zaŁĄcznik nr 2 autoreferat w języku polskim

ZAŁĄCZNIK nr 2

Autoreferat w języku polskim.

dr Anna Stanković Autoreferat w języku polskim Załącznik nr 2

1

AUTOREFERAT

1. Imię i nazwisko: Anna Maria Stanković

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe – z podaniem nazwy, miejsca i roku oraz tytuły

rozprawy doktorskiej

Stopień doktora nauk biologicznych z zakresu biologii nadany uchwałą Rady

Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego z dnia 31.01.2000.

Tytuł rozprawy doktorskiej: „Ektokomensaliczne i pasożytnicze orzęski zasiedlające

Euphausidae Oceanu Atlantyckiego”. Promotorem w przewodzie doktorskim był prof. dr hab.

Stefan Radzikowski (Instytut Zoologii UW), a recenzentami, prof. dr hab. Stanisław Rakusa-

Suszczewski (Zakład Biologii Antarktyki PAN) oraz prof. dr hab. Edward Siński (Instytut

Parazytologii UW).

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych

- od 01.07.2008: adiunkt (1/2 etatu) na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego;

- od 01.01.2003: biolog (1/3 etatu) w Instytucie Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii

Nauk;

- od 01.02.2000: adiunkt (obecnie 1/2 etatu) w Ośrodku Badań nad Antykiem Europy

Południowo - Wschodniej na Uniwersytecie Warszawskim;

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust.2 ustawy z dnia 14 marca 2003 o

stopniach naukowych i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki

(Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)

a) Tytuł osiągnięcia naukowego

Zastosowanie analiz antycznego DNA w filogenetyce i genetyce konserwatorskiej


2

b) Wykaz publikacji stanowiących osiągniecie naukowe

1. Stanković A., 2011. The Past and Future of Sturgeons in Poland: The Genetic Approach. W: Williot P., Rochard E., Desse-Berset N., Kirschbaum F., Gessner J., (eds): Biology and Conservation of the European Sturgeon Acipenser sturio L. 1758. Springer, Berlin, 561-572.

2. Popovic D., Panagiotopoulou H., Baca M., Stefaniak K., Mackiewicz P., Makowiecki D., King TL., Gruchota J., Weglenski P., Stankovic A., 2014. The history of sturgeon in the Baltic Sea. Journal of Biogeography, 41(8), 1590-1602. IF – 2013 = 4,863; MNiSW = 40

3. Panagiotopoulou H., Baca M., Popovic D., Weglenski P., Stankovic A., 2014. A PCR-RFLP based test for distinguishing European and Atlantic sturgeons. Journal of Applied Ichthyology, 30(1), 14-17. IF – 2013 = 0,903; MNiSW = 20 4. Stankovic A., Doan K., Baca M., Mackiewicz P., Gromadka R., Socha P., Ridush B., Weglenski P., Nadachowski A., Stefaniak K., 2011. First ancient DNA sequences of the Late Pleistocene red deer (Cervus elaphus) from the Crimea, Ukraine. Quaternary International, 245(2), 262-267. IF – 2011= 1,874; MNiSW =30

5. Baca M., Stankovic A., Stefaniak K., Marciszak A., Hofreiter M., Nadachowski A., Weglenski P, Mackiewicz P., 2012. Genetic analysis of cave bear specimens from Niedźwiedzia Cave, Sudetes, Poland. Palaeontologia Electronica, 15(2):21A, 1-16.

IF – 2012 = 0,871; MNiSW = 30

6. Baca M., Mackiewicz P., Stankovic A., Popovic D., Stefaniak K., Czarnogórska K., Nadachowski A., Gąsiorowski M., Hercman H., Weglenski P., 2013. Ancient DNA and dating of cave bear remains from Niedzwiedzia Cave suggest early appearance of Ursus

ingressus in Sudetes. Quaternary International, vol. 339-340, pp. 217-223.

IF – 2013 = 2,128; MNiSW = 30


3

Zastosowanie analiz antycznego DNA w filogenetyce i genetyce konserwatorskiej

Streszczenie

Poznanie i porównywanie sekwencji DNA stanowi obecnie podstawę analiz

taksonomicznych, filogenetycznych i ewolucyjnych. Rozwój technik izolacji, amplifikacji

i sekwencjonowania DNA pozwolił w ostatnich latach na ustalanie sekwencji antycznego

DNA (aDNA), otrzymywanego ze szczątków organizmów wymarłych nawet kilkaset tysięcy

lat temu. Analizy aDNA są nie tylko ważnym uzupełnieniem danych uzyskiwanych

klasycznymi metodami paleontologicznymi. Dzięki nim możliwe jest ustalenie przebiegu

ewolucji poszczególnych gatunków, odtwarzanie struktury wymarłych populacji i kierunków

ich migracji oraz poszukiwanie czynników, zarówno genetycznych jak i środowiskowych,

które w okresie plejstocenu i holocenu kształtowały skład flory i fauny na Ziemi.

Jako osiągnięcie przedstawiono zespół sześciu publikacji, prezentujących wyniki

analiz aDNA, wykonanych w celu rozwiązania określonych problemów z zakresu

filogenetyki i genetyki konserwatorskiej.

Trzy prace poświęcono analizie genetycznej jesiotra ostronosego (Acipenser

oxyrinchus oxyrinchus) – gatunku, który wyginął w wodach Polski w połowie XX wieku.

Analizy DNA jesiotrów, których szczątki pochodziły z I – III wieku p.n.e., ze średniowiecza

oraz z czasów nowożytnych, pozwoliły na ustalenie, że w wodach Polski gatunkiem

dominującym był A. o. oxyrinchus a nie, jak dawniej sądzono, A. sturio. Analizy DNA

jesiotrów pochodzących z zachowanych do dziś w Ameryce Północnej populacji A. o.

oxyrinchus umożliwiły wskazanie populacji genetycznie najbliższej do tej, która występowała

w Polsce. Populacja ta posłużyła do zbudowania stada tarłowego i rozpoczęcia programu

restytucji jesiotra w wodach Polski. Jedna praca dotyczy filogenetyki jelenia szlachetnego

(Cervus elaphus). Praca ta wykazuje rolę Półwyspu Krymskiego jako refugium, zarówno dla

jeleni obecnie występujących na Dalekim Wschodzie, jak i w Europie. Wreszcie, dwie prace

poświęcone są historii niedźwiedzia jaskiniowego na terenie Polski i dokumentują

wcześniejsze niż sądzono, pojawienie się w Polsce gatunku Ursus ingressus.


4

Wstęp

Metody filogenetyczne oparte na analizach sekwencji DNA stały się podstawą do

wyjaśnienia historii ewolucyjnej wielu gatunków występujących obecnie lub przeszłości na

naszej planecie. Dzięki rozwojowi technik pracy z DNA, a przede wszystkim technik jego

amplifikacji i sekwencjonowania, wkroczyliśmy w erę genomiki, tj. poznawania

i porównywania sekwencji całych genomów. Dotychczas udało się poznać pełne sekwencje

genomów kilkudziesięciu gatunków (nie licząc mikroorganizmów), w tym genomu

człowieka (Collins i wsp., 2003). Ze względu na ogromne znaczenie poznawcze zastosowania

w medycynie, poznanie sekwencji ludzkiego genomu jest powszechnie uznawane za jedno z

największych osiągnięć współczesnej nauki. Prace nad sekwencjonowaniem genomu

człowieka trwały kilkanaście lat (1990–2003). O ich zakończeniu poinformowali na wspólnej

konferencji prasowej Prezydent Stanów Zjednoczonych i Premier Wielkiej Brytanii. Obecnie

pełną sekwencję ludzkiego genomu można uzyskać w ciągu kilku dni kosztem 1000 dolarów

amerykańskich (Hayden, 2014). Wszystko wskazuje na to, że w niedalekiej przyszłości

będziemy mieli możliwość porównywania pełnych sekwencji wielu, jeśli nie większości

genomów przedstawicieli poszczególnych gatunków.

Znajomość pełnej sekwencji genomów nie jest jednak konieczna do prowadzenia

badań filogenetycznych opartych na analizach DNA. Dotychczas, w ogromnej większości

przypadków, prace te opierały się na porównywaniu fragmentów genomu, takich jak wybrane

odcinki mitochondrialnego DNA (mtDNA), sekwencje mikrosatelitarne i inne sekwencje

określane jako markery genetyczne. W wyniku tych prac ustalono historię ewolucyjną wielu

współcześnie żyjących gatunków, w tym człowieka. W przypadku człowieka, porównanie

sekwencji mtDNA pobranego od 147 przedstawicielek różnych, współcześnie żyjących

populacji (Cann i wsp., 1987), pozwoliła na wysunięcie hipotezy zwanej popularnie „Out of

Africa”. Hipoteza ta zakłada, że gatunek Homo sapiens wyewoluował w Afryce i około

100 000 lat temu, niewielka populacja tego gatunku podjęła wędrówkę wzdłuż doliny Nilu,

ku północy kontynentu, by przez półwysep Synaj dotrzeć 50 000 – 60 000 lat temu na Bliski

Wschód (Stewart i Stringer, 2012). Wkrótce potem, potomkowie tej grupy rozeszli się po

terenach Eurazji, wypierając napotykane po drodze populacje innych hominidów – H.

erectus i H. neanderthalensis (Cavalli-Sforza i Feldman, 2003). Obecnie hipoteza ta jest


5

popierana przez większość genetyków i antropologów (Stewart i Stringer, 2012 i cytowania

tam zawarte).

Badania filogenetyczne, opierające się na analizach DNA współcześnie żyjących

gatunków, zyskały ostatnio silne wsparcie dzięki rozwojowi prac nad antycznym DNA

(aDNA). Jest to DNA, który izoluje się z tkanek organizmów pochodzących z wykopalisk

archeologicznych lub zbiorów muzealnych. Analiza aDNA pozwala na precyzyjne określenie

przynależności gatunkowej szczątków kopalnych, a także na wniknięcie w historię danego

gatunku, określenie czasu jego ekspansji czy też wymierania, prześledzenie procesów

udomowiania zwierząt, określanie czasu i miejsca rozejścia się gatunków należących do

jednego rodzaju, czy też rozróżniania gatunków i podgatunków (Hofreiter i Stewart, 2009).

Pierwsze prace pokazujące możliwość odczytania informacji genetycznej z

antycznego materiału ukazały się w połowie lat osiemdziesiątych XX wieku. W 1984 roku

wyizolowano oraz sekwencjonowano mtDNA ze 150-letniego, muzealnego okazu,

wymarłego podgatunku zebry stepowej quagga Equus quagga quagga (Higuichi i wsp.,

1984) a w 1985 roku sukcesem zakończyła się izolacja jądrowego DNA z tkanki mumii

egipskiej sprzed ok. 2400 lat (Pääbo, 1985). W obu pracach posłużono się metodą klonowania

krótkich fragmentów DNA na plazmidach bakteryjnych i sekwencjonowania. Technika ta

okazała się jednak mało wydajna, głównie ze względu na uszkodzenia występujące w aDNA,

które hamują jego replikację w komórkach bakterii. Ponadto, uszkodzone cząsteczki DNA

mogą być naprawiane przez bakteryjne systemy naprawy DNA, co generuje błędy w badanej

sekwencji nukleotydowej (Pääbo, 1989a).

W ciągu 30 lat od pierwszych prób analiz aDNA nastąpił ogromny postęp w

technikach sekwencjonowania DNA. Konieczność zmniejszenia kosztów sekwencjonowania,

przy jednoczesnym zwiększeniu szybkości stosowanych procedur, doprowadziły do rozwoju

technik sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ang. high-throughput seqencing) zwanego

także sekwencjonowaniem nowej generacji (ang. new generation sequencing, NGS) (Millar

i wsp., 2008, 2010; Ginolhac i wsp., 2012; Meyer i wsp., 2012), a przez to, do rozwoju

wszystkich tych obszarów badań, które są oparte na analizach aDNA. Podczas ostatnich kilku

lat wykorzystanie techniki NGS doprowadziło poznania pełnych sekwencji kilkunastu, obok

człowieka, genomów organizmów wyższych oraz sekwencji wielu genomów

mitochondrialnych (mitogenomów) (Miller i wsp., 2008; Stiller i wsp., 2009;

Ho i Gilbert, 2010; Rasmussen i wsp., 2011; Bon i wsp., 2012; Hofreiter i wsp., 2014).


6

Metody stosowane do sekwencjonowania aDNA zostaną dokładniej omówione dalej, w

rozdziale „Metody pracy z aDNA”.

Ze szczątków kopalnych i z okazów muzealnych najczęściej izoluje się, amplifikuje

oraz sekwencjonuje DNA mitochondrialny, a w przypadku roślin, DNA chloroplastowy.

Organella te występują w komórkach w dużej liczbie kopii, przez co ich amplifikacja jest

łatwiejsza niż amplifikacja fragmentów genomu jądrowego. Sekwencje pierwszych

mitogenomów uzyskano dla dwóch gatunków wymarłych ptaków moa (Anomalopteryx

didiformis i Emus crassus) (Cooper i wsp., 2001; Haddrath i Baker, 2001), co pozwoliło na

wyjaśnienia relacji filogenetycznych tych wymarłych gatunków z współcześnie żyjącymi

największymi nielotami z rodzaju Struthioniformes. Do 2014 roku opublikowano kompletne

lub prawie kompletne sekwencje mitogenomów dla ponad 30 gatunków (Paijmans i wsp.,

2013; Hofreiter i wsp., 2014 i prace tam cytowane).

