załącznik nr 2 autoreferat w języku polskim akg‚ącznik_nr... · 2018. 4. 18. · aneta...

Aneta Kaniak-Golik Załącznik nr 2: Autoreferat

1

AUTOREFERAT

Naprawa i utrzymanie mitochondrialnego DNA w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae w sieci powiązań między

mitochondriami i jądrem w modelowej komórce eukariotycznej


2

1. Imię i Nazwisko. Aneta Kaniak-Golik 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

• Magister biologii/ specjalizacja mikrobiologia, Uniwersytet Wrocławski, 1992 r. Praca magisterska pt.: „Adenylate kinase in yeast (AKY2): characterisation of two suppressor

genes of AKY2 deficiency, URA6 and SAK2”.

Tłumaczenie z języka angielskiego: “Kinaza adenylowa w drożdżach (AKY2): charakteryzacja

dwóch genów supresorowych defektu AKY2, URA6 i SAK2”).

Promotor: prof. dr hab. Tadeusz Lachowicz, współ-promotor prof. Wolfhard Bandlow (Institut

für Genetik und Mikrobiologie, Universität München w Monachium, Niemcy)

• Doktor Uniwersytetu Pierre et Marie Curie Paris VI, Paryż (Francja), w zakresie

genetyki komórkowej i molekularnej, 1998 r.

Praca doktorska pt. „Analyse fonctionelle des gènes decouverts par le séquençage génomique

systematique de la levure S. cerevisiae”

Tłumaczenie z języka francuskiego: „Analiza funkcjonalna genów odkrytych w ramach

systematycznego sekwencjonowania genomu drożdży S. cerevisiae”

Promotor: prof. Piotr P. Słonimski

Nostryfikacja powyższego tytułu jako równorzędnego do tytułu doktora nauk biologicznych w

zakresie biologii na Uniwersytecie Wrocławskim, Wydział Nauk Przyrodniczych, 14.06.1999 r.

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych.

• 1999-2003: staż podoktorski w laboratorium prof. Marka H. Johnston w Washington

University School of Medicine w St. Louis (USA).

• Od 1.11.2003 r. - 31.10.2012 r. praca na stanowisku adiunkta, a od 1.12.2012 r. do teraz

praca na stanowisku asystenta, w Instytucie Biochemii I Biofizyki PAN w Warszawie.


3

4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego, Naprawa i utrzymanie mitochondrialnego DNA w komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae w sieci powiązań między mitochondriami i jądrem w modelowej komórce eukariotycznej

b) 6 publikacji wchodzących w skład osiągnięcia:

1. Kaniak A.*, Dzierzbicki P.*, Rogowska A.T., Malc E., Fikus M., Cieśla Z. Msh1p

counteracts oxidative lesion-induced instability of mtDNA and stimulates mitochondrial

recombination in Saccharomyces cerevisiae (2009). DNA Repair (Amst). 8: 318-29.

CI 18; IF2009 4,199; MNISW 35.

Byłam autorem korespondencyjnym. *: równy udział autorów.

Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; konstrukcja większości szczepów (szczepy YAK) i plazmidów; opracowanie metody testu na mitochondrialną rekombinację alleliczną w drożdżach S. cerevisiae przy użyciu genu reporterowego ARG8m; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Fig. 7; udział w analizie i interpretacji wyników badań oraz udział w opiece nad pracą doktorantek, Pani Ewy Malc i Pani Agaty Rogowskiej; udział w przygotowaniu manuskryptu i tabel; wykonanie Fig. 7 i koordynacja przygotowania pozostałych rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy. Mój wkład oceniam na 40%.

2. Malc E.*, Dzierzbicki P.*, Kaniak A., Skoneczna A., Cieśla Z. Inactivation of the 20S

proteasome maturase, Ump1p, leads to the instability of mtDNA in Saccharomyces cerevisiae

(2009). Mutat Res. 669: 95-103.

CI 16; IF2009 3,556; MNISW 35.


Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Fig. 4B; udział w analizie i interpretacji wyników badań oraz udział w opiece nad doktorantką, Panią Ewą Malc; udział w przygotowaniu manuskryptu, tabel i rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy. Mój wkład oceniam na 30%.


4

3. Dzierzbicki P.*, Kaniak-Golik A.*, Malc E., Mieczkowski P., Cieśla Z. The generation of

oxidative stress-induced rearrangements in Saccharomyces cerevisiae mtDNA is dependent on

the Nuc1 (EndoG/ExoG) nuclease and is enhanced by inactivation of the MRX complex (2012).

Mutat Res. 740: 21-33.

CI 8; IF2012 3,902; MNISW 35


Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; konstrukcja większości szczepów (szczepy YAK) i plazmidu pCTA1-kanMX; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Tab. 3, Fig. 4C-D, Fig. 5, Fig. 6B; udział w przygotowaniu manuskryptu, tabel i rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy; napisanie projektu badawczego i kierowanie grantem MSWiN Nr N N303 611038 (zakończony w roku 2015), z którego były finansowane te badania. Mój wkład oceniam na 40%.

4. Kaniak-Golik A., Kuberska R., Dzierzbicki P., Śledziewska-Gójska E. Activation of Dun1 in

response to nuclear DNA instability accounts for the increase in mitochondrial point mutations in

Rad27/FEN1 deficient S. cerevisiae (2017). PLoS One 12(7): e0180153. doi:

10.1371/journal.pone.0180153.

CI 0; IF2016 2,806; MNISW 35

Byłam autorem korespondencyjnym.

Udział w opracowaniu koncepcji pracy i planowaniu doświadczeń; napisanie projektu badawczego i kierowanie grantem w ramach konkursu „OPUS 4” (nr 2012/07/B/NZ3/02914; przedłużony do 2018 r.), z którego były finansowane te badania; konstrukcja szczepów i plazmidów wykorzystanych w tej pracy; wykonanie eksperymentów, których wyniki są zamieszczone w Fig. 1 – 4 (Fig. 2 i Fig. 3 we współpracy z Panem dr. Piotrem Dzierzbickim), Tab. 4 - 6; udział w analizie i interpretacji wyników badań; opieka nad doktorantką Panią Renatą Kuberską; udział w przygotowaniu manuskryptu, tabel i rysunków; przygotowanie odpowiedzi na uwagi recenzentów; piecza nad końcową wersją pracy. Mój wkład oceniam na 70%.

5. Kaniak-Golik A. and Skoneczna A. Mitochondria-nucleus network for genome stability

(2015). Free Radic Biol Med. 82:73-104.

CI 20; IF2015 5,784; MNISW 40


5

Napisałam rozdział „Maintenance of the mitochondrial genome” oraz uczestniczyłam w redakcji pozostałych części artykułu oraz Tab. 1; brałam udział w przygotowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój wkład oceniam na 45%. Współautorka, Pani dr hab. Adrianna Skoneczna (autor korespondencyjny) w swojej habilitacji oceniła jej wkład w tym artykule na 55%.

6. Skoneczna A., Kaniak A., Skoneczny M. Genetic instability in budding and fission yeast –

sources and mechanisms (2015). FEMS Microbiol Rev. 39: 917-67.

CI 10; IF2015 13,687; MNISW 45

Napisałam rozdziały: „Recombination and genomic stability” i „Mitochondria and genome stability”; współuczestniczyłam w pisaniu rozdziału „Mitochondrial influence on the nuclear genome”; przygotowałam Tab. 2; uczestniczyłam w przygotowaniu Tab. 3 oraz rysunków: Fig. 8 i Fig. 9; uczestniczyłam w redakcji pozostałych części artykułu oraz w przygotowaniu odpowiedzi na uwagi recenzentów. Mój wkład oceniam na 40%.

Łączny IF publikacji wchodzących w skład osiągnięcia: 33,93; punktów MNiSW: 225: cytowań: 72.

Te sześć prac tworzy całość osiągnięcia naukowego, które omówione jest poniżej.

c) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania

WPROWADZENIE

Mitochondria, komórkowe struktury o wymiarach w przekroju średniej wielkości bakterii

(tj. 1-10 µm) otoczone dwiema podwójnymi błonami fosfolipidowymi, są jednymi z

charakterystycznych organelli komórek eukariotycznych, występującymi u wszystkich wolno

żyjących Eukaryota przystosowanych do aerobowych warunków życia. Mitochondria są

strukturami dynamicznymi, które nieustannie łączą się i dzielą, tworząc rozgałęzioną

przestrzenną siatkę rurkowatych kanałów1. Mitochondria, jak wiele struktur komórkowych, nie

mogą powstawać de novo2,3. Nowo powstająca komórka musi odziedziczyć mitochondria od

komórki rodzicielskiej w wyniku podziału już istniejącego kompartmentu w komórce

macierzystej i przeniesienia fragmentu mitochondrium do komórki potomnej w czasie podziału

komórki. Główna funkcja tych organelli jest związana z pozyskiwaniem energii w reakcjach

utleniania pirogronianu do dwutlenku węgla i wody, czemu towarzyszy zużycie tlenu, oraz z

magazynowaniem uwolnionej energii w postaci cząsteczek ATP. Hydroliza ATP umożliwia


6

zajście wielu reakcji komórkowych wymagających energii. Produkcja ATP nie jest jednak

jedyną funkcją mitochondrium. W mitochondriach są także zlokalizowane enzymy biorące

udział w syntezie wielu związków: aminokwasów, nukleotydów, witamin, kwasów

tłuszczowych, fosfolipidów, kwasu liponowego jako ko-faktora dehydrogenazy pirogronianowej

i innych enzymów, hemu do koordynacji jonów żelaza Fe2+ w wielu hemobiałkach, ale przede

wszystkim niezbędnych do przeżycia grup prostetycznych Fe-S. Mitochondria produkują nie

tylko swoje białka z grupami Fe-S, wśród których są liczne składniki łańcucha oddechowego i

enzymy, np. akonitaza, ale są też miejscem, z którego jest eksportowany do cytoplazmy związek

zawierający siarkę wymagany do składania tych grup prostetycznych w cytoplazmie dla białek

Fe-S działających w cytoplazmie lub jądrze4.

Błony mitochondrialne dzielą mitochondrium na 4 główne wyspecjalizowane strukturalnie i

funkcjonalnie kompartmenty (oddziały): 1. Błona zewnętrzna (OMM; ang. skrót outer

mitochondrial membrane); 2. Przestrzeń międzybłonowa (IMS; skrót od ang. intermembrane

space); 3. Błona wewnętrzna (IMM; skrót od ang. inner mitochondrial membrane); 4. Macierz

(matriks) mitochondrialna ograniczona IMM. W matriks mitochondrialnej są zlokalizowane

enzymy cyklu Krebsa, które przeprowadzają stopniowe reakcje utlenienia pirogronianu. Błona

wewnętrzna tworzy liczne pofałdowania, wpuklenia, tzw. cristae (łac.), czyli grzebienie

mitochondrialne, które znacznie zwiększają dostępną powierzchnię, na której skupiają się

kompleksy syntazy ATP i kompleksy przenośników elektronów łańcucha oddechowego.

Mitochondrialna błona wewnętrzna, podobnie jak błona tylakoidow w chloroplastach oraz błony

plazmatyczne komórek prokariotycznych, są wyspecjalizowane w reakcjach konwersji energii, w

których dochodzi do chemiosmotycznego sprzężenia aktywności łańcucha przenośników

elektronów generującej gradient protonowy w poprzek nieprzepuszczalnej dla protonów błony z

aktywnością syntazy ATP produkującej w matriks ATP kosztem rozproszenia tego gradientu5.

Jest jeszcze jedno znaczące podobieństwo między chemiosmotycznymi systemami organelli

eukariotycznych i komórkami prokariotycznymi. Wszystkie błony energetyczne, na których

zachodzi produkcja ATP sprzężona z dysypacją gradientów elektrochemicznych generowanych

przez łańcuchy przenośników redoks są związane z własnymi genomami i w bezpośrednim

sąsiedztwie tych błon odbywa się synteza wszystkich lub przynajmniej niektórych składników

chemiosmotycznej maszynerii kodowanych przez te genomy. O ile ta sytuacja nie wydaje się

szczególna dla całych komórek prokariotycznych, o tyle w przypadku organelli energetycznych


7

nie jest oczywiste, dlaczego zarówno mitochondria, jak i chloroplasty, posiadają swój własny

wyspecjalizowany wielokopijny genom i lokalny system ekspresji genów. Hipoteza CORR (ang.

co-location for redox regulation; tłumaczenie: ko-lokalizacja dla regulacji redoks) wyjaśnia

zależność funkcji błon bioenergetycznych od genomów zlokalizowanych w bezpośrednim

sąsiedztwie tych błon koniecznością lokalnej regulacji ekspresji genów na lokalne zmiany w

potencjale błon mitochondrialnych6. Brak odpowiedniej regulacji, skutkowałby zaburzeniami

przepływu elektronów i zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS).

