Онкогематология 2012 год № 4

ОНКО

2 0 1 2

Г Е М АТОЛ О Г И ЯН А У Ч Н О - П Р А К Т И Ч Е С К И Й Е Ж Е К В А Р Т А Л Ь Н Ы Й Р Е Ц Е Н З И Р У Е М Ы Й Ж У Р Н А Л

4

ISSN 1818-8346

Новые направления медицинской науки

Хронический миелолейкоз

Материалы VIII симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний»

Издательский дом «АБВ-пресс» специализируется на выпуске периодической научной медицинской литературы, книгопечатной продукции и создании сайтов медицинского направления

Москва, 2012

Книги и наши издания

можно заказать и приобрести

в редакции по адресу:

г. Москва, Каширское ш.,

д. 24, стр. 15

и по телефону:

+7 (499) 929-96-19.

Адрес электронной почты:

[email protected]

НАШИ ЖУРНАЛЫ и ГАЗЕТЫ

НАШИ КНИГИ

НАШИ САЙТЫ

www.hnonco.ru

www.roou.ruwww.oncoproct.ru

www.netoncology.ru

www.urotoday.ru www.neuromuscular.ru

4

Журнал включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, в которых публикуются основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОРпроф., д.м.н. Е.В. Самочатова

Заместители главного редакторапроф., д.м.н. В.В. Птушкин,

проф., д.м.н. Б.В. АфанасьевОтветственный секретарь

д.м.н. Ю.В. Румянцева

РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯпроф., д.м.н. О.В. Алейникова (Минск)

проф., д.м.н. А.К. Голенков (Москва)проф., д.м.н. А.И. Карачунский (Москва)

д.м.н. Е.Н. Паровичникова (Москва)проф., д.м.н. Ю.А. Криволапов (С.-Петербург)

доц., д.м.н. М.Л. Минков (Австрия)д.м.н. Н.В. Мякова (Москва)

к.м.н. Е.А. Никитин (Москва)проф., д.м.н. О.А. Рукавицын (Москва)

проф., д.м.н. С.А. Румянцев (Москва)д.м.н. Л.П. Менделеева (Москва)

к.м.н. Л.Г. Фечина (Екатеринбург)д.м.н. А.Л. Усс (Минск)

РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТпроф., д.м.н. Е.А. Лукина (Москва)

чл.-корр. РАМН И.В. Поддубная (Москва)чл.-корр. РАМН А.Г. Румянцев (Москва)

к.м.н. В.А. Россиев (Самара)проф., д.м.н. А.Г. Талалаев (Москва)

Адрес редакции:115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24,

стр. 15, НИИ канцерогенеза, 3-й этаж.Тел./факс: +7 (499) 929-96-19

www.abvpress.rue-mail: [email protected]

Заведующая редакцией Т.В. КлюковкинаКорректор В.В. Калинина

Дизайн Е.В. СтепановаВерстка О.В. Гончарук

Служба подписки и распространения И.В. Шургаева, +7 (499) 929-96-19

e-mail: [email protected]Служба рекламы

В.А. Клюковкин, +7 (499) 929-96-19e-mail: [email protected]

Журнал зарегистрированв Федеральной службе по надзору

в сфере связи, информационных технологийи массовых коммуникаций (Роскомнадзор)

ПИ № ФС77-36928 от 21 июля 2009 г.

При полной или частичной перепечаткематериалов ссылка на журнал«Онкогематология» обязательна.

Редакция не несет ответственностиза содержание публикуемыхрекламных материалов.

В статьях представлена точказрения авторов, которая можетне совпадать с мнением редакции.

ISSN 1818-8346Онкогематология. 2012. № 4. 1–72© ООО «ИД «АБВ-пресс», 2012

Подписной индекс в каталоге«Пресса России» — 42167

Отпечатано в типографииООО «Графика»

Тираж 3000 экз.

EDITOR-IN-CHIEFProf. Ye.V. SamochatovaDeputy EditorsProf. V.V. Ptushkin,Prof. B.V. AfanasievExecutive SecretaryD. Sci. Yu.V. Rumyantseva

EDITORIAL BOARDProf. O.V. Aleynikova (Minsk)Prof. A.K. Golenkov (Moscow)Prof. A.I. Karachunskiy (Moscow)D. Sci. Ye.N. Parovichnikova (Moscow)Prof. Yu.A. Krivolapov (St.-Petersburg)D. Sci. M.L. Minkov (Austria)D. Sci. N.V. Myakova (Moscow)PhD Ye.A. Nikitin (Moscow)Prof. O.A. Rukavitsyn (Moscow)Prof. S.A. Rumyantsev (Moscow)D. Sci. L.P. Mendeleeva (Moscow)PhD L.G. Fechina (Yekaterinburg)D. Sci. A.L. Uss (Minsk)

EDITORIAL COUNCILProf. Ye.A. Lukina (Moscow)Prof. I.V. Poddubnaya (Moscow)Prof. A.G. Rumyantsev (Moscow)PhD V.A. Rossiyev (Samara)Prof. A.G. Talalayev (Moscow)

4 2012

С О Д Е Р Ж А Н И Е

От редакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ НАУКИ

М.А. Орлова, Т.П. Трофимова, А.П. Орлов, О.А. Шаталов, А.А. Свистунов, Ю.К. Наполов, В.П. Чехонин

Производные фуллерена как модуляторы процессов клеточной пролиферации и апоптоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

М.А. Орлова, Т.П. Трофимова, А.П. Орлов, О.А. Шаталов, А.А. Свистунов, Ю.К. Наполов, В.П. Чехонин

Фуллерены и оксидативный стресс . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ

Е.Г. Овсянникова, К.Д. Капланов, Т.Ю. Клиточенко, А.В. Мисюрин, И.Л. Давыдкин, Л.В. Заклякова, Е.А. Попов, Б.Н. Левитан

Мутационный статус резистентных к иматинибу больных хроническим миелолейкозом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

О.Ю. Виноградова, Е.А. Асеева, А.В. Воронцова, А.Г. Туркина, А.Л. Неверова, О.В. Лазарева, Е.Ю. Челышева, Г.А. Гусарова, Т.И. Колошейнова, Л.Ю. Колосова, С.Р. Горячева, М.В. Вахрушева, С.М. Куликов, И.А. Тищенко, Л.В. Дяченко, А.И. Удовиченко, Г.А. Алимова, Е.В. Клеина, Л.А. Гребенюк, М.Л. Коннова, С.Ю. Смирнова, Н.Д. Хорошко, Е.В. Домрачева

Влияние различных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках костного мозга на течение хронического миелолейкоза при терапии ингибиторами тирозинкиназ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

И.И. Калинина, У.Н. Петрова, О.В. Горонкова, Д.Д. Байдильдина, В.В. Синицына, Л.А. Хачатрян, М.А. Масчан, Г.А. Клясова, А.А. Масчан

Инфекции, вызванные редкими плесневыми грибами, в гематологии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

РЕДКИЕ БОЛЕЗНИ: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

Е.Л. Сахаровская, И.Б. Резник, М.М. Дубровин, Г.П. Павлова, А.Ю. Щербина

Рентгенологическая картина злокачественного остеопетроза на ранних и поздних стадиях развития заболевания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

Д.Д. Панков, А.Г. Румянцев

Оптимизация экспериментальных моделей заболевания лейкозом у человека (обзор литературы) . . . . . . . . . . . . . . . 48

КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯМатериалы VIII симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1–3 февраля 2013 г . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

C O N T E N T S

From edition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

NEW TRENDS IN MEDICAL SCIENCE

M.A. Orlova, T.P. Trofimova, A.P. Orlov, O.A. Shatalov, A.A. Svistunov, Yu.K. Napolov, V.P. Chekhonin