Czas „przeżycia” aDNA zależy od środowiska, w jakim szczątki kopalne były

przechowywane. Według Hofreitera i Stewarta (2009) i prac tam cytowanych, aktualny stan

technik analiz DNA pozwala na izolacje i amplifikacje DNA ze szczątków mających do około

1 miliona lat w przypadku organizmów, których szczątki zachowały się w wiecznej

zmarzlinie (Willerslev i wsp., 2004), czy też pochodzą z odwiertów lodowcowych na

Grenlandii (Willerslev i wsp., 2007; Rawlence i wsp. 2014). W przypadku szczątków

pochodzących ze strefy umiarkowanej czas ten szacuje się na około 100 000 lat. Ostatnie

doniesienia wykazują jednak, że nawet w tej strefie udaje się uzyskać DNA ze szczątków

znacznie starszych. Świadczy o tym powodzenie w ustaleniu sekwencji DNA z kości

hominida H. heidelbergensis, datowanych na 400 000. lat, znalezionych w jaskini Sima de los

Huesos w Hiszpanii (Meyer i wsp., 2014). Najstarsze sekwencjonowane fragmenty DNA

ssaków pochodzą z liczących 700 000 lat szczątków konia, odkrytych w wiecznej zmarzlinie

na terenie Kanady (Orlando i wsp., 2013). Doniesienia o uzyskaniu sekwencji aDNA

izolowanego z owada zatopionego ponad 100 milionów lat temu w bursztynie (Cano i wsp.,

1993), okazały się całkowicie nieprawdziwe i posłużyły jedynie jako motyw do słynnego

filmu Stevena Spielberga „Park Jurajski”. Wiadomo obecnie, że DNA w szczątkach

organizmów zatopionych w bursztynie ulega szybkiej degradacji (Austin i wsp., 1997; Ho i

Gilbert, 2010).

Lista problemów, jakie rozwiązuje się poprzez badania aDNA jest bardzo długa. Są to

problemy z dziedziny ewolucji gatunków, filogenetyki i filogeografii, biologii


7

konserwatorskiej, a także z dziedziny archeologii, w której wyróżnia się dział „archeologii

molekularnej” oraz antropologii, gdyż można na podstawie analiz aDNA uzyskiwać

informacje o stosunkach rodzinnych i społecznych panujących w żyjących przed wiekami

populacjach (Cavalli-Sforza i Feldman, 2003). Poniżej podane są przykłady prac nad aDNA,

których rezultaty miały duże znaczenie dla rozmaitych dziedzin nauki.

Jednym z największych sukcesów w badaniach nad aDNA było poznanie niemal

pełnego genomu neandertalczyka (H. neanderthalensis) (Green i wsp., 2010; Endicott i wsp.,

2010). Jego analiza udowodniła, że pomiędzy H. neanderthalensis a H. sapiens dochodziło do

krzyżowania się, czego dowodem jest obecność u współczesnego Europejczyka około 2%

genów Neandertalskich. Podobnym ważnym osiągnięciem, było poznanie genomu człowieka

z jaskini Denisova (Ałtaj), datowanego na 41 000. lat (Krause i wsp., 2010; Meyer i wsp.,

2012). Porównanie tego genomu z genomami współczesnych przedstawicielami H.

sapiens wykazało, że 4 - 6% genomu człowieka z jaskini Denisova jest obecnych w genomie

współczesnych ludzi zamieszkujących Papuę Nową Gwineę i Australię (Krause i wsp., 2010;

Reich i wsp., 2011). Ostatnio stwierdzono również znaczącą introgresję genów

Denisowianina w genomach Tybetańczyków i Chińczyków plemienia Han (Huert-Sanchez

i wsp., 2014). Nie stwierdzono domieszki genów „Denisowian” w genomach współczesnych

Europejczyków (Prűfer i wsp., 2013), wykazano natomiast, że neandertalczycy i

Denisowianie krzyżowali się ze sobą – ci ostatni mają ponad 0,5% genów Neandertalczyków

(Sarkissian i wsp., 2015).

Obecnie najstarszym, prawie w całości sekwencjonowanym mitogenomem hominida

jest wspomniany wyżej genom H. heidelbegensis. Jego analiza wykazała, że ma on

wspólnego przodka zarówno z człowiekiem z jaskini Denisova, jak również i z

neandertalczykami (Krause wsp., 2010; Blum i Jakobsson, 2011; Reich, 2010; Mayer wsp.,

2012). Ostatnio (Seguin-Orlando i wsp., 2014), udało się ustalić sekwencję genomu

najstarszego przedstawiciela współczesnych Europejczyków, którego szczątki odkryto w

europejskiej części Rosji, na stanowisku Kostenki 14. Wiek znaleziska oszacowano na 38 700

– 36 200 lat. Okazało się, że domieszka genów neandertalczyka u tego osobnika jest nieco

większa niż u ludzi współczesnych i wynosi 2,4%. Poza tym, jego genom znacznie mniej

różni się od genomu współczesnego Europejczyka niż od genomu ludzi zamieszkujących

wschodnią część Azji. Wskazuje to na wcześniejsze niż sądzono, rozdzielenie się

ewolucyjnych linii Europejskiej i Wschodnio-Azjatyckiej.


8

Bardzo wiele prac nad aDNA koncentruje się nad ustaleniem przyczyn masowego

wymierania wielkich ssaków w okresie późnego czwartorzędu. Szacuje się, że podczas

wielkiego plejstoceńskiego wymierania, spośród około 150 rodzajów dużych ssaków (o

wadze powyżej 45 kg), wyginęło co najmniej 97% (Barnosky i wsp. 2004). Jak wiadomo,

okres ten charakteryzował się dużymi wahaniami temperatury, powodującymi bardzo

poważne zmiany w biocenozach a nawet w ekosystemach na całej Półkuli Północnej. Badania

aDNA takich zwierząt jak mamut (Mammuthus primigenius), nosorożec włochaty

(Coelodonta antiquitatis), koń (Equus ferus i Equus. caballus), bizon (Bison priscus/Bison

bison), renifer (Rangifer tarandus) i wół piżmowy (Ovibus maschatus) wykazały, że

różnorodność genetyczna populacji tych gatunków wykazywała znacznie większe i częstsze

zmiany niż dotychczas sądzono na podstawie wyników klasycznych prac paleontologicznych

(Hewitt, 2004; Barnosky i wsp., 2004; Shapiro i wsp., 2004; Martin i wsp., 2004; Stuart

i Lister, 2007; Hofreiter i Stuart, 2009 i cytowania w nim zawarte; Shapiro i Hofreter, 2014).

Badania aDNA pozwoliły na stwierdzenie, że oprócz refugiów południowych, do których

wycofywały się zwierzęta w okresie zlodowaceń (Hewitt, 2000; Hofreiter i Stuart, 2009;

Hofreiter i Stewart, 2012), istniały również refugia północne (Steward i Lister, 2001;

Somemer i Nadachowski, 2006; Provan i Bennett, 2008). Wykazano również, że dla wielu

gatunków zmiany klimatu nie były wyłączną przyczyną ich ginięcia. Ostatnie prace, w

których porównywano dane dotyczące liczebności i dystrybucji zachowanych szczątków

ludzkich i szczątków dużych ssaków, wydają się wykazywać, że w okresie późnego

plejstocenu, nie tylko klimat, ale i człowiek istotnie przyczynił się do wyginięcia wielu

gatunków (Lorenzen i wsp., 2011; Sandom i wsp., 2014; Shapiro i Hofreiter, 2014).

Dzięki analizom aDNA szczególnie dokładnie odtworzono ewolucyjną historię

mamuta (M. primigenius). Wykazano, że w Eurazji występowały dwa podgatunki, z których

jeden wyginął około 40 000 lat temu, a drugi, wywodzący się z Ameryki Północnej, zasiedlił

Syberię natomiast ostatnia jego populacja z Wyspy Wrangla wyginęła dopiero 3 700 lat

temu (Barnes i wsp., 2007). Wyniki te potwierdzono analizując 15 pełnych mitogenomów

mamuta (Miller i wsp., 2008; Gilbert i wsp., 2008; Debruyene i wsp., 2013).

Prześledzono również historię takich wymarłych gatunków jak niedźwiedź jaskiniowy

(Ursus spelaeus) (Hofreiter i wsp., 2004a; 2004b; 2007; Műnzel i wsp., 2004; 2011; Lorenzen

i wsp., 2011) i hiena jaskiniowa (Crocuta crocuta spelaea) (Rohland i wsp., 2005). W

przypadku hieny jaskiniowej, która wymarła 25 000. lat temu, jej DNA udało się wyizolować


9

z koprolitów. Analiza sekwencji fragmentu mtDNA kodującego cytochrom b pozwoliła

zarówno na odtworzenie historii hieny jaskiniowej, jak i relacji tego gatunku z hieną

cętkowaną (C. crocuta), występującą współcześnie. Wyniki analiz wykazały jednoznacznie,

że hieny plejstoceńskie i współczesne są genetycznie bardzo blisko spokrewnione i należy je

traktować jak jeden gatunek (Hofreiter i wsp., 2004b; Rohland i wsp., 2005). Co ciekawe, z

tego samego materiału wyizolowano i sekwencjonowano mitogenomy dwóch osobników

jelenia szlachetnego (Bon i wsp., 2012).

Wspomniane wyżej wyniki prac nad sekwencjonowaniem genomu konia z wczesnego

Środkowego Plejstocenu stanowiły nie tylko przykład powodzenia w sekwencjonowaniu

bardzo starego (700 000 lat) genomu. Posłużyły również do ustalenia przebiegu ewolucji

rodzaju Equus (Orlando i wsp., 2013; Millar i Lambert, 2013). Autorzy cytowanych prac

ustalili relacje pomiędzy zbadanym przez siebie koniem a koniem Przewalskiego, (Equus

ferus przewaskii) koniem ze środkowego plejstocenu, koniem współczesnym (Equus ferus

caballus) i osłem (Equus asinus) i oszacowali czas dywergencji konia i osła na 4,0 – 4,5

milionów lat.

Badania aDNA pozwoliły również na odtworzenie filogeografii i chronologii

wymarcia lwa jaskiniowego (Panthera spelaea). W późnym plejstocenie i na początku

holocenu istniały trzy populacje lwa, jedna występująca współcześnie w Afryce i Azji i dwie

obecnie wymarłe. W Eurazji lew jaskiniowy wymarł około 14 000 - 14 500 lat temu, zaś na

Alasce około tysiąca lat później, kiedy, jak wiadomo, doszło do znaczącego ocieplenia, jak

również pojawienia się na tym terenie ludzi (Stuart i Lister, 2011). Obie wymarłe populacje

różnią się genetycznie od populacji lwów obecnie występujących na świecie.

Badania nad aDNA pozwalają na uzyskanie takich danych o historii gatunków, jakie

nie są osiągalne poprzez badania morfologii zachowanych szczątków. Doskonale ilustruje to

przykład niedźwiedzi brunatnych. Badania morfologiczne szczątków wykazały, że

niedźwiedzie brunatne występowały na Alasce przed 40 000 lat i po 21 000 lat temu. Analizy

genetyczne udowodniły, że populacja niedźwiedzi, która zasiedliła Alaskę 21 000 lat temu,

była całkowicie różna od tej, która zamieszkiwała te tereny wcześniej (Hofreiter i wsp., 2007;

Leonard i wsp., 2008).

Podobnego przykładu dostarczają badania nad wilkami (Canis lupus) z terenów

Alaski. Gatunek ten należy do jednego z nielicznych spośród dużych ssaków, który przetrwał

wymieranie megafauny w okresie plejstocenu na dużych obszarach, z wyjątkiem Alaski,


10

gdzie kompletnie wyginął w późnym plejstocenie (około 10 000 - 12 000 lat temu). Badania

aDNA wilków z okresu przed ich wyginięciem na Alasce wykazały, że reprezentują one

haplotypy, których nie obserwuje się w żadnej ze współcześnie żyjących populacji.

Haplotypy te są zbliżone do haplotypów późnoplejstoceńskich wilków z Ukrainy i Ałtaju.

Tak więc, wydaje się, że wilki z Alaski stanowiły odrębny tzw. ekomorf, przystosowany do

polowań na przedstawicieli megafauny, która wyginęła wraz z nimi (Leonard i wsp., 2007).

Badania aDNA dostarczają ważnych informacji na temat historii udomowiania

zwierząt, takich jak koń (Equus ferus caballus) (Orlando i wsp., 2011; 2013) i pies (Canis

familiaris) (Vonholdt i wsp., 2010; Thalmann i wsp., 2013). I tak, w przypadku psów sądzono,

że gatunek ten został udomowiony przez człowieka w Małej Azji, około 15 tysięcy lat temu

(Von Holdt i wsp., 2010). Znane były jednak znacznie starsze znaleziska szczątków psów

towarzyszące znaleziskom szczątków ludzkich z terenu Europy. Wykonane ostatnio,

zakrojone na szeroką skalę badania nad sekwencjami mtDNA antycznych i współczesnych

psów i wilków wykazały, że obecnie żyjące psy są najbliższe genetycznie tym, które

występowały w Europie, od 20 000 do ponad 30 000 lat temu. Stąd też, dane uzyskane z

analiz aDNA przesunęły datę początków udomowiania psów na 18 800 – 32 100 lat temu

(Thalmann i wsp., 2013).

Bardzo ważnym dla badań epidemiologicznych było ustalenie sekwencji genomu

bakterii Yersinia pestis, odpowiedzialnej za plagę „czarnej śmierci”, która nawiedziła

Zachodnią Europę w połowie XIV wieku, powodując, jak się szacuje, śmierć około 30

milionów mieszkańców. Bos i wsp. (2011) pozyskali materiał do badań ze szczątków osób

pochowanych na jednym z cmentarzy w Londynie, założonym w 1348 roku i przeznaczonym

dla ofiar epidemii. Sekwencje kilku genomów bakterii pochodzących ze szczątków różnych

osób porównano ze sobą oraz z sekwencjami zarówno patogennych jak i niepatogennych

szczepów Y. pestis pochodzących z kolekcji mikrobiologicznych. Wyniki tych badań,

uzupełnione w kolejnej pracy (Bos i wsp., 2012) posłużyły do rekonstrukcji drzewa

filogenetycznego tego gatunku i ustalenia, jakie mutacje genomu są odpowiedzialne za

patogenność.


11

Wykorzystanie analiz aDNA w genetyce konserwatorskiej

Gwałtowny przyrost ludności na Ziemi, uprzemysłowienie oraz wykorzystywanie

coraz większych obszarów na potrzeby rolnictwa, powodują narastające zagrożenie dla

bioróżnorodności. W ostatnich dziesięcioleciach wiele gatunków roślin i zwierząt wyginęło, a

jeszcze więcej jest zagrożonych wyginięciem. Paul Crutzen, laureat nagrody Nobla,

zaproponował termin „Antropocen” na określenie obecnej, zdominowanej działalnością

człowieka epoki geologicznej. Jego zdaniem, ta nowa epoka geologiczna rozpoczęła się już

200 lat temu. Ochrona różnorodności biologicznej jest uznawana za jedno z najwaźniejszych,

i jednocześnie najtrudniejszych wyzwań stojących przed ludzkością.

