Ya-Juan Liu, Hai-Long Wu, Ru-Qin Yu Kang

hlwu@hnu.edu.cn 16 April 2012

State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics

Hunan University

实验 11. 苯、萘、联苯、菲的高效液相色谱分析授课老师 : 王青

2013 年春

一、实验目的1 、了解反相色谱的优点及应用；2 、熟悉有关高效液相色谱分析的操作技术；3 、学会运用归一化法进行定量分析和计算。

二、实验原理2.1 归一化 在液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，这种色谱法称为反相色谱法。这种分离方式特别适合于同系物、苯并系物等。苯、萘、联苯、菲在 ODS 柱上的作用力大小不等，它们的 k’ 值不等（ k’ 为不同组分的分配比），在柱内的移动速率不同，因而先后流出柱子。根据组分峰面积大小及测得的定量校正因子，就可由归一化定量方法求出各组分的含量。归一化定量公式为：

式中： Ai 为组分的峰面积； 为组分的相对质量校正因子。 采用归一化法的条件是样品中所有组分都要流出色谱柱并出峰。此法简便、准确，对进样量的要求不十分严格。

2.2 相对质量校正因子 色谱定量分析是基于峰面积与组分的量呈正比关系。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的灵敏度不同，所以两个相等量的物质不一定得到相等的峰面积。或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质的量。因此，在计算时需将面积乘上一个换算系数（ ） , 使组分的面积转换成相应物质的量，即：

式中： 为组分 i 的量，它可以是质量，也可以是物质的量或体积（对气体），在本实验中采用的是质量； Ai 为峰面积； 为换算系数，因此就称为质量校正因子； 但在实际工作中，由于物质量 不易准确测量，所以 也不易得到，通常以相对质量校正因子 代替质量校正因子 。

2.3 色谱分离原理 使混合物中各组分在两相间进行分配 , 其中一相是不动的 ( 固定相 ), 另一相 ( 流动相 ) 携带混合物流过此固定相 , 与固定相发生作用 , 在同一推动力下 , 不同组分在固定相中滞留的时间不同 , 依次从固定相中流出 , 又称色层法 , 层析法。

2.4 高效液相色谱仪流路图（ I ） . 高压输液系统 (carrier gas)（ II ） . 进样系统 (sample injection)（ III ） . 分离系统 (capillary column)（ IV ） . 检测系统 ( detector)1 流动相容器； 2 高压输液泵； 3 进样器；4 色谱柱； 5 检测器； 6 工作站； 7 废液瓶。

本实验中的高效液相色谱仪

三、实验部分3.1 仪器、药品及材料 日本岛津 LC—10ATVP 高效液相色谱仪； 25μL 微量注射器；甲醇（重蒸馏 1 次）； 2 次蒸馏水、苯、萘、联苯、菲，均为 AR级。3.2 操作条件 检测器：紫外吸收检测器 流速： 0.8mL min-1

柱温：室温 检测器工作波长： 254nm 流动相配比：甲醇 / 水 =80/20 。 色谱柱： Econoshpere C18 （ 3μm ）， 15cm×4.6mm 。

3.3 操作步骤（ 1 ）按仪器操作说明书使色谱仪正常运行，并将实验条件调节如下： 柱温：室温 流动相流量： 0.8mL min-1 检测器工作波长： 254nm（ 2 ）标准溶液配制：准确称取苯约 0.1g ，萘约 0.08g ，联苯 0.2g ，菲 0.01g ，用重蒸馏的甲醇溶解，并转移至50mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。（ 3 ）在基线平直后，注入标准溶液 5.0μL ，记下各组分保留时间。再分别注入纯样对照。（ 4 ）注入样品 5.0μL ，记下保留时间。重复 2 次。（ 5 ）实验结束后，按要求关好仪器。

实验数据记录表格

四、结果处理 根据上述实验所得的数据，进行结果分析：（ 1 ）确定未知样中各组分的山峰次序。（ 2 ）求取各组分的相对质量校正因子。（ 3 ）求取样品中各组分的质量分数。（ 4 ）计算以萘为标准时的柱效。

五、注意事项 在进行实验时，要注意以下事项： （ 1 ）用微量注射器吸液时，要防止气泡吸入。首行将擦干净并用 样品吸洗过的注射器插入样品液面后，反复提拉数次，驱除气泡，然后缓缓提升针芯到刻度。 （ 2 ）室温较低时，为加速萘的溶解，可用红外灯稍稍加热。 （ 3 ）不可将注射器针尖对着人，以免扎伤。

思考题1.观察分离所得的色谱图，解释不同组分之间分离差别的原因。2.高效液相色谱柱一般可在室温下进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？高效液相色谱柱有时也实行恒温，这又为什么？