Fullerene derivatives as modulators for the cell proliferation and apoptosis processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

M.A. Orlova, T.P. Trofimova, A.P. Orlov, O.A. Shatalov, A.A. Svistunov, Yu.K. Napolov, V.P. Chekhonin

Fullerene and oxidative stress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

HEMATOLOGIC MALIGNANCIES: DIAGNOSIS, TREATMENT, SUPPORTIVE CARE

E.G. Ovsyannikova, K.D. Kaplanov, T.Yu. Klitochenko, A.V. Misyurin, I.L. Davydkin, L.V. Zaklyakova, E.A. Popov, B.N. Levitan

Mutation status of refractory to imatinib patients with chronic myeloid leukemia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

O.Yu. Vinogradova, E.A. Aseeva, A.V. Vorontsova, A.G. Turkina, A.L. Neverova, O.V. Lazareva, E.Yu. Chelysheva, G.A. Gusarova, T.I. Kolosheinova, L.Yu. Kolosova, S.R. Goryacheva, M.V. Vakhrusheva, S.M. Kulikov, I.A. Tishchenko, L.V. Dyachenko, A.I. Udovichenko, G.A. Alimova, E.V. Kleina, L.A. Grebenyuk, M.L. Konnova, S.Yu. Smirnova, N.D. Khoroshko, E.V. Domracheva

Influence of different chromosomal abnormalities in Ph-positive bone marrow cells on the chronic myeloid leukemia course during tyrosine kinase inhibitors therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

I.I. Kalinina, U.N. Petrova, O.V. Goronkova, D.D. Baidildina, V.V. Sinitsina, L.A. Khachatryan, M.A. Maschan, G.A. Klyasova, A.A. Maschan

Infections caused by rare mold fungi in hematology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

RARE DISEASES: DIFFERENTIAL DIAGNOSIS

E.L. Sakharovskaya, I.B. Reznik, M.M. Dubrovin, G.P. Pavlova, A.Yu. Shcherbina

Radiological features of malignant osteopetrosis at early and late stages of disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

BASIC RESEARCH

D.D. Pankov, A.G. Rumyantsev

Optimization of experimental human leukemia models (review) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

CONFERENCES, SYMPOSIUMS, MEETINGSProceedings of the VIII Symposium «Biological bases for the therapy of oncological and hematological diseases», Moscow, February 1–3, 2013 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

64

’2

01

2

Поздравляем читателей журнала «Онкогематология» с наступившим Новым годом!

Желаем всем успешного решения деловых и личных проблем, уважения и доверия коллег и пациентов, новых знаний и умений.

В минувшем году мы старались всесторонне осветить вопросы практической онкогематологии и уделяли серьезное внимание научным проблемам, которые лежат в основе достижений этой области медицины.

Журнал продолжит эту практику. Как и год назад, когда в журнале был опубликован образовательный цикл лекций, посвященных молекулярным основам лейкемогенеза, в текущем году мы также хотим познакомить читателей журнала «Онкогематология» с новой для большинства из них областью знаний – наномедициной. Мало кто в наше время не слышал или каким бы то ни было образом не соприкасался с достижениями науки о наночастицах, однако только единицы представляют себе хотя бы основные ее позиции и тем более, какое отношение нанотехнологии имеют к практической медицине.

Редакция посчитала своевременным открыть для вас первые страницы науки о наночастицах и начинает публиковать цикл лекций специалистов в этой области. Ждем ваших откликов и вопросов.

Главный редактор журнала «Онкогематология»

д.м.н., проф. Е.В. Самочатова

ОТ РЕДАКЦИИ / FROM EDITION

7

4’

20

12

Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И

Производные фуллерена как модуляторы процессов клеточной пролиферации и апоптоза

М.А. Орлова1, Т.П. Трофимова1, А.П. Орлов2, О.А. Шаталов3, А.А. Свистунов3, Ю.К. Наполов3, В.П. Чехонин2

1Химический факультет, кафедра радиохимии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»;

2медико-биологический факультет, кафедра медицинских нанобиотехнологий ГБОУ ВПО «Российский научно-исследовательский медицинский университет

им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва; 3фармацевтический факультет, кафедра фармакологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский

университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Контакты: Марина Алексеевна Орлова [email protected]

Fullerene derivatives as modulators for the cell proliferation and apoptosis processes

M.A. Orlova1, T.P. Trofimova1, A.P. Orlov2, O.A. Shatalov3, A.A. Svistunov3, Yu.K. Napolov3, V.P. Chekhonin2

1M.V. Lomonosov Moscow State University;2N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow;

3I.M. Sechenov Moscow State Medical University

*Аллотропия (от др.-греч. αλλος – «другой», τροπος – «поворот, свойство») – существование одного и того же химического элемента в виде 2 и более простых веществ, различных по строению и свойствам, – так называемых аллотропических (аллотропных) модификаций или форм. Явление аллотропии обусловлено либо различным составом молекул простого вещества (аллотропия состава), либо способом размещения атомов или молекул в кристалличе ской решетке (аллотропия формы). Углерод имеет множество модификаций: алмаз, графит, фуллерен, карбин, графен, углеродные нанотрубки, лонсдейлит и др. Точное число модификаций указать затруднительно вследствие разнооб-разия форм связывания атомов углерода между собой. Наиболее многочисленны молекулярные структуры фуллеренов и нанотрубок.

Нанотехнологии, т. е. технологии создания и ис-пользования наноразмерных (~ 1–100 нанометров (10-9 метра) (нм)) объектов, при которых для достиже-ния практического результата размер имеет принци-пиальное, даже критическое значение, открывают новые возможности, занимая особую нишу в различ-ных областях науки и промышленности [1], законо-мерно проникая в область фармации и медицины. Особое место среди таких продуктов занимает срав-нительно недавно (1985) открытый класс фуллеренов. Фуллерен – это одна из аллотропных* форм углерода (другие — алмаз, карбин и графит), представляет со-бой выпуклые замкнутые многогранники, составлен-ные из четного числа трехкоординированных атомов углерода. Своим названием фуллерены обязаны ин-женеру и дизайнеру Ричарду Бакминстеру Фуллеру, в чьих конструкциях используется такая форма. Пер-воначально данный класс соединений был ограничен лишь структурами, включающими только пяти- и шестиугольные грани. Самый симметричный и наи-более полно изученный представитель класса фулле-

ренов — фуллерен (C60

), в котором углеродные атомы образуют усеченный икосаэдр, состоящий из 20 шес-тиугольников и 12 пятиугольников и напоминающий футбольный мяч размером 1,6–1,8 нм (рисунок).

Следующим по распространенности является фул-лерен C

70, отличающийся от фуллерена C

60 вставкой

пояса из 10 атомов углерода в экваториальную область C

60, в результате чего молекула C

70 оказывается вытяну-

той и напоминает своей формой мяч для игры в регби.Так называемые высшие фуллерены, содержащие

большее число атомов углерода (до 400), встречаются реже и часто имеют довольно сложный изомерный состав. Среди наиболее изученных высших фуллере-нов можно выделить Cn, где n = 74, 76, 78, 80, 82 или 84. Если в состав молекулы фуллерена помимо атомов углерода входят атомы других химических эле-ментов, то, если они расположены внутри углеродно-го каркаса, такие фуллерены называются эндоэдраль-ными, если снаружи – экзоэдральными.