W pracach nad ochroną bioróżnorodności ważną rolę zaczął odgrywać nowy dział

genetyki, określany jako genetyka konserwatorska (ang. conservation genetics), będący

połączeniem ekologii, genetyki populacyjnej i taksonomii. Zajmuje się on oceną

polimorfizmu genetycznego zachowanych populacji zagrożonych gatunków, ustalaniem

właściwości populacji, które występowały na danym terenie przed ich wyginięciem

i poszukiwaniem genetycznie zbliżonych populacji, które mogły stanowić materiał wyjściowy

do odbudowy populacji wymarłych (Leonard, 2008 i cytowania tam zawarte).

Bardzo wiele publikacji z dziedziny genetyki konserwatorskiej dotyczy wyników

badań nad najlepszymi metodami utrzymania zmienności w populacjach cennych lub

zagrożonych gatunków na odpowiednim poziomie. Zakłada się, że wyższa średnia

heterozygotyczność zwiększa szanse na przetrwanie danej populacji. Populacje gatunków

rzadkich i zagrożonych charakteryzują się zwykle, na skutek występowania chowu wsobnego

i dryfu genetycznego, obniżonym poziomem heterozygotyczności (Avise, 2004). Znaczne

zmniejszenie liczebności populacji jest też zwykle przyczyną spadku różnorodności

genetycznej oraz fiksacji alleli, co z kolei skutkuje ograniczeniem zdolności gatunku do

radzenia sobie ze zmianami następującymi w środowisku (Swatdipong i wsp., 2010). Na

dodatek obniżony polimorfizm genetyczny pociąga za sobą wzrost ryzyka ujawnienia się

chorób recesywnych oraz podwyższenia poziomu wsobności, obniżającej sukces rozrodczy

i przeżywalność osobników. Tak więc utrzymanie możliwie wysokiego poziomu zmienności

genetycznej jest niezbędne dla stabilności populacji. Temu celowi służą zabiegi

konserwatorskie polegające na utrzymywaniu odpowiedniej liczebności populacji, czy też

reintrodukcji populacji wymarłej na danym terenie, poprzez zasiedlenie go osobnikami


12

możliwie najbliższymi genetycznie do tych, które uprzednio tam występowały (Willerslev i

Cooper, 2005; Leonard, 2008).

Dla uzyskania prawidłowych wyników restytucji gatunków, bądź też odnowy

populacji, koniecznym jest często sięgnięcie do analiz aDNA. W wielu przypadkach nie

chodzi tu o analizy DNA sprzed wielu tysięcy lat, gdyż szereg gatunków zostało wytępionych

stosunkowo niedawno i materiały do analiz DNA można uzyskać z muzeów. Klasyczne

przypadki z terenu Polski, to kilka gatunków ryb, jak jesiotr (Acipenser oxyrinchus) i łosoś

(Salmo salar), które wyginęły całkowicie w XX wieku i kilka innych, jak sieja (Coregonus

lavaretus) czy certa (Vimba vimba), których liczebność drastycznie obniżyła się (Witkowski i

wsp., 2003; Witkowski i wsp., 2009). Z podobnymi przypadkami mamy do czynienia w

przypadku ssaków, spośród których nie udało się zachować tura (Bos primigenius), który

wyginął całkowicie w XVII wieku, zaś udało się uratować żubra (Bison bonasus). Aktualnym

problemem jest zachowanie czystych linii gatunkowych populacji żbika (Felis silvestris),

który krzyżuje się z kotami domowymi czy też wilka (Canis lapus), gdzie od niedawna

pojawił się problem krzyżowania się z psami domowymi.

DNA uzyskany od okazów przechowywanych w muzeach i innych zbiorach stanowi

wzorzec pozwalający na bezbłędne określenie przynależności gatunkowej dzikich,

odłowionych osobników. W przypadku możliwości pozyskania większej liczby osobników

muzealnych, czy też w przypadku zachowania się populacji resztkowych danego gatunku,

analizy DNA pozwalają na określenie zakresu polimorfizmu genetycznego, jaki

charakteryzował wymarłą lub ginącą populację, a także, na zidentyfikowanie populacji, która

mogłaby służyć jako materiał do odbudowy populacji, która na danym terenie wyginęła.

Metody pracy z aDNA

DNA zachowany w materiałach antycznych występuje w bardzo małych ilościach i jest

zdegradowany do fragmentów, których długość zwykle nie przekracza 200 – 300

nukleotydów (Hofreiter i wsp. 2001; Pääbo i wsp., 2004). Reakcje chemiczne, takie jak

hydroliza, oksydacja oraz tworzenie wiązań krzyżowych, prowadzą często do modyfikacji

DNA, uniemożliwiających jego amplifikację lub zmieniających jego sekwencję (Hofreiter

i wsp. 2001; Willerslev i Cooper, 2005; Krause i wsp., 2010; Ho i wsp., 2010; Molak i wsp.,

2011; Sawyer i wsp., 2012). Procesy degradacji DNA rozpoczynają się natychmiast po


13

śmierci organizmu. W komórkach uaktywniają się endogenne nukleazy, przecinające

sekwencje nukleotydowe. Ważnym czynnikiem wpływającym na degradację aDNA jest także

działalność mikroorganizmów i występujących w nich nukleaz. Nadal można znaleźć bardzo

niewiele danych dotyczących korelacji szybkości degradacji DNA w szczątkach kopalnych, a

sposobem i czasem ich przechowywania. Ciekawym eksperymentem okazało się porównanie

izolacji, a następnie amplifikacji DNA z dwóch różnych fragmentów tej samej kości, które

zostały wydobyte z wykopaliska w odstępie sześćdziesięciu lat. DNA z fragmentu kości,

który był wydobyty w 1947, roku a następnie przechowywany w muzeum był zdegradowany

w stopniu uniemożliwiającym jego amplifikację, podczas gdy DNA z materiału wydobytego z

ziemi w roku 2004 roku amplifikował się bez trudności. Okazało się, że szybkość degradacji

DNA w szczątkach kopalnych, przechowywanych w muzeum przez 57 lat, była większa niż

w czasie 3200 lat przechowywania w ziemi (Pruvost i wsp., 2007). Z przywołanej wyżej i z

innych obserwacji (Shapiro i Hofreiter, 2012) wynika, że kluczowym czynnikiem,

zapewniającym dobre przechowanie się DNA, jest stała i niska temperatura.

W przypadku zwierząt aDNA najczęściej izoluje się z kości długich i z zębów (lecz

możliwa jest również jego izolacja z tkanek miękkich). Ich budowa (np. szkliwo na zębach)

stanowi stosunkowo najlepszą naturalną barierę, chroniącą DNA przed szkodliwym

działaniem środowiska zewnętrznego, a także, przed kontaminacją egzogennym materiałem

genetycznym (Adler i wsp., 2011). Ze względu na to, że w szczątkach kopalnych występują

jedynie śladowe ilości DNA, ryzyko kontaminacji aDNA przez DNA współczesny musi być

zawsze brane pod uwagę. Stąd też laboratorium, w którym izoluje się i amplifikuje aDNA

powinno być tak wyposażone, aby zapewnić sterylność pracy, zmniejszyć maksymalnie

możliwość kontaminacji prób, zarówno DNA współczesnym, jak i DNA amplifikowanym. W

laboratorium powinny być zainstalowane lampy UV dla okresowej sterylizacji

pomieszczenia, a wejście do laboratorium powinno być zaopatrzone w śluzę. Stanowiska do

izolacji DNA i jego amplifikacji powinny być fizycznie rozdzielone - wszelkie prace po

etapie uzyskania produktu amplifikacji powinny być prowadzone w oddzielnym laboratorium.

Zasady pracy z aDNA zostały skodyfikowane przez Willerslev i Cooper (2005) i stanowią

„dziesięć przykazań” dla wszystkich zajmujących się tego typu materiałem.

W przypadku izolacji DNA z kości lub zębów, ich fragmenty oczyszcza się

detergentami i alkoholem absolutnym, a następnie płucze dwukrotnie destylowaną wodą.

Zewnętrzną warstwę kości i zębów usuwa się w szczelnej komorze przy pomocy


14

diamentowanych ostrzy jubilerskich, po czym materiał naświetla się UV przez 15 min. Do

rozdrabniania próbek służą młynki kriogeniczne. DNA izoluje się za pomocą metody tzw.

fenol-chloroform. Procedura ta ma na celu również usunięcie z aDNA zanieczyszczeń takich

jak kwasy humusowe i fulwinowe oraz uwolnienie związanych cukrów (tzw. produktów

Maillarda) (Poinar, 1996).

W przypadku aDNA izolowanego z prób liczących sobie kilka, czy kilkadziesiąt

tysięcy lat, często jedyne fragmenty DNA, które można amplifikować i sekwencjonować

pochodzą z mtDNA. Wynika to z faktu wielokopijności mtDNA w komórkach i przez to jego

stosunkowo większej ilości w stosunku do fragmentów DNA jądrowego. Najczęściej

amplifikuje się fragmenty mtDNA kodujące cytochrom b (cyt b) oraz tzw. pętlę D,

niekodujący odcinek mtDNA, charakteryzujący się stosunkowo dużą zmiennością

nukleotydową. Należy pamiętać o tym, że mtDNA dziedziczony jest tylko w linii żeńskiej.

Dla wielu celów, koniecznym jest amplifikowanie i sekwencjonowanie fragmentów DNA

jądrowego, np. w przypadku człowieka, fragmentów chromosomu

Y (Underhill i Kivisild, 2007).

Wyżej wymienione odcinki mtDNA nie są jedynymi markerami genetycznymi

stosowanymi w archeologii molekularnej. Jeżeli celem prac z aDNA jest ustalanie struktury

wymarłej populacji, korzystnym jest sięgnięcie po markery charakteryzujące się większą

zmiennością niż markery mitochondrialne, np. mikrosatelitarny DNA (msDNA). Ich

zastosowanie jest możliwe jedynie w przypadku prób charakteryzujących się dobrze

zachowanym DNA, a więc na ogół prób, które nie liczą sobie więcej niż kilka tysięcy lat. W

przypadku dobrze zachowanych prób, np. wspomnianych wyżej fragmentów kości

Neandertalczyków czy Denisowian, można pokusić się nawet o zsekwencjonowanie pełnego

genomu.

Rozwój badań nad aDNA był możliwy dzięki ulepszeniu metod izolacji DNA,

polegających na dobraniu właściwych buforów do ekstrakcji DNA i wiązaniu go przed

strącaniem etanolem z podłożami krzemowymi (Rohland i Hofreiter, 2007). Metody izolacji

DNA udało się jeszcze bardziej udoskonalić poprzez zwiększenie efektywności ekstrakcji i

precypitacji krótkich fragmentów DNA (Dabney i wsp., 2013), które z reguły stanowią

znaczą część aDNA. Efekt ten uzyskano poprzez kolejne modyfikacje buforów do ekstrakcji i

precypitacji DNA. W efekcie uzyskano możliwość izolacji i sekwencjonowania fragmentów

DNA o długości nieprzekraczającej 50 bp.


15

Ostatnio ukazało się szereg prac, w których zastosowano metodę wzbogacania ilości

izolowanego aDNA poprzez hybrydyzację (Hofreiter i wsp., 2014). Metoda ta polega na

użyciu sekwencji DNA lub RNA otrzymanych z tkanek osobników tego samego lub

pokrewnego gatunku jako „przynęty” dla fragmentów aDNA. Dla przykładu, metodę tą

zastosowano do konstrukcji bibliotek DNA ludzi z epoki brązu z wykopalisk w Bułgarii i z

mumii z okresu pre-Kolumbijskiego, odkrytych w Peru (Carpenter i wsp., 2013). W tym

przypadku przynętę stanowiły cząsteczki RNA uzyskane na drodze transkrypcji biblioteki

genomowej współczesnego człowieka. Cząsteczki te po ich biotynylacji wiąże się z kolumną

ze złożem zawierającym streptawidynę i hybrydyzuje z DNA wyizolowanym z antycznych

szczątków. DNA odzyskany po hybrydyzacji stanowi bibliotekę, którą można poddać

sekwencjonowaniu za pomocą jednej z metod sekwencjonowania nowej generacji (patrz

dalej). Podobną metodę, z tym, że jako przynęty użyto biblioteki DNA, zastosowano przy

sekwencjonowaniu genomu Denisowianina (Meyer i wsp., 2012) a także do

sekwencjonowania genomów mitochondrialnych i chloroplastowych kilkunastu gatunków

(Hofreiter i wsp,. 2014 i literatura tam cytowana).

Kluczową metodą w badaniach aDNA jest łańcuchowa reakcja polimerazy

(PCR) (Pääbo i wsp., 1989b). PCR pozwala na amplifikację fragmentów DNA nawet z bardzo

małej ilości wyjściowej materiału genetycznego, występującego w szczątkach kopalnych. W

badaniach antycznego DNA powszechnie stosowana jest reakcja multiplex PCR, która

pozwala na amplifikację wielu różnych fragmentów w pojedynczej reakcji (Krause i wsp.,

2010). Warto zaznaczyć, że spośród 124 zbadanych mitogenomów, tylko 6 amplifikowano

stosując „pojedynczy” (ang. simplex) PCR. Wszystkie pozostałe udało się amplifikować za

pomocą multiplex PCR (Paijmans i wsp., 2013).

Jak wspomniano wyżej, w ciągu ostatnich 30 lat obserwuje się bardzo szybki rozwój

technik sekwencjonowania DNA. Początkowo, w badaniach aDNA wykorzystywano

klasyczne sekwencjonowanie metodą Sangera (Sanger i wsp., 1977). Jest to jednak technika

czasochłonna i kosztowna, przez co ilość otrzymywanych danych jest ograniczona. Potrzeba

zmniejszenia kosztów sekwencjonowania z jednoczesnym zwiększeniem szybkości procedury

doprowadziła do powstania technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) (Paijmans

wsp., 2013).


