày 3Trung bình(n=6) 0,030 mg/g 0,220 mg/gRSD (%) 4,86 3,46

Trung bình (n=18) 0,030 mg/g 0,220 mg/gRSD (%) 4,71 3,56

Nhận xét: Ở cả 2 mẫu thẩm định chỉ tiêu độ chính xác trung gian, kết quả cho

thấy phương pháp khảo sát có độ chính xác đạt yêu cầu của AOAC cho khoảng

nồng độ ≥ 0,01% (độ lặp lại RSD < 5,3%).







3.4.5. Khảo sát độ đúng

Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, xác định giá trị

phần trăm tìm lại chuẩn. Thực hiện ở ba mức nồng độ khác nhau, mỗi mứcnồng độ tiến hành 3 lần, tương ứng 9 mẫu thử riêng biệt.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn thêm vào mẫu thử: hút chính xác 5,0 ml dung

dịch chuẩn gốc adenosin và 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc cordycepin vào bình

định mức 50 ml, thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH, lắc đều được dung dịch

chuẩn hỗn hợp có hàm lượng mỗi chất khoảng 50 µg/ml.

Chuẩn bị dung dịch thử R1 thêm chuẩn khảo sát độ đúng: cân chính xác

khoảng 0,50 g bột mẫu thử vào ống ly tâm, thêm chính xác 1,0 ml hoặc 2,0 ml

hoặc 4,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trên, thêm khoảng 15 ml H2O, tiến hành

chiết mẫu như mục 3.3.1 đối với mẫu thử dạng rắn được các dung dịch thử thêm

chuẩn ở 3 mức nồng độ.

Chuẩn bị dung dịch thử L1 thêm chuẩn khảo sát độ đúng: cân chính xác

khoảng 1,00 g mẫu thử vào bình định mức 25 ml, thêm chính xác 1,0 ml hoặc

2,0 ml hoặc 4,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trên, thêm khoảng 15 ml MeOH,

tiến hành chiết mẫu như mục 3.3.1 đối với mẫu thử dạng lỏng được các dung

dịch thử thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ.

Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch thử thêm chuẩn, xác định hàm lượng

adenosin và cordycepin trong các dung dịch dựa vào đường chuẩn xây dựng

trong cùng ngày phân tích.

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.14.







Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu R1.

Adenosin CordycepinLượng

thêm(µg)

Lượng

tìm lại(µg)

Độ thu

hồi (%)

Lượng

thêm (µg)

Lượng

tìm lại(µg)

Độ thu

hồi (%)

Mức 145,8 44,4 96,9 49,5 50,7 102,445,8 47,5 103,7 49,5 49,8 100,645,8 45,5 99,4 49,5 49,0 99,1

Mức 291,6 91,2 99,5 99,0 94,8 95,791,6 94,8 103,5 99,0 95,9 96,991,6 94,6 103,2 99,0 97,8 98,8

Mức 3

183,2 178,5 97,5 198,0 189,1 95,5

183,2 179,8 98,1 198,0 188,5 95,2183,2 190,7 104,1 198,0 196,6 99,3

TB 100,7 98,2RSD(%)

3,66 2,55

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1.

Adenosin Cordycepin

Lượngthêm(µg)

Lượngtìm lại

(µg)

Độ thu hồi(%)

Lượngthêm(µg)

Lượngtìm lại(µg)

Độ thuhồi (%)

Mức 145,8 46,0 100,4 49,5 52,6 106,345,8 46,7 101,9 49,5 52,4 106,045,8 44,7 97,6 49,5 51,1 103,3

Mức 291,6 90,7 99,1 99,0 103,9 104,991,6 92,8 101,4 99,0 100,0 101,091,6 90,2 98,5 99,0 104,0 105,1

Mức 3183,2 179,3 97,9 198,0 207,9 105,0183,2 165,0 90,1 198,0 192,8 97,4183,2 179,3 97,9 198,0 207,9 105,0

TB 98,3 103,8RSD (%) 3,52 2,77







Nhận xét:

Với quy trình đã lựa chọn, định lượng các chất đã nghiên cứu trên cả 2 nền

mẫu thử có độ thu hồi đều nằm trong khoảng đáp ứng yêu cầu về thẩm định phương pháp đối vớ i phân tích mẫu của AOAC:

Mẫu R1: độ thu hồi của adenosin và cordycepin là 96,9 – 104,1% và 95,2

– 102,4% (nằm trong khoảng 90 – 107% với hàm lượng mẫu ≥ 0,01%)

Mẫu L1: độ thu hồi của adenosin và cordycepin là 90,1 – 101,9% và 97,4 –

106,3% (nằm trong khoảng 90 – 107% với hàm lượng mẫu ≥ 0,01%).

3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành:

Chuẩn bị mẫu placebo 1, mẫu placebo 2 như mục 3.4.2.

Chuẩn bị mẫu placebo 1, mẫu placebo 2 thêm chuẩn hỗn hợp adenosin và

cordycepin được dung dịch có hàm lượng mỗi chất 0,5 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,2

µg/ml, 0,1 µg/ml.

Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 3 lần các dung dịch trên theo điều kiện sắc ký như

mục 3.3.2.

Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu nền (S/N) bằng cách xác định chiều cao

pic mỗi chất chia cho độ nhiễu xung quanh pic tính về hai phía pic. Nhiễu nền

xác định trong khoảng 20 lần độ rộng pic ở ½ chiều cao pic. Kết quả trung bình

như sau:

Bảng 3.16. Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn.

Nồng độ S/N adenosin S/N cordycepin0,5 µg/ml 15 140,25 µg/ml 11 100,2 µg/ml 8 70,1 µg/ml 3 3







Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất).

Nhận xét: trên cả 2 nền mẫu placebo, phương pháp có giới hạn phát hiện

của cả 2 hoạt chất là 0,1 µg/ml. Giới hạn định lượng xác định bằng 3,3 lần giới

hạn phát hiện có giá trị là 0,33 µg/ml. Giới hạn khá thấp chứng tỏ phương pháp

có độ nhạy cao.

Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu

cao, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp đáp ứng

yêu cầu của AOAC [6]. Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp 0,1 µg/ml với

mỗi chất do vậy có thể định tính đối với các mẫu có hàm lượng thấp. Kết quả

thẩm định đáp ứng các yêu cầu của AOAC do vậy có thể áp dụng đối với phân

tích mẫu thực.

3.5. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứa ĐTHT

Các mẫu TPCN chứa ĐTHT được chuẩn bị mẫu như mục 3.3.1, mỗi mẫu

chuẩn bị 3 thử riêng biệt. Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký như mục 3.3.2,

ghi lại sắc ký đồ. Kết quả định tính và định lượng được minh họa trong hình

3.24, 3.25 (đầy đủ trong phụ lục C) và bảng 3.17, 3.18.

3.5.1. Định tính

Sắc ký đồ dung dịch thử các mẫu thử có pic tại thời gian lưu tương ứng với

thời gian lưu của pic adenosin và cordycepin trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn.







Kết quả so phổ của pic tại thời gian lưu của adenosin và cordycepin với phổ

chuẩn adenosin và cordycepin của các mẫu thử đều cho hệ số Match > 0,99

(phổ hai chất tương đối giống nhau). Do vậy có thể kết luận các mẫu thử khảosát thể hiện phép thử định tính của adenosin và cordycepin.

Bảng 3.17. Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử

và chuẩn hỗn hợp.

Mẫuthử

Thời gian lưu pic dungdịch mẫu chuẩn (phút)

Thời gian lưu pic dungdịch mẫu thử (phút)

Hệ số Match

Adenosin Cordycepin Adenosin Cordycepin Adenosin CordycepinR2 20,0 22,1 20,0 22,1 0,9981 0,9994R3 20,3 22,4 20,3 22,4 0,9903 0,9921R4 20,5 22,9 20,5 22,9 0,9912 0,9984R5 20,0 22,0 20,0 22,0 0,9933 0,9915R6 19,9 21,8 19,9 21,8 0,9935 0,9996L2 20,0 22,0 20,0 22,0 0,9934 0,9941L3 19,9 21,9 19,9 21,9 0,9987 0,9978L4 20,6 22,4 20,6 22,4 0,9908 0,9989L5 21,1 23,1 21,1 23,1 0,9905 0,9969L6 21,1 23,2 21,1 23,2 0,9906 0,9938

a)

(b)

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b).







(a) (b)

Hinh 3.24. So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và mẫu

chuẩn tương ứng.

3.5.2. Định lượng

Dựa vào khối lượng mẫu thử, nồng độ chất phân tích trong sắc ký đồ của dung

dịch mẫu thử và đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích tính hàm

lượng (mg/g) adenosin và cordycepin trong mẫu thử.

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.18.







Bảng 3.18. Kết quả hàm lượng adenosin và cordycepin trong các mẫu thử.

Tênmẫu

Mô tả Hàm lượng (mg/g)(TB ± SD) (n = 3)Adenosin Cordycepin

R2Viên nang cứng vỏ màuvàng nhạt, bột bên trongmàu vàng nâum = 0,5313 g

0,224 ± 0,004 1,624 ± 0,003

R3

Viên nang cứng vỏtrong, bột bên trong màuvàng nhạt m = 0,5031 g

0,282 ± 0,003 0,904 ± 0,006

R4

Viên nang cứng màu

vàng nhạt, bột bên trongmàu nâum = 0,4986 g

1,023 ± 0,011 0,205 ± 0,008

R5Bột màu vàng cam 0,063 ± 0,002

mg/g3,134 ± 0,01 mg/g

R6Viên hoàn cứng màunâu đen

1,584 ± 0,018mg/g

0,051 ± 0,0006mg/g

L2Chế phẩm dạng dịchlỏng màu vàng nâu, lẫn

mảnh nhỏ màu trắng

0,0108 ± 0,0002mg/g

0,0066 ± 0,0002mg/g

L3Chế phẩm dạng dịchlỏng màu nâu

0,0087 ± 0,0006mg/g

0,027 ± 0,0006mg/g

L4Chế phẩm dạng caolỏng màu nâu đen

0,261 ± 0,004mg/g

0,102 ± 0,004mg/g

L5Chế phẩm dạng dịchlỏng màu nâu đen

0,122 ± 0,004mg/g

1,519 ± 0,007mg/g

L6Chế phẩm dạng dịchlỏng màu vàng

0,0094 ± 0,0008mg/g

0,0229 ± 0,0007mg/g

Nhận xét:Các mẫu TPCN được định tính định lượng adenosin và cordycepin đều thể hiện