Mitochondrialne DNA zostało odkryte na początku lat 60-tych ubiegłego wieku7,8. W

oparciu o obecność w mitochondriach materiału genetycznego Lynn Margulis zaproponowała

teorię endosymbiotycznego pochodzenia tych organelli9,10, potwierdzoną później przez analizy

filogenetyczne na podstawie sekwencjonowania genomów wielu organizmów prokariotycznych i

eukariotycznych, w tym również genomów organellarnych. Obecnie przyjmuje się, że

mitochondria powstały w trakcie ewolucji organizmów żywych około 1,5-2 mld lat temu na

skutek jednokrotnego zdarzenia endosymbiotycznego, w którym endosymbiont zbliżony do

obecnych α-proteobakterii wniknął do innej komórki prokariotycznej podobnej do komórek

współcześnie żyjących archeonów11. Główna zmiana ewolucyjna polegała na redukcji genomu

endosymbionta poprzez utratę genów oraz przejęcie większości genów α-proteobakteryjnego

przodka przez genom gospodarza12. Co ciekawe, pochodzące od mitochondriów beztlenowe

organella (mitosomy i hydrogenosomy), które nie posiadają aktywnego łańcucha oddechowego,

pozbawione są również mtDNA13. W 2010 roku Nick Lane i William Martin sformułowali

hipotezę, że dopiero endosymbioza i w konsekwencji powstanie mitochondrium z własnym

wielokopijnym genomem pozwoliły przekształcić się komórce prokariotycznej w eukariotyczną

przez uwolnienie błony komórkowej od ograniczeń związanych z utrzymaniem w tej lokalizacji

przenośników elektronów i aparatu do chemiosmotycznej syntezy ATP14. Internalizacja

bioenergetycznych błon wraz z genomem, który je „obsługuje”, uwolniła komórki od

ograniczenia związanego z wielkością genomu, umożliwiając wzrost liczby wyrażanych genów.

Co więcej, wzrost wielkości genomu i przyrost liczby białek, które genom koduje, dało z kolei

początek ewolucji coraz bardziej złożonych organizmów: Metazoa i roślin wyższych.

Endosymbiotyczne pochodzenie wyjaśnia też obecność genomów w chloroplastach. Ich historia

ewolucyjna jest jednak znacznie bardziej złożona niż monofiletycznych mitochondriów15.


8

Genomy mitochondrialne wykazują znaczne zróżnicowanie ewolucyjne, zarówno pod

względem struktury, jak i repertuaru zawartych w nich genów oraz mechanizmów ich

ekspresji16. Regułą jest jednak to, że większość kodowanych w nich białek to kluczowe

podjednostki kompleksów bioenergetycznych – mitochondrialnego łańcucha transportu

elektronów oraz syntazy ATP. Przykładowo, mtDNA ssaków koduje 13 białek, wchodzących w

skład kompleksów I, III i IV mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów oraz syntazy

ATP. Dodatkowo, zawiera 2 geny mitorybosomalnego RNA oraz zestaw 22 genów tRNA,

kodujących niezbędne składniki mitochondrialnego aparatu syntezy białek. Bardzo podobnie

wygląda repertuar genów zawartych w mtDNA odległych ewolucyjnie modelowych drożdży

Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe – najistotniejszą różnicą jest brak

kodowanych mitochondrialnie 7 podjednostek kompleksu I (często traconych niezależnie w

różnych liniach ewolucyjnych grzybów) oraz obecność jednego genu kodującego białko

wchodzące w skład mitorybosomu. Znacznie większe zróżnicowanie repertuaru genów można

spotkać w mtDNA roślin oraz przedstawicieli wczesnych odgałęzień drzewa filogenetycznego

Eukaryota, zbiorczo zaliczanych do Protista – są tam zarówno silnie zredukowane mtDNA

Plasmodium (5 genów), jak i genom mitochondrialny Reclinomonas americana,

prawdopodobnie najbardziej podobny do genomu endosymbiotycznego przodka, zawierający 97

genów, w tym 62 geny determinujące białka17.

Ponieważ to łańcuch oddechowy w mitochondriach jest głównym źródłem ROS w komórce18,

brak właściwej odpowiedzi mitochondrialnego genomu na zmiany potencjału wewnętrznej błony

mitochondrialnej, co przewiduje wymieniona powyżej hipoteza CORR, może doprowadzić do

nadprodukcji ROS, która w komórkach wielu eukariontów, od najprostszych zaczynając,

prowadzi do uruchomienia programowanej śmierci komórki19. Powstające w mitochondriach

ROS są też jednym z głównych czynników prowadzących do powstawania uszkodzeń w DNA

mitochondrialnym. Spośród najprostszych reaktywnych form tlenu, produktów stopniowych

jednoelektronowych redukcji cząsteczkowego tlenu, najbardziej niebezpieczną jest cząsteczka

rodnika hydroksylowego. Jest to jeden z „najbardziej reaktywnych utleniaczy znanych

chemikom”20, który może reagować z praktycznie każdym związkiem w komórce, w tym

również z lipidami i DNA. Rodnik hydroksylowy szczególnie łatwo reaguje z guaniną poprzez

dołączenie się do atomu węgla w pozycji 8. pierścienia, co powoduje przekształcenie zasady

albo w 8-oksoguaninę (8-okso-7,8-dihydro-2’-deoksyyguaninę; skrót 8-oksoGua) z


9

zachowaniem układu dwóch pierścieni, albo wręcz prowadzi do otwarcia mniejszego pierścienia

guaniny i powstania 2,6-diamino-4-hydroksy-5-formamidopirymidiny (Fapy-Gua)21. Obecność

obu zmienionych zasad prowadzi do powstania mutacji typu podstawienia o sygnaturze GC do

TA, ponieważ polimerazy często wstawiają naprzeciwko tych zmodyfikowanych zasad

adeninę21,22. Oprócz tego rodnik hydroksylowy jest w stanie reagować z każdą inną zasadą

azotową oraz resztami cukrowymi, w tym również może doprowadzić do bezpośredniego

przerwania łańcucha, a w konsekwencji powstania pęknięć w pojedynczej lub podwójnej nici

DNA23.

Mimo kluczowego znaczenia genomu mitochondrialnego dla fizjologii i ewolucji Eukaryota,

mechanizmy zapewniające stabilność mtDNA – rekombinacja i naprawa uszkodzeń DNA – są

znacznie słabiej poznane, niż te działające w genomie jądrowym. Najdogodniejszym układem do

badania procesów związanych z biologią molekularną i genetyką mitochondriów pozostają

drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae), organizm dla którego opracowano w ciągu

wielu dekad badań proste metody analizy genetycznej, wiele narzędzi do genetycznych

manipulacji i metod do poszukiwania mutantów o najrozmaitszych fenotypach24,25. W badaniach

nad genetyką mitochondriów istotny jest szczególny metabolizm tego organizmu,

wykorzystywany w gospodarce człowieka od zarania dziejów naszego gatunku. Komórki tego

grzyba: 1) fermentują fruktozę lub glukozę do etanolu w obecności tlenu (efekt Crabtree), 2)

rosną w warunkach beztlenowych, 3) są petite-pozytywne, czyli mogą żyć bez funkcjonalnego

mtDNA, zwanego genomem rho+. Dzięki tym szczególnym właściwościom metabolicznym

drożdży S. cerevisiae jesteśmy w stanie łatwo izolować i badać mutanty pozbawione funkcji

oddechowej, także na skutek mutacji w mtDNA.

Wśród zaburzeń genetycznych mitochondriów drożdżowych bardzo częste są rearanżacje

mtDNA, prowadzące do powstania mitochondrialnych przearanżowanych genomów (rho¯), w

których brakuje całych fragmentów mitochondrialnego genomu i które w rezultacie tracą

całkowicie zdolność do wyrażenia niezbędnego dla oddychania zestawu genów kodowanych

przez genom mitochondrialny. Rearanżacje generujące defektywne genomy mitochondrialne

rho– są najczęstszym powodem utraty zdolności do oddychania u drożdży i pojawiania się tzw.

nieoddychających mutantów petite, które tworzą mniejsze kolonie na podłożu z niskim

stężeniem glukozy (0.1%) w porównaniu z koloniami oddychających komórek drożdży rho+26,27.


10

Ten typ mutacji mitochondrialnego genomu odpowiadałby zatem mutacjom w genomie

jądrowym zwanym po angielsku gross chromosomal rearrangements (skrót: GCR; tłumaczenie:

rozległe rearanżacje chromosomalne), które, podobnie jak w jądrze, powstają w rezultacie

rekombinacji pomiędzy sekwencjami nieallelicznymi, którą czasami nazywa się „błędną” lub

„nieuprawnioną”. Częstość występowania mutantów petite typu rho¯ w różnych szczepach

laboratoryjnych jest cechą zmienną i warunkowaną przez liczne geny jądrowe28, w tym niektóre

polimorficzne29. Uważa się jednak, że u większości szczepów typu dzikiego częstość mutacji

petite typu rho¯ nie przekracza 2%30. Mutanty zupełnie pozbawione mtDNA, tzw. rho0, są

izolowane dosyć rzadko w szczepach typu dzikiego, ale jest wiele genów w genomie S.

cerevisiae, które kodują białka niezbędne do utrzymania mtDNA28,31.

Również dużo rzadsze niż mutanty rho¯, bo wykrywane przy częstościach mniejszych o

cztery do pięciu rzędów wielkości, są mutacje punktowe w mtDNA, których poziom można

oszacować na podstawie częstości pojawiania się mutantów opornych na inhibitory

mitochondrialne, jak przykładowo erytromycynę (mutacje w mitochondrialnym genie 21S

rRNA32,33), czy oligomycynę (mutacje w genach ATP6 i ATP934,35), które wykorzystywaliśmy w

naszych badaniach36-38. Głównym problemem komplikującym interpretację wyników testów z

wykorzystaniem tych i innych antybiotyków jest możliwość selekcji mutacji jądrowych, które

również mogą nadać komórkom drożdżowym cechę oporności na dany antybiotyk. Jednym z

istotnych wątków poruszonych w podjętych przez nas badaniach było zatem opracowanie

wiarygodnych metod planowania i interpretacji eksperymentów mierzących poziom mutagenezy

mtDNA.

Jednym ze sposobów wyjścia poza ograniczenia klasycznych testów na mutagenezę

mitochondrialnego genomu drożdży jest znalezienie innego genu docelowego w mitochondrium.

Do naszych badań nad mutagenezą i naprawą mtDNA używaliśmy szczepów niosących

skonstruowany w laboratorium Toma Foxa, niezwiązany bezpośrednio z oddychaniem,

mitochondrialny gen reporterowy ARG8m 39. Rekodowany (ze względu na różnice w kodzie

genetycznym między genomem mitochondrialnym i jądrem w komórkach drożdży40) ARG8m

wprowadzony do mtDNA drożdży w zastępstwie ORF-u mitochondrialnego genu COX3 i

wyrażony pod promotorem tego genu był zdolny do komplementacji fenotypu auksotrofii

argininowej szczepu, w którym inaktywowano jądrową kopię ARG839. Podobnie było kiedy gen


11

reporterowy ARG8m zastąpił ORF innego genu mitochondrialnego COX241. Skonstruowano na

bazie tego reportera trzy interesujące systemy do badania różnych aspektów utrzymania

sekwencji mtDNA: 1) stabilność mikrosatelitarnych powtórzeń w mtDNA422) mutacje typu

frameshift w defektywnym allelu arg8m-143, 3) delecje genu reporterowego między

bezpośrednimi powtórzeniami44. Wykorzystywaliśmy w naszych badaniach nad różnymi genami

kodującymi białka odpowiedzialne za naprawę i utrzymanie mtDNA wszystkie te trzy systemy

eksperymentalne, co opisuję poniżej. W pracy Kaniak et al. (2009)36 opracowaliśmy na bazie

reportera cox3::ARG8m metodę do badania rekombinacji allelicznej mtDNA, którą też użyliśmy

w eksperymentach opisanych w pracy Dzierzbicki et al. (2012)45 oraz Kaniak-Golik et al.

(2017)38.

Głównymi czynnikami warunkującymi integralność genomu mitochondrialnego w

komórkach drożdży S. cerevisiae są: stabilność struktury kompleksu białek z mtDNA, zwanego

nukleoidem 46,47 oraz procesy związane z replikacją, rekombinacją i naprawą uszkodzeń mtDNA.