Наночастицы размером менее 100 нм (1–50 нм) имеют совершенно уникальные физико-химические

84

’2

01

2Н О В Ы Е Н А П Р А В Л Е Н И Я М Е Д И Ц И Н С К О Й Н А У К И

параметры, механизмы и точки биомедицинского приложения. Это связано с нахождением большинства атомов на межфазной, внешней поверхности частиц, что обуславливает особые квантово-механические за-кономерности их действия. Фуллерены, в отличие от других углеродных наночастиц и материалов, могут вступать в реакции присоединения по двойным связям (с получением экзопроизводных), внедрения атомов и кластеров внутрь углеродной сферы (эндопроизвод-ные) и способны к образованию гетерофуллеренов (металлофуллеренов) и супрамолекул. Они обладают целым спектром разнообразных свойств, влияющих на человеческий организм. Многие представители об-ширного семейства водорастворимых производных фуллеренов и созданных на их основе наночастиц привлекают внимание как средства адресной доставки лекарств, противовирусные и противоопухолевые агенты. Сегодня получено огромное количество таких производных фуллерена С

60. Однако для внедрения

фуллере новых производных в медицинскую практику необходимо понимание причин и механизмов прямых и отдаленных последствий их эффектов in vivo, осно-ванных на внедрении в регуляцию процессов проли-ферации, апоптоза и некроза клеток. Большое влия-ние на последующие свойства фуллереновых наночастиц имеет способ их получения и функциона-лизации, а также морфология – их размеры, форма, рельеф поверхности, аффинность к клеточным струк-турам, т. е. параметры, в зависимости от которых биологические эффекты наночастиц могут меняться от цитопротекторного до цитотоксического. Основ-ным эффекторным воздействием фуллеренов долгое время считалась индукция образования активных форм кислорода, однако в последние годы показано, что в зависимости от размеров фуллерены могут внед-ряться в органеллы клеток, встраиваться в структуры молекул белков и ДНК, изменяя их конформацион-ную лабильность и оказывая воздействие на их функ-

ционирование, что ведет к изменениям параметров метаболизма и клеточного цикла. Так, фуллерен (С

60)

и его водорастворимые производные, полученные присоединением разнообразных функциональных групп к сетке фуллерена, в различных условиях могут выступать как цитопротекторы, так и как цитотокси-ческие агенты [2]. В частности, ряд гидроксилирован-ных производных С

60 и С

60-малонаты ведут себя как

поглотители (акцепторы, губки) радикалов и защища-ют клетки от повреждений, опосредованных оксида-тивным стрессом [2–7]. Однако при более высоких концентрациях, а также под действием излучения в ультрафиолетовом спектре они же способны приво-дить к клеточной смерти через активные формы кис-лорода (АФК) – АФК-зависимые и АФК-независимые механизмы [7–10].

Для некоторых производных фуллерена описано цитотоксическое влияние на определенные (в частнос-ти, раковые) клетки [11]. Это может быть целенаправ-ленно использовано в терапии опухолей без заметного повреждения здоровой ткани [12]. Все производные фуллерена, несущие S-триазиновый фрагмент, в разной степени ингибировали рост бактерий [13].

Коллоидные растворы С60

при взаимодействии с водой способны образовывать агрегаты различного размера и, соответственно, различной токсичности. Поэтому наряду с повышением привлекательности фуллеренов для использования в медицинских целях существует также некоторая неопределенность отно-сительно их токсичности и отдаленных последствий их применения. Функционализация (сужение и уси-ление направленности конкретной функции за счет прикрепления соответствующих молекул) С

60 при

уменьшении видимой токсичности может существен-но влиять на характер взаимодействия фуллеренов с биологическими системами [14], что повышает не-определенность последствий, а иногда даже создает эффект «троянского коня». Поэтому очень важно пра-вильно оценить риски и последствия развития фулле-рен-нанотехнологий.

Споры о токсичности наночастиц С60

и гидрокси-лированных фуллеренов подробно описаны в ряде источников [15]. В последнее время особый интерес лежит в области доставки функциональной лекарс-твенной составляющей в отдельные органы и ткани организма (drug delivery). Производные фуллеренов, особенно порфириновые и супрамолекулярные, спо-собны выполнять функции как транспортера, так и самого лекарства. Последнее обусловлено тем, что фуллерены обладают собственным влиянием на окси-дативный стресс, пролиферацию, апоптоз, экспрес-сию генов и другие функции клеток и систем орга-низма.

В 2005 г. издан ряд монографий, подробно описы-вающих органическую химию фуллеренов [16, 17] и результаты их применения в биомедицинских иссле-дованиях [18]. Написано и немало обзоров по изуче-

Структура фуллерена C60

9

4’

20

12


нию синтеза новых соединений этого класса [19–24] и их возможного медицинского применения [25–31]. Рассмотрено антимикробное действие фуллеренов и их производных [32]. Особое значение для медици-ны имеют водорастворимые фуллерены, среди кото-рых значительное место занимают их порфириновые производные [33, 34] и фуллеролы (гидроксифуллере-ны, фуллеренолы) [35]. В силу того, что основное направление исследований по фуллеренам связано с синтезом новых конструкций, информация о биохи-мических результатах во многих случаях носит хаотич-ный характер.

Вопрос о том, являются ли фуллерены полезными с точки зрения практической медицины или они пред-ставляют собой еще один фактор риска, активно дискутируется в научной литературе и пока не имеет однозначного ответа. Нельзя не учитывать экологи-ческую и техногенную составляющую воздействия фуллеренов, поскольку эти соединения появляются в окружающей среде из природных и антропогенных источников, таких как извержения вулканов, лесные пожары и сжигание углеродных материалов [36, 37].

Кроме того, в последнее время резко увеличилось производ ство и применение инженерных фуллеренов в различных отраслях промышленности. Все это по-вышает важность проблемы всесторонней оценки их токсичности для окружающей среды и здоровья человека.

Мы представляем цикл лекций, где попытались сконцентрировать внимание на основных аспектах воздействия фуллеренов на живые организмы, в том числе связанных с апоптозом и пролиферацией нор-мальных и опухолевых клеток, которые особенно важ-ны для диагностики и терапии злокачественных опу-холей и нейродегенеративных заболеваний. Мы также рассмотрим тенденции интенсивно развивающихся направлений использования фуллереновых наночас-тиц для адресной доставки лекарств. Цикл лекций состоит из 4 частей, посвященных: 1) оксидативному стрессу; 2) влиянию на сигнальные пути апоптоза; 3) противоопухолевой активности; 4) возможности использования фуллеренов для адресной доставки ле-карств и 5) применению в фотодинамической и радио-терапии опухолей.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Duncan R., Gaspar R. Nanomedicine(s) under the microscope. Mol Pharmaceutics 2011;8:2101–41.2. Harhaji L., Isakovic A., Raicevic N. et al. Multiple mechanisms underlying the anticancer action of nanocrystalline fullerene. Eur J Pharmacol 2007;568:89–98. 3. Dugan L.L., Turetsky D.M., Du C. et al. Carboxyfullerenes as neuroprotective agents. Proc Natl Acad Sci (USA) 1997;94:9434–9. 4. Monti D., Moretti L., Salvioli S. et al. C

60 carboxyfullerene exerts a protective

activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;277:711–7. 5. Dugan L.L., Gabrielsen J.K., Yu S.P. et al. Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitotoxic and apoptotic death of cultured cortical neurons. Neurobiol Dis 1996;3:129–35. 6. Isakovic A., Markovic Z., Nikolic N. et al. Inactivation of nanocrystalline C

60

cytotoxicity by γ-irradiation. Biomaterials 2006;27:5049–58. 7. Isakovic A., Markovic Z., Todorovic-Markovic B. et al. Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene. Toxicol Sci 2006;91:173–83. 8. Yamawaki H., Iwai N. Cytotoxicity of water-soluble fullerene in vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 2006;290:C1495–C1502.