phép thử định tính của hai hoạt chất này. Tuy nhiên hàm lượng adenosin và

cordycepin trên các mẫu thử khảo sát rất khác nhau, tùy thuộc hàm lượng

ĐTHT, chất lượng ĐTHT, loài ĐTHT nhà sản xuất đưa vào sản phẩm. Do vậy

khó đánh giá sản phẩm đang lưu hành có đạt tiêu chuẩn chất lượng không.







Chương 4. BÀN LUẬN

1. Về lựa chọn phương pháp phân tích

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp có thể định tính,định lượ ng đượ c ứng dụng phổ biến hiện nay cho nhiều hoạt chất. Phương pháp

này có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao đượ c sử dụng nhiều tại các

phòng thí nghiệm.

Phương pháp sắc ký lớ p mỏng của tác giả MA King Wah và các cộng sự,

phương pháp đo màu của Nicholas M. Kredich và Armand J. Guarino, phương

pháp điện di mao quản… của các nghiên cứu tham khảo đều chỉ tiến hành trên

nền mẫu dượ c liệu ĐTHT chưa thực hiện trên nền chế phẩm có thêm các thành

phần khác (ngoài ĐTHT). Phương pháp định lượ ng bằng sắc ký lớ p mỏng tiến

hành đơn giản, không cần quá quan tâm đến ảnh hưở ng của nền mẫu nhưng quá

trình tiến hành chịu ảnh hưở ng của nhiều yếu tố như sự chính xác của thể tích

chấm sắc ký, cách chấm (tròn hay vạch), thiết bị và chương trình xử số liệu, …

sẽ ảnh hưở ng tớ i k ết quả. Khi sử dụng phương pháp quang phổ phân tích mẫu

thực phẩm chức năng có nhiều thành phần khác có đặc tính tương tự cordycepin

và adenosin thì nền mẫu sẽ ảnh hưở ng lớn đến tính chọn lọc cũng như khả năng

phân tích chính xác hai hoạt chất nghiên cứu do vậy phương pháp so màu sẽ

không đảm bảo chính xác do ảnh hưở ng bở i các thành phần khác trong mẫu

phân tích. Phương pháp điện di mao quản có khả năng tách tốt, kinh tế và thân

thiện với môi trườ ng do chỉ cần dung dịch đệm điện ly (dung dịch nước), nhưng

thiết bị này không phổ biến trong các phòng thí nghiệm nên sẽ hạn chế khi triển

khai trong thực tế. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đượ c lựa chọn sử

dụng trong nghiên cứu này nhằm đưa ra phương pháp phân tích chính xác,

thườ ng quy cho các phòng thí nghiệm để đánh giá hàm lượ ng hai hoạt chất

adenosin và cordycepin trong thực phẩm chức năng chứa ĐTHT.







2. Về quy trình xử lý mẫu

Các loại dung môi chiết mẫu đượ c sử dụng khảo sát dựa trên độ tan của

hai hoạt chất trong các dung môi thông thườ ng. K ết quả cho thấy đối vớ i mẫudạng r ắn, việc chiết hoạt chất bằng nướ c cho k ết quả hàm lượ ng hai chất phân

tích cao nhất. Dung môi nước có ưu điểm phân tán, làm rã các hạt nhỏ mẫu

giúp cho việc chiết hoạt chất hiệu quả nhất, đồng thờ i là loại dung môi r ẻ tiền,

k hông độc hại. Đối vớ i mẫu dạng lỏng, dung môi chiết cho hàm lượ ng hai hoạt

chất nhiều nhất là dung môi MeOH. Các mẫu TPCN dạng lỏng phần lớ n thành

phần nướ c là chủ yếu, do vậy đã phân tán tốt các tiểu phân hoạt chất trong dung

dịch, khi sử dụng dung môi MeOH có thể hòa tan tốt hơn hai hoạt chất định

lượ ng. Mặt khác mẫu lỏng có một lượ ng khá lớ n thành phần đườ ng, protein

(trong mẫu nướ c yến), việc sử dụng MeOH làm dung môi chiết mẫu có ưu điểm

gây k ết tủa các thành phần này giúp cho việc lọc mẫu dễ hơn.