W omawianych tu naszych badaniach nie testowałam mutantów z zaburzeniami struktury

mitochondrialnego nukleoidu, koncentrując się na trzech podstawowych procesach

warunkujących stabilność sekwencji mtDNA i integralność genomu typu dzikiego w komórkach

drożdży S. cerevisiae:

1) wierności replikacji mtDNA katalizowanej przez mitochondrialną polimerazę DNA,

Mip148,49, homolog ssaczej podjednostki katalitycznej POLG1;

2) procesie naprawy niesparowanych zasad (ang. mismatch repair; w skrócie MMR) dzięki

aktywności białka Msh1, które zapewnia dodatkowy system korygowania błędów

replikacji33 oraz, analogicznie do jądrowych systemów MMR w komórce, służy odrzucaniu

niesparowanych lub częściowo niesparowanych heterodupleksów50 powstających podczas

rekombinacji wielokopijnego mtDNA, która może zachodzić również jako rekombinacja

pomiędzy nieallelicznymi sekwencjami44,51

3) usuwaniu uszkodzeń mtDNA generowanych pod wpływem reaktywnych form tlenu

(generowanych przez łańcuch oddechowy, ale także powstających pod wpływem UV lub

promieniowania jonizującego) i innych genotoksycznych czynników (np. czynniki

metylujące, jak MMS) poprzez system naprawy wycinający zmienione zasady (skrót : BER,

ang. base excision repair). Naprawa typu BER jest wieloetapowa i wielotorowa, wymagająca


12

koordynacji aktywności wielu enzymów wśród, których są rozmaite glikozylazy

rozpoznające specyficznie zmodyfikowane zasady i rozpoczynające ciąg reakcji naprawy

poprzez hydrolizę wiązania N-glikozylowego pomiędzy zasadą i deoksyrybozą, są również:

endonukleaza nacinająca powstające w reakcji katalizowanej przez glikozylazy miejsca

bezzasadowe, polimeraza/y DNA oraz ligaza51.

Poniżej przedstawiam cykl prac, w których podjęłam się badania roli różnych mechanizmów

naprawy DNA w utrzymaniu stabilności drożdżowego genomu mitochondrialnego, w

szczególności wobec presji uszkodzeń związanych z działaniem reaktywnych form tlenu.

1. Rola białka Msh1 i rekombinacji homologicznej w zapobieganiu gromadzenia się

mutacji wynikających z uszkodzeń oksydacyjnych w mtDNA - Kaniak et al.

(2009)36.

Białko Msh1, podstawowy element głównego systemu wspomagającego polimerazę

Mip1 w utrzymaniu integralności i sekwencji mtDNA w komórkach S. cerevisiae, jest

mitochondrialnym homologiem bakteryjnych białek MutS zaangażowanych w naprawę

niesparowanych zasad52. Białko wiąże się preferencyjnie do DNA z niesparowanymi zasadami i

hydrolizuje ATP53,54. Brak Msh1 prowadzi do utraty integralności genomów rho+ i

przekształcenia ich w przearanżowane genomy rho¯ 52. Taki fenotyp sugeruje, że Msh1 w

mitochondriach bierze udział w systemie kontroli procesów rekombinacyjnych, podobnie jak

jądrowe homologi MutS50. Białka Msh monitorują jakość heterodupleksów powstających

podczas rekombinacji i przeciwdziałają dokończeniu rekombinacji przy udziale heterodupleksów

zawierających niesparowane zasady (ang. heteroduplex rejection). Poprzez zależny od Msh1

proces odrzucenia niesparowanych lub częściowo niesparowanych heterodupleksów

dochodziłoby do ograniczenia nieallelicznych zdarzeń rekombinacyjnych, które prowadzą do

rearanżacji genomu rho+ i powstania niefunkcjonalnych genomów rho¯. Dodatkowo, częściowy

defekt funkcji Msh1 wiąże się ze zwiększeniem mutagenezy punktowej w mtDNA, co sugeruje,

że Msh1 może brać udział w mitochondrialnej MMR (mtMMR) usuwającej błędy

replikacyjne w mtDNA54. Ścieżka (lub ścieżki), na której działa to białko w mitochondriach nie

została jeszcze poznana - nie znamy czynników białkowych, które współdziałają z Msh1 w


13

mtMMR lub odrzuceniu heterodupleksów w czasie rekombinacji prowadzącej do rearanżacji

mtDNA.

W tej pracy opisujemy wyniki doświadczeń, w których spróbowaliśmy odpowiedzieć na

pytanie, czy białko Msh1 bierze udział w przeciwdziałaniu mutagenezie mtDNA wywołanej

przez uszkodzenia oksydacyjne, a jeśli tak, czy białko to działa na tym samym szlaku, co znane

czynniki mitochondrialnego BER zaangażowane w usuwanie oksydacyjnych uszkodzeń w

mtDNA. W tym celu zbadaliśmy genetyczne interakcje pomiędzy mutacją punktową w genie

MSH1 prowadzącą do częściowego defektu kodowanego białka Msh1 (allel msh1-R813W) a

delecjami genów, których brak powoduje zwiększenie poziomu uszkodzeń oksydacyjnych w

mtDNA. Przetestowaliśmy, z jednej strony, delecję wywołującą endogenny stres oksydacyjny w

mitochondrium poprzez inaktywację genu SOD2, który koduje znajdującą się w matriks

mitochondrialnej Mn-zależną dysmutazę ponadtlenkową, oraz, z drugiej strony, delecje genów

OGG1, NTG1 oraz APN1, kodujących mitochondrialne enzymy BER uczestniczące w naprawie

DNA poprzez usuwanie oksydacyjnie zmienionych zasad. Allel genu MSH1, który badaliśmy w

tej pracy, koduje białko Msh1 z pojedynczym podstawieniem w silnie konserwowanej domenie

wiążącej ATP. Mutacja ta została wprowadzona na wzór opisanej wcześniej mutacji w

homologicznym białku jądrowym Msh255,56. Allel msh1-R813W prowadzi do tylko częściowej

utraty funkcji genu. Szczepy niosące ten allel utrzymują mtDNA typu rho+ (choć w porównaniu

ze szczepami typu dzikiego, wykazują wyraźny wzrost częstości powstawania mutantów rho¯,

do czego jeszcze powracam poniżej), oraz w ich mtDNA gromadzą się mutacje wykrywane ze

zwiększoną częstością w testach mutagenezy oporności na oligomycynę lub erytromycynę. Ten

fenotyp msh1-R813W jest zgodny z defektem opisanym dla analogicznego mutanta msh2-

R730W, który okazał się niezdolny do naprawy MMR w czasie rekombinacji DNA jądrowego55.

Wyniki naszych badań przedstawione w tej pracy pokazały synergistyczny wzrost poziomu

mutagenezy OR w szczepie mutanta podwójnego sod2Δ msh1-R813W w porównaniu z

mutantami pojedynczymi, co wskazuje na znaczący udział białka Msh1 w naprawie uszkodzeń

oksydacyjnych prowadzących do mutacji punktowych w mtDNA komórek pozbawionych

dysmutazy Sod2. Ten wniosek jest również zgodny z supresją podwyższonych poziomów

częstości mutantów OR i mutantów ER w szczepie sod2Δ po transformacji plazmidem

centromerycznym z genem MSH1. Efekt supresji sugeruje, że nawet stosunkowo niewielka

nadekspresja MSH1 może zapobiec zwiększonej mitochondrialnej mutagenezie indukowanej


14

endogennym stresem oksydacyjnym. Brak dysmutazy Sod2 jednak nie zmienił fenotypu

niestabilności genomów rho+ w mutancie msh1-R813W (26-krotny przyrost częstości mutantów

rho¯ w porównaniu ze szczepem dzikim niezależnie od allelu genu SOD2), co sugeruje, że

mechanizmy powstawania mutacji OR i rho¯ w mutancie msh1-R813W są inne i prawdopodobnie

związane z dwoma niezależnymi funkcjami białka Msh1 w mitochondrium. Z kolei, pomiary

poziomów mutagenezy mitochondrialnej mierzonej częstością pojawiania się mutacji OR w

szczepach podwójnych mutantów niosących allel msh1-R813W oraz jedną z trzech delecji genów

kodujących białka zaangażowane w mtBER, tj. ogg1D, apn1D i ntg1D, pokazały, że glikozylaza

Ogg1 i endonukleaza Apn1 działają na inne uszkodzenia niż ścieżka zależna od Msh1

zapobiegająca utrwalaniu się mutacji OR (przyrosty w podwójnych mutantach jedynie

addytywne), natomiast w tle genetycznym naszych szczepów w warunkach spontanicznych

glikozylaza Ntg1 nie odgrywa znaczącej roli w naprawie uszkodzeń, które prowadzą do mutacji

OR. Jeśli chodzi o stabilność genomów rho+, zależności między badanymi mutacjami były

odmienne. Brak Ntg1 zwiększył około 2-krotnie stabilność genomu rho+ w szczepie msh1-

R813W (tj. zmniejszył poziom częstości mutantów rho¯). Tymczasem, obie delecje ogg1Δ i

apn1D wykazały przeciwną do ntg1D interakcję z allelem msh1-R813W pod względem fenotypu

częstości mutantów rho¯. O ile żadna z pojedynczych inaktywacji OGG1 czy APN1 nie prowadzi

do znaczącej destabilizacji genomu rho+ ponad poziom obserwowany w szczepie typu dzikiego,

o tyle mutanty podwójne, msh1-R813W ogg1D i msh1-R813W apn1D, wykazują synergistycznie

zwiększone poziomy częstości mutantów rho¯, które powstają w wyniku rearanżacji genomu

mitochondrialnego. Te wyniki sugerują, że niektóre czynniki mtBER (glikozylaza Ogg1 oraz

endonukleaza Apn1) działają prawdopodobnie równolegle do ścieżki Msh1, przyczyniając

się do naprawy tych samych uszkodzeń oksydacyjnych, które nienaprawione mogą

prowadzić do rearanżacji mtDNA.

W kontynuacji tych badań planuję sprawdzić, czy synergistyczny przyrost częstości

przearanżowanych genomów rho¯ w msh1-R813W ogg1D i msh1-R813W apn1D zależy od

obecności glikozylazy Ntg1. Badania nad replikacją genomów rho¯ zachowujących sekwencję

ori5 w mitochondriach drożdży pokazały, że glikozylaza Ntg1 rozpoznaje specyficzne

oksydacyjne uszkodzenia indukowane przez działanie nadtlenku wodoru w ori5, przyczyniając

się do powstania pęknięcia podwójnej nici57. Pęknięcie ori5 w mtDNA inicjuje z kolei zależną


15

od rekombinacji replikację (RDR; ang. recombination-dependent replication) mtDNA we

współdziałaniu z 5’-egzonukleazą Din7 i mitochondrialną rekombinazą Mhr157,58. Pomimo kilku

publikacji na ten temat, wciąż nie jest jasne, czy replikacja inicjowana przez rekombinację

zależną od rekombinazy Mhr1 jest specyficzna dla replikacji defektywnych genomów rho¯, czy

może mieć znaczenie również dla replikacji genomu typu dzikiego rho+. Dopiero najnowsze

dane sugerują, że replikacja mtDNA w komórkach S. cerevisiae inicjowana przez naprawę

pęknięć podwójnej nici DNA, a nie przez wydłużanie transkryptów syntetyzowanych przez

mitochondrialną polimerazę RNA, jak dotąd uważano59, jest prawdopodobnie dominującą formą

replikacji w mitochondrium60. Jeśli tak rzeczywiście jest, to ścieżka Msh1 monitorująca jakość

heterodupleksów w mitochondrium, jako swego rodzaju punkt kontrolny rekombinacji,

miałaby kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności mitochondrialnego genomu rho+

podczas inicjacji replikacji DNA w mitochondrium.

Kolejny nasz wynik przytoczony w tej publikacji wskazuje, że rola białka Msh1 w punkcie

kontrolnym rekombinacji mtDNA nie musi sprowadzać się tylko do jego prawdopodobnej roli w

odrzucaniu niesparowanych heterodupleksów. Ponieważ przypuszczaliśmy, że mechanizm

rearanżacji mtDNA w mutancie msh1-R813W, których częstość wzrasta po inaktywacji genu

OGG1 lub APN1, związany jest ze zmianą wydajności rekombinacji w tym mutancie,

opracowaliśmy na bazie mitochondrialnego reportera ARG8m test mitochondrialnej

heteroallelicznej rekombinacji dla komórek drożdżowych i sprawdziliśmy efekt nadekspresji

genu MSH1 na częstość rekombinacji wykrywanej tym testem. Pokazaliśmy, że umiarkowana

nadprodukcja białka Msh1 typu dzikiego stymuluje rekombinację alleliczną mtDNA.

Natomiast, nadekspresja alleli kodujących defektywne warianty białka Msh1, Msh1-R813W lub

Msh1-G776D, nie zwiększała częstości rekombinacji allelicznej, chociaż poziomy wszystkich

trzech białek, typu dzikiego i dwóch białek zmutowanych, wykrywanych w komórkach były

zbliżone. Ten wynik wskazuje, że defekt w zmutowanym białku Msh1-R813W nie tylko

zatrzymuje naprawę MMR (zwiększony poziom mitochondrialnych mutacji punktowych), ale

również uniemożliwia stymulację rekombinacji allelicznej przez Msh1. Ta zbieżność sugeruje

możliwość, że inne białka mtMMR, które współdziałają z Msh1 na szlaku MMR, mogą również

być potrzebne do pełnej stymulacji rekombinacji allelicznej mtDNA, co może być wykorzystane

w poszukiwaniach nieznanych jeszcze czynników mtMMR. Dodatkowo, po publikacji

omawianego artykułu pokazaliśmy, że ten sam konstrukt plazmidowy, z którego


16

nadprodukowane było białko Msh1 w eksperymentach pokazujących stymulację rekombinacji

allelicznej w mitochondrium, po stransformowaniu do odpowiedniego szczepu reporterowego

obniża częstość rekombinacji między bezpośrednimi powtórzeniami w mtDNA, a zatem

rekombinację niealleliczną. Ten wynik jest z kolei zgodny z proponowaną funkcją Msh1 w

procesie odrzucania heterodupleksów w punkcie kontrolnym rekombinacji zachodzącej w

mitochondrium. Mamy zamiar zweryfikować te wstępne wyniki, szukając czynników

białkowych, które uczestniczą z Msh1 bądź w mtMMR i stymulacji rekombinacji allelicznej,

bądź w zahamowaniu rekombinacji nieallelicznej.