9. Yang X.L., Fan C.H., Zhu H.S. Photo-induced cytotoxicity of malonic acid [C

60]

fullerene derivatives and its mechanism. Toxicol in Vitro 2002;16:41–6. 10. Rancan F., Rosan S., Boehm F. et al. Cytotoxicity and photocytotoxicity of a dendritic C

60 mono-adduct and a malonic

acid C60

tris-adduct on Jurkat cells. J Photochem Photobiol B 2002;67:157–62.11. Bosi S., Feruglio L., Da Ros T. et al. Hemolytic effects of water-soluble fullerene derivatives. J Med Chem 2004;47:6711–5. 12. Chen C., Xing G., Wang J. et al. Multihydroxylated [Gd@C

82(OH)

22]n

nanoparticles: antineoplastic activity of high efficiency and low toxicity. Nano Lett 2005;5(10):2050–7. 13. Darwish A.D. Fullerenes. Annu Rep Prog Chem A 2010;106:356–75.14. Gao J., Wang H.L., Shreve A., Iyer R. Fullerene derivatives induce premature senescence: A new toxicity paradigm or novel biomedical applications. Toxicol Appl Pharmacol 2010;244:130–43. 15. Jung H., Wang C., Jang W. Nano-C

60 and

hydroxylated C60

: Their impacts on the environment. Toxicol Envir Health Sci 2009;1:132–9. 16. Сидоров Л.Н., Юровская М.А., Борщевский А.Я. и др. Фуллерены. М.: Экзамен, 2005.17. Hirsch A., Brettreich M. Fullerenes: chemistry and reactions. Weinheim, Wiley-VCH, 2005.

18. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии. СПб.: Росток, 2006.19. Трошин П.А., Любовская З.Н. Орга-ническая химия фуллеренов: основные реакции, типы соединений фуллеренов и перспективы их практического приме-нения. Успехи химии 2008;77:324–69. 20. Ema M., Kobayashi N., Naya M., Hanai S. et al. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials. J Reprod Toxicol 2010;30:343–52.21. Markovic Z., Trajkovic V. Biomedical potential of the reactive oxygen species generation and quenching by fullerenes (C

60).

Biomaterials 2008;29:3561–73. 22. Grausova L., Vacik J., Vorlicek V. et al. Fullerene C

60 films of continuous and

micropatterned morphology as substrates for adhesion and growth of bone cells. Diamond Relat Mater 2009;18:578–86. 23. Aschberger K., Johnston H.J., Stone V. et al. Review of fullerene toxicity and exposure – Appraisal of a human health risk assessment, based on open literature. Regul Toxicol Pharmacol 2010;58:455–73. 24. Da Ros T., Spalluto G., Prato M. Biological applications of fullerene derivatives: a brief overview. Croat Chem Acta 2001;74:743–55. 25. Da Ros T. Twenty Years of Promises: Fullerene in Medicinal Chemistry. In.: Medicinal Chemistry and Pharmacological

104

’2

01


Potential of Fullerenes and Carbon Nanotubes. Series: Carbon Materials: Chemistry and Physics, Vol. 1, 2008. Pp. 1–21. 26. Bakry R., Vallant R.M., Najam-ul-Haq M. et al. Medicinal applications of fullerenes. Int J Nanomed 2007;4:639–49. 27. Satoh M., Takayanagi I. Pharmacological Studies on Fullerene (C

60), a Novel Carbon

Allotrope, and Its Derivatives. J Pharmacol Sci 2006;100:513–8. 28. Chawla P., Chawla V., Maheshwari R., Saraf A. Fullerenes: from carbon to nanomedicine. Mini Reviews in Med Chem 2010;10:662–77. 29. Partha R., Conyers J.L. Biomedical applications of functionalized fullerene-based nanomaterials. Int J Nanomed 2009;4:261–75.

30. Yan L., Zhao F., Li S. et al. Low-toxic and safe nanomaterials by surface-chemical design, carbon nanotubes, fullerenes, metallofullerenes, and graphenes. Nanoscale 2011;3:362–82. 31. Parveen S., Misra R., Sahoo S.K. Nanoparticles: a boon to drug delivery, therapeutics, diagnostics and imaging. Nanomedicine 2012;8(2):147–66. 32. Huh A.J., Kwon Y.J. «Nanoantibiotics»: A new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J Control Release 2011;7:128–45. 33. Койфман О.И., Мамардашвили Н.Ж., Антипин И.С. Синтетические рецепторы на основе порфиринов и их конъюгатов с каликс[4]аренами. М.: Наука, 2006.

34. Satake A., Kobuke Y. Dynamic supramolecular porphyrin system. Tetrahedron 2005;61:13–41.35. Tykhomyrov A.A., Nedzvetsky V.S., Klochkov V.K., Andrievsky G.V. Nanostructures of hydrated C

60 fullerene

(C60

HyFn) protect rat brain against alcohol impact and attenuate behavioral impairments of alcoholized animals. Toxicology 2008;246:158–65. 36. Buseck P.R. Geological fullerenes: review and analysis. Earth Planet Sci Lett 2002;203:781–92. 37. Shinohara N., Gamo M., Nakanishi J. Fullerene C

60: inhalation hazard assessment

and derivation of a period-limited acceptable exposure level. Toxicol Sci 2011;123:576–89.

11

4’

20

12


Фуллерены и оксидативный стресс

М.А. Орлова1, Т.П. Трофимова1, А.П. Орлов2, О.А. Шаталов3, А.А. Свистунов3, Ю.К. Наполов3, В.П. Чехонин2

1Химический факультет, кафедра радиохимии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»;

2медико-биологический факультет, кафедра медицинских нанобиотехнологий ГБОУ ВПО «Российский научно-исследовательский медицинский университет

им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва; 3фармацевтический факультет, кафедра фармакологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский

университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Контакты: Марина Алексеевна Орлова [email protected]

Многие представители обширного семейства водорастворимых аддуктов фуллеренов и наночастиц на их основе привлекают серьезное внимание как противовирусные агенты, противоопухолевые агенты и средства адресной доставки лекарств. Сегодня получено огромное количество таких производных фуллерена С

60. Однако для внедрения фуллереновых производных в медицинскую

практику необходимо понимание причин и механизмов прямых и отдаленных последствий их эффектов in vivo. В первую очередь это касается их влияния на регуляцию процессов пролиферации, апоптоза и некроза. Огромное значение имеют способ получения, функционализации и морфология фуллереновых наночастиц (их размеры, форма, рельеф поверхности, аффинность к клеточным структурам), т. е. параметры, в зависимости от которых биологические эффекты наночастиц могут меняться от цитопро-текторного до цитотоксического. Одним из основных эффектов фуллеренов на живые системы считается индукция образования активных форм кислорода. В данной лекции содержится анализ современных представлений о влиянии фуллеренов и их производ-ных на образование активных форм кислорода и модуляции процессов пролиферации и апоптоза нормальных и опухолевых клеток.

Ключевые слова: фуллерены, апоптоз, оксидативный стресс

Fullerene and oxidative stress

M.A. Orlova1, T.P. Trofimova1, A.P. Orlov2, O.A. Shatalov3, A.A. Svistunov3, Yu.K. Napolov3, V.P. Chekhonin2

1M.V. Lomonosov Moscow State University;2N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow;

3I.M. Sechenov Moscow State Medical University

Fullerene derivatives superfamily attracts a serious attention as antiviral and anticancer agents and drug delivery carriers as well. A large number of such fullerene С

60 derivatives obtained to date. However, there is an obvious deficit of information about causes and mechanisms

of immediately and long-term consequences of their effects in vivo which is a true obstacle on the way leading to their practical medical using. First, this concerns their impact on the proliferation, apoptosis and necrosis regulation. Fullerene nanoparticle functionalization type, their sizes and surface nanopathology are of great importance for further promoting of either cytoprotective or cytotoxic effects. One of the main effects of fullerenes on living systems is the reactive oxygen species (ROS) formation induction. This lecture provides a modern concept analy-sis regarding fullerenes effects on ROS formation and modulation of proliferation and apoptosis in normal and tumor cells.