Hai phương pháp đượ c sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là phương

pháp siêu âm và đun hồi lưu cách thủy. K ết quả khảo sát trên nền mẫu r ắn và

mẫu lỏng đều cho thấy phương pháp chiết siêu âm cho k ết quả hàm lượ ng

adenosin và cordycepin cao hơn so với phương pháp hồi lưu. Điều này có thể

giải thích là do phương pháp siêu âm có tác dụng tăng mạnh tính thấm thấu và

khuếch tán nhờ những tác dụng của sóng siêu âm: làm tăng diện tích tiế p xúc

giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ, tăng cườ ng sự xáo

tr ộn của hỗn hợ p.

Nhiệt độ chiết mẫu khảo sát trên nền mẫu dạng rắn cho thấy với mẫu dạng

rắn nhiệt độ chiết mẫu tốt nhất ở 40oC. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên

cứu của tác giả Jiamin Li và cộng sự khi nghiên cứu nhiệt độ chiết ảnh hưởng

đến hàm lượng hoạt chất adenosin và cordycepin trong mẫu dược liệu C.

militaris. Các tác giả cho rằng, adenosin chiết trong mẫu dược liệu ở nhiệt độ

từ 20 – 40oC là tốt nhất do adenosin trong môi trường nước kém bền với nhiệt

độ, cordycepin không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ chiết [19].







Đối với mẫu dạng lỏng, kết quả nghiên cứu này cho thấy nhiệt độ chiết tốt

nhất ở 75oC, chứng tỏ trong môi trường methanol, adenosin ít chịu ảnh hưởng

bởi nhiệt độ. Kết quả này phù hợp với phương pháp chiết adenosin trong dượcliệu C. sinensis theo chuyên luận dược điển Trung Quốc 2010 (đun hồi lưu trên

cách thủy trong 30 phút) [31].

Kết quả của nghiên cứu cho thấy thời gian chiết mẫu cũng ảnh hưởng đến

hàm lượng hoạt chất chiết ra. Cụ thể khi tăng thời gian chiết từ 15 phút đến 30

phút, hàm lượng cả hai chất đều tăng, khi tăng thời gian chiết từ 30 – 120 phút,

hàm lượng hoạt chất thay đổi không đáng kể. Do vậy việc lựa chọn thời gian

chiết 30 phút có tác dụng tiết kiệm thời gian đồng thời có thể tránh sự giảm

hàm lượng adenosin nếu bị tác động bởi nhiệt khi chiết thời gian dài (siêu âm

thời gian dài dung dịch nước trong máy nóng lên gây tăng nhiệt độ chiết).

Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu trên nền mẫu dạng rắn cho thấy hàm lượng

hai chất adenosin và cordycepin khi chiết 1 lần, chiết 2 và 3 lần không khác

nhau đáng kể, điều này có nghĩa là việc chiết 1 lần đã lấy được hết hoạt chất ra

khỏi nền mẫu. Hơn thế nữa việc chiết 1 lần có ưu điểm tiết kiệm thời gian, dung

môi chiết.

Về phương pháp chiết hoạt chất, nghiên cứu của tác giả Jian – Ping Yuan

và cộng sự cho thấy dược liệu C. militaris được chiết bằng dung môi nước theo

phương pháp siêu âm cho hàm lượng 12 nucleosid cao nhất [36]. Trong khi đó

Lei Huang và cộng sự chiết adenosin và cordycepin trong mẫu quả thể và sinh

khối các loài Cordyceps bằng phương pháp siêu âm công suất 75W với hỗn

hợp dung môi methanol và nước tỷ lệ 1:1 (tt/tt). Như vậy với nền mẫu dạng rắn

nước là dung môi chiết tốt hai hoạt chất adenosin và cordycepin. Đối với nền

mẫu dạng lỏng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về phương pháp tách chiết hai

hoạt chất này.







3. Về điều kiện sắc ký

Sắc ký lỏng pha đảo hiện nay được sử dụng rộng rãi vì tách và phân tích

được nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực, ít phân cực đếnkhông phân cực. Đồng thời thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh

tế. Nghiên cứu này sử dụng pha tĩnh không phân cực bản chất silicagel được

xilan hóa bởi nhóm octadecyl (C18) là loại pha tĩnh có hiệu quả tách tốt, được

sử dụng phổ biến nhất hiện nay.

Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến khả năng phân tích thông qua ảnh hưởng đến

sự rửa giải của hoạt chất. Khi tăng nhiệt độ cột sẽ khiến cho pha động giảm độ

nhớt, do vậy chất phân tích được rửa giải nhanh hơn. Tuy nhiên trong nền mẫu

phức tạp việc rửa giải nhanh có thể dẫn đến khả năng tách kém cho cột. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát nhiệt độ cột 40 oC và nhiệt độ phòng 25oC,

kết quả cho thấy khi nhiệt độ cột ở 40oC cả hai chất phân tích rửa giải nhanh

hơn nhưng trong nền mẫu thử lại chưa tách được hoạt chất adenosin ra khỏi nền

mẫu.