16

Obecnie wykorzystywane są głównie 4 techniki NGS:

- pirosekwencjonowanie na platformie Roche (454) (Gilbert i wsp., 2007; Stiller i wsp.,

2009; Knapp i Hofreiter, 2010);

- sekwencjonowanie przez syntezę - Ilumina (Solexa) (Knapp i Hofreiter, 2010; Metzker,

2010);

- SOLiD (ang. Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) (Ho i Gilbert, 2010);

- Helicos (BioSiences) (ang. Single Molecule Fluorescent Sequencing) (Ginolhac i wsp.,

2012).

We wszystkich wymienionych technikach sekwencjonowane są krótkie fragmenty

DNA, od kilkudziesięciu do kilkuset par zasad. Największą zaletą technik NGS w stosunku

do klasycznego sekwencjonowania metodą Sangera, jest możliwość sekwencjonowania nawet

miliona fragmentów jednocześnie (Millar i wsp., 2008). NGS ostatnio sprzęga się z nowymi

metodami przygotowywania bibliotek do sekwencjonowania. Przełomem w tym zakresie było

wykorzystanie jako matryc do sekwencjonowania, jednoniciowego DNA (tSMS, ang. true

single DNA molecule sequencing) (Sanchez-Quinto i Lalueza-Fox, 2014 i prace tam

cytowane). Jak wiadomo, aDNA jest zwykle silnie zdegradowany i występują w nim liczne

pęknięcia pojedynczych nici. Do wolnych końców 3’OH, których w aDNA jest znacznie

więcej niż w DNA współczesnym, przyłącza się startery do sekwencjonowania i

przeprowadza sekwencjonowanie na platformie Illumina lub Helicos. Zaletą metody jest to,

że nie jest potrzebna amplifikacja fragmentów DNA techniką PCR i wszystkie reakcje

oczyszczania i strącania DNA, przy których traci się znaczną część cząsteczek aDNA.

Metodę tSMS z powodzeniem zastosowano do sekwencjonowania na platformie Helicos

genomu konia, którego szczątki datowane na około 700 000 lat, pozyskano z wiecznej

zmarzliny na terenie Kanady (Orlando i wsp., 2011). Szczegółowy protokół przygotowania

bibliotek jednoniciowego DNA do sekwencjonowania na platformie Illumina został

opracowany przez Gansauge i Meyer’a (2013) i zastosowany przy sekwencjonowaniu DNA

ze szczątków kilku hominidów.

W przedstawionych pracach wchodzących w skład osiągnięcia naukowego, stanowiącego

podstawę do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego, wykorzystywano technikę

Sangera (Sanger i wsp., 1977) oraz technikę pirosekwencjonowania (Gilbert i wsp., 2007;

Stiller i wsp., 2009; Knapp i Hofreiter, 2010). Przeznaczony do sekwencjonowania DNA

amplifikowano dwukrotnie w celu uniknięcia błędów, które mogły pojawić się na skutek


17

zdarzających się modyfikacji DNA. Na wszystkich etapach izolacji i amplifikacji DNA

przeprowadzano reakcje „ślepe” (mieszaniny reakcyjne zawierały wszystkie składniki z

wyjątkiem DNA), w celu wykrycia ewentualnych kontaminacji. W przypadku próbek

przeznaczonych do pirosekwenconowania, produkty PCR były przed ich skumulowaniem

indywidualnie znakowane ( ang. barcoded).

Prawidłowość uzyskanych sekwencji DNA oceniano stosując kryteria zaproponowane

przez Stiller i wsp., (2009). Uliniowywanie uzyskanych sekwencji wykonywano za pomocą

programu BioEdit 7.0.9.0 (Hall, 1999).

Analizy filogenetyczne

Do rekonstrukcji drzew filogenetycznych stosowano metody łączenia sąsiadów (NJ,

neighbour joining), największej oszczędności (MP, ang. maximum parsimony) i minimalnej

odległości (ME, ang. minimum evolution), wykorzystując program Paup 4.0 (Swofford,

2003). Do uzyskiwania drzew metodą największej wiarygodności (ML, ang. maximum

likelihood) stosowano program PhyML (Guindon i wsp., 2010). Drzewa Bayesowskie

odtwarzano w programach MrBayes 3.1.2 (Ronquist i Huelsenbeck, 2003) i PhyloBayes 3.2f

(Lartillot i Philippe, 2004). W przypadku metod MrBayes, ML i NJ, model substytucji

najbardziej pasujący do danego zestawu danych (HKY+I) był wybierany za pomocą

programu jModelTest 0.1.1. (Posada, 2008).

Sieci haplotypów rekonstruowano w programie Network 4.6.1 (Bandelt,

1999). Zmienność nukleotydową, jak zmienność haplotypowa, obliczano za pomocą

programu Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier i Lischer, 2010).

W przypadku analiz msDNA, do sprawdzenia obecności artefaktów wykorzystywano

program MicroChecker 2.2.3 (van Oosterhout i wsp. 2004). Liczba alleli w locus (Na),

efektywna liczba alleli w locus (Ne), liczba alleli prywatnych (Np), bogactwo alleliczne (R),

wartości współczynnika wsobności (FIS) dla każdej grupy osobników obliczane były za

pomocą programu FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2002), GENEPOP (Raymond i Russet, 1995),

GenAlEx 6.4.1 (Peakall i Smouse, 2006).

Heterozygotyczność obserwowana i oczekiwana (HO i HE,) obliczana była za pomocą

programu Arlequin 3.5.1.2 (Excoffier i Lischer, 2010) i programu GenAlEx (Peakall


18

i Smouse, 2012). Dystans genetyczny obliczano za pomocą programu FSTAT, Arlequin

i RSTCalc (Goodman, 1997). Strukturę genetyczną populacji ustalano za pomocą

oprogramowania STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard i wsp., 2000). Czas kolonizacji populacji

założycielskiej oparty o analizę msDNA przeprowadzono metodą Bayesowską (ABC)

(Beaumont i wsp., 2002), za pomocą programu DIYABC 1.0.4.46 (Cornuet i wsp., 2008).

Omówienie prac wchodzących w skład osiągnięcia, które jest podstawą do ubiegania się

o nadanie stopnia naukowego doktora habilitowanego

W skład osiągnięcia naukowego będącego podstawą do ubiegania się o nadanie

stopnia naukowego doktora habilitowanego włączono 6 publikacji, w których zastosowano

techniki analizy aDNA do rozwiązania określonych problemów z zakresu genetyki

konserwatorskiej i filogenetyki zwierząt. Trzy prace są poświęcone analizom genetycznym

przeprowadzonym z związku z restytucją jesiotra w Polsce. Pozostałe trzy dotyczą

filogenetyki jelenia szlachetnego i niedźwiedzia jaskiniowego. Celem przedstawienia tego

zespołu prac była próba wykazania, jak wielki potencjał kryje się w technikach analizy aDNA

i jak wiele istotnych problemów można rozwiązać je stosując. Poniżej omówione zostały

kolejno dwie wymienione grupy prac.

1. Restytucja jesiotra bałtyckiego (Acipenser oxyrinchus oxyrinchus) w oparciu o analizy

aDNA.

Trzy spośród prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego są poświęcone

zagadnieniu restytucji jesiotra w wodach Polski. Prace te stanowiły podstawę do ustalenia

programu restytucji tego gatunku. Ich przedmiotem są analizy aDNA wykonywane w celu

określenia który gatunek jesiotra występował w dorzeczach Wisły i Odry przed wyginięciem,

jaki był zakres polimorfizmu genetycznego wymarłych populacji i która z występujących

jeszcze na świecie populacji jesiotra jest genetycznie najbliższa tej, która wymarła w Polsce.

Jesiotry (Acipenseridae) nazywane „żywymi skamielinami”, są jedną z najstarszych

rodzin ryb kostnoszkieletowych. Pierwsze kopalne ich szczątki znane są z górnej jury, od

kiedy ich cechy morfologiczne nie uległy znaczącym zmianom. Występują w słodkich

i słonych wodach na półkuli północnej. Jesiotry są rybami anadromicznymi, część swojego

cyklu życiowego spędzają w środowisku słonym, część w słodkim, gdzie się rozradzają.


19

Cechuje je filopatria, tj. powracanie na tarło do tych samych rzek, w których się wylęgły

(Waldman i wsp. 2002; Peng i wsp., 2007).

Jesiotr bałtycki był jedynym gatunkiem z rodziny jesiotrowatych występującym w

Polsce. Od czasów ustąpienia ostatniego zlodowacenia, jesiotry mogły swobodnie migrować

w Bałtyku w górę rzek Odry i Wisły. Począwszy od średniowiecza, liczebność populacji

jesiotra zmniejszała się, jednak do XVIII wieku był to gatunek nadal licznie występujący w

Polsce. Miał bardzo duże znaczenie gospodarcze, przede wszystkim ze względu na kawior. W

wyniku nadmiernej eksploatacji, zabudowy hydrotechnicznej rzek oraz zanieczyszczenia wód

w połowie XX wieku doszło do całkowitego wymarcia tego gatunku na terenie całej Polski.

Ostatniego jesiotra złowiono w Wiśle w 1965 roku (Mamcarz, 2000). Podobnie wyglądała

sytuacja w innych krajach europejskich. W Niemczech ostatniego jesiotra złowiono w 1969

zaś w Bałtyku w roku 1996, u wybrzeży Estonii (Gessner i wsp., 2011). Uznaje się, że w

zlewni Morza Bałtyckiego populacje jesiotra wyginęły całkowicie. Spośród rodziny

jesiotrowatych, prawie wszystkie gatunki (szczególnie euroazjatyckie, w mniejszym stopniu

amerykańskie) są zagrożone wyginięciem (Peng i wsp., 2007). Większość z nich wpisano do

Czerwonej Księgi gatunków zagrożonych i są one chronione zgodnie z odpowiednimi

konwencjami (Kolman i wsp., 2011; Kirschbaum i wsp., 2011). W Polsce od 1932 jesiotr

objęty jest ochroną całkowitą (Witkowski i wsp.2009).

Do czasów nam współczesnych, w Europie zachował się jedynie tzw. jesiotr zachodni

(Acipenser sturio). Jest jednym z najbardziej zagrożonych gatunków ryb jesiotrowatych. Na

świecie występuje tylko liczebnie niewielka populacja tego gatunku w rzece Garonnie we

Francji (Kirchbaum i wsp., 2011). Historycznie, gatunek ten występował we wschodniej

części Oceanu Atlantyckiego, od morza Bałtyckiego aż po wybrzeże Morza Śródziemnego.

Po drugiej stronie Oceanu Atlantyckiego występuje jesiotr amerykański (Acipenser

oxyrinchus), tzw. jesiotr ostronosy. Jego populacje zajmują zachodnie wybrzeże Ameryki

Północnej, od rzeki St. John w Kanadzie aż po Zatokę Meksykańską na południu. Znane są

dwa jego podgatunki: A. o. oxyrinchus i A. o. desotoi. Mimo faktu, że gatunki te rozdzieliły

się około 58 mln. lat temu (Peng i wsp., 2007), pozostały morfologicznie, genetycznie

i cytologicznie bardzo podobne do siebie (Fontana i wsp., 2008 i cytowania tam zawarte). W

rejonach współwystępowania stwierdzono obecność hybryd pomiędzy oboma gatunkami

(Tidemann i wsp., 2007; Chassaing i wsp., 2013).


20

Do niedawna nie było jednoznacznej odpowiedzi, który z dwóch gatunków, jesiotr

zachodni, A. sturio, czy też ostronosy A. o. oxyrinchus, zasiedlał w przeszłości dorzecza

Wisły i Odry. W roku 2002 opublikowano pierwsze wyniki badań genetycznych szczątków

kopalnych jesiotrów datowanych na okres średniowiecza z terenów otaczających

Bałtyk (Ludwig i wsp., 2002). Badania te wykazały, że wody Morza Bałtyckiego

zamieszkiwał jesiotr ostronosy A. o. oxyrinchus. Były to badania oparte na analizie sekwencji

pętli D mtDNA oraz sekwencji flankujących mikrosatelitarny DNA (msDNA). Według

autorów cytowanej pracy, obniżenie temperatury wód w okresie tzw. Małej Epoki

Lodowcowej (pomiędzy XIV a XVIII wiekiem), umożliwiło kolonizację Bałtyku przez

jesiotra ostronosego, który zasiedlił wolną niszę po ustępującym jesiotrze zachodnim. Jesiotr

zachodni, odbywający tarło w wodzie o temperaturze powyżej 20 oC, przetrwał do dziś tylko

w południowej Europie (Ludwig i wsp., 2002; 2008).

W roku 1988 w Polsce rozpoczęto program restytucji jesiotra (Kolman i wsp.,

2011). Postanowiono wykorzystać jako materiał zarybieniowy jesiotry z rzeki St John w

Kanadzie. Stało się zasadnym sprawdzenie, czy do czasu wyginięcia jesiotrów w Polsce

jesiotr ostronosy był, podobnie jak w Niemczech, gatunkiem dominującym. Należało też

porównać pod względem zakresu polimorfizmu genetycznego naturalną populację z rzeki

St John z tą, która niegdyś występowała w rzekach Polski i ustalić, na ile gwarantuje ona

powodzenie projektu restytucji. Wyniki badań zostały przedstawione w trzech publikacjach

wchodzących w skład osiągnięcia naukowego:

1. Stanković A., 2011. The Past and Future of Sturgeons in Poland: The Genetic Approach. W: Williot P., Rochard E., Desse-Berset N., Kirschbaum F., Gessner J., (eds): Biology and Conservation of the European Sturgeon Acipenser sturio L. 1758. Springer, Berlin, 561-572. 2. Popovic D., Panagiotopoulou H., Baca M., Stefaniak K., Mackiewicz P., Makowiecki D., King TL., Gruchota J., Weglenski P., Stankovic A., 2014. The history of sturgeon in the Baltic Sea. Journal of Biogeography, 41(8), 1590-1602.

3. Panagiotopoulou H., Baca M., Popovic D., Weglenski P., Stankovic A., 2014. A PCR-RFLP based test for distinguishing European and Atlantic sturgeons. Journal of Applied Ichthyology, 30(1), 14-17.