Key words: fullerenes, apoptosis, oxidative stress

Одним из основных факторов воздействия вне-шней среды, влияющих на апоптоз, является окси-дативный стресс, выражающийся в образовании ак-тивных форм кислорода (АФК), среди которых наибольшее действие производят синглетный кисло-род, супероксид-анион-радикал, пероксид водорода и гидроксильные радикалы, дополнительно появляю-щиеся в катализируемых металлами реакциях Фенто-на и Хабера–Вейса. АФК участвуют в запуске как ре-цепторного, так и нерецепторного механизмов апоптоза, аутофагии, перекисного окисления липидов и опосредованно влияют на многие сигнальные пути молекулярно-биологических реакций [1, 2]. Известно, что основное воздействие наночастиц вообще и фул-лереновых в частности заключается как раз в индук-

ции оксидативного стресса, возникающего при их попадании в организм [3]. Конкретные последствия воздействия наночастиц сильно зависят от их физико-химических свойств: размера, формы, диспергирован-ности в растворителе, растворимости в воде, состава боковых цепей и т. д. Их действие варьирует в широ-ком диапазоне – от токсического до протективного. Концентрационная зависимость является одним из важнейших показателей, определяющих послед-ствия введения фуллеренов.

Благодаря своей уникальной сферической струк-туре С

60 имеет возможность принимать до 6 электро-

нов [4]. Эти электроны быстро двигаются вокруг структуры (фуллереновой сетки) за счет дипольных моментов. Когда C

60 находится под воздействием

124

’2

01


света, электрон поднимается на более высокий энер-гетический уровень, продуцируя возбужденный синглетный C

60, который реагирует с молекулой кис-

лорода (О2) с образованием синглетного кислорода

(1О2) – кислорода со свободным электроном на вне-

шней орбите. Фуллерены являются чрезвычайно эф-фективными генераторами синглетного кислорода с квантовым выходом SО

2, близким к единице. Они

сильно поглощают свет в ультрафиолетовой и умерен-но в видимой области спектра [5], что позволяет использовать их в фотодинамической терапии.

Увеличение количества функциональных групп, добавленных к фуллерену, приводит к снижению квантового выхода синглетного кислорода и АФК-опосредованной цитотоксичности [6]. Токсичность заметно снижена или даже полностью отсутствует и у гидрофильных фуллеренов [7]. Производные фул-лерена способны контролировать как экзогенные, так и эндогенные АФК [8].

Токсичность С60

оценивалась в разных экспери-ментах на клеточных культурах и экспериментальных животных [9–13]. Практически во всех экспериментах цитотоксического эффекта не было, либо он был ми-нимальным, однако во многих экспериментах от-мечалось снижение пролиферативного потенциала клеток.

Чтобы модулировать токсичность наночастиц n-C

60 и улучшить возможности их медицинского при-

менения, фуллерены различными способами пытают-ся сделать либо реально, либо псевдорастворимыми в воде. Этот процесс помимо прочих свойств влияет на способность к агрегации и сильно зависит от типа боковых цепей, при этом образуются морфологически различные структуры: стержни, пузырьки, шарики, мембраны и линейные структуры [14, 15]. Морфоло-гия агрегатов производных С

60 в основном связана

с гидрофобными взаимодействиями и водородными

связями. Различия в сродстве к электрону и физиче-ские свойства (степень агрегации) сильно влияют на биологическую и биомедицинскую активность кон-формационных производных фуллеренов [16]. Такие изменения могут способствовать увеличению сродства к радикалам.

Для приготовления растворимых образцов С60

ис-пользуют различные методы придания фуллерену функции растворимости: гидро- и амфифильности, которые в разной степени влияют на их последующую гено- и цитотоксичность (рис. 1) [5].

1. Химическая модификация фуллеренового кар-каса путем присоединения различных гидрофильных функциональных групп (дериватизация или функцио-нализация фуллерена) [17].

2. Включение фуллерена в водорастворимые суп-рамолекулярные структуры с помощью поливинил-пирролидона-PVP [18], каликсаренов или цикло-декстринов (CD) [19–21], когда ядро фуллерена полностью покрыто модификатором и не имеет кон-такта с водой.

3. Метод обмена растворителей (MОР) [22, 23] ис-пользует летучие, смешивающиеся с водой раствори-тели, которые растворяют фуллерен, а после добавле-ния воды испаряются, оставляя суспензию n-С

60 [24].

4. Длительное (более 2 недель) перемешивание чистого С

60 с водой. Однако при этом могут образовы-

ваться крупные агрегаты, а концентрация фуллерена снижается [25].

Ранее считалось, что более сильные растворители способствуют более высокой токсичности. Биологи-ческие эффекты С

60, суспендированного в растворе,

определяли на культурах E. coli. По этим данным, наиболее безопасным растворителем при необходи-мости биосовместимости оказался N,N-диметил-формамид, причем растворимость не связана напря-мую с цитотоксичностью, зато озонирование n-C

60

Рис. 1. Основные способы солюбилизации аддуктов фуллерена С60

20–400 nm

γ-cyclodextrin

13

4’

20

12


явно и значительно увеличивало инактивацию E. coli [26, 27].

При изучении противоопухолевого действия n-C60

(МОР в диметилсульфоксиде) в высокой концентра-ции (1 μг/мл n-C

60) на клетках глиомы человека (линия

U251) и клетках глиомы крыс (линия С6) наблюдали индукцию оксидативного стресса, приводящего к не-крозу с повреждением мембраны, опосредованному внеклеточной сигнал-регулируемой киназой (ERK), и смерти клеток [28]. Аналогичная картина наблюда-лась в клетках саркомы у мышей. При низкой концен-трации (0,25 μг/мл n-C

60) имела место аутофагия

и остановка пролиферации в G2/M-фазе. Концентра-

ционно-зависимым образом С60

влияет и на диффе-ренцировку мышиных эмбриональных стволовых клеток [29].

В определенных условиях нано-C60

способны вы-зывать лизис эритроцитов человека дозо- и время- зависимым образом, который мог быть остановлен применением N-ацетил-L-цистеина (NAC), что ука-зывает на роль АФК в этом процессе [30].

Введение С60

может изменять токсическое дейст-вие других микропримесей. В клетках, культивируе-мых с добавлением С

60 и As(III), содержание As(III)

было выше (эффект «троянского коня»), так как бла-годаря фуллерену не происходило повышения клеточ-ной токсичности [31].

Азотсодержащие соединения фуллерена могут об-ладать сильно различающимися свойствами в зависи-мости от строения вплоть до значительной токсичнос-ти. Присоединение к фуллеренам С

60 пиридинов

и пиримидинов усиливает их избирательную ней-ротропную активность и в 3–5 раз повышает общую токсичность.