Pha động có vai trò quan tr ọng để r ửa giải chất phân tích trong sắc ký lỏng.

Tiến hành so sánh khả năng rửa giải adenosin và cordycepin bằng hai dung môi

thường đượ c sử dụng trong sắc ký lỏng pha đảo là methanol và acetonitril. K ết

quả cho thấy dung môi acetonitril r ửa giải 2 chất này nhanh hơn, pic gọn, cân

đối. Tuy nhiên, vớ i nền mẫu TPCN còn có nhiều thành phần khác nên r ửa giải

sớ m sẽ dẫn đến việc chưa tách hoàn toàn pic hoạt chất ra khỏi nền mẫu phức

tạ p. Mặt khác, methanol là dung môi r ẻ tiền hơn, do vậy việc sử dụng methanol

sẽ kinh tế hơn mà vẫn đảm bảo khả năng rửa giải hoạt chất trong nền mẫu phức

tạ p. Việc khảo sát 3 chương trình gradient cho thấy chương trình gradient chúng

tôi lựa chọn đảm bảo độ phân giải giữa 2 chất (>6), pic sắc ký gọn, cân đối,

thời gian phân tích 40 phút đảm bảo các thành phần khác của đượ c r ửa giải

hoàn toàn.







Phổ hấp thụ tử ngoại của hai hoạt chất thu được cho thấy hai chất có cực

đại hấp thụ ở bước sóng 260 nm, do vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng phát

hiện là 260 nm để tăng đáp ứng phân tích của chất phân tích, do vậy tăng độnhạy của phương pháp. Bước sóng này giống bước sóng phát hiện trong phần

định lượng adenosin trong chuyên luận của dược điển Trung Quốc 2010 trong

khi đó một số tác giả lựa chọn bước sóng 254 nm [12], [16].

4. Về việc thẩm định phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích trong nghiên cứu này được thẩm định các chỉ tiêu

độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Kết quả cho thấy đối

với cả 2 nền mẫu TPCN đánh giá, phương pháp cho độ chọn lọc cao, hệ số

chồng phổ của cả adenosin và cordycepin đều lớn hơn 0,99. Khoảng tuyến tính

được xây dựng với hàm lượng mỗi chất từ 1 – 40 µg/ml, kết quả cho thấy có sự

tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng hoạt chất và đáp ứng pic sắc ký (diện tích

pic sắc ký). Độ lặp lại trên 2 nền mẫu TPCN được tiến hành trong ngày và khác

ngày cho kết quả đáp ứng yêu cầu của AOAC [6]. Độ đúng của phương pháp

được đánh giá thông qua độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn. Kết quả cho

thấy đối với cả 2 mẫu TPCN nghiên cứu, phương pháp cho độ đúng đạt yêu cầu

của AOAC [6].

Phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin trong các

nghiên cứu trong và ngoài nước chủ yếu dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao với detector UV – VIS. Tác giả Jian Wei Xie và cộng sự đã xây dựng

phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/ESI-MS) định lượng 4 nucleosid trong

C. sinensis trong đó có thành phần adenosin và cordycepin [34]. Phương pháp

này đánh giá giới hạn phát hiện của adenosin và cordycepin đều có giá là 0,1

µg/ml, giới hạn định lượng của adenosin và cordycepin lần lượt là 0,6 và 0,5

µg/ml. Như vậy phương pháp sắc ký lỏng trong nghiên cứu này có độ nhạy

tương đương phương pháp sắc ký lỏng khối phổ của tác giả Jian Wei Xie.







5. Về việc ứng dụng phương pháp để định tính, định lượng một số TPCN chứa

ĐTHT

Trên thị trường Hà Nội, lượng mẫu TPCN chứa ĐTHT vô cùng lớn, hầuhết đều không ghi rõ hàm lượng ĐTHT trong mẫu là bao nhiêu gây khó khăn

cho nhà quản lý khi đánh giá chất lượng sản phẩm. Mặt khác hiện nay ĐTHT

được bán dưới dạng dược liệu sấy khô khá nhiều, chủ yếu là loài C.militaris

được nuôi trồng (cordycepin là nucleosid có hàm lượng cao nhất trong loài

này). Do vậy việc đánh giá hàm lượng cả hai hoạt chất adenosin và cordycepin

là cần thiết. Kết quả phân tích cho thấy mẫu dược liệu C. sinensis cũng như các

mẫu TPCN có thành phần ĐTHT loài này (ví dụ như mẫu viên hoàn cứng Hong

– cho gold) có hàm lượng adenosin cao hơn cordycepin nhiều trong khi đó mẫu

dược liệu C. militaris cũng như TPCN có thành phần ĐTHT loài này (ví dụ

mẫu ĐTHT Aloha) có hàm lượng cordycepin cao hơn adenosin. Dược điển

Trung Quốc 2010 có chuyên luận Cordyceps sinensis trong đó quy định hàm

lượng adenosin không ít hơn 0,01% (tính theo dược liệu khô kiệt) và chuyên

luận sản phẩm Bailing capsule (Fermented cordyceps powder Cs – C – Q80)