W pierwszej z wyżej wymienionych publikacji przedstawiono wyniki analiz sekwencji

mtDNA (pętli D i sekwencji kodującej część cytochromu b), które miały na celu ustalenie,


21

jaki gatunek jesiotra zamieszkiwał w przeszłości rzeki w Polsce. Analizą objęto materiał

antyczny i archiwalny (tarczki kostne), datowany na okres od III - I w. p.n.e., poprzez

wczesne średniowiecze aż po wiek XX. Spośród 98 zbadanych osobników tylko jeden,

datowany na wiek XIV, okazał się byś jesiotrem zachodnim/europejskim (A. sturio).

Wszystkie pozostałe należały do gatunku jesiotr ostronosy (A. o. oxyrinchus). Nie można

więc zatem mieć wątpliwości, że do polskich rzek powinien być wprowadzony jesiotr

ostronosy. Okazało się przy tym, że hipotezy o zasiedleniu Bałtyku przez jesiotra ostronosego

dopiero podczas małej epoki lodowcowej (Ludwig i wsp., 2002; 2008) nie są prawdziwe,

ponieważ najstarsze z analizowanych prób wskazują na obecność tego gatunku już w III - I w.

p.n.e.

Aby ustalić czy wybór populacji jesiotra ostronosego z rzek kanadyjskich był

prawidłowy, przeprowadzono analizy fragmentów mtDNA, a także siedmiu markerów

mikrosatelitarnych, dla osobników reprezentujących populacje z rzek St John, St Lawrence

i Hudson. Obliczono dystans genetyczny pomiędzy tymi populacjami a dwoma populacjami

antycznymi z Polski, datowanymi na III wiek p.n.e. i IX – XIII wiek n.e. Do analiz włączono

też populacje A. o. desotoi z rzeki Choctawatchee (USA) oraz A. sturio z rzeki Garonny

(Francja). Okazało się, że populacja z rzeki St John jest najbliższą genetycznie do wymarłych

populacji z terenu Polski. Zgodnie z oczekiwaniami, najbardziej odległymi od siebie były

populacje A. o. desotoi i A. sturio.

W drugiej z wymienionych wyżej prac przedstawiono wyniki analiz struktury

genetycznej antycznych i współczesnych populacji jesiotra, wykorzystując znacznie

rozszerzony materiał badawczy. Stwierdzono, że populacje wymarłe (określane jako „Ancient

Roman” i „Medieval”) charakteryzowały się wysokim polimorfizmem genetycznym,

wyższym niż obserwowany we współczesnych populacjach Północnoamerykańskich.

Oceniono, że populacje współczesne z rzek St John i St Lawrence zachowały wystarczające

bogactwo alleliczne, by mogły stać się źródłem do pozyskania tarlaków dla celów restytucji

jesiotra w Polsce.

Przeprowadzono również analizy mające wykazać stopień introgresji pomiędzy

gatunkami A. sturio i A. o. oxyrinchus. Wykazano, że wymarłe populacje A. o. oxyrinchus z

Polski posiadały ok. 11% gatunkowo-specyficznych dla A. sturio alleli, zaś 40% osobników

co najmniej jeden allel charakterystyczny dla tego gatunku. Wskazuje to na hybrydyzację tych

dwóch gatunków w przeszłości. Jednakże stwierdzona introgresja musiała zajść wcześnie,


22

prawdopodobnie jeszcze przed zasiedleniem Bałtyku, gdyż żaden ze zbadanych osobników

nie był hybrydą pierwszego pokolenia. Nie stwierdzono również obecności czystych

gatunkowo osobników należących do A. sturio.

Wykorzystując modelowanie matematyczne metodą bayesowską (ABC), obliczono

prawdopodobny czas kolonizacji Bałtyku przez jesiotra ostronosego z Ameryki Północnej.

W zależności od przyjętych założeń (liczebność i pochodzenie grupy założycielskiej) czas

kolonizacji Bałtyku oszacowano na 3 do 6 tysięcy lat.

Wynik ten, podobnie jak inne omówione wyżej dane, jednoznacznie wskazują na dużo

wcześniejszy okres zasiedlenia Bałtyku przez jesiotra ostronosego niż ten, który

zaproponowany został przez Ludwig’a i wsp. (2002, 2008). W oparciu o dane literaturowe

wskazujące na to, że jesiotr ostronosy pojawił się w Europie Zachodniej, co najmniej 5 000

lat temu (Chassaing i wsp., 2013) oraz na istnienie introgresji pomiędzy jesiotrem ostronosym

i zachodnim, hipoteza o dwu-stopniowej kolonizacji Bałtyku (1: Europa Zachodnia, 2:

Bałtyk) przez jesiotra ostronosego, wydaje się bardzo prawdopodobna.

Wyniki uzyskane w omówionych wyżej pracach dostarczyły dobrych podstaw

teoretycznych do prowadzonych w Polsce, Niemczech i Francji prac nad restytucją jesiotra

(Willot i wsp., 2007; Gessner i wsp., 2011; Kolman i wsp., 2011). W Polsce w okresie

pomiędzy latami 2006 - 2008 wypuszczono do rzek ponad 200 tys. szt. narybku jesiotra

ostronosego pochodzącego z rzeki St. John z Kanady. Z kolei we Francji, w okresie 1995-

2009 wypuszczono do Garonny 139 tys. szt. narybku jesiotra zachodniego (A. sturio).

Intensywne zarybiania mogą doprowadzić w przyszłości do koegzystencji tych dwóch

gatunków w Atlantyku i Morzu Północnym. Mimo, że jesiotry wykazują silny

„homing”, znany jest fakt, iż cześć ryb nie wraca do macierzystych rzek (Kirschbaum i wsp.,

2011).

Wszelkie projekty zarybieniowe powinny być monitorowane przez cały okres ich trwania.

W przypadku jesiotrów przydatną powinna stać się metoda łatwego rozróżniania osobników

dwóch gatunków A. sturio i A. o. oxyrinchus. Metodę taką opracowano i jest ona

przedstawiona w trzeciej z wymienionych wyżej prac dotyczących jesiotrów i zaliczonych do

niniejszego osiągnięcia naukowego. Metoda ta (test PCR-RFLP) polega na amplifikacji

dwuniciowego fragmentu cyt b mtDNA o długości 884 nukleotydów i trawieniu go za

pomocą dwóch enzymów restrykcyjnych, BtsI i BsrDI. Rozdział produktów trawienia w żelu

agarozowym pozwala na uzyskanie łatwego do interpretacji obrazu, umożliwiającego


23

ustalenie bez najmniejszych wątpliwości, czy badany materiał genetyczny pochodzi od

jednego, czy też drugiego gatunku jesiotra. Opracowany test jest łatwy i prosty w porównaniu

z testami proponowanymi przez innych autorów (Wolf i wsp.,1999; Chassaing i wsp., 2013)

i z pewnością będzie wykorzystany przez ośrodki monitorujące przebieg zarybień

jesiotrowych. W omawianej pracy podkreślono też, że w celu rozróżnienia ewentualnych

mieszańców pomiędzy A. o. oxyrinchus a A. sturio, konieczne jest wykonanie dodatkowego

testu, opartego o analizę mikrosatelitarnego, jądrowego DNA.

2. Filogenetyka i filogeografia jelenia szlachetnego i niedźwiedzia jaskiniowego.

a) Jeleń szlachetny (Cervus elaphus)

Jeleń szlachetny jest jednym z najważniejszych zwierząt łownych o szerokim zasięgu w

Europie (Milner i wsp., 2006; Zachos i Hartl, 2011). Występuje w środowiskach o różnych

warunkach klimatycznych i ekologicznych, takich jak obszary leśne, tereny otwarte, np. łąki,

torfowiska, a także rejony górskie (Geist 1998; Dolan, 1988; Lister, 2004). Jest bardzo licznie

reprezentowany na stanowiskach archeologicznych na znacznym obszarze Europy (Sommer

i Nadachowski, 2006; Somer i wsp., 2008; Meiri i wsp., 2013). Jeleń jest odpowiednim

gatunkiem modelowym do badania procesów biogeograficznych ze względu na szereg jego

cech gatunkowych, takich jak występowanie na całej półkuli północnej w strefie ciepłej

i umiarkowanej, a także przemieszczanie się na duże odległości w odpowiedzi na zmiany

klimatyczne (Schmitt, 2007). Istotne jest również to, że współczesna filogenetyka

i filogeografia tego gatunku są bardzo dobrze poznane.

Badania filogeograficzne współczesnych populacji tego gatunku, pokazują, że istnieją

różne linie filogenetyczne jeleni, które mają ściśle określony zasięg geograficzny (Ludt

i wsp., 2004). Opisano dwie główne grupy genetyczne jeleni: wschodnie, do których należą

osobniki zamieszkujące Azję i Amerykę Północną oraz zachodnie, zasiedlające Europę, Bliski

Wschód oraz Afrykę (Polziehn i Strobeck, 2002; Ludt i wsp., 2004). Grupy te różnią się

morfologicznie, preferują różne środowiska, a także są przystosowane do innych warunków

klimatycznych (Geist, 1998). Szacowany przez różnych autorów wiek rozdzielenia się tych

grup wynosi od < 1 do 7 milionów lat temu (Polziehn i Strobeck, 2002; Ludt i wsp., 2004).

Jelenie z grupy zachodniej, zamieszkujące Europę, dzielą się na trzy grupy (A, B,

C) (Skog i wsp., 2009; Niedziałkowska i wsp., 2011), które prawdopodobnie wyewoluowały


24

w trzech różnych plejstoceńskich refugiach położonych w rejonie Morza Śródziemnego tj. na

Półwyspie Iberyjskim, Afryce lub Sardynii oraz na Półwyspie Bałkańskim. Linia

(haplogrupa) A, pochodząca z Półwyspu Iberyjskiego, po ustąpieniu lodowca zasiedliła

Europę zachodnią, centralną i północną, zasięg linii B jest ograniczony do Afryki Północnej

i Sardynii, natomiast haplogrupa C, o prawdopodobnie Bałkańskim pochodzeniu, zasiedla

wschodnią i południowo-wschodnią część kontynentu (Skog i wsp., 2009; Niedziałkowska

i wsp., 2011; 2012). Generalnie, ta historia ewolucji i postglacjalnej kolonizacji Europy

odzwierciedla model zmian zasięgu populacji jelenia w trakcie ostatniego zlodowacenia i po

jego ustąpieniu, który jest znany dla innych gatunków (Hewitt, 2000 i cytowania tam

zawarte).

Drastyczne zmiany klimatyczne, zachodzące podczas późnego plejstocenu (około

120 000 lat), a zwłaszcza ostatnich 70 000 lat miały decydujący wpływ na przetrwanie

i rozmieszczenie populacji wszystkich gatunków ssaków na półkuli północnej (Lister, 2004;

Hofreiter i Stewart, 2009). Przyjmuje się, że w czasie dwóch maksimów ostatniego

zlodowacenia, pierwszego, łagodniejszego, (74 000 – 60 000 lat temu) i drugiego, znacznie

ostrzejszego (25 000 – 18 000 lat temu), znanego jako Last Glacial Maximum (LGM),

eurazjatyckie populacje ssaków klimatu umiarkowanego przetrwały w refugiach

południowych (Hewitt, 2000; Sommer i Zachos, 2009). Jak wspomniano wyżej, były to

półwyspy Iberyjski i Apeniński oraz Bałkany. Według Sommera i Nadachowskiego (2006)

jako refugia dla jeleni Europy środkowej i wschodniej mogły służyć Karpaty i rejony morza

Czarnego oraz Kaspijskiego. Badania paleontologiczne oraz analizy kopalnego DNA jeleni

wskazują, że jeleń mógł przetrwać okres ostatniego zlodowacenia także poza opisanymi

dotychczas refugiami, a rozmieszczenie przestrzenne i zasięg opisanych współcześnie linii

genetycznych były zupełnie inne (Sommer i wsp., 2008).

Od lat przedmiotem dyskusji jest sprawa uznania Krymu za ważne refugium, może

nawet „pierwotne” dla Europy i Azji, z którego zwierzęta migrowały zarówno w kierunku

wschodnim (Azja Wschodnia) jak i zachodnim (Europa) (Sommer i Nadachowski, 2006;

Markowa, 2011). Szansę na uzyskanie odpowiedzi na powyższe pytania otworzyło odkrycie

w jaskini Emine-Bair-Khosar na Krymie szczątków C. elaphus. Jaskinia Emine-Bair-Khosar

znajduje się w północnej części masywu górskiego Chatyrdag na Krymie. Duża akumulacja

materiału paleontologicznego w jaskini Emine-Bair-Khosar spowodowana jest


25

prawdopodobnie tym, że wejście do jaskini, ze względu na ukształtowanie terenu,

funkcjonowało jak pułapka (Vremir i Ridush, 2005; Ridush i wsp., 2013).

Filogenetyce i filogeografii jelenia szlachetnego poświęcona jest jedna z prac

wchodzących w skład niniejszego osiągnięcia, w której przedstawiono wyniki analizy

materiałów z jaskini Emine-Bair Khosar:

4. Stankovic A., Doan K., Baca M., Mackiewicz P., Gromadka R., Socha P., Ridush B., Weglenski P., Nadachowski A., Stefaniak K., 2011. First ancient DNA sequences of the Late Pleistocene red deer (Cervus elaphus) from the Crimea, Ukraine. Quaternary International, 245(2), 262-267.

Gdy rozpoczynano badania przedstawione w tej pracy, istniała dość bogata literatura

dotycząca filogenetyki jelenia szlachetnego, oparta jedynie na klasycznych analizach

paleontologicznych i na danych uzyskanych z analiz DNA osobników współczesnych. Brak

było jakichkolwiek danych na temat haplotypów tego gatunku występujących w okresie

Późnego Plejstocenu, niezbędnych do prześledzenia historii i szlaków migracji tego gatunku.