2. Rola systemu kontroli jakości białek w utrzymaniu integralności mtDNA - Malc et

al. (2009)37.

Wątek roli białka Msh1 w zapobieganiu uszkodzeniom mtDNA powstającym na skutek

akumulacji reaktywnych form tlenu (ROS) w mitochondrium pojawił się w kolejnej pracy, w

której badaliśmy wpływ jednego z głównych ogólno-komórkowych systemów kontroli jakości

białek, systemu ubikwityna-proteasom (UPS), na funkcję mitochondrialną związaną z

utrzymaniem integralności i sekwencji mtDNA. UPS rozpoznaje, rozplata, a następnie degraduje

białka, które zostają wcześniej zaznaczone poprzez przyłączenie poliubikwityny61. Białka

degradowane przez UPS to najczęściej białka o krótkim czasie półtrwania, białka regulacyjne m.

in. istotne dla przebiegu cyklu komórkowego lub odpowiedzi na uszkodzenia DNA, ale także

białka, które zostały oksydacyjnie uszkodzone. Testowaliśmy szczepy pozbawione genu UMP1,

kodującego maturazę 20S proteasomu, która jest jednym z czynników regulujących i

ułatwiających stopniowe składanie podjednostek proteasomu62. Komórki pozbawione białka

Ump1 żyją, ale rosną wolno i są termowrażliwe. Pokazaliśmy, że szczep ump1Δ wykazuje

również fenotyp mutatora mitochondrialnego: 1) w hodowlach tego szczepu w warunkach

wzrostu w temperaturze permisywnej częstość mutantów petite z przearanżowanym mtDNA

(rho¯) jest ponad 15 razy wyższa niż w hodowlach szczepu typu dzikiego, 2) poziom

mutagenezy punktowej w mtDNA również wzrasta w tym szczepie: częstość mutantów OR jest

ponad 35-krotnie, a mutantów ER 6-krotnie wyższa od częstości analogicznych mutantów w

szczepie typu dzikiego. Następnie pokazaliśmy, że przy 3-krotnym wzroście poziomu białka

Msh1 w komórkach szczepu ump1Δ częstość mutantów ER zmniejszyła się do poziomu


17

obserwowanego w szczepie dzikim, natomiast częstości mutantów OR i petite zmniejszyły się

częściowo (odpowiednio, ponad 3- i 2-krotnie). Zatem, uszkodzenia w mtDNA komórek z

defektywnym proteasomem mogą być całkowicie lub częściowo naprawione przez szlak

zależny od Msh1. Na kolejnym etapie pracy sprawdziliśmy poziom ROS w ekstraktach z

komórek szczepu ump1Δ i szczepu kontrolnego. Wyniki naszych testów pokazały, że defekt

proteasomu na skutek braku białka Ump1 indukuje endogenny stres oksydacyjny w komórkach

drożdży, na co wskazuje 4-krotny wzrost poziomu ROS wykrywany w tych komórkach. Supresja

fenotypu mutatora mitochondrialnego w szczepie ump1Δ stransformowanym plazmidem z

MSH1 nie doprowadziła do supresji zwiększonego poziomu ROS w tym szczepie, co sugeruje,

że wzrost mutacji mitochondrialnych w komórkach ump1D, choć znaczący, nie jest źródłem

stresu oksydacyjnego zaindukowanego przez defekt proteasomu. Rozważaliśmy tę możliwość na

podstawie znanej od dawna propozycji samonapędzajacego się „błędnego koła” gromadzących

się mutacji w mtDNA, które mogą prowadzić do syntezy wadliwych składników łańcucha

oddechowego generujących jeszcze więcej ROS i, w konsekwencji, do powstawania nowych

uszkodzeń w mtDNA, z których część może ulec utrwaleniu w postaci kolejnych mutacji63.

Nasze wyniki nie wskazują, aby taki był mechanizm dodatkowego stresu oksydacyjnego w

komórkach ump1D.

Żeby wyjaśnić jak w warunkach braku Ump1 regulowany jest poziom białka Msh1,

pokazaliśmy, że poziom Msh1 jest przynajmniej 2-krotnie niższy zarówno w ekstraktach

całkowitych komórek ump1Δ, jak i w mitochondriach. Ponieważ system UPS kontroluje wiele

białek regulacyjnych warunkujących poziom transkrypcji wielu genów64, zmierzyliśmy poziom

transkryptu genu MSH1 w szczepie pozbawionym UMP1 w porównaniu ze szczepem

kontrolnym, co pozwoliło wykazać około 2-krotne obniżenie poziomu transkryptu MSH1 w

komórkach ump1D. Na podstawie tych danych wywnioskowaliśmy, że zmniejszony poziom

mRNA MSH1 w komórkach z defektywnym proteasomem prowadzi do obniżenia poziomu

białka Msh1 w mitochondriach, co z kolei w warunkach towarzyszącego stresu oksydacyjnego i

gromadzenia się w mtDNA uszkodzeń pociąga za sobą zaburzenia w kontroli rekombinacji

inicjującej replikację (funkcja zależnego od Msh1 punktu kontrolnego rekombinacji

mitochondrialnej, o czym pisałam powyżej) i w naprawie mtDNA. W konsekwencji,

przynajmniej część defektów utrzymania integralności i sekwencji mtDNA obserwowanych w


18

szczepach pozbawionych białka Ump1 wynika z obniżonego poziomu białka Msh1 w

mitochondriach tych szczepów, jednak ogólny stres oksydacyjny i znaczna część niestabilności

genomu rho+ (podniesiona częstość rho¯) oraz zwiększonej mitochondrialnej mutagenezy

punktowej (mutacje OR) jest niezależna od niedoboru Msh1.

Mechanizm zwiększonej mutagenezy mtDNA w komórkach ump1D pozostaje jeszcze do

zbadania, ale ponieważ jest coraz więcej doniesień o ewolucyjnie konserwowanych ścieżkach

specyficznej degradacji białek mitochondrialnych wykorzystującej proteasom (ang.

mitochondria-associated degradation; skrót MAD), jedna zależna od ATPazy Cdc48 (VCP u

ssaków), druga od ATPazy Msp1 (ATAD1 u ssaków)65, wśród mitochondrialnych substratów

tych ścieżek MAD należałoby szukać białek, których gromadzenie się w mitochondriach w

warunkach defektu proteasomu odpowiada za mutagenezę mitochondrialnego genomu

niezależną od Msh1 i stres oksydacyjny w szczepie ump1D.

3. Badanie mechanizmów powstawania i naprawy wywoływanych przez stres

oksydacyjny uszkodzeń, które prowadzą do rearanżacji mtDNA - Dzierzbicki et al.,

(2012)45

Wcześniejsze badania wykazały, że stres wywoływany w mitochondriach przez reaktywne

formy tlenu powoduje powstawanie zarówno mutacji punktowych, jak i rearanżacji genomu

mitochondrialnego. Kolejna praca miała na celu bliższe zbadanie, jak te rearanżacje powstają i

jakie mechanizmy im zapobiegają.

Poszukując warunków stresu oksydacyjnego, w których można powtarzalnie wykryć w

drożdżach niestabilność mtDNA, wypróbowaliśmy dwa związki znane jako czynniki

oksydacyjne w komórkach drożdży: antymycynę A i menadion. Antymycyna A hamuje

przepływ elektronów przez łańcuch oddechowy na etapie kompleksu III, co powoduje produkcję

anionorodnika ponadtlenkowego w mitochondriach. Z kolei, menadion (2-metylo-1,4-

naftochinon) ulega redukcji katalizowanej przez flawoenzymy komórkowe, które są

zlokalizowane zarówno w błonach mitochondrialnych, jak i w retikulum endoplazmatycznym, i

spontanicznie utlenia się w reakcji z tlenem, generując anionorodnik ponadtlenkowy20. Cykl

redukcji i utleniania może powtórzyć się wielokrotnie, za każdym razem produkując cząsteczki


19

ROS. Dodatkowo, menadion i pokrewne związki mogą również hamować aktywność

acetylotranferaz66, które spełniają w komórce szereg różnych funkcji niekoniecznie bezpośrednio

związanych z mitochondriami67. Poglądowo porównując działanie antymycyny i menadionu,

można uogólnić, że antymycyna produkuje rodniki lokalnie w mitochondrium, menadion

natomiast może działać w całej komórce. Zgodne z tym wnioskiem są wyniki wcześniejszych

badań, które pokazały, że menadion w komórkach drożdży powoduje zatrzymanie cyklu

komórkowego w fazie G1 przez nieznany mechanizm, niezależny od białka Rad9, w odróżnieniu

od mechanizmu oddziaływania nadtlenku wodoru na cykl komórkowy drożdży, który działa

przez Rad9, zatrzymując cykl w fazie G268. Natomiast, nie ma danych wskazujących na

zaburzenia regulacji cyklu komórkowego w drożdżach po traktowaniu antymycyną. Na

podstawie tego krótkiego przeglądu podobieństw i różnic w działaniu tych dwóch inhibitorów

generujących w komórkach ROS można przewidywać, że drożdże powinny inaczej odpowiadać

na traktowanie antymycyną w porównaniu z odpowiedzią po menadionie, co potwierdziły

wyniki naszych eksperymentów.

Antymycyna indukowała zwiększenie częstości mutantów z przearanżowanymi genomami

rho¯, jednak tylko w czasie wzrostu na niefermentowalnych źródłach węgla, kiedy oddychanie

było jedynym procesem generującym energię, natomiast traktowanie antymycyną nie zmieniało

częstości punktowej mutagenezy mitochondrialnej. Traktowanie menadionem, na odwrót,

indukowało mutagenezę punktową w mtDNA niezależnie od źródła węgla, ale nie wpływało

znacząco na stabilność genomów rho+. Aby wyjaśnić, te różnice w odpowiedziach na

antymycynę i menadion zmierzyliśmy poziomy ROS i ATP w ekstraktach z komórek szczepu

typu dzikiego dzielących się w podłożu z niefermentowalnym źródlem węgla w obecności

antymycyny lub menadionu. Chociaż oba związki spowodowały podobne wzrosty poziomów

anionorodnika w komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi, tylko antymycyna

zaindukowała znaczący wzrost poziomu nadtlenku wodoru w traktowanych komórkach. Z

drugiej strony, pomiary poziomów ATP w komórkach po traktowaniu antymycyną lub

menadionem w hodowlach rosnących na niefermentowalnym źródle wegla, pokazały wyższy

spadek poziomu ATP po antymycynie niż menadionie, co było do przewidzenia, ponieważ

antymycyna jest bezpośrednim inhibitorem aktywności łańcucha oddechowego. Ponieważ

stwierdziliśmy korelację niestabilności genomów rho+ (wyższą częstość mutantów rho¯) z

podwyższonym poziomem nadtlenku wodoru w komórkach po traktowaniu antymycyną,


20

sprawdziliśmy, czy w tych warunkach nadprodukcja katalazy Cta1, jednego z enzymów

detoksyfikujących nadtlenek wodoru w mitochondriach69,70, zwiększy stabilność genomów rho+.