quy định hàm lượng adenosin không ít hơn 0,16 mg/viên đối với viên 200 mg

và 0,40 mg/viên đối với viên 500 mg [31]. Ở Việt Nam hiện nay theo thông tư

số 43/2014/TT-BYT ban hành ngày 24 tháng 11 năm 2014 của Bộ Y tế quy

định về quản lý thực phẩm chức năng yêu cầu kiểm nghiệm chất có hoạt tính

sinh học có nguồn gốc từ dược liệu và các cơ sở đăng ký phải công bố giới hạn

cho hàm lượng các hoạt chất này. Do vậy rất khó khăn trong việc đánh giá chất

lượng sản phẩm nếu sản phẩm chưa được đăng ký lại. Kết quả bước đầu này có

thể là một kênh thông tin giúp nhà sản xuất tiêu chuẩn hóa để nâng cao chất

lượng sản phẩm của đơn vị mình.







KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Qua nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi thu được các kết quả sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và

cordycepin trong chế phẩm dạng lỏng và dạng rắn chứa đông trùng hạ thảo

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

* Quy trình cụ thể là:

Xử lý mẫu:

Đối với mẫu dạng rắn, mẫu được chiết với nước bằng phương pháp siêu âm

trong 30 phút ở 40oC. Mẫu dạng lỏng chiết với dung môi methanol bằng phương

pháp siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 75oC.

Điều kiện sắc ký:

Cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 25oC, pha động

gồm hai thành phần methanol (A) và nước (B) theo chương trình gradient: 0 –

3 phút: 2% A; 3 – 10 phút: 2 – 10% A; 10 – 22 phút: 10 – 22% A; 22 – 28 phút:

22 – 100% A; 28 – 31 phút: 100 – 2% A; 31 – 40 phút: 2% A. Tốc độ dòng 1,0

ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, detector PDA bước sóng 260 nm.

Định tính adenosin và cordycepin dựa vào thông số thời gian lưu và hệ số Match

chồng phổ dung dịch mẫu thử tại thời gian lưu tương ứng với dung dịch mẫu

chuẩn.

Định lượng: tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân

tích với r > 0,995.

* Đã thẩm định phương pháp phân tích adenosin và cordycepin trên nền mẫu

dạng rắn và nền mẫu dạng lỏng chứa đông trùng hạ thảo. Kết quả thu được cho

thấy các tiêu chí thẩm định: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính 1 – 40 µg/ml cho

thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất và diện tich pic, độ lặp

lại của phương pháp đối với cả hai hoạt chất RSD từ 3,14% đến 3,93% đạt yêu

cầu AOAC [5] (< 5,3%), độ đúng từ 96,2% đến 106,3% nằm trong khoảng giới







hạn 90 – 107% đối với hàm lượng mẫu ≥ 0,01% theo AOAC. Giới hạn phát

hiện, giới hạn định lượng của phương pháp đối với adenosin và cordycepin

tương đối thấp (0,1 µg/ml) chứng tỏ phương pháp có độ nhạy cao. 2. Đã áp dụng phương pháp phân tích đối với một số sản phẩm TPCN chứa

ĐTHT (5 mẫu dạng rắn, 5 mẫu dạng lỏng). Sắc ký đồ cho 2 pic của 2 chất tách

nhau và không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu (hệ số Match > 0,99) và đáp ứng phân

tích (diện tích pic) nằm trong khoảng tuyến tính 1 – 40 µg/ml đối với mỗi hoạt

chất. Quy trình xử lý mẫu áp dụng đối với các chế phẩm chứa ĐTHT cho thấy

phương pháp có thể áp dụng đối với đa số nền mẫu ví dụ các mẫu thành phần

dược liệu có chứa nhóm hoạt chất flavonoid, saponin kém tan trong nước cũng

như thành phần protein, đường trong mẫu dạng lỏng sẽ kết tủa bởi dung môi

methanol do đó dịch chiết mẫu sẽ ít tạp hơn. Kết quả phân tích các sản phẩm

này cho thấy do có nguồn gốc khác nhau (xuất xứ Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt

Nam), thành phần ĐTHT các loài khác nhau nên hàm lượng hoạt chất thu được

khác nhau (adenosin mẫu dạng rắn từ 0,063 mg/g đến 1,584 mg/g và mẫu dạng

lỏng từ 0,009 mg/g đến 0,261 mg/g; cordycepin mẫu dạng rắn từ 0,051 mg/g

đến 3,134 mg/g và mẫu dạng lỏng từ 0,007 mg/g đến 1,519 mg/g, do vậy rất

khó khăn cho việc đánh giá chất lượng sản phẩm khi chưa có quy định rõ r àng

cho mặt hàng TPCN này.

Kiến nghị

- Ứng dụng phương pháp phân tích adenosin và cordycepin đã xây dựng

để kiểm tra chất lượng các đối tượng mẫu thực phẩm chức năng chứa đông

trùng hạ thảo có thành phần tương tự nền mẫu đã khảo sát.