Активно исследуют производные фуллерена, мо-дифицированные различными аминокислотами, а также карбоксифуллерены. Например, цистин-С

60 –

производное фуллерена [32] – показал высокую эф-фективность антиоксидантного действия против су-пероксид-анион- и гидроксильных радикалов, предотвращая H

2O

2-индуцированный апоптоз клеток

феохромоцитомы крыс (линия PC12) при концентра-ции 5 μг/мл. Из-за гидрофобных взаимодействий мно-гие производные (например, аминокислота-С

60) само-

стоятельно собираются в сферические агрегаты, при этом морфология агрегатов существенно влияет как на цитотоксический, так и на цитопротективный эф-фект этих соединений против Н

2О

2-индуцированного

апоптоза [33].При рассмотрении разных вариантов модифика-

ции С60

остатками гексакарбоновой кислоты (С3 или

D3 конформации) наблюдаются [34] важные различия

между липофильными и гидрофильными частицами (С

3/D

3–C

60). В качестве модельной системы исполь-

зовали антиоксидантное действие фуллеренов против перекисного окисления липидов и разрушения целост-ности мембран клеток, вызываемых радикалами,

полученными в реакциях ксантин/ксантин-оксидаза и Фентона. У липофильных производных С

60 обнару-

жен защитный эффект даже больший, чем у природ-ного антиоксиданта – витамина Е. Антиапоптотиче-ские функции таких производных фуллерена могут быть неза висимыми от их АФК-акцепторной роли. Так, трис-карбокси-С

60 является мощным ингибито-

ром апоптоза в человеческих кожных эпителиальных клетках (НЕК), блокируя клеточный цикл в G

0/G

1-

фазе и вызывая клеточное старение. При этом наблю-дается снижение уровня экспрессии убиквитин лига-зы HERC5, участвующей во врожденном иммунном ответе на вирусные и бактериальные инфекции. В клетках, обработанных гекса-карбокси-С

60 и γ-CD-С

60

в этих же условиях, никаких изменений в пролифера-ции не наблюдалось.

Показано, что 10 μмоль/л карбоксифуллеренов уменьшают апоптоз мононуклеаров крови [35], а про-токатеховая кислота-С

60 [36] снижает апоптоз клеток

феохромоцитомы крыс (линия PC12). Уровень кон-центрации зависит от химического строения произ-водного, которое определяет его дальнейшую способ-ность к агрегированию и связыванию с различными сайтами биологических компонентов, и от характе-ристик используемой клеточной линии. Конформа-ционная компонента играет существенную (если не определяющую) роль в этих процессах.

Сравнение антиоксидантных свойств различных производных С

60 (PEG (полиэтиленгликоль)-С

60,

PVP-С60

, CD-С60

, C60

, содержащего ОН-группы и С

60-изостеариновая кислота) по отношению к кера-

тиноцитам кожи человека выявило мощный антира-дикальный акцепторный потенциал всех этих соеди-нений [37].

Из-за декларируемого многими авторами отсут-ствия видимой токсичности и уникальных физико-химических свойств особый интерес вызывают фуллеролы. Гидроксилированный водорастворимый С

60(С

60HyFn) благодаря антиоксидантному действию

ингибирует катаболическую стресс-индуцированную продукцию матричных металлопротеиназ ММР-1, ММР-3 и ММР-13, а также апоптоз и преждевремен-ное старение в культурах человеческих хондроцитов. Это позволяет предполагать возможность его исполь-зования в качестве защитного агента против остео-артрита [38]. При определенных условиях такие высоко-гидроксилированные фуллерены могут существенно снижать накопление жира и генерацию АФК [39].

Акцепторную активность по отношению к су-пероксидрадикалу в системе ксантин/ксантин- оксидаза проявлял фуллерол С

60(ОН)

24, не оказывая

генотоксических эффектов и демонстрируя цитопро-текторные свойства в широком диапазоне концентра-ций (11–221 μмоль/л). Однако по другим данным, при исследовании доксорубицин-индуцированной кардио-токсичности этот же фуллерол размером 7 нм при концентрации 1–100 μмоль/мл вызывает морфологи-

144

’2

01


ческие изменения в клетках сосудов эндотелия, инги-бирует их пролиферацию и активирует аутофагию. Это сопровождается накоплением в клетках полиубикви-тированных белков, что активирует аутофагию [40, 41].

Другой гидроксилированный фуллерол C60

(OH)22

в диапазоне наномолярных концентраций вызывал ингибирование роста клеток. Эффект зависел от ха-рактеристик конкретной клеточной линии, дозы и времени его действия. В то же время C

60(OH)

22, как

и С60

(ОН)24

, значительно подавлял индуцированную доксорубицином цитотоксичность при любых концен-трациях независимо от времени добавления фуллерола. Считается, что эти свойства С

60(ОН)

22 опосредованы

его высокой акцепторной активностью по отношению именно к ОН-радикалам [41]. При концентрациях бо-лее 10 μмоль/л фуллеролы в ряде экспериментов про-являли выраженную цитотоксичность [42].

Некоторые водорастворимые фуллерены [43] спо-собны проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и, противодействуя оксидативному стрессу, вли-ять на пролиферацию клеток мозга [44]. In vitro было смоделировано взаимодействие наночастиц водорас-творимого карбоксифуллерена С

60(С(СООН)

2)

2 с клет-

ками ГЭБ в условиях окислительного стресса, вызван-


1. Orlova M.A., Orlov A.P. Role of zinc in an organism and its influence on processes leading to apoptosis. Br J Med Res 2011;1:239–305.2. Portt L., Norman G., Clapp C., Greenwood M. Anti-apoptosis and cell survival. Biochim Biophys Acta 2011;1813:238–59.

3. Shvedova A.A., Kagan V.E., Fadeel B. Close encounters of the small kind: adverse effects of man-made materials interfacing with the nano-cosmos of biological systems. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2010;50:63–88.4. Markovic Z., Trajkovic V. Biomedical potential of the reactive oxygen species

generation and quenching by fullerenes (C60

). Biomaterials 2008;29:3561–73.5. Yamakoshi Y., Umezawa N., Ryu A. et al. Active oxygen species generated from photoexcited fullerene (C

60) as potential

medicines: O2-* versus 1O

2. J Am Chem Soc

2003;125:12803–9.

ного пероксидом водорода, которое показало, что частицы этого соединения

селективно проникают пре-

имущественно в окисленные (а не нормальные) клет-ки эндотелия микрососудов, сохраняя их целостность за счет подавления Н

2О

2-индуцированной деполиме-

ризации F-актина [45].Карбоксифуллерены продемонстрировали in vivo

свою эффективность в предотвращении нейродегенера-ции при амиотрофическом латеральном склерозе [46].

Водорастворимые фуллеролы считаются главным достижением нанотехнологий для нейромедицины [47]. При концентрациях от 10 до 100 μмоль/л они на 10–80 % ингибируют активность глутаматных ре-цепторов. Однократная обработка клеток нейроэпи-телиомы человека (линия SK-N-MC) нетоксичной концентрацией водорастворимого С

60-бис-аддукта

(рис. 2) вызывала модуляцию экспрессии аденозино-вых рецепторов с увеличением экспрессии A2A- и A2B-рецепторов мРНК и повышением уровня А1 и А2А белков [48].

Однако нельзя забывать, что наряду с нейропро-текторным возможно и нейротоксическое действие фуллеренов, проявления которого пока изучены дале-ко недостаточно.