Wyniki naszych eksperymentów potwierdziły to przypuszczenie, co pozwoliło nam sformułować

wniosek, że zaindukowana przez działanie antymycyny niestabilność genomów rho+,

objawiająca się podwyższoną częstością mutantów rho¯, jest wywołana przez gromadzący

się w tych warunkach nadtlenek wodoru w mitochondrium. Choć najbardziej

prawdopodobną cząsteczką ROS bezpośrednio powstającą w wyniku działania antymycyny jest

anionorodnik ponadtlenkowy20, ta cząsteczka ulega szybko dysmutacji na drodze spontanicznej

lub enzymatycznej do nadtlenku wodoru. Ponieważ antymycyna podwyższała poziom nadtlenku

wodoru również w komórkach rosnących na glukozie, ale bez jednoczesnej destabilizacji

genomów rho+, wywnioskowaliśmy, że komórki są w stanie naprawić lub przeciwdziałać

uszkodzeniom w mtDNA wywołanym podwyższonym poziomem nadtlenku wodoru, pod

warunkiem, że mają wystarczająco dużo ATP do przeprowadzenia niezbędnych reakcji naprawy

DNA. Doprecyzowaliśmy, zatem, warunki obniżonej stabilności genomów rho+ pod wpływem

stresu oksydacyjnego wywołanego przez antymycynę jako połączenie podwyższonego poziomu

nadtlenku wodoru z obniżonym bilansem energetycznym mitochondrium. Ponieważ wcześniej

pokazano dla DNA jądrowego drożdży, że menadion w odróżnieniu od nadtlenku wodoru nie

powoduje uszkodzeń typu przecięcia obu nici DNA71, zwane DSB (ang. double-strand break),

obserwowane różnice w mutagenezie mtDNA po antymycynie i po menadionie przypisaliśmy

odmiennym rodzajom uszkodzeń gromadzącym sie w mtDNA pod wpływem antymycyny, w

porównaniu z uszkodzeniami po menadionie. Niestabilność genomów rho+ po antymycynie

może być konsekwencją powstających DSB w mtDNA w wyniku działania nadtlenku

wodoru i następującej potem próbie naprawy tych DSB poprzez system zależnej od

rekombinacji replikacji (RDR). Nasze wyniki są zgodne z tą propozycją. Po pierwsze,

pokazaliśmy poprzez sekwecjonowanie całogenomowe 26 szczepów petite, że nieoddychające

mutanty wyizolowane po traktowaniu antymycyną zawierają z reguły przearanżowane

genomy rho¯ pozbawione dużych partii mtDNA, ale z zamplifikowanymi fragmentami

zawierającymi jedno, dwa lub wyjątkowo trzy sekwencje ori z 4 znanych ori

mitochondrialnych. Po drugie, szczepy pozbawione genów kodujących białka zaangażowane w

naprawę DSB w jądrze, które też funkcjonują w mitochondrium72, Rad50 i Xrs2, po traktowaniu

antymycyną wykazują wyższą częstość mutantów rho¯ niż szczepy typu dzikiego, co sugeruje,


21

że brak kompleksu Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) w mitochondrium, podobnie jak w jądrze,

zaburza wydajną naprawę DSB. Pokazaliśmy, że w szczepach rad50Δ i xrs2Δ poziomy

mitochondrialnej rekombinacji allelicznej są niższe niż w szczepach typu dzikiego, co wskazuje

na udział kompleksu MRX w regulacji rekombinacji allelicznej w mitochondriach jako

czynnik przeciwdziałający powstawaniu przearanżowanych genomów rho¯. Podobnie do

wyników w naszej wcześniejszej pracy36, inaktywacja genu kodującego glikozylazę Ogg1 w

szczepie rad50Δ doprowadziła do synergistycznego wzrostu mutantów rho¯ po traktowaniu

antymycyną, pokazując, że mitochondrialne funkcje ścieżki BER zależnej od Ogg1 i ścieżki

kompleksu MRX równolegle przeciwdziałają przekształceniu tych samych uszkodzeń w mtDNA

w mutagennym procesie, który prowadzi do powstania przearanżowanych genomów rho¯. Po

trzecie, znaleźliśmy nukleazę, która bierze udział w procesowaniu uszkodzeń mtDNA po

traktowaniu antymycyną na szlaku, który prowadzi do powstania genomów rho¯. Szczep

pozbawiony mitochondrialnej nukleazy Nuc1 wykazuje znacznie obniżony poziom mutantów

rho¯ zaindukowanych antymycyną, jak również inaktywacja genu NUC1 obniża znacząco

niestabilność genomu rho+ w mutancie rad50Δ. Nukleaza Nuc1 ma aktywność endonukleazy

oraz 5’→3’ egzonukleazy73. Enzym ten jest zlokalizowany w komórkach drożdży w

mitochondriach, ale przemieszcza się do jądra w odpowiedzi na sygnały apoptotyczne74.

Wcześniej przypisano tej nukleazie również udział w homologicznej rekombinacji w

mitochondriach75. Na podstawie wyników naszej pracy proponujemy, że w warunkach stresu

oksydacyjnego wynikającego z gromadzenia się nadtlenku wodoru w mitochondrium

powstają uszkodzenia DNA, które przekształcają się w DSB. Jest bardzo prawdopodobne, że

mitochondrialne ori zawierające skupiska par GC (ang. GC clusters) mogą być również

preferowanymi miejscami, gdzie powstają DSB w wyniku uszkodzeń oksydacyjnych. Zgodnie z

tym przewidywaniem, dla mitochondrialnej sekwencji ori5 pokazano, że pod wpływem

nadtlenku wodoru tworzy się w niej DSB zależne od aktywności glikozylazy Ntg157.

Uszkodzenia powstające po traktowaniu antymycyną byłyby następnie procesowane przez Nuc1

i być może inne egzonukleazy mitochondrialne (np. procesowanie DSB w ori5 jest zależne nie

od Nuc1, a od Din757,58). Wytrawione jednoniciowe zakończenia 3’ mogą ulec sparowaniu z

innymi jednoniciowymi zakończeniami albo mogą zostać sparowane przy udziale rekombinazy z

homologicznym dupleksem (np. na szlaku procesowania DSB w ori5 działa mitochondrialna

rekombinaza Mhr176), dostarczając startera do nowej rundy replikacji zależnej od rekombinacji.


22

RDR może rozpocząć się w sekwencji allelicznej do nici inwazyjnej, wtedy dojdzie do wiernej

inicjacji replikacji genomu rho+. Kiedy jednak RDR rozpocznie nową rundę replikacji w miejscu

nieallelicznym do nici inwazyjnej, w wyniku tak zainicjowanej replikacji może powstać genom

przearanżowany. Jak pisałam powyżej, do rekombinacji między sekwencjami nieallelicznymi

dochodzi wtedy, kiedy zawodzi mechanizm punktu kontroli rekombinacji zależny od Msh1.

Funkcja tego białka zależy od ATP, zatem przypuszczalnie jest mocno ograniczona w

warunkach deficytu energetycznego w czasie traktowania antymycyną.

W ramach kontynuacji tej pracy pokazaliśmy że, zgodnie z wcześniejszymi

przypuszczeniami, co do niespecyficzności menadionu jako związku napędzającego cykle redoks

w całej komórce, że traktowanie menadionem podnosi w komórkach drożdży nie tylko

mutagenezę punktową mtDNA, ale też mutagenezę jądrowego DNA mierzoną za pomocą

oznaczania częstości mutantów opornych na kanawaninę. Te wstępne wyniki sugerują, że w

wyniku działania menadionu podniesienie poziomu punktowej mutagenezy mitochondrialnej

koreluje ze wzrostem poziomu mutagenezy jądrowego DNA. Dopiero wyniki badań opisanych w

późniejszej publikacji38 wyjaśniły tę korelację, pokazując, że aktywacja jądrowego szlaku kinaz

Mec1/Tel1/Rad53 w odpowiedzi na uszkodzenia DNA może powodować podniesienie

mutagenezy punktowej mtDNA poprzez podniesienie poziomu deoksyrybonukleotydów w

komórce, co jest zależne od aktywności jednej z kinaz efektorowych tego szlaku, Dun1. Te

wyniki są omawiane poniżej.

4. Związek mutagenezy mitochondrialnej z odpowiedzią komórek drożdży na

uszkodzenia genomu jądrowego - Kaniak-Golik et al. (2017)38

W tej pracy kontynuowaliśmy badania nad rolą nukleaz zaangażowanych w utrzymywanie

stabilności mitochondrialnego genomu, koncentrując się na wyjaśnieniu mitochondrialnej roli

nukleazy Rad27 o podwójnej, jądrowej i mitochondrialnej, lokalizacji w komórkach

drożdżowych. Ta konserwowana w ewolucji nukleaza (homolog ludzkiego białka FEN1) spełnia

w jądrze funkcję głównej endonukleazy typu „flap” procesującej struktury pośrednie replikacji

odbywającej się na nici opóźnionej77. Mutanty pozbawione tego białka wykazują całą serię

rozmaitych fenotypów jądrowych i mitochondrialnych związanych ze zmienioną stabilnością

DNA w obu kompartmentach, jednak do tej pory nie było dowodu na bezpośrednią funkcję


23

Rad27 w mitochondrium. Wykazaliśmy, że w szczepach pozbawionych tej nukleazy tylko część

mutacji oporności na erytromycynę jest zlokalizowana w mitochondrium. Nawet po

uwzględnieniu tej korekty, inaktywacja RAD27 prowadzi do zwiększonej punktowej

mutagenezy mtDNA, a charakterystyczną sygnaturą mutacyjną dla tej mutagenezy jest

tranzycja GC→AT. Kolejne wyniki naszych badań pokazały, że większość mitochondrialnych

fenotypów w szczepach rad27Δ jest pośrednim efektem związanej z brakiem nukleazy

Rad27 aktywacji jądrowej ścieżki odpowiedzi na uszkodzenia wywołane stresem

replikacyjnym zależnej od kinaz Mec1/Tel1/Rad53. W szczególności, zwiększony poziom

punktowych mutacji w mtDNA w komórkach pozbawionych Rad27 jest w znacznej części

konsekwencją aktywacji kinazy efektorowej Dun1, działającej na wyżej wymienionym szlaku

transdukcji sygnału, oraz wynikającym z tej aktywacji podniesieniem poziomu

deoksyrybonukleotydów (dNTP) w komórce. Pokazaliśmy też, że supresja niestabilności

jądrowego DNA poprzez nadprodukcję egzonucleazy Exo1 odwraca szereg fenotypów

mitochondrialnych związanych z delecją genu RAD27.

Wyniki omawianej pracy wskazują, zatem, że niestabilność jądrowego DNA może

wywołać podniesienie mutagenezy mitochondrialnego DNA. Zgodnie z tym wnioskiem,

pokazaliśmy, że w innym mutancie, pozbawionym helikazy Rrm3 zaangażowanej w

regulację replikacji rDNA, w którym ścieżka DDR również podlega konstytutywnej

aktywacji, podwyższony poziom mitochondrialnej mutagenezy jest zależny od kinazy

Dun1. Dodatkowo wyniki tej pracy wykazały, że Rad27 bierze też bezpośredni udział w

metabolizmie mitochondrialnego DNA, funkcjonując na ścieżce rekombinacji nieallelicznej

między bezpośrednimi powtórzeniami w mtDNA.

Uzyskane w powyższych pracach eksperymentalnych wyniki umieściłam w szerszym

kontekście obszernej literatury dotyczącej badania stabilności genomu jądrowego i

mitochondrialnego w dwóch pracach przeglądowo-koncepcyjnych, omówionych poniżej.

5. Mechanizmy utrzymywania stabilności genomu mitochondrialnego i wpływ

zaburzeń mitochondrialnych na stabilność genomu jądrowego - Kaniak-Golik and

Skoneczna (2015)78


24

W tej pracy przeglądowej zostały omówione doniesienia literaturowe wskazujące na

kluczowy udział szlaków biochemicznych zlokalizowanych w mitochondrium w utrzymaniu

genomu jądrowego ze szczególnym uwzględnieniem niezbędnej dla przeżycia komórki ścieżki

mitochondrialnej syntezy grup prostetycznych Fe-S. W pierwszej części artykułu zostały opisane

znane mechanizmy utrzymania i naprawy mtDNA w komórkach S. cerevisiae dotyczące

replikacji mtDNA, organizacji mitochondrialnego genomu oraz udziału poszczególnych ścieżek

naprawy mtDNA w jego stabilności. Uwzględniono również znane czynniki białkowe

odpowiedzialne za utrzymanie i stabilność sekwencji mtDNA w trzech daleko spokrewnionych

organizmach: S. cerevisiae, Candida albicans i człowiek. W drugiej części pracy zostały

przedstawione przykłady wpływu zmienionego metabolizmu mitochondrium na stabilność

genomu jądrowego. Zaburzenia mitochondrialnej funkcji przez: 1) zablokowanie przepływu

elektronów przez łańcuch oddechowy lub 2) brak funkcjonalnego mtDNA, a zatem zupełny

brak aktywnego łańcucha oddechowego (mutanty rho0 lub rho¯) prowadzą do wzrostu

poziomu mutagenezy jądrowego DNA. Co ciekawe, w obu przypadkach mechanizm

powstawania niestabilności genomowego DNA jest inny.

Blokada łańcucha oddechowego wywołuje stres oksydacyjny w komórce, co przyczynia się

do wzrostu niestabilności genomu jądrowego, ale niezależnie od aktywności polimeraz TLS:

Rev1, Rev3 i Rev7, natomiast w drugim przypadku, pomimo obniżenia poziomu ROS w

komórkach, poziom mutagenezy jądrowego DNA wzrasta na skutek aktywacji polimeraz Rev3 i

Rev779. Veatch et al.80 pokazali, że brak mtDNA wywołuje niestabilność genomu jądrowego

poprzez defekt syntezy cytoplazmatycznych grup prostetycznych Fe-S połączony z włączeniem

transkrypcyjnej odpowiedzi na niedobór żelaza. Defekt biogenezy białek Fe-S jest

konsekwencją obniżenia potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej, spowodowanego

brakiem aktywności łańcucha oddechowego, w wyniku czego dochodzi do zaburzeń

mitochondrialnego składania grup Fe-S, zahamowania eksportu z mitochondrium związku

zawierającego siarkę, który jest konieczny do biogenezy cytoplazmatycznych białek Fe-S,

oraz deregulacji metabolizmu żelaza w komórce81. Nie jest znany dokładnie mechanizm,

który jest odpowiedzialny za tę niestabilność, jednak jedną z możliwości jej wytłumaczenia jest

obniżenie poziomu białek z grupami Fe-S koniecznych dla replikacji i naprawy DNA jądrowego,

co powoduje gromadzenie się uszkodzeń w genomie i w konsekwencji aktywację szlaku


25

transdukcji sygnału o uszkodzeniu genomu jądrowego, czyli szlaku DDR, który jest jednym z

kanałów komunikacji między obu kompartmentami.