- Phát triển, đánh giá phương pháp này để phân tích adenosin và

cordycepin trong mẫu thực phẩm chức năng chứa đông trùng hạ thảo có chứa

nhiều thành phần dược liệu khác như sắn dây (Puerariae radix), cam thảo

(Liquorice root), táo (Jujube)…







TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Vân Anh (2014), Xác định adenosin trong thực phẩm chức năng

có chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC , Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.

2. Đái Duy Ban, Lưu Tham Mưu (2009), Đông trùng hạ thảo, nhà xuất bản Y

học, Hà Nội.

3. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích tập 2 – Phân tích dụng cụ, NXB Y học, Hà

Nội.

4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.

5. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định

phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB Khoa học và

kỹ thuật, Hà Nội

Tiếng Anh

6. AOAC International (2012), AOAC official methods of analysis, Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part I: AOAC

Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for

dietary supplements and botanicals.

7. E.J. Buenz, B.A. Bauer, T.W. Osmundson, T.J. Motley (2005), “The

traditional Chinese medicine Cordyceps sinensis and its effects on the

apoptotic homeostatic”, Journal of Ethnopharmacology, 96, pp. 19 – 29.

8. Harry G. Brittain (1998), Analytical profiles of Drug Substances and

Excipients Volume 25, Academic Press, USA.

9. Peter C.K. Cheung (2008), Mushrooms as functional foods, A John Wiley &

Sons Inc, USA.







10. Baoyan Fan and Haibo Zhu (2012), “Cordycepin: pharmacological

properties and their relevant mechanisms”, TANG Humanitas medicine, 2,

pp. 141 – 147. Td cordycepin11. Masatsugu Hori and Masafumi Kitakaze (1991), “Adenosine, the Heart,

and Coronary Circulation”, Hypertension, 18, pp. 565 – 574.

12. Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou

(2009), “Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the

products of Cordyceps spp”, Journal of Microbiology Research, 3 (12),

pp. 957 – 961.

13. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical

procedures: Text and Methodology Q2 (R1).

14. P. Karthe, N. Gautham, Anil Kumar and S.B. Katti (1997), “β – D – 3’ –

Deoxyadenosine (Cordycepin), Acta Cryst., C53, pp, 1694 – 1696.

15. Nicholas M. Kredich and Armand J. Guarino (1960), “An improved method

of isolation and determination of cordycepin”, Biochim. Biophy. Acta, 41,

pp. 361 – 363.

16. Hemanth Kumar and M. Spandana (2013), “Simultaneous Extraction,

determination and anaylysis of Adenosine, Cordycepin and other

derivatives of Cordyceps sinensis of Nepal by new validated HPLC

method”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2 (4), pp. 43 –

45.

17. Hong Jue Lee et al (2012), “The nucleoside antagonist cordycepin causes

DNA double strand breaks in breast cancer cells”, Invest New Drugs, 20,

pp. 1917 – 1925.

18. Seul Gi Lee, Sun – Hee Hyun, Gi – Ho Sung and Hyung – Kyoon Choi

(2014), “Simple and rapid determination of Cordycepin in Cordyceps

militaris Fruiting Bodies by Quantitative Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy”, Analytical Letters, 47, pp. 1031 – 1042.







19. Jiamin Li, Minyi Guan and Yi Li (2015), “Effects of cooking on the

contents of adenosine and cordycepin in Cordyceps militaris”, Procedia

Engineering , 102, pp. 485 – 491.20. Yuanhong Liao et al (2015), “Cordycepin induces cell cycle arrest and

apoptosis by inducing DNA damage and up – regulation of p53 in

Leukemia cells”, Cell Cycle, 14, pp. 761 – 771.

21. King – Wah Ma, Foo – Tim Chau, Jian – Yong Wu (2004), “Analysis of

the Nucleoside Content of Cordyceps sinensis Using the Stepwise

Gradient Elution Technique of Thin – Layer Chromatography”, Chinese

Journal of Chemistry, 22, pp. 85 – 91.

22. Li Ma, Song Zhang and Mei Du (2015), “Cordycein from Cordyceps

militaris prevents hyperglycemia in alloxan – induced diabetic mice”,

Nutrition research, 35, pp. 431 – 439.

23. K.J. Patel, R.S. Ingalhalli (2013), “Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link – An

Important Medicinal Mushroom”, Journal of Pharmacognosy and

Phytochemistry, Vol. 2, Issue 1, pp. 315 – 319.

24. Yerra Koteswara Rao, Chia – Hsien Chou, Yew – Min Tzeng (2006), “A

simple and rapid method for identification and determination of

cordycepin in Cordyceps militaris by capillary electrophoresis”, Analytica

Chimica Acta, 566, pp. 253 – 258.

25. M.G. Shashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar, B. Mahohar (2013),

“Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement

– A review”, Journal of Functional foods, Vol. 5, Issue 3, pp. 1013 – 1030.