T3SS SK-N-MC cells

A1 A2A

Рис. 2. Аденозиновые рецепторы в SK-N-MC линии клеток нейроэпителиомы человека во взаимодействии с аддуктом фуллерена С60

[49]

15

4’

20

12


6. Sayes C.M., Gobin A.M., Ausman K.D. et al. Nano- C

60 cytotoxicity is due to lipid

peroxidation. Biomaterials 2005;26:7587–95.7. Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E., Pirisi L. Synthesis of 14C-labeled C

60, its

suspension in water, and its uptake by human keratinocytes. J Am Chem Soc 1994;116:4517–8.8. Maeda R., Noiri E., Isobe H. et al. A water-soluble fullerene vesicle alleviates angiotensin II-induced oxidative stress in human umbilical venous endothelial cells. Hypertension Res 2008;31:141–51.9. Kolosnjaj J., Szwarc H., Moussa F. Toxicity studies of fullerenes and derivatives. Adv Exp Med Biol 2007;620:168–80. 10. Jia G., Wang H., Yan L. et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene. Environ Sci Technol 2005;39:1378–83.11. Sayes C.M., Marchione A.A., Reed K.L., Warheit D.B. Comparative pulmonary toxicity assessments of C

60 water suspensions

in rats: few differences in fullerene toxicity in vivo in contrast to in vitro profiles. Nano Lett 2007;7:2399–406.12. Baker G.L., Gupta A., Clark M.L. et al. Inhalation toxicity and lung toxicokinetics of C

60 fullerene nanoparticles and

microparticles. Toxicol Sci 2008;101:122–31.13. Horie M., Nishio K., Kato H. et al. In vitro evaluation of cellular responses induced by stable fullerene C

60 medium dispersion.

J Biochem 2010;148:289–98. 14. Zhou S., Burger C., Chu B. et al. Spherical bilayer vesicles of fullerene-based surfactants in water: a laser light scattering study. Science 2001;291:1944–7.15. Sawamura M., Kawai K., Matsuo Y. et al. Stacking of conical mesogens with a fullerene apex into polar columns in crystals and liquid crystals. Nature 2002;419:702–5.16. Yin J.J., Lao F., Fu P.P. et al. The scavenging of reactive oxygen species and the potential for cell protection by functionalized fullerene materials. Biomaterials 2009;30:611–21.17. Husebo L.O., Sitharaman B., Furukawa K. et al. Fullerenols revisited as stable radical anions. J Am Chem Soc 2004;126:12055–64. 18. Yamakoshi Y.N., Yagami T., Sueyoshi S., Miyata N. Acridine adduct of [60]fullerene with enhanced DNA-cleaving activity. J Org Chem 1996;61:7236–7.19. Makha M., Purich A., Raston C.L., Sobolev A.N. Structural diversity of host-guest and intercalation complexes of fullerene C

60. Eur J Inorg Chem

2006;3:507–17.20. Deguchi S., Mukai S.A., Tsudome M., Horikoshi K. Facile generation of fullerene nanoparticles by hand-grinding. Adv Mater 2006;18:729–32.21. Quaranta A., Zhang Y., Filippone S. et al. Photophysical studies of six amphiphilic 2:1 cyclodextrin:[60]fullerene derivatives. Chem Phys 2006;325:397–403.

22. Dhawan A., Taurozzi J.S., Pandey A.K. et al. Stable colloidal dispersions of C

60

fullerenes in water: evidence for genotoxicity. Environ Sci Technol 2006;40:7394–401.23. Deguchi S., Alargova R.G., Tsujii K. Stable dispersions of fullerenes, C

60 and C

70,

in water: preparation and characterization. Langmuir 2001;17:6013–7. 24. Lyon D.Y., Adams L.K., Falkner J.C., Alvarez P.J. Antibacterial activity of fullerene water suspensions: effects of preparation method and particle size. Environ Sci Technol 2006;40:4360–6.25. Brant J.A., Labille J., Bottero J.Y., Wiesner M.R. Characterizing the impact of preparation method on fullerene cluster structure and chemistry. Langmuir 2006;22:3878–85.26. Cook S.M., Aker W.G., Rasulev B.F. et al.Choosing safe dispersing media for С

60

fullerenes by using cytotoxicity tests on the bacterium Escherichia coli. J Hazar Mater 2010;176:367–73.27. Cho M., Fortner J.D., Hughes J.B., Kim J.H. Escherichia coli inactivation by water-soluble, ozonated С

60 derivative:

kinetics and mechanisms. Envir Sci Technol 2009;43:7410–5.28. Каркищенко Н.Н. Нанобезопасность: новые подходы к оценке рисков и токсичности наноматериалов. Биомедицина 2009;1:5–27.29. Nishimura T., Kubota R., Tahara M. et al. Biological effects of fullerene С

60

in mouse embryonic stem cells. Toxicol Lett 2006;164S:S214.30. Trpkovic A., Todorovic-Markovic B., Kleut D. et al. Oxidative stress-mediated hemolytic activity of solvent exchange-prepared fullerene (С

60) nanoparticles.

Nanotechnol 2010;21(37):375102.31. Costa C.L.A., Chaves I.S., Ventura-Lima J. et al. In vitro evaluation of co-exposure of arsenium and an organic nanomaterial (fullerene, С

60) in zebrafish hepatocytes.

Comp Biochem Physiol C 2012;155:206–12. 32. Hu Z., Guan W., Wang W. et al. Protective effects of a novel cystine С

60

derivative on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma PC12 cells. Chem Biol Interact 2007;167:135–44.33. Hu Z., Guan W., Wang W. et al. Synthesis of amphiphilic amino acid С

60 derivatives

and their protective effect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells. Carbon 2008;46:99–109. 34. Wang I.C., Tai L.A., Lee D.D. et al. С

60 and water-soluble fullerene derivatives as

antioxidants against radical-initiated lipid peroxidation. J Med Chem 1999;42: 4614–20.35. Monti D., Moretti L., Salvioli S. et al. С

60 carboxyfullerene exerts a protective

activity against oxidative stress-induced apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;277:711–7.

36. Guan S., Bao Y., Jiang B., An L. Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphyllaon hydrogen peroxide-induced oxidative PC12 cell death. Eur J Pharmacol 2006;538:73–9. 37. Xiao L., Takada H., Maeda K. et al. Antioxidant effects of water-soluble fullerene derivatives against ultraviolet ray or peroxylipid through their action of scavenging the reactive oxygen species in human skin keratinocytes. Biomed Pharmacotherapy 2005;59:351–8. 38. Alcaraz M.J., Megías J., García-Arnandis I. et al. New molecular targets for the treatment of osteoarthritis. Biochem Pharmacol 2010;80:13–21. 39. Bal R., Turk G., Tuzcu M. et al. Protective effects of nanostructures of hydrated С

60 fullerene on reproductive

function in streptozotocin-diabetic male rats. Toxicology 2011;282:69–81. 40. Mirkov S.M., Djordjevic A.N., Andric N.L. et al. Nitric oxide-scavenging activity of polyhydroxylated fullerenol, С

60(OH)

24.

Nitric Oxide 2004;11:201–7. 41. Bogdanovic G., Koji V., Dordevic A. et al. Modulating activity of fullerol С

60(OH)

22 on doxorubicin-induced

cytotoxicity. Toxicol In Vitro 2004;18: 629–37. 42. Wielgus A.R., Zhao B., Chignell C.F. et al. Phototoxicity and cytotoxicity of fullerol in human retinal pigment epithelial cells. Toxicol Appl Pharmacol 2010; 242:79–90. 43. Cagle D.W., Kennel S.J., Mirzadeh S. et al. In vivo studies of fullerene-based materials using endohedral metallofullerene radiotracers. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:5182–7. 44. Oberdorster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C

60) induce

oxidative stress in the brain of juvenile largemouth bass. Environ Health Perspect 2004;112:1058–62. 45. Lao F., Chen L., Li W. et al. Fullerene nanoparticles selectively enter oxidation-damaged cerebral microvessel endothelial cells and inhibit JNK related apoptosis. Acs Nano 2009;3:3358–68. 46. Lin J., Wu C. Surface characterization and platelet adhesion studies on polyurethane surface immobilized with C

60.