W zależności od etapu, na którym biogeneza mitochondrialnych białek Fe-S jest

zahamowana, włączają się różne mediatory (kinazy) szlaku DDR, przesyłając sygnał aktywacji

do znanej od dawna kinazy efektorowej Dun182. Aktywność tej kinazy odpowiada za jedną z

podstawowych zmian indukowanych po aktywacji szlaku DDR – zwiększenie syntezy

deoksyrybonukleotydów (dNTP). Dzieje się tak głównie (choć nie tylko) poprzez zależną od

Dun1 indukcję transkrypcji genów kodujących podjednostki reduktazy rybonukleotydowej

(RNR) katalizującej limitujący etap syntezy dNTP (więcej o tej odpowiedzi w opisie artykułu

Kaniak-Golik et al., 201738). Co więcej, utrzymanie aktywności RNR jest jedną z głównych

pośrednich funkcji mitochondrium, ponieważ reakcje katalizowane przez ten enzym wymagają

kilku cytoplazmatycznych białek Fe-S, takich jak: monotiolowe glutaredoksyny Grx3/Grx4 jako

źródła żelaza do utworzenia nietypowej rodnikowej grupy prostetycznej (Fe(III)2-Y•),

charakterystycznej dla tego enzymu, oraz, jako źródła elektronów, oksydoreduktazy Dre2

działającej z białkiem Tah1883,84. Synteza tych cytoplazmatycznych białek Fe-S wymaga z kolei

aktywności mitochondrialnego szlaku syntezy grup Fe-S. Kinaza Dun1 jest aktywowana również

w warunkach niedoboru żelaza niezależnie od głównych kinaz szlaku DDR, Mec1 i Rad5385.

Przyszłe badania powinny rozstrzygnąć znaczenie kinazy Dun1 jako głównego regulatora

aktywności RNR w integracji sygnałów, z jednej strony, o poziomie żelaza oraz, z drugiej

strony, o zapotrzebowaniu na dNTP związanym np. ze stresem replikacyjnym.

Bardzo ważną ścieżką łączącą mitochondria i jądro, charakterystyczną dla komórek

eukariotycznych, nawet u organizmów jednokomórkowych, takich jak drożdże, są szlaki

programowanej śmierci komórki. Wymienione powyżej białko Tah18 w warunkach stresu

oksydacyjnego wywołanego przez egzogenny H2O2, jeden z typowych sygnałów pro-

apoptotycznych dla komórek drożdży, uwalnia się z kompleksu z Dre2, które jest białkiem Fe-S,

i ulega translokacji do mitochondrium, gdzie przyczynia się do śmierci komórki przez bliżej

nieznany mechanizm, który obejmuje prawdopodobnie degradację mitochondrium86. Nie

wiadomo, jaki jest związek w komórkach drożdży pomiędzy śmiercią komórek zależną od

translokacji do mitochondrium białka Tah18 a innymi znanymi ścieżkami apoptotycznymi, które

włączają się w odpowiedzi na stres wywołany egzogennym H2O2, zależnymi od białka Aif187


26

czy od, omawianej powyżej, nukleazy Nuc174. Przyszłe badania powinny wyjaśnić znaczenie

tych i innych ścieżek apoptotycznych dla funkcjonowania mitochondrium w komórkach S.

cerevisiae jako modelowych komórkach eukariotycznych.

6. Porównanie genomów mitochondrialnych i znanych mechanizmów utrzymania ich

stabilności w komórkach dwóch gatunków grzybów, Saccharomyces cerevisiae i

Schizosaccharomyces pombe - Skoneczna et al., (2015)88

Celem tej pracy przeglądowej było porównanie informacji na temat mechanizmów

utrzymania stabilności genomu jądrowego i mitochondrialnego DNA w komórkach dwóch

odległych ewolucyjnie gatunków grzybów, Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces

pombe (ich linie ewolucyjne oddzieliły się przynajmniej 500 mln lat temu89). Oba organizmy są

badane od dawna jako modelowe jednokomórkowe organizmy eukariotyczne i porównywane do

komórek wyższych Eukaryota. Wyniki tych badań wskazują na wysoki stopień podobieństwa

podstawowych procesów komórkowych, w tym również mechanizmów zapewniających

stabilność obu genomów, we wszystkich organizmach eukariotycznych. Tym niemniej, w

związku z dystansem ewolucyjnym dzielącym te dwa gatunki szczegóły rozwiązań

biochemicznych siłą rzeczy są odmienne. Niewątpliwie, wiele szczegółów biologii komórki

Schz. pombe wykazuje więcej podobieństw do analogicznych struktur i procesów w komórkach

Metazoa niż komórki S. cerevisiae, szczególnie tych dotyczących procesów zachodzących w

jądrze i cytoplazmie (np. białka chromatyny, białka TRF wiążące telomery, ścieżka

interferencyjnego RNA (iRNA), kontrola cyklu komórkowego w przejściu między fazami G2 i

M i inne)89,90. Z drugiej strony, komórki obu gatunków drożdży charakteryzują się

przystosowaniami do fermentacji cukrów. Zarówno S. cerevisiae, jak i Schz. pombe są

organizmami Crabtree-pozytywnymi, czyli produkują alkohol w obecności tlenu i przy wysokim

stężeniu glukozy. Główna metaboliczna różnica między nimi polega na tym, że drożdże

piekarnicze są w stanie utleniać etanol na drodze zależnego od funkcji mitochondrialnej

oddychania i przeprowadzać reakcje glukoneogenezy, natomiast Schz. pombe utraciły w trakcie

ewolucji aktywności glukoneogeniczne i nie mogą wykorzystywać etanolu jako jedynego źródła

węgla91. Jeśli chodzi o skład genów kodowanych w mtDNA, mitochondrialne genomy obu

gatunków drożdży są bardzo podobne. Zarówno S. cerevisiae, jak i Schz. pombe, w odróżnieniu

od komórek ssaczych i roślinnych, nie posiadają genów kodujących podjednostki dehydrogenazy


27

kompleksu I w ich mtDNA, ale mogą utleniać w mitochondriach zredukowany NAD+ z cytozolu

dzięki dehydrogenazom NADH, których aktywność nie jest sprzężona chemiosmotycznie z

syntezą ATP92-94. Nie jest wykluczone, że luka w łańcuchu oddechowym tych dwóch gatunków

grzybów wyewoluowała w ich liniach filogenetycznych na zasadzie konwergencji jako

przystosowanie do fermentacji cukrów, ponieważ jest kilka drożdży bliżej spokrewnionych z S.

cerevisiae, u których kompleks jest kodowany w mtDNA, zatem nie wydaje się, żeby brak

kompleksu I był cechą pierwotną95. Mitochondrialny genom Schz. pombe jest dużo mniejszy niż

mtDNA S. cerevisiae (19 kb vs. 85 kb), w czym jest podobny do mtDNA ssaków (16 kb), ale z

drugiej strony mitochondrialne geny obu grzybów, inaczej niż u ssaków, są przerywane

intronami96. Ponadto, wśród gatunków pokrewnych do Schz. pombe występuje duże

zróżnicowanie w wielkości mtDNA (np.: wielkość mtDNA Schz. japonicus jest zbliżona do

wielkości mtDNA z S. cerevisiae, co wynika głównie z amplifikacji rejonów niekodujących97),

co oznacza, że wielkość mtDNA nie jest cechą pierwotną Schz. pombe. Podstawowa różnica

pomiędzy mitochondrialnymi systemami w Schz. pombe i S. cerevisiae polega na tym, że

komórki Schz. pombe są petite-negatywne i nie tolerują dużych delecji mtDNA lub utraty

mtDNA nawet w warunkach laboratoryjnych. Pod tym względem, Schz. pombe różni się nie

tylko od komórek Saccharomyces cerevisiae, ale nawet od komórek ssaczych, ponieważ w

hodowlach laboratoryjnych można utrzymać mysie lub ludzkie komórki rho0 w obecności

dodatku urydyny lub urydyny i pirogronianu, odpowiednio98,99. Dokładne podłoże cechy petite-

negatywności komórek Schz. pombe nie jest znane, ale wyizolowano 6 niesprzężonych mutacji

jądrowych, dotąd jeszcze nieopisanych, które indywidualnie nadają komórkom tego grzyba

tolerancję na utratę całego mtDNA93, z czego można wnioskować, że cecha ta jest złożonym

zjawiskiem, wymagającym dopiero wyjaśnienia. Ciekawe, jest, że w S. cerevisiae mamy do

czynienia z sytuacją odwrotną. Szczepy typu dzikiego są petite-pozytywne, ale delecje

kilkunastu genów nadają komórkom zależność od mtDNA rho+ 100. Identyfikacja genów Schz.

pombe, których mutacje prowadzą do uniezależnienia tych komórek od obecności mtDNA rho+,

powinna w przyszłości przyczynić się do lepszego zrozumienia konserwowanych funkcji

mitochondrium w komórkach eukariotycznych. W związku z petite-negatywnością komórek

Schz. pombe, szczegóły replikacji i innych mechanizmów utrzymania stabilności mtDNA w tych

komórkach nie zostały jeszcze dobrze poznane, ale wiadomo, że w genomie Schz. pombe są geny

kodujące kilka charakterystycznych dla S. cerevisiae czynników niezbędnych dla utrzymania


28

genomu mitochondrialnego, które nie występują w komórkach Metazoa. Są to na przykład geny

kodujące: Msh1, o którym była mowa powyżej (homologi mitochondrialne są nieobecne w

komórkach Metazoa, ale występują w komórkach roślin wyższych101), rekombinazę

mitochondrialną Mhr1 oraz mitochondrialną endonukleazę Cce1 (Ydc2), specyficzną dla wiązań

krzyżowych powstających podczas rekombinacji. Chociaż szczegółów aktywności tych białek w

komórkach Schz. pombe jeszcze nie znamy, obecność tych genów wskazuje na znaczący udział

rekombinacji homologicznej w utrzymaniu mtDNA, podobnie jak w mitochondrium S.

cerevisiae i innych grzybów102.

4. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych.

a) Pozostałe osiągnięcia naukowo - badawcze po uzyskaniu stopnia doktora

Publikacje

1. Rempoła B., Kaniak A., Migdalski A., Rytka J., Słonimski P.P. and di Rago J.-P.

Functional analysis of RRD1 (YIL153w) and RRD2 (YPL152w), which encode two

putative activators of the phosphotyrosyl phosphatase activity of PP2A in Saccharomyces

cerevisiae. Mol Gen Genet. 262 (2000): 1081-92.

Mój wkład oceniam na 40%. Współudział w planowaniu i wykonaniu eksperymentów.

2. Rempoła B., Kaniak A., di Rago J. P. and Rytka J. Anaerobic growth of Saccharomyces

cerevisiae alleviates the lethal effect of phosphotyrosyl phosphatase activators depletion.

Acta Biochim Pol. 48 (2001): 1043-9.

Mój wkład oceniam na 40%. Współudział w planowaniu i wykonaniu eksperymentów.

3. Kaniak A., Xue Z., Macool D., Kim J. H. and Johnston M. Regulatory network

connecting two glucose signal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae.

Eukaryot. Cell 3 (2004): 221-231.

Mój wkład oceniam na 50%. Współudział w wykonaniu eksperymentów i przygotowaniu

manuskryptu.


29

4. Rogowska A.T., Puchta O., Czarnecka A. M., Kaniak A., Stępień P. P., Golik P. Balance

between transcription and RNA degradation is vital for Saccharomyces cerevisiae

mitochondria: reduced transcription rescues the phenotype of deficient RNA degradation.

Mol Biol Cell. 17 (2006):1184-93.

Mój wkład oceniam na 5%. Współudział w analizie szczepów supresorowych.

5. Lipiński K. A., Kaniak-Golik A., Golik P. Maintenance and expression of the S.

cerevisiae mitochondrial genome--from genetics to evolution and systems biology.

Biochim Biophys Acta. 1797 (2010):1086-98.

Mój wkład oceniam na 30%. Napisanie rozdziału 2, pt. “Maintenance of the yeast mitochondrial

genome: replication, recombination, repair and transmission”.

6. Kaliszewska M., Kruszewski J., Kierdaszuk B., Kostera-Pruszczyk A., Nojszewska M.,

Łusakowska A., Vizueta J., Sabat D., Lutyk D., Lower M., Piekutowska-Abramczuk D.,

Kaniak-Golik A., Pronicka E., Kamińska A., Bartnik E., Golik P., Tońska K. Yeast

model analysis of novel polymerase gamma variants found in patients with autosomal

recessive mitochondrial disease. Hum Genet. 134 (2015): 951-66.