26. Jiang – Feng Song, Chun - Quan Liu, Da – Jing Li and Bang – Quan Jin

(2007), “ Optimization of cordycepin extraction from cultured Cordyceps

militaris by HPLC – DAD coupled with uniform design”, J. Chem.

Technol. Biotechnol , 82, pp. 1122 – 1126.







27. Lucia Spicuzza, Giuseppe Di Maria, Riccardo Polosa (2006), “Adenosine

in the airways: Implications and applications”, European Journal of

Pharmacology, 533, pp. 77 – 88.28. Yung – Jen Tsai, Lie – Chwen Lin and Tung – Hu Tsai (2010),

“Pharmacokinetics of Adenosine and Cordycepin, a Bioactive Constituent

of Cordyceps sinensis in Rat”, J. Agric. Food Chem., 58, pp. 4638 – 4643.

29. Oyvind Stensrud, Nigel L. Hywel – Jones and Trond Schumacher (2005),

“Toward a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA

sequence data confirm divergent lineages and paraphyly”, Mycol. Res.,

109(1), pp. 41 – 56.

30. Gi – Ho Sung et al (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and

the clavicipitaceous fungi”, Study in Mycology, 57, pp. 5 – 59.

31. The Pharmacopoeia of the people’s republic of China (2010), pp. 129.

32. Hardeep S. Tuli, S.S. Sandlu, Dharambir Kashap and Anil K. Sharma

(2014), “Optimization of extraction conditions and antimicrobial potential

of a bioactive metabolite, cordycepin from Cordyceps militaris 3936”,

World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical sciences, Vol. 3, Issue

4, pp. 1525 – 1535.

33. Hardeep S. Tuli, Anil K. Sharma, Sardul S. Sandhu, Dharambir Kashyap

(2013), “Cordycepin: A bioactive metabolite with therapeutic potential”,

Life Sciences, 93, pp. 863 – 869.

34. Jian – Wei Xie, Lan – Fang Huang, Wei Hu, Yun – Biao He and Kin Ping

Wong (2010), Molecules, 15, pp. 305 – 314.

35. Li Yu et al (2006), “Quality evaluation of Cordyceps through simultaneous

determination of eleven nucleosides and bases by RP – HPLC”, J. Sep.

Sci., 29, pp. 953 – 958.







36. Jian – Ping Yuan, Shu – Yan Zhao, Jiang – Hai Wang, Hui – Cong Kuang

and Xin Liu (2008), “Distribution of Nucleosides and Nucleobases in

Edible Fungi”, J. Agric. Food Chem, 56, pp. 809 – 815.37. Xuanwei Zhou, Zhenghua Gong, Ying Su, Juan Lin and Kexuan Tang

(2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions

and developmental products”, Journal of Pharmacy and Pharmacology,

61, pp. 279 – 291.







PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO VÀ

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA ĐTHT

Hình A.1. Hình ảnh của một số loài ĐTHT: a: C. gracilis; b: C. ishikariensis;c: C. liangshanensis; d: C. martialis; e: C. militaris; f: C. nutans; g: C.

pruinosa; h: C. sinensis; i: C. sphecocephala; j: C. tricentri







Hình A.2. Hình ảnh một số sản phẩm TPCN chứa ĐTHT.







PHỤ LỤC B: TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ

Phụ lục B1: Tiêu chí đánh giá độ lặp lại

Bảng C1.1. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theoAOAC)TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)1 100 1 100 1,32 10 10-1 10 1,83 1 10-2 1 2,74 0,1 10-3 0,1 3,75 0,01 10-4 100 5,36 0,001 10-5 10 7,3

7 0,0001 10

-6

1 118 0,00001 10-7 100 159 0,000001 10-8 10 2110 0,0000001 10-9 1 30

Phụ lục B2: Tiêu chí đánh giá độ thu hồi Bảng C2.1. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC)TT Hàm lượng

%Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)

1 100 1 100% 98 – 1022 ≥10 10-1 10% 98 – 1023 ≥1 10-2 1% 97 – 1034 ≥0,1 10-3 0,1% 95 – 1055 0,01 10-4 100ppm 90 – 1076 0,001 10-5 10ppm 80 - 1107 0,0001 10-6 1ppm 80 - 1108 0,00001 10-7 100ppb 80 - 1109 0,000001 10-8 10ppb 60 - 11510 0,0000001 10-9 1ppb 40 - 120







PHỤ LUC D. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ.







M ẫ u R3







M ẫ u R4







M ẫ u R5







M ẫ u R6







M ẫ u L3







M ẫ u L4







M ẫ u L5







M ẫ u L6







PHỤ LỤC D. HÌNH ẢNH CHỒNG PHỔ PIC ADENOSIN,CORDYCEPIN MỘT SỐ MẪU THỬ

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L3.

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R5.







Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R6.








PHỤ LỤC E: CHỨ NG CHỈ PHÂN TÍCH CHUẨN

Chu ẩ n adenosin







Chuẩn cordycepin

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHONWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin...

Documents