W pracy Stankovic i wsp. (2011) opisano wyniki analizy trzech osobników jelenia

szlachetnego, datowanych na <49 000, 42 0000 i 31 100 lat. Są to pierwsze sekwencje aDNA

ustalone dla jelenia szlachetnego. Jeden z analizowanych osobników posiadał haplotyp

należący do grupy zachodniej jelenia (współcześnie występującej na Bałkanach) zaś pozostałe

dwa reprezentują haplotypy jeleni Sika, bliskich genetycznie do współcześnie występujących

jeleni w Chinach. Widać więc, że jelenie linii wschodnioazjatyckiej i zachodnioeuropejskiej

w okresie późnego plejstocenu zajmowały to samo terytorium. Uzyskane wyniki rzucają

nowe światło na pochodzenie jelenia szlachetnego w Europie i potwierdzają hipotezę uznania

Krymu, jako refugium funkcjonującego podczas ostatnich 100 000 lat nie tylko dla jeleni z

Europy Środkowej i Wschodniej, ale również ze Wschodniej Azji.

b) Niedźwiedź jaskiniowy (Ursus spelaeus, U. ingressus )

W przeciwieństwie do jelenia szlachetnego, niedźwiedź jaskiniowy jest gatunkiem,

który nie dotrwał do naszych czasów, niemniej prac nad jego filogenetyką i filogeografią jest

znacznie więcej niż prac poświęconych jeleniowi szlachetnemu. Pod nazwą „niedźwiedź

jaskiniowy” kryją się co najmniej trzy grupy niedźwiedzi, Ursus spelaeus, U. ingressus i

U. deningeri, które zdaniem jednych autorów mają status różnych gatunków (Rabeder 1995;

Hofreiter i wsp., 2002; Hofreiter i wsp., 2004a; Rabeder i Hofreiter, 2004; Hofreiter 2006;

Bocherens i wsp., 2011) podczas gdy inni uznają je za podgatunki jednego gatunku


26

(Baryshnikow i Puzarenko, 2011). Postuluje się, że wspólnym przodkiem zarówno

niedźwiedzia jaskiniowego, jak i niedźwiedzia brunatnego (U. arctos), był

U. deningeri (Rabeder i wsp., 2000; Rabeder i Hofreiter 2004), którego najstarsze szczątki w

Europie są datowane na około 600 000 lat (Rabeder i wsp., 2000). Genetyczne relacje

pomiędzy U. deningeri U. spelaeus i U. ingressus nie są jednak zbyt dobrze określone.

U. deningeri którego szczątki znaleziono w jaskini Kuraro 3 (Kaukaz), okazał się

reprezentować odrębną linię ewolucyjną niedźwiedzi, wyraźnie różniącą się od pozostałych

(Knapp i wsp. 2009). Dabney i wsp., (2013), stosując nową metodę izolacji DNA, uzyskali

i zsewencjonowali cały genom mitochondrialny U. deningeri ze stanowiska Sima de los

Heusos w Hiszpanii, datowanego na ponad 300 tysięcy lat. Analizy filogenetyczne wykazały,

że zajmuje on bazalną pozycje w stosunku do U. ingressus i U. spelaeus. Wydaje się jednak,

że bezpośredni przodek tych dwóch gatunków wywodzi się z innej Europejskiej populacji U.

deningeri (Dabney i wsp., 2013).

Wiadomo, że U. spelaeus pojawił się w Europie na początku ostatniego interglacjału

(Rabeder, 1995; Rabeder i wsp., 2000; Rabeder i Hofreiter, 2004) i ok. 28 tys. lat temu został

wyparty przez formę U. ingressus, (Hofreiter, 2007) która ostatecznie wyginęła ok. 25 000.

lat temu (Stiller i wsp. 2010; Műnzel i wsp., 2011).

Powody wyginięcia niedźwiedzi jaskiniowych nie są do końca ustalone. Niektórzy

autorzy uważają, że przyczyną wyginięcia były zmiany klimatu powodujące zmiany składu

gatunkowego roślinności, którą niedźwiedź się żywił (Hofreiter, 2006; Pacher i Stuart, 2008).

Stiller i wsp. (2014) opublikowali wyniki analizy sekwencji regionu kontrolnego mtDNA dla

142 niedźwiedzi jaskiniowych. Stwierdzili, że drastyczny spadek polimorfizmu genetycznego

populacji tego gatunku nastąpił około 30 000 lat temu, czyli na długo przed nadejściem

ostatniego zlodowacenia. Inni autorzy skłaniają się do uznania działań człowieka za bardziej

prawdopodobny powód wyginięcia niedźwiedzi, gdyż człowiek wypierał niedźwiedzie z

jaskiń, stanowiących ich naturalne schronienie i miejsce odchowu potomstwa (Lorenzen

i wsp., 2011; Műnzel i wsp., 2011; Sandom i wsp., 2014).

Powody dla których na dużych obszarach Europy U. spelaeus został zastąpiony przez

formę U. ingressus również nie są jasne. Wiadomo, że U. ingressus napływał do Europy

Zachodniej z Europy Południowo-Wschodniej. Według Radebedera i Hofreitera (2004)

migracja U. ingressus w kierunku zachodnim rozpoczęła się ok. 60 000 lat temu. Badania


27

aDNA wykazały obecność tej formy niedźwiedzi jaskiniowych na terenie Rumunii, Słowenii,

Austrii (50 000 lat temu) i w jaskiniach na Jurze Szwabskiej (30 000 lat temu).

Nie było dotychczas nic wiadomo o tym, która forma niedźwiedzia jaskiniowego i

kiedy, występowała na północ od łuku Karpat i w Sudetach. Uzyskanie informacji na ten

temat stało się szczególnie istotne po stwierdzeniu występowania niedźwiedzi jaskiniowych

na Syberii i na terenie Kaukazu (Knapp i wsp., 2009) i możliwości zasiedlania Europy przez

ten gatunek z kierunku wschodniego. Tym zagadnieniom poświęcone są dwie publikacje

spośród zaliczonych do osiągnięcia naukowego będącego podstawą do ubiegania się o

nadanie stopnia naukowego doktora habilitowanego:

5. Baca M., Stankovic A., Stefaniak K., Marciszak A., Hofreiter M., Nadachowski A., Weglenski P, Mackiewicz P., 2012. Genetic analysis of cave bear specimens from Niedźwiedzia Cave, Sudetes, Poland. Palaeontologia Electronica, 15(2):21A, 1-16.


ingressus in Sudetes. Quaternary International, vol. 339-340, pp. 217-223.

W pracach tych przedstawiono wyniki analiz aDNA 14 osobników należących do

siedmiu haplotypów niedźwiedzi jaskiniowych, których szczątki odkryto w Jaskini

Niedźwiedziej w Sudetach. Okazało się, że oprócz jednego osobnika niedźwiedzia

brunatnego, wszystkie pozostałe należały do U. ingressus. Analizy filogenetyczne wykazały,

że populacja U. ingressus zamieszkująca Jaskinię Niedźwiedzią była różna genetycznie od

pozostałych środkowoeuropejskich populacji tego gatunku. Wszystkie osobniki lokowały się

w jednej, odrębnej gałęzi drzewa filogenetycznego a także tworzyły odrębną grupę na sieci

haplotypów. Oznacza to, że populacja U. ingressus z Jaskini Niedźwiedziej była izolowana

od populacji zlokalizowanych po północnej stronie łuku Karpat. Datowania szczątków

przeprowadzone metodami torowo-uranową i radiowęglową wykazały, że najstarsze próby

mają ponad 80 000 lat a najmłodsze ok. 40 000 lat. Mamy, więc do czynienia z najstarszą

populacją U. ingressus spośród dotychczas badanych w Europie. Najstarsze znane szczątki

kopalne Ursus ingressus pochodzące z Alp datowane są na 47 300 lat (Bocherens i wsp.,

2011).

Pozostaje otwarta kwestia migracji i pochodzenia tego gatunku. Fakt, że

nie zidentyfikowano żadnego osobnika należącego do gatunku U. spelaeus sugeruje, że co


28

najmniej przez 40 000 lat w Sudetach występował jedynie U. ingressus. Biorąc pod uwagę

datowanie osobników U. ingressus z Jaskini Niedźwiedziej a także ich odmienność

genetyczną, można twierdzić, że gatunek ten pojawił się w Sudetach co najmniej 20 000 lat

wcześniej niż Alpach. Dane te wskazują na to, że kolonizacja Sudetów przez

U. ingressus nastąpiła znacznie wcześniej niż kolonizacja Alp i Jury Szwabskiej. Jest też

prawdopodobne, że migracja przebiegała wzdłuż łuku Karpat i Sudetów po północnej stronie

tych łańcuchów. Możliwe, że Karpaty stanowiły barierę dla migracji tego gatunku ponieważ

nie stwierdzono żadnego przepływu genów pomiędzy populacjami po obu stronach tego

pasma górskiego. Wydaje się też, że populacje U. ingressus przetrwały po północnej stronie

Karpat znacznie dłużej, niż te które były zlokalizowane w Alpach. Świadczy o tym wykrycie

w Polsce szczątków niedźwiedzi datowanych na 26 000 i 31 000 lat (Nadachowski i wsp.,

2010).


29

Bibliografia

Adler C.J., Haak W., Donlon D., Cooper A. 2011. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science, 38(5):956-964.

Austin J.J., Ross A.J., Smith A.B., Fortey R.A., Thomas R.H. 1997. Problems of reproducibility-does geologically ancient DNA survive in amber-preserved insects? Proceedings. Biological Sciences, 264(1381):467-474.

Avise, J. C. 2004. Molecular Markers, Natural History, and Evolution. 2nd ed. Chapter 11. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.

Bandelt H.J., Forster P., Röhl, A. 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution, 16:37-48.

Barnosky A.D., Koch P.L., Feranec R.S., Wing S. L., Shabel A.B. 2004. Assessing the causes of Late Pleistocene extinctions on the continents. Science, 306:70-75.

Barnes I., Shapiro B., Lister A., Kuznetsova T., Sher A., Guthrie D., Thomas M.G. 2007. Genetic structure and extinction of the woolly mammoth, Mammoths Primigenius. Current Biology, 7:1072-1075.

Baryshnikov G.F., A.Y. 2011. Craniometrical variability in the cave bears (Carnivora, Ursidae): Multivariate comparative analysis. Quaternary International, 245:350-368.

Beaumont M.A., Zhang, W.Y., Balding D.J. 2002. Approximate Bayesian computation in population genetics. Genetics, 162: 2025-2035.

Blum M.G.B., Jakobsson M. 2011. Deep divergences of human gene trees and models of human origins. Molecular Biology and Evolution, 28(2):889-898.

Bocherens H., Stiller M., Hobson K.A., Pacher M., Rabeder G., Burns J.A., Tütken T., Hofreiter M. 2011. Niche partitioning between two sympatric genetically distinct cave bears (Ursus spelaeus and Ursus ingressus) and brown bear (Ursus arctos) from Austria: isotopic evidence from fossil bones. Quaternary International, 245:238-248.

Bon C., Berthonaud V., Maksud F., Labadie K., Poulain J., Artiguenave F., Wincker P., Aury J.M., Elalouf J.M. 2012. Coprolites as a source of information on the genome and diet of the cave hyena. Proceedings of the Royal Society B: Biological Science, 279(1739), 2825-2830.

Bos K.I., Schuenemann V.J., Golding G.B., Burbano H.A., Waglechner N., Coombes B.K., McPhee J.B., Sharon N. DeWitte S.N., Meyer M. et al. 2011.A draft genome of Yersinia

pestis from victims of the Black Death. Nature, 478, 506-10.

Cann R.L, Stoneking M., Wilson A.C. 1987. Mitochondrial DNA and Human Evolution. Nature, 325:31-36.

Cano R.J., Poinar H.N., Pieniezak N.S., Poinar J.G.O. 1993. Enzymatic amplification and nucleotide sequencing of DNA from 120–135 million year old weevil. Nature, 363:536-538.


30

Cavalli-Sforza L.L., Feldman M.W. 2003. The Application of Molecular Genetic Approaches to the Study of Human Evolution. Nature, 33:266-275.

Carpenter ML, Buenrostro J.D., Valdiosera C., Schroeder H., Morten E., Allentoft M.E., Sikora M, Rasmussen M, Gravel S., Guille´n, S. et al. 2013. Pulling out the 1%: whole-genome capture for the targeted enrichment of ancient DNA sequencing libraries. American Journal of Human Genetics. 93, 852-864.

Chassaing O., Desse-Berset N., Duffraisse M., Hughes S., Hänni C., Berrebi P. 2013. Palaeogenetics of western French sturgeons spotlights the relationships between Acipenser

sturio and Acipenser oxyrinchus. Journal of Biogeography, 40:382-393.

Collins F.S., Morgan M., Patrinos A. 2003. The Human Genome Project: lessons from large-scale biology Science, (300) 5617:286-290.

Cooper A., Lalueza-Fox C., Anderson S., Rambaut A., Austin J., Ward R. 2001. Complete mitochondrial genome sequences of two extinct moas clarify ratite evolution Nature, 409: 704-706.

Cornuet J.M., Santos F., Beaumont M.A., Robert C.P., Marin J.M., Balding, D.J., Guillemaud T., Estoup A. 2008. Inferring population history with DIY ABC: a user-friendly approach to approximate Bayesian computation. Bioinformatics, 24:2713-2719.

Dabney J., Knapp M., Glocke I., Gansauge M.T., Weihmann A., Nickel B., Valdiosera C., García N., Pääbo S., Arsuaga J.L., et al. 2013. Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments. Preceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 110:15758-15763.

Dolan J.M. 1988. A Deer of Many Lands: A Guide to the Subspecies of the Red Deer, Cervus

elaphus L. Zoonooz, 62 (10): 4-34.

Endicott P., Ho S.Y.W., and Stringer C. 2010. Using genetic evidence to evaluate four palaeoanthropological hypotheses for the timing of Neanderthal and modern human origins. Journal of Human Evolution, 59(1):87-95.

Excoffier L., and Lischer H.E.L. 2010. Arlequin suite ver. 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10:564-567.

Fontana F., Lanfredi M., Kirschbaum F., Garrido-Ramos M. A., Robles F., Forlani A., Congiu, L. 2008. Comparison of karyotypes of Acipenser oxyrinchus and A. sturio by chromosome banding and fluorescent in situ hybridization. Genetica, 132:281-286.