Swój wkład oceniam na 10%. Uczestniczyłam w ustawianiu testów mutagenezy

mitochondrialnej drożdży i analizie wyników.

W pracach Rempoła et al. (2000)103i Rempoła et al. (2001)104 zostały opisane wyniki

badań, w których brałam udział jeszcze w czasie pracy doktorskiej w laboratorium prof. Piotra P.

Słonimskiego, w ramach analizy funkcjonalnej dwóch paralogicznych regulatorów fosfataz

PP2A, drożdżowych białek Rrd1 i Rrd2, których geny zostały odkryte w wyniku

sekwencjonowania genomu S. cerevisiae, uczestniczących w regulacji przepływu sygnałów na

przecięciu kilku ważnych konserwowanych w komórkach eukariotycznych szlaków transdukcji

sygnałów, szlaku TOR i szlaków kinaz MAP. Praca Kaniak et al. (2004)105 powstała na

podstawie wyników badań nad ścieżkami wykrywania glukozy w komórkach drożdży, które

przeprowadziłam podczas kilkuletniego stażu podoktorskiego w laboratorium prof. Marka

Johnston w Washington University School of Medicine w St. Louis (USA). W pracach

badawczych, które zostały opisane w publikacji Rogowska et al. (2006)106, brałam udział w


30

początkowej analizie genetycznej opisywanych mutacji supresorowych, która została później

rozwinięta, pozwalając na ukazanie konieczności utrzymania w mitochondrium równowagi

miedzy syntezą i degradacją RNA dla efektywnej ekspresji genów mitochondrialnych. W r. 2010

wzięłam udział w napisaniu pierwszej pracy przeglądowej, której część była poświęcona

mechanizmom utrzymania sekwencji i integralności mtDNA w komórkach drożdży S.

cerevisiae107. Brałam udział w jeszcze jednej pracy badawczej o tematyce związanej ze

stabilnością mtDNA w komórkach drożdży, w której zbadano w układzie drożdżowym wpływ

mutacji w mitochondrialnej polimerazie Mip1, odpowiadających mutacjom w ortologicznej

polimerazie POLG1 zidentyfikowanym u pacjentów z chorobami mitochondrialnymi, na

stabilność genomu mitochondrialnego108. Szczepy z opisanymi w tej pracy allelami drożdżowej

Mip1 planuję wykorzystać w nowym projekcie badawczym, który uzyskał dofinansowanie w

roku 2017 z NCN w ramach OPUS 25.

5. Dane bibliometryczne. W sumie 18 publikacji, z czego po doktoracie 12, w tym w skład osiągnięcia wchodzi 6. Razem

400 cytowań (377 bez autocytowań), z czego prac po doktoracie 278, w tym prac wchodzących

w skład osiągnięcia 72.

Indeks Hirscha 10 (Web of Science v.5.26.2, dn. 6.12.2017).

Sumaryczny IF 71,114, z czego prac po doktoracie 58,04, w tym prac wchodzących w skład

osiągnięcia 33,934. IF z roku publikacji (dla prac sprzed 1997 brano IF1997, a dla pracy z 2017

IF2016).

Wszystkie publikacje są z listy A MNiSW oraz listy JCR. W sumie 540 punktów MNiSW, z

czego prac po doktoracie 400 punktów MNiSW, w tym prac wchodzących w skład osiągnięcia

225 punktów MNiSW (punktacja według aktualnej listy MNiSW na rok 2016).

BIBLIOGRAFIA

Prace habilitantki wchodzące w skład osiągnięcia oznaczone wytłuszczoną czcionką; dla innych prac habilitantki

wyróżnione taką czcionką numery.


31

1 Nunnari, J. et al. Mitochondrial transmission during mating in Saccharomyces cerevisiae is determined by mitochondrial fusion and fission and the intramitochondrial segregation of mitochondrial DNA. Molecular Biology of the Cell 8, 1233-1242 (1997).

2 Luck, D. J. Formation of mitochondria in Neurospora crassa. A quantitative radioautographic study. The Journal of Cell Biology 16, 483-499 (1963).

3 Warren, G. & Wickner, W. Organelle inheritance. Cell 84, 395-400 (1996). 4 Lill, R. et al. The role of mitochondria and the CIA machinery in the maturation of cytosolic and nuclear

iron-sulfur proteins. Eur J Cell Biol 94, 280-291, doi:10.1016/j.ejcb.2015.05.002 (2015). 5 Boyer, P. D. The ATP synthase--a splendid molecular machine. Annual Review of Biochemistry 66, 717-

749, doi:10.1146/annurev.biochem.66.1.717 (1997). 6 Allen, J. F. The function of genomes in bioenergetic organelles. Philosophical Transactions of the Royal

Society of London. Series B, Biological sciences 358, 19-37; doi:10.1098/rstb.2002.1191 (2003). 7 Nass, M. M. & Nass, S. Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. I. Fixation and Electron

Staining Reactions. The Journal of Cell Biology 19, 593-611 (1963). 8 Schatz, G., Haslbrunner, E. & Tuppy, H. Deoxyribonucleic Acid Associated with Yeast Mitochondria.

Biochemical and Biophysical Research Communications 15, 127-132 (1964). 9 Sagan, L. On the origin of mitosing cells. Journal of Theoretical Biology 14, 255-274 (1967). 10 Margulis, L. Origin of Eukaryotic Cells. (1970). 11 Spang, A. et al. Complex archaea that bridge the gap between prokaryotes and eukaryotes. Nature 521,

173-179, doi:10.1038/nature14447 (2015). 12 Gray, M. W. Mitochondrial evolution. Cold Spring Harb Perspect Biol 4, a011403,

doi:10.1101/cshperspect.a011403 (2012). 13 Muller, M. et al. Biochemistry and evolution of anaerobic energy metabolism in eukaryotes. Microbiology

and molecular biology reviews : MMBR 76, 444-495, doi:10.1128/MMBR.05024-11 (2012). 14 Lane, N. & Martin, W. The energetics of genome complexity. Nature 467, 929-934,

doi:10.1038/nature09486 (2010). 15 Gray, M. W. & Doolittle, W. F. Has the endosymbiont hypothesis been proven? Microbiological Reviews

46, 1-42 (1982). 16 Burger, G., Gray, M. W. & Lang, B. F. Mitochondrial genomes: anything goes. Trends in Genetics : TIG

19, 709-716 (2003). 17 Lang, B. F. et al. An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. Nature

387, 493-497, doi:10.1038/387493a0 (1997). 18 Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. The Biochemical Journal 417, 1-13,

doi:10.1042/BJ20081386 (2009). 19 Bidle, K. D. & Falkowski, P. G. Cell death in planktonic, photosynthetic microorganisms. Nature Reviews.

Microbiology 2, 643-655, doi:10.1038/nrmicro956 (2004). 20 Bartosz, G. Druga twarz tlenu. (Wydawnictwo Naukowe PWN, 2004). 21 Dizdaroglu, M., Kirkali, G. & Jaruga, P. Formamidopyrimidines in DNA: Mechanisms of formation,

repair, and biological effects. Free Radical Bio Med 45, 1610-1621, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.07.004 (2008).

22 Shibutani, S., Takeshita, M. & Grollman, A. P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature 349, 431-434, doi:10.1038/349431a0 (1991).

23 Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P. & Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med 107, 13-34, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2016.12.049 (2017).

24 Kumar, A. & Snyder, M. Emerging technologies in yeast genomics. Nature Reviews. Genetics 2, 302-312, doi:10.1038/35066084 (2001).

25 Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics 2, 659-668, doi:10.1038/35088500 (2001).

26 Ephrussi, B., Hottinguer, H., and Tavlitzki, J. (1949). Ann. Inst. Pasteur & (Paris) 77. Action de l’acriflovine sur les levures. II-Etude genetique de mutant ‘‘petite colonie’’. Ann. Inst. Pasteur (Paris) 77, 419-450 (1949).

27 Dujon, B. in The molecular biology of the yeast Saccharomyces: life cycle and inheritance 505-635 (Cold Spring Harb. Lab., N.Y., 1981).

28 Contamine, V. & Picard, M. Maintenance and integrity of the mitochondrial genome: a plethora of nuclear genes in the budding yeast. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR 64, 281-315 (2000).


32

29 Dimitrov, L. N., Brem, R. B., Kruglyak, L. & Gottschling, D. E. Polymorphisms in multiple genes contribute to the spontaneous mitochondrial genome instability of Saccharomyces cerevisiae S288C strains. Genetics 183, 365-383, doi:10.1534/genetics.109.104497 (2009).

30 Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology 350, 3-41 (2002). 31 Merz, S. & Westermann, B. Genome-wide deletion mutant analysis reveals genes required for respiratory

growth, mitochondrial genome maintenance and mitochondrial protein synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology 10, R95, doi:10.1186/gb-2009-10-9-r95 (2009).

32 Sor, F. & Fukuhara, H. Erythromycin and spiramycin resistance mutations of yeast mitochondria: nature of the rib2 locus in the large ribosomal RNA gene. Nucleic Acids Research 12, 8313-8318 (1984).

33 Vanderstraeten, S., Van den Brule, S., Hu, J. & Foury, F. The role of 3'-5' exonucleolytic proofreading and mismatch repair in yeast mitochondrial DNA error avoidance. The Journal of Biological Chemistry 273, 23690-23697 (1998).

34 John, U. P. & Nagley, P. Amino acid substitutions in mitochondrial ATPase subunit 6 of Saccharomyces cerevisiae leading to oligomycin resistance. Febs Lett 207, 79-83 (1986).

35 Nagley, P., Hall, R. M. & Ooi, B. G. Amino acid substitutions in mitochondrial ATPase subunit 9 of Saccharomyces cerevisiae leading to oligomycin or venturicidin resistance. Febs Lett 195, 159-163 (1986).

36 Kaniak, A. et al. Msh1p counteracts oxidative lesion-induced instability of mtDNA and stimulates mitochondrial recombination in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair 8, 318-329 (2009).

37 Malc, E., Dzierzbicki, P., Kaniak, A., Skoneczna, A. & Ciesla, Z. Inactivation of the 20S proteasome maturase, Ump1p, leads to the instability of mtDNA in Saccharomyces cerevisiae. Mutation Research 669, 95-103, doi:10.1016/j.mrfmmm.2009.05.008 (2009).

38 Kaniak-Golik, A., Kuberska, R., Dzierzbicki, P., Sledziewska-Gojska, E. Activation of Dun1 in response to nuclear DNA instability accounts for the increase in mitochondrial point mutations in Rad27/FEN1 deficient S. cerevisiae. PloS ONE (2017).

39 Steele, D. F., Butler, C. A. & Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 5253-5257 (1996).

40 Fox, T. D. Natural variation in the genetic code. Annual Review of Genetics 21, 67-91, doi:10.1146/annurev.ge.21.120187.000435 (1987).

41 Bonnefoy, N. & Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Molecular & General Genetics : MGG 262, 1036-1046 (2000).

42 Sia, E. A. et al. Analysis of microsatellite mutations in the mitochondrial DNA of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 250-255 (2000).

43 Strand, M. K. & Copeland, W. C. Measuring mtDNA mutation rates in Saccharomyces cerevisiae using the mtArg8 assay. Methods in Molecular Biology 197, 151-157, doi:10.1385/1-59259-284-8:151 (2002).

44 Phadnis, N., Sia, R. A. & Sia, E. A. Analysis of repeat-mediated deletions in the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 171, 1549-1559, doi:10.1534/genetics.105.047092 (2005).

45 Dzierzbicki, P., Kaniak-Golik, A., Malc, E., Mieczkowski, P. & Ciesla, Z. The generation of oxidative stress-induced rearrangements in Saccharomyces cerevisiae mtDNA is dependent on the Nuc1 (EndoG/ExoG) nuclease and is enhanced by inactivation of the MRX complex. Mutation Research 740, 21-33, doi:10.1016/j.mrfmmm.2012.12.004 (2012).

46 Chen, X. J. & Butow, R. A. The organization and inheritance of the mitochondrial genome. Nature Reviews. Genetics 6, 815-825, doi:10.1038/nrg1708 (2005).

47 Kucej, M. & Butow, R. A. Evolutionary tinkering with mitochondrial nucleoids. Trends in Cell Biology 17, 586-592, doi:10.1016/j.tcb.2007.08.007 (2007).

48 Foury, F. Cloning and sequencing of the nuclear gene MIP1 encoding the catalytic subunit of the yeast mitochondrial DNA polymerase. The Journal of Biological Chemistry 264, 20552-20560 (1989).

49 Foury, F. & Vanderstraeten, S. Yeast mitochondrial DNA mutators with deficient proofreading exonucleolytic activity. The EMBO Journal 11, 2717-2726 (1992).

50 Chakraborty, U. & Alani, E. Understanding how mismatch repair proteins participate in the repair/anti-recombination decision. FEMS Yeast Research 16, doi:10.1093/femsyr/fow071 (2016).

51 Kaniak-Golik, A. & Skoneczna, A. Mitochondria-nucleus network for genome stability. Free Radic Biol Med 82, 73-104, doi:10.1016/j.freeradbiomed.2015.01.013 (2015).


33

52 Boiteux, S. & Jinks-Robertson, S. DNA repair mechanisms and the bypass of DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 193, 1025-1064, doi:10.1534/genetics.112.145219 (2013).

53 Reenan, R. A. & Kolodner, R. D. Characterization of insertion mutations in the Saccharomyces cerevisiae MSH1 and MSH2 genes: evidence for separate mitochondrial and nuclear functions. Genetics 132, 975-985 (1992).

54 Chi, N. W. & Kolodner, R. D. The effect of DNA mismatches on the ATPase activity of MSH1, a protein in yeast mitochondria that recognizes DNA mismatches. The Journal of Biological Chemistry 269, 29993-29997 (1994).

55 Chi, N. W. & Kolodner, R. D. Purification and characterization of MSH1, a yeast mitochondrial protein that binds to DNA mismatches. The Journal of Biological Chemistry 269, 29984-29992 (1994).

56 Studamire, B., Price, G., Sugawara, N., Haber, J. E. & Alani, E. Separation-of-function mutations in Saccharomyces cerevisiae MSH2 that confer mismatch repair defects but do not affect nonhomologous-tail removal during recombination. Molecular and Cellular Biology 19, 7558-7567 (1999).

57 Koprowski, P., Fikus, M. U., Mieczkowski, P. & Ciesla, Z. A dominant mitochondrial mutator phenotype of Saccharomyces cerevisiae conferred by msh1 alleles altered in the sequence encoding the ATP-binding domain. Molecular Genetics and Gnomics : MGG 266, 988-994, doi:10.1007/s00438-001-0621-x (2002).

58 Ling, F., Hori, A. & Shibata, T. DNA recombination-initiation plays a role in the extremely biased inheritance of yeast [rho-] mitochondrial DNA that contains the replication origin ori5. Molecular and Cellular Biology 27, 1133-1145, doi:10.1128/MCB.00770-06 (2007).

59 Ling, F. et al. Din7 and Mhr1 expression levels regulate double-strand-break-induced replication and recombination of mtDNA at ori5 in yeast. Nucleic Acids Research 41, 5799-5816, doi:10.1093/nar/gkt273 (2013).

60 Lecrenier, N. & Foury, F. New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man. Gene 246, 37-48 (2000).

61 Prasai, K., Robinson, L. C., Scott, R. S., Tatchell, K. & Harrison, L. Evidence for double-strand break mediated mitochondrial DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research 45, 7760-7773, doi:10.1093/nar/gkx443 (2017).

62 Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T. & Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 192, 319-360, doi:10.1534/genetics.112.140467 (2012).

63 Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A. & Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. The EMBO journal 26, 2339-2349, doi:10.1038/sj.emboj.7601681 (2007).

64 Bandy, B. & Davison, A. J. Mitochondrial mutations may increase oxidative stress: implications for carcinogenesis and aging? Free Radic Biol Med 8, 523-539 (1990).

65 Lipford, J. R. & Deshaies, R. J. Diverse roles for ubiquitin-dependent proteolysis in transcriptional activation. Nature Cell Biology 5, 845-850, doi:10.1038/ncb1003-845 (2003).

66 Braun, R. J. & Westermann, B. With the Help of MOM: Mitochondrial Contributions to Cellular Quality Control. Trends in Cell Biology 27, 441-452, doi:10.1016/j.tcb.2017.02.007 (2017).

67 Vasudevarao, M. D. et al. Naphthoquinone-mediated inhibition of lysine acetyltransferase KAT3B/p300, basis for non-toxic inhibitor synthesis. The Journal of Biological Chemistry 289, 7702-7717, doi:10.1074/jbc.M113.486522 (2014).

68 Lee, K. K. & Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes: one size doesn't fit all. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 8, 284-295, doi:10.1038/nrm2145 (2007).

69 Flattery-O'Brien, J. A. & Dawes, I. W. Hydrogen peroxide causes RAD9-dependent cell cycle arrest in G2 in Saccharomyces cerevisiae whereas menadione causes G1 arrest independent of RAD9 function. The Journal of Biological Chemistry 273, 8564-8571 (1998).

70 Petrova, V. Y., Drescher, D., Kujumdzieva, A. V. & Schmitt, M. J. Dual targeting of yeast catalase A to peroxisomes and mitochondria. The Biochemical Journal 380, 393-400, doi:10.1042/BJ20040042 (2004).

71 Kathiresan, M., Martins, D. & English, A. M. Respiration triggers heme transfer from cytochrome c peroxidase to catalase in yeast mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 17468-17473, doi:10.1073/pnas.1409692111 (2014).

72 Letavayova, L. et al. Relative contribution of homologous recombination and non-homologous end-joining to DNA double-strand break repair after oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair 5, 602-610, doi:10.1016/j.dnarep.2006.01.004 (2006).

73 Kalifa, L. et al. Mitochondrial genome maintenance: roles for nuclear nonhomologous end-joining proteins in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 190, 951-964, doi:10.1534/genetics.111.138214 (2012).


34

74 Dake, E., Hofmann, T. J., McIntire, S., Hudson, A. & Zassenhaus, H. P. Purification and properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry 263, 7691-7702 (1988).

75 Büttner, S. et al. Endonuclease G regulates budding yeast life and death. Molecular Cell 25, 233-246 (2007).

76 Zassenhaus, H. P. & Denniger, G. Analysis of the role of the NUC1 endo/exonuclease in yeast mitochondrial DNA recombination. Current Genetics 25, 142-149 (1994).

77 Hori, A., Yoshida, M., Shibata, T. & Ling, F. Reactive oxygen species regulate DNA copy number in isolated yeast mitochondria by triggering recombination-mediated replication. Nucleic Acids Research 37, 749-761, doi:10.1093/nar/gkn993 (2009).

78 Bambara, R. A., Murante, R. S. & Henricksen, L. A. Enzymes and reactions at the eukaryotic DNA replication fork. The Journal of Biological Chemistry 272, 4647-4650 (1997).

79 Rasmussen, A. K., Chatterjee, A., Rasmussen, L. J. & Singh, K. K. Mitochondria-mediated nuclear mutator phenotype in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research 31, 3909-3917 (2003).

80 Veatch, J. R., McMurray, M. A., Nelson, Z. W. & Gottschling, D. E. Mitochondrial dysfunction leads to nuclear genome instability via an iron-sulfur cluster defect. Cell 137, 1247-1258 (2009).

81 Lill, R. et al. The role of mitochondria in cellular iron-sulfur protein biogenesis and iron metabolism. Bba-Mol Cell Res 1823, 1491-1508, doi:10.1016/j.bbamcr.2012.05.009 (2012).

82 Pijuan, J., Maria, C., Herrero, E. & Belli, G. Impaired mitochondrial Fe-S cluster biogenesis activates the DNA damage response through different signaling mediators. Journal of Cell Science 128, 4653-4665, doi:10.1242/jcs.178046 (2015).

83 Zhang, Y. et al. Dre2, a conserved eukaryotic Fe/S cluster protein, functions in cytosolic Fe/S protein biogenesis. Molecular and Cellular Biology 28, 5569-5582, doi:10.1128/MCB.00642-08 (2008).

84 Netz, D. J. et al. Tah18 transfers electrons to Dre2 in cytosolic iron-sulfur protein biogenesis. Nature Chemical Biology 6, 758-765, doi:10.1038/nchembio.432 (2010).

85 Sanvisens, N. et al. Yeast Dun1 kinase regulates ribonucleotide reductase inhibitor Sml1 in response to iron deficiency. Molecular and Cellular Biology 34, 3259-3271, doi:10.1128/MCB.00472-14 (2014).

86 Vernis, L. et al. A newly identified essential complex, Dre2-Tah18, controls mitochondria integrity and cell death after oxidative stress in yeast. PloS ONE 4, e4376, doi:10.1371/journal.pone.0004376 (2009).

87 Wissing, S. et al. An AIF orthologue regulates apoptosis in yeast. The Journal of Cell Biology 166, 969-974, doi:10.1083/jcb.200404138 (2004).

88 Skoneczna, A., Kaniak, A. & Skoneczny, M. Genetic instability in budding and fission yeast-sources and mechanisms. FEMS Microbiology Reviews 39, 917-967, doi:10.1093/femsre/fuv028 (2015).

89 Rhind, N. et al. Comparative functional genomics of the fission yeasts. Science 332, 930-936, doi:10.1126/science.1203357 (2011).

90 Olsson, I. & Bjerling, P. Advancing our understanding of functional genome organisation through studies in the fission yeast. Current Genetics 57, 1-12, doi:10.1007/s00294-010-0327-x (2011).

91 Flores, C. L., Rodriguez, C., Petit, T. & Gancedo, C. Carbohydrate and energy-yielding metabolism in non-conventional yeasts. FEMS Microbiology Reviews 24, 507-529 (2000).

92 Overkamp, K. M. et al. In vivo analysis of the mechanisms for oxidation of cytosolic NADH by Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Journal of bacteriology 182, 2823-2830 (2000).

93 Chiron, S. et al. Studying mitochondria in an attractive model: Schizosaccharomyces pombe. Methods in Molecular Biology 372, 91-105, doi:10.1007/978-1-59745-365-3_7 (2007).

94 Herrero, E., Ros, J., Belli, G. & Cabiscol, E. Redox control and oxidative stress in yeast cells. Biochim Biophys Acta 1780, 1217-1235, doi:10.1016/j.bbagen.2007.12.004 (2008).

95 Merico, A., Sulo, P., Piskur, J. & Compagno, C. Fermentative lifestyle in yeasts belonging to the Saccharomyces complex. The FEBS Journal 274, 976-989, doi:10.1111/j.1742-4658.2007.05645.x (2007).

96 Schäfer, B. Genetic conservation versus variability in mitochondria: the architecture of the mitochondrial genome in the petite-negative yeast Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics 43, 311-326, doi:10.1007/s00294-003-0404-5 (2003).

97 Bullerwell, C. E., Leigh, J., Forget, L. & Lang, B. F. A comparison of three fission yeast mitochondrial genomes. Nucleic Acids Research 31, 759-768 (2003).

98 Dunn, C. D., Lee, M. S., Spencer, F. A. & Jensen, R. E. A genomewide screen for petite-negative yeast strains yields a new subunit of the i-AAA protease complex. Molecular Biology of the Cell 17, 213-226, doi:10.1091/mbc.E05-06-0585 (2006).


35

99 Shedge, V., Arrieta-Montiel, M., Christensen, A. C. & Mackenzie, S. A. Plant mitochondrial recombinationsurveillance requires unusual RecA and MutS homologs. Plant Cell 19, 1251-1264,doi:10.1105/tpc.106.048355 (2007).

100 Gerhold, J. M., Aun, A., Sedman, T., Joers, P. & Sedman, J. Strand invasion structures in the invertedrepeat of Candida albicans mitochondrial DNA reveal a role for homologous recombination in replication.Molecular Cell 39, 851-861, doi:10.1016/j.molcel.2010.09.002 (2010).

101 Rempola, B. et al. Functional analysis of RRD1 (YIL153w) and RRD2 (YPL152w), which encode twoputative activators of the phosphotyrosyl phosphatase activity of PP2A in Saccharomyces cerevisiae.Molecular & General Genetics : MGG 262, 1081-1092 (2000).

102 Rempola, B., Kaniak, A., di Rago, J. P. & Rytka, J. Anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiaealleviates the lethal effect of phosphotyrosyl phosphatase activators depletion. Acta Biochimica Polonica48, 1043-1049 (2001).

103 Kaniak, A., Xue, Z., Macool, D., Kim, J. H. & Johnston, M. Regulatory network connecting two glucosesignal transduction pathways in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic Cell 3, 221-231 (2004).

104 Rogowska, A. T. et al. Balance between transcription and RNA degradation is vital for Saccharomycescerevisiae mitochondria: reduced transcription rescues the phenotype of deficient RNA degradation.Molecular Biology of the Cell 17, 1184-1193, doi:10.1091/mbc.E05-08-0796 (2006).

105 Lipinski, K. A., Kaniak-Golik, A. & Golik, P. Maintenance and expression of the S. cerevisiaemitochondrial genome--from genetics to evolution and systems biology. Biochim Biophys Acta 1797, 1086-1098, doi:10.1016/j.bbabio.2009.12.019 (2010).

106 Kaliszewska, M. et al. Yeast model analysis of novel polymerase gamma variants found in patients withautosomal recessive mitochondrial disease. Human Genetics 134, 951-966, doi:10.1007/s00439-015-1578-x (2015).

Warszawa, 27.12.2017 Dr Aneta Kaniak-Golik

załącznik nr 2 autoreferat w języku polskim akg‚ącznik_nr... · 2018. 4. 18. · aneta...

Documents