Gansauge M.T., Meyer M. 2013. Single-stranded DNA library preparation for the sequencing of ancient or damaged DNA. Nature Protocols 8, 737-748.

Gilbert M.T., Binladen J., Miller W., Wiuf C., Willerslev E., Poinar H., Carlson J.E., Leebens-Mack J.H., Schuster S.C. 2007. Recharacterization of ancient DNA miscoding lesions: insights in the era of sequencing-by-synthesis. Nucleic Acids Research, 35(1):1-10.


31

Gilbert M.T.P., Drautz D.I., Lesk A.M., Ho S.Y.W., Qi J., Ratan A., Hsu C.H., Sher A., Dalén L., Götherström A., et al. 2008. Intraspecific phylogenetic analysis of Siberian woolly mammoths using complete mitochondrial genomes. Preceedings of the National Academy of Science USA, 105(24):8327-8332.

Ginolhac A., Rasmussen M., Gilbert M.T.P., Willerslev E., Orlando L. 2012. mapDamage: testing for damage patterns in ancient DNA sequences. Bioinformatics, 27:2153-2155.

Geist V. 1998. Deer of the world: their evolution, behaviour and ecology Stackpole Books.

Gessner J., Tautenhahn M., Spratte S., Arndt G.-M., von Nordheim H. 2011. Development of a German Action Plan for the restoration of the European sturgeon Acipenser

sturio L. – implementing international commitments on a national scale. Journal of Applied Ichthyology, 27:192-198.

Goodman S.J. 1997. RST Calc: a collection of computer programs for calculating estimates of genetic differentiation from microsatellite data and determining their significance. Molecular Ecology, 6:881-885.

Goudet J. 2002. FSTAT version 2.9.3.2. Université de Lausanne, Lausanne, Switzerland.URL: http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm.

Green R.E., Krause J., Briggs A.W., Maricic T., Stenzel U., Kircher M., Patterson N., Li H., Zhai W., Fritz M.H., et. al. 2010. A draft sequence of the Neandertal genome. Science, 328 (5979): 710-722.

Guindon S., Dufayard J. F., Lefort V., Anisimova M., Hordijk W., Gascuel O. 2010. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Systematic Biology, 59:307-21.

Hall T.A. 1999. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleid Acids Symposium Series, 41:95-98.

Haddrath O., Baker A.J. 2001. Complete mitochondrial DNA geonome sequences of extinct birds: ratite phylogenetics and the vicariance biogeography hypothesis. Proceeding the Royal Society, 268:939-945.

Hayden E.C. 2014. The $ 1, 000 genome. Nature, 507:29-295

Hewitt G. 2000. The genetic legacy of the Quaternary ice ages. Nature, 405:907-913.

Hewitt G. 2004. Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences, 359:183-195.

Higuchi R., Bowman B., Freiberger M., Ryder O.A., Wilson A.C. 1984. DNA sequences from the quagga, an extinct member of the horse family. Nature, 312:282-284.

Ho S.Y., Gilbert M.T. 2010. Ancient mitogenomics. Mitochondrion, 10:1-11.


32

Hofreiter M., Serre D., Poinar H.N., Kuch M., Pääbo S. 2001. Ancient DNA. Nature reviews genetics, 2(5):353-359.

Hofreiter M., Capelli C., Krings M., Waits L., Conard N., Munzel S., Rabader G., Nanel D., Paunovic M., Jambresic G., et. al. 2002. Ancient DNA analyses reveal high mitochondrial DNA sequence diversity and parallel morphological evolution of late Pleistocene cave bears. Molecular Biology and Evolution, 19:1244-1250.

Hofreiter M., Rabeder G., Jaenicke-Despre´s V., Withalm G., Nagel D., Paunovic M., Jambresic G., Pääbo S. 2004a. Evidence for reproductive isolation between cave bear populations. Current Biology, 14:40-43.

Hofreiter M., Serre D., Rohland N., Rabeder G., Nagel D., Conard N., Münzel S., Pääbo S. 2004b. Lack of phylogeography in European mammals before the last glaciations. Preceedings of the National Academy of Science, 101(35):12963-12968.

Hofreiter M. 2006. Progress in ancient DNA analysis from cave bears. Abstract Book 12th International Cave Bear Symposium, Aridea, Macedonia, Greece, 2-5 November p. 25.

Hofreiter M., Münzel S., Conard N.J., Pollack J., Slatkin M., Weiss G., Pääbo S. 2007. Sudden replacement of cave bear mitochondrial DNA in the late Pleistocene. Current Biology, 17(4), R122-123.

Hofreiter M., Stewart J. 2009. Ecological change, range fluctuations and population dynamics during the Pleistocene. Current Biology, 19(14):R584-594.

Hofreiter M., Collins M., Stewart J.R. 2012. Ancient biomolecules in Quaternary paleoecology. Quaternary Science Review, 33:1-13.

Hofreiter M., Paijmans J.L., Goodchild H., Camilla F., Speller C.F., Barlow A., Fortes G.G., Jessica A., Thomas J.A., Ludwig A Matthew J. Collins M.J. 2014.The future of ancient DNA: Technical advances and conceptual shifts. Bioessays, 36 DOI:10.1002/bies.201400160.

Huerta-Sanchez E., Xin J., Bianba AZ., Peter BM., Vinckenosch N., Liang Y., Yi X., He M., Somel M., Ni P., et al. 2014. Altitude adaptation in Tibetans caused by introgression of Denisovan-like DNA. Nature, 512 (2014):194–197.

Kirschbaum F., Williot P., Fredrich F., Tiedemann R., Gessner J. 2011. Restoration of the European sturgeon Acipenser sturio in Germany. In: Biology and conservation of the European sturgeon Acipenser sturio L. 1758. The reunion of the European and Atlantic Sturgeons. P. Williot, E. Rochard, N. Desse-Berset, F. Kirschbaum and J. Gessner (Eds). Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 309-333.

Knapp M., Rohland N., Weinstock J., Baryshnikov G., Sher A., Nagel D., Rabeder G., Pinhasi R., Schmidt H.A., Hofreiter M. 2009. First DNA sequences from Asian cave bear fossils reveal deep divergences and complex phylogeographic patterns. Molecular ecology, 18:1225-1238.

Knapp M., Hofrreiter M. 2010. Next Generation Sequencing of Ancient DNA Requirements, Strategies and Perspectives. Genes, 1:227-243.


33

Kolman R., Kapusta A., Duda A., Wiszniewski G. 2011. Review of the current status of the Atlantic sturgeon Acipenser oxyrinchus oxyrinchus Mitchill 1815, in Poland: principles, previous experience, and results. Journal of Applied Ichthyology, 27:186-191.

Krause J., Fu Q., Good J.M., Viola B., Shunkov M.V., Derevianko A.P., Pääbo S. 2010. The Complete Mitochondrial DNA Genome of an Unknown Hominin from Southern Siberia. Nature, 464:894-897.

Lartillot N, Lepage T, and Blanquart S. 2009. PhyloBayes 3: a Bayesian software package for phylogenetic reconstruction and molecular dating. Bioinformatics, 25:2286-2288.

Lister A.M. 2004. The impact of Quaternary Ice Ages on mammalian evolution. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences, 359:221-241.

Leonard J.A., Vilà C., Fox-Dobbs K., Koch P.L., Wayne R.K., Van Valkenburgh B. 2007. Megafaunal extinctions and the disappearance of a specialized wolf morph. Current Biology, 17:1146-1150.

Leonard J.A. 2008. Ancient DNA applications for Wild life conservation. Molecular Ecology, 17:4186-4196.

Lorenzen E.D., Nogues-Bravo D., Orlando L., et al. (55 co-authors). 2011. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature, 479:359-364.

Ludt C.J., Schroeder W., Rottmann O., Kuehn R. 2004. Mitochondrial DNA phylogeography of red deer (Cervus elaphus). Molecular Phylogenetics and Evolution, 31:1064-1083.

Ludwig A., Debus L., Lieckfeldt D., Wirgin I., Benecke N., Jenneckens I., Williot P., Waldman J.R., Pitra C. 2002. Fish populations: when the American sea sturgeon swam east. Nature, 419:447-448.

Ludwig A., Arndt U., Lippold S., Benecke N., Debus L., King T.L., Matsumura S. 2008. Tracing the first steps of American sturgeon pioneers in Europe. BMC Evolutionary Biology, 8,221.

Mamcarz A. 2000. Decline of the Atlantic sturgeon Acipenser sturio L., 1758 in Poland: An outline of problems and prospects. Boletin Instituto Espanol de Oceanografia, 16:191-202.

Markova A.K. 2011. Small mammals from the Paleolithic sites of Crimea. Quaternary International, 231:22-27.

Martin L.D., Stephenson R.O., Storer J., Tedford R., Zimov S., Cooper A. 2004. Rise and Fall of the Beringian Steppe Bison. Science, 306:1561-1565.

Metzker M.L. 2010. Sequencing technologies - the next generation. Nature Reviews Genetics, 11(1):31-46.

Meyer M., and Kircher M. 2010. Illumina Sequencing Library Preparation for Highly Multiplexed Target Capture and Sequencing. Cold Spring Harb Protoc 2010. pdb prot 5448.


34

Meyer M., Kircher M., Gansauge M.T., Li H., Racimo F., Mallick S., Schraiber J.G., Jay F., Prüfer K., de Filippo C., et al. 2012. A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science, 338:222-226.

Meyer M., Fu Q., Aximu-Petri A., Glocke I., Nickel B., Arsuaga J.L., Martínez I., Gracia A., Bermúdez de Castro J.M., Carbonell E. 2014. A Mitochondrial genome sequence of a hominin from Sima de los Huesos. Nature, 505:403-406.

Millar C.D., Huynen L., Subramanian S., Mohandesan E., Lambert D.M. 2008. New developments in ancient genomics. Trends in Ecology and Evolution, 23:386-393.

Millar C.D., Lambert D.M. 2013 Ancient DNA: towards a million-year-old genome. Nature, 499, 34-35.

Miller W., Drautz D.I., Ratan A., Pusey B., Qi J., Lesk A.M., Tomsho L.P., Packard M.D., Zhao F., Sher A., et al. 2008. Sequencing the nuclear genome of the extinct woolly mammoth. Nature, 456:387-390.

Milner J.M., Bonenfant C., Mysterud A., Gallard J., Csányi S., Stenseth N.C. 2006. Temporal and spatial development of red deer harvesting in Europe: biological and cultural factors. Journal of Applied Ecology, 43:721-734.

Meiri M., Lister A.M., Higham T.F., Stewart J.R., Straus L.G., Obermaier H., González Morales M.R., Marín-Arroyo A.B., Barnes I. 2013. Late-glacial recolonization and phylogeography of European red deer (Cervus elaphus L.). Molecular Ecology, 22:4711-4722.

Molak M., Ho S.Y. 2011. Evaluating the impact of post-mortem damage in ancient DNA: a theoretical approach. Journal of Molecular Evolution, 73(3-4):244-255.

Münzel S.C., Conard N.J. 2004. Cave bear hunting in Hohle Fels Cave in the Ach Valley of the Swabian Jura. Revue de Paléobiologie, 23:877-885.

Münzel S.C., Stiller M., Hofreiter M., Mittnik A., Conard N.J., Bocherens H. 2011. Pleistocene bears in the Swabian Jura (Germany): Genetic replacement, ecological displacement, extinctions and survival. Quaternary International, 245:225-237.

Nadachowski A., Lipecki G., Stefaniak K., Wojtal P. 2010. Radiocarbon dates on cave bear (Ursus spelaeus) from Late Pleistocene of Poland. (In:) Bocherens H. & Pacher M. (eds.) SSP-4.4 – Late Quaternary mammal ecology: insight from new approaches (direct dating, stable isotopes, DNA). European Geosciences Union, General Assembly 2010, Vienna, Austria, 02-07 May, 2010, s. 24.

Niedzialkowska M., Jedrzejewska B., Honnen A.-C., Otto T., Sidorovich V.E., Perzanowski K., Skog A., Hartl G.B., Borowik T., Bunevich A.N., et al. 2011. Molecular biogeography of red deer Cervus elaphus from eastern Europe: insights from mitochondrial DNA sequences. Acta Theriologica, 56:1-12.


35

Niedziałkowska M., Jędrzejewska B., Wójcik J.M., Goodman S.J. 2012. Genetic structure of red deer population in northeastern Poland in relation to the history of human interventions. The Journal of Wildlife Management, 76:1264-1276.

Orlando L., Ginolhac A., Raghavan M., Vilstrup J., Rasmussen M., Magnussen K.,

Steinmann K.E., Kapranov P., Thompson J.F., Zazula G. 2011. True single-molecule D NA sequencing of a Pleistocene horse bone. Genome Research, 21 (10):1705-1719.

Orlando L., Ginolhac A., Zhang G., Froese D., Albrechtsen A., Stiller M., Schubert M., Cappellini E., Petersen B., Moltke I., et al. 2013. Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse. Nature, 499:74-78.

Paijmans J.L., Gilbert M.T., and Hofreiter M. 2013. Mitogenomic analyses from ancient DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution, 69 (2):404-16.

Pacher M., Stuart, A.J. 2008. Extinction chronology and palaeobiology of the cave bear (Ursus spelaeus). Boreas, 38:189-206.

Pääbo S. 1985. Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA. Nature, 314:644–645.

Pääbo S. 1989a. Ancient DNA: Extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(6):1939-1943.

Pääbo S., Higuchi R.G., Wilson A.C. 1989b. Ancient DNA and the Polymerase Chain Reaction. The Journal of Biological Chemistry, 264(17):9709-9712.

Pääbo S., Poinar H., Serre D., Jaenicke-Despres V., Hebler J., Rohland N., Kuch M., Krause J., Vigilant L., Hofreiter M. 2004. Genetic analyses from ancient DNA. Annual Review of Genetics, 38:645-679.

Peakall R., Smouse P.E. 2006. genalex 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 6: 288-295.

Peng Z.G., Ludwig A., Wang D.Q., Wang D., Diogo R., Wei Q., He S. 2007. Age and biogeography of major clades in sturgeons and paddlefishes (Pises:Acipenseriformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 42:854-862.

Poinar H.N., Höss M., Bada J.L., Pääbo S. 1996. Amino acid racemization and the preservation of ancient DNA. Science, 272:864-866.

Polziehn R.O., Strobeck C. 2002. A phylogenetic comparison of red deer and wapiti using mitochondrial DNA. Molecular phylogenetics and Evolution, 22:342-356.

Posada D. 2008. jModelTest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology and Evolution 25:1253-1256.

Pritchard J. K., Stephens M. and Donnelly P. 2000. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 155:945-959.


36

Provan J., Bennett K. D. 2008. Phylogeographic insights into cryptic glacial refugia. Trends in ecology and evolution, 23(10): 564-571.

Pruvost M., Schwarz R., Correia V.B., Champlot S., Braguier S., Morel N., Fernandez-Jalvo Y., Grange T., Geigl E.M. 2006. Freshly excavated fossil bones are best for amplification of ancient DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of U.S.A. 104 (3):739-744.

Prüfer K. et al. 2013. "The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai Mountains". Nature, 505 (7481): 43-49.

Rabeder G. 1995. Evolutionsniveau und Chronologie der Höhlenbären aus der Gamsulzen-Höhle im Toten Gebirge (Oberösterreich). Mitteilungen der Kommission für Quartärforschung Österreichische Akademie der Wissenschaften, 9:69-81.

Rabeder G., Nagel D., Pacher M. 2000. Der Höhlenbär. Jan Thorbecke Verlag, Stuttgart.

Rabeder G., Hofreiter M. 2004. Der neue Stammbaum der Höhlenbären. Die Höhle 55:1-19.

Rasmussen M., Guo X., Wang Y., Lohmueller K.E., Rasmussen S., Albrechtsen A., Skotte L., Lindgreen S., Metspalu M., Jombart T., et al. 2011. An Aboriginal Australian genome reveals separate human dispersals into Asia. Science, 334(6052): 94-98.

Raymond M., Rousset F. 1995. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity, 86:248-249.

Rawlence N.J., Lowe D.J., Wood J.R., Young J.M., Churchman G.J., Huang Y.-T. Cooper A. 2014. Using palaeoenvironmental DNA to reconstruct past environments: progress and prospects. Journal of Quaternary Science, 29 (7):610-626.

Reich D., Green R.E., Kircher M., Krause J., Patterson N., Durand E.Y., Viola B., Briggs A.W., Stenzel U., Johnson P.L., et.al. 2010. Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia. Nature, 468:1053-1060.

Ridush B., Stefaniak K., Socha P., Proskurnyak Y., Marciszak A., Vremir M., Nadachowski A. 2013. Emine-Bair-Khosar Cave in the Crimea, a huge bone accumulation of Late Pleistocene fauna. Quaternary International, 284:151-160.

Reich D., Green R.E., Kircher M., Krause J., Patterson N., Durand E.Y., Viola B., Briggs A.W., Stenzel U., Johnson P.L., et. al. 2010. Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia. Nature, 468:1053-1060.

Rohland N., Pollack J.L., Nagel D., Beauval C.É., Airvaux J., Pääbo S., Hofreiter M. 2005. The population history of extant and extinct hyenas. Molecular Biology and Evolution, 22:2435-2443.

Rohland N., M., Hofreiter M. 2007. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques, 42:343-352.


37

Ronquist F., Huelsenbeck J.P. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics, 19:1572-1574.

Sandom C., Faurby S., Sandel B., Svenning, J.C. 2014. Global late Quaternary megafauna extinctions linked to humans, not climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 281, 20133254.

Sanger F., Nicklen, S., Coulson R. 1977. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467.

Sarkissian C.D., Allentoft M.E., Avila-Arcos M.C., Barnett R., Campos P.F. ,Cappellini E., Ermini L., Fernandez R., da Fonseca R, Ginolhac A., et al. 2014. Ancient genomics. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 370: 20130387.

Sawyer S., Krause J., Guschanski K., Savolainen V., Pääbo S. 2012. Temporal Patterns of Nucleotide Misincorporations and DNA Fragmentation in Ancient DNA. PLoS ONE, 7(3): e34131.

Schmitt T. 2007. Molecular biogeography of Europe: Pleistocene cycles and postglacial trends. Frontiers in Zoology, 4:1-13.

Seguin-Orlando A., Korneliussen T. S., Sikora M., Malaspinas A-S., Manica A., Moltke I., Albrechtsen A., Ko A., Margaryan A., Moiseyev et al. 2014. Genomic structure in Europeans dating back at least 36,200 years. Science, 346:1113-1118.

Shapiro B., Drummond A.J., Rambaut A., Wilson M.C., Matheus P.E., Sher A.V., Pybus O.G., Gilbert M.T.P., Barnes I., Binladen J., et al. 2004. Rise and fall of the Beringian steppe bison. Science, 306:1561-1565.

Shapiro B., Hofreiter M. (eds.) 2012. Ancient DNA: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, 840, Springer Protocols. Humana Press.

Shapiro B., Hofreter M. 2014. A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA. Science, 343:61-69.

Skog A., Zachos F.E., Rueness E.K., Feulner P.G.D., Mysterud A., Langvatn R., Lorenzini R., Hmwe S.S., Lehoczky I., Hartl G.B., et al. 2009. Phylogeography of red deer (Cervus elaphus) in Europe. Journal of Biogeography, 36:66-77.

Sommer R., Nadachowski A. 2006. Glacial refugia of mammals in Europe: evidence from fossil records. Mammal Review, 36:251-265.

Sommer R., Zachos F., Street M., Jöris O., Skog A., Benecke N. 2008. Late Quaternary distribution dynamicsand phylogeography of the red deer (Cervus elaphus) in Europe. Quaternary Science Reviews, 27:714-733.

Sommer R.S., Zachos F.E. 2009. Fossil evidence and phylogeography of temperate species “glacial refugia” and post-glacial recolonization. Journal of Biogeography, 36:2013-2020.


38

Stewart J.R., Lister A.M. 2001. Cryptic northern refugia and the origins of the modern biota. Trends in Ecology and Evolution, 16:608-613.

Stewart J.R., Stringer C.B. 2012. Human evolution out of Africa: the role of refugia and climate change. Science, 335:1317-1321.

Stiller M., Knapp M., Stenzel U., Hofreiter M., Meyer M. 2009. Direct multiplex sequencing (DMPS) a novel method for targeted high-throughput sequencing of ancient and highly degraded DNA. Genome Research, 19:1843-1848.

Stiller M., Baryshnikov G., Bocherens H., Grandal d'Anglade A., Hilpert B., Münzel S.C., Pinhasi R., Rabeder G., Rosendahl W., Trinkaus E. 2010. Withering away - 25,000 years of genetic decline preceded cave bear extinction. Molecular Biology and Evolution, 27:975-978.

Stiller M., Molak M., Prost S., Rabeder G., Baryshnikov G., Rosendahl W., Münzel S., Bocherens H., Grandal-d’Anglade A., Hilpert B., et al. 2014. Mitochondrial DNA diversity and evolution of the Pleistocene cave bear complex. Quaternary International, 339-340:224-231.

Stuart A.J., Lister A.M. 2007. Patterns of Late Quaternary megafaunal extinctions in Europe and northern Asia. Courier Forschungsinstitut Senckenberg, 259:287-297.

Stuart A.J., Lister A.M. 2011. Extinction chronology of the cave lion Panthera spelaea Quaternary Science Reviews, 30:2329-2340.

Swatdipong A., Primmer CR., Vasemägi A. 2010. Historical and recent genetic bottlenecks in European grayling. Thymallus thymallus. Conservation Genetics, 11:279-292.

Swofford D.L. 2003. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and other methods). Version 4. Sinauer associated, Sunderland, Massachusetts.

Underhill P.A., Kivisild T. 2007. Use of Y chromosome and mitochondrial DNA population structure in tracing human migrations. Annual Review Genetics, 41:539-564.

Tiedemann R., Moll K., Paulus K.B., Scheer M., Williot P., Bartel R., Gessner J., Frank Kirschbaum F. 2007. Atlantic sturgeons (Acipenser sturio, Acipenser oxyrinchus) American females successful in Europe. Naturwissenschaften, 94:213-217.

Thalmann O., Shapiro B, Cui P., Schuenemann V.J., Sawyer S.K., Greenfield D.L., Germonpré M.B., Sablin M.V., López-Giráldez F., Domingo-Roura X., et al. 2013. Complete mitochondrial genomes of ancient Canids suggest a European origin of domestic dogs. Science, 342:871-874.

Van Oosterhout C., William F., Hutchinson D., Wills M., Shipley P. 2004. Micro-Checker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, 4: 535-538.

Vonholdt B.M., Pollinger J.P., Lohmueller K.E., Han E., Parker H.G., et al. 2010. Genome-wide SNP and haplotype analyses reveal a rich history underlying dog domestication. Nature, 464:898-902.


39

Vremir M., Ridush B. 2005. The Emine-Bair-Khosar “Mega-Trap”. Mitteilungen der Kommission für Quartärforschung Österreichischen Akademie der Wissenschaften, 14:235-239.

Waldman J.R., Grunwald C., Stabile J., Wirgin I. 2002. Impacts of life history and biogeography on the genetic stock structure of Atlantic sturgeon Acipenser oxyrinchus oxyrinchus, Gulf sturgeon A. oxyrinchus desotoi, and shortnose sturgeon A. brevirostrum. Journal of Applied Ichthyology, 18:509-518.

Willerslev E., Hansen A.J., Poinar H.N. 2004. Isolation of nucleic acids and cultures from fossil ice and permafrost. Trends in Ecology and Evolution, 19(3):141-147.

Willerslev E., Cooper A. 2005. Ancient DNA. Proceedings of Biological Sciences / The Royal Society, 272(1558):3-16.

Willerslev E., Cappellini E., Boomsma W., Nielsen R., Hebsgaard M.B., Brand T.B., Hofreiter M., Bunce M., Poinar H.N., Dahl-Jensen D. 2007. Ancient Biomolecules from Deep Ice Cores Reveal a Forested Southern Greenland. Science, 317(5834):111-114.

Witkowski A., Błachuta J., Kleszcz M., Napora K. 2003. Realizacja projektu restytucji ryb dwuśrodowiskowych w górnym i środkowym dorzeczu Odry. Komunikaty Rybackie, 3:13-16.

Witkowski A., Kotusz J., Przybylski M. 2009. The degree of threat to the freshwater ichthyofauna of Poland: Red list of fishes and lampreys-situation in 2009. Chrońmy Przyrodę Ojczystą, 65:33-52.

Wolf, C., Hübner P., Lüthy J. 1999. Differentiation of sturgeon species by PCR-RFLP. Food Research International, 32: 699-705.

Zachos F.E., Hartl G.B. 2011. Phylogeography, population genetics and conservation of the European red deer Cervus elaphus. Mammal Review, 41:138-150

Wykaz publikacji stanowiące osiągniecie naukowe, o którym mowa w art. 16 ust.2, ze

szczególnym omówieniem indywidualnego wkładu własnego

1. Stanković A., 2011. The Past and Future of Sturgeons in Poland: The Genetic Approach. W: Williot P., Rochard E., Desse-Berset N., Kirschbaum F., Gessner J., (eds): Biology and Conservation of the European Sturgeon Acipenser sturio L. 1758. Springer, Berlin, str. 561-572. Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na: Wykonanie doświadczeń, interpretacja wyników, zaplanowanie i napisanie pracy. Mój udział szacuję na 100%

2. Popovic D., Panagiotopoulou H., Baca M., Stefaniak K., Mackiewicz P., Makowiecki D., King TL., Gruchota J., Weglenski P., Stankovic A., 2014. The history of sturgeon in the Baltic Sea. Journal of Biogeography, 41 (8), 1590-1602. IF – 2013 = 4,863; MNiSW = 40


40

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na: Zaplanowanie pracy, wykonanie większości doświadczeń, interpretacja wyników, udział w przygotowaniu manuskryptu. Mój udział szacuję na 60%

3. Panagiotopoulou H., Baca M., Popovic D., Weglenski P., Stankovic A., 2014. A PCR-RFLP based test for distinguishing European and Atlantic sturgeons. Journal of Applied Ichthyology, 30 (1), 14-17. IF – 2013 = 0,903; MNiSW = 20 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na: Zaplanowanie pracy, wykonanie części doświadczeń, izolacji, amplifikacji i sekwencjonowania DNA, udział w interpretacji wyników i opracowaniu manuskryptu. Mój udział szacuję na 40% 4. Stankovic A., Doan K., Baca M., Mackiewicz P., Gromadka R., Socha P., Ridush B., Weglenski P., Nadachowski A., Stefaniak K., 2011. First ancient DNA sequences of the Late Pleistocene red deer (Cervus elaphus) from the Crimea, Ukraine. Quaternary International, 245(2), 262-267. IF – 2011=1,874; MNiSW = 30 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na: kierowaniem projektem badawczym MNiSW nr NCN N N303 821140 w ramach, zaplanowanie doświadczeń, udział w pisaniu manuskryptu, interpretacji uzyskanych wyników, zebranie literatury dział w koordynacji współpracy z zagranicznymi partnerami. Mój udział szacuję na 60%

5. Baca M., Stankovic A., Stefaniak K., Marciszak A., Hofreiter M., Nadachowski A., Weglenski P, Mackiewicz P., 2012. Genetic analysis of cave bear specimens from Niedźwiedzia Cave, Sudetes, Poland. Palaeontologia Electronica, 15(2):21A, 1-16. IF – 2012 = 0,871; MNiSW = 30 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na: Zaplanowanie i wykonanie znaczącej części doświadczeń, udział w opracowaniu koncepcji pracy i udział w pisaniu manuskryptu. Udział w koordynacji współpracy z zagranicznymi partnerami. Mój udział szacuję na 40%


ingressus in Sudetes. Quaternary International, vol. 339-340, str. 217-223. IF – 2013 = 2,128; MNiSW = 30 Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na: Zaplanowaniu i wykonaniu znaczącej części doświadczeń, izolacji, amplifikacji i sekwencjonowaniu DNA, udział w opracowaniu koncepcji pracy i udział w pisaniu manuskryptu. Mój udział szacuję na 30%

zaŁĄcznik nr 2 autoreferat w języku polskim

Documents