Biomaterials 1999;20:1613–20. 47. Linazasoro G. Potential applications of nanotechnologies to Parkinson’s disease therapy. Parkinson Relat Disor 2008; 14:383–92. 48. Morimoto Y., Hirohashi M., Ogami A. et al. Inflammogenic effect of well-characterized fullerenes in inhalation and intratracheal instillation studies. Part Fibre Toxicol 2010;7:4–22.49. Lee Y.T., Chiang L.Y., Chen W.J., Hsu H.C. Water-soluble hexasulfobutyl-[60]-fullerene inhibits low-density lipoprotein oxidation in aqueous and lipophilic phases. Proc Soc Exp Biol Med 2000;224:69–75.

Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я164

’2

01

2 Мутационный статус резистентных к иматинибу больных хроническим миелолейкозом

Е.Г. Овсянникова1, К.Д. Капланов2, Т.Ю. Клиточенко2, А.В. Мисюрин3, И.Л. Давыдкин4, Л.В. Заклякова1, Е.А. Попов1, Б.Н. Левитан1

1ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрава России; 2 ГБУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер № 1»;

3ООО «ГеноТехнология», Москва;4НИИ гематологии, трансфузиологии и интенсивной терапии ГБОУ ВПО

«Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России

Контакты: Елена Георгиевна Овсянникова [email protected]

В исследовании проводится анализ мутационного статуса у 36 больных Ph+ хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в хронической стадии с первичной и вторичной резистентностью к терапии иматинибом. Мутации гена BCR-ABL определены методом пря-мого секвенирования ДНК. В результате исследования мутации киназного домена BCR-ABL были обнаружены у 30,5 % (у 11 из 36) этих больных. Большинство выявленных мутаций относились к миссенс-мутациям: Q252H, M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V, F359C, F486S. Показана значительно более низкая бессобытийная 4-летняя выживаемость больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL по сравнению с больными ХМЛ без мутаций (18 % vs 53 %; р = 0,003).Результаты исследования могут быть использованы в качестве справочного материала при принятии решений о тактике лече-ния резистентных к иматинибу больных ХМЛ с клинически значимыми мутациями гена BCR-ABL.

Ключевые слова: хронический миелолейкоз, мутации гена BCR-ABL, резистентность, иматиниб

Mutation status of refractory to imatinib patients with chronic myeloid leukemia

E.G. Ovsyannikova1, K.D. Kaplanov2, T.Yu. Klitochenko2, A.V. Misyurin3, I.L. Davydkin4, L.V. Zaklyakova1, E.A. Popov1, B.N. Levitan1

1Astrakhan State Medical Academy;2Volgograd Regional Clinical Oncological Dispensary № 1;

3LLC «GenoTehnologiya», Moscow;4Research Institute of Hematology, Transfusiology and Intensive Care, Samara State Medical University, Ministry of Health of Russia

Mutation status of 36 chronic myeloid leukemia (CML) patients in chronic phase with primary and secondary imatinib resistance was ana-lyzed. BCR-ABL mutations identified by direct DNA sequencing. BCR-ABL kinase domain mutations were detected in 30.5 % (11 of 36) of those patients. Most of identified mutations were missense mutations: Q252H, M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V, F359C, F486S. Patients with BCR-ABL mutations have significantly lower 4-year event-free survival compared with CML patients without mutations (18 % vs. 53 %; р = 0.003).The results can be used as reference information in deciding on therapy in imatinib resistant CML patients with clinically relevant BCR-ABL mutations.

Key words: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL mutations, resistance, imatinib

Таргетная терапия хронического миелолейкоза (ХМЛ) не только значительно улучшила качество жиз-ни, но и позволила увеличить выживаемость больных ХМЛ [1]. В то же время у части больных развивается резистентность к лечению ингибиторами тирозинки-назы (ИТК) BCR-ABL как первого, так и последующих поколений.

В настоящее время широко обсуждается один из аспектов BCR-ABL-зависимого механизма резис-тентности к иматинибу – мутации гена BCR-ABL [2, 3]. Однако не все из более чем 90 [4, 5] описанных in vitro мутаций киназного домена BCR-ABL являются клини-чески значимыми. Неоднозначной считается и интер-претация данных по степени чувствительности in vitro разных мутантных клонов к воздействию иматиниба,

разработанных на основе половинной максимальной ингибирующей концентрации IC

50 (inhibitory concent-

ration 50 %) [6–8]. В связи с этим большое значение имеют данные клинических исследований. Так, ре-зультаты исследования GIMEMA показали, что на увеличение частоты возникновения мутаций гена BCR-ABL влияет не только предлеченность больных ХМЛ и стадия заболевания, но и степень резистент-ности к иматинибу [2, 9].

Определение мутационного статуса у резистент-ных к терапии иматинибом больных ХМЛ в настоящее время входит в необходимый перечень исследований согласно критериям European Leukemia Net (ELN), опубликованным в 2009 г. [10]. В 2011 г. ELN были раз-работаны рекомендации по мониторингу мутаций ге-

Г Е М О Б Л А С Т О З Ы : Д И А Г Н О С Т И К А , Л Е Ч Е Н И Е , С О П Р О В О Д И Т Е Л Ь Н А Я Т Е Р А П И Я 17

4’

20

12на BCR-ABL [11]. В 2012 г. рабочая группа ESMO

(Европейское общество медицинской онкологии) представила новые рекомендации по диагностике, ле-чению и мониторингу ХМЛ, где также освещены аспекты мутационного мониторинга [12].

В нашей работе анализируются результаты лечения резистентных к иматинибу больных ХМЛ в хроничес-кой фазе с выявленными мутациями гена BCR-ABL.

Материалы и методыВ анализ был включен 141 пациент из популяции

больных ХМЛ в хронической фазе (Астраханская и Волгоградская области). Исследование мутаций в локусе гена BCR-ABL было проведено у 36 резистент-ных к иматинибу пациентов. Мутации гена BCR-ABL определены методом прямого секвенирования ДНК (ООО «ГеноТехнология», Москва).

При сравнении 2 групп больных с мутациями гена BCR-ABL и без мутаций по полу, возрасту на момент диагностики ХМЛ, сроку предлеченности, длитель-ности терапии иматинибом статистически значимых различий не обнаружено. Преобладали больные с пер-вичной резистентностью к лечению, как в группе больных ХМЛ с обнаруженными мутациями, так и в группе больных без мутаций (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительный анализ резистентных к иматинибу больных ХМЛ с мутациями и без мутаций гена BCR-ABL

ПоказательМутации

обнаружены, n = 11

Мутаций нет,n = 25

Статистиче-ская

значимость

Число мужчин (%) 8 (73) 10 (40)

χ2 = 2,09; р = 0,15Число женщин (%)

3 (23) χ2 = 2,91; р = 0,08

15 (60)χ2 = 1,28; р = 0,25

Возраст на мо-мент диагноза, Ме (годы)

47 (39; 61) 55 (45; 62) р = 0,6*

Предлеченность, Ме (мес)

6,4 (1,7; 46) 2,9 (1,7; 23) р = 0,3**

Длительность терапии иматини-бом, Ме (мес)

40 (27; 48) 39 (30; 61) р = 0,7*

Первичная резистентность, %

73 (8 из 11) 88 (22 из 25)

χ2 = 0,42; р = 0,5Вторичная

резистентность, %

23 (3 из 11)χ2 = 2,91; р = 0,08

12 (3 из 25) χ2 = 8,73; р = 0,003

Примечание. * – критерий Стьюдента; ** – критерий Манна–Уитни.

В группе из 11 больных ХМЛ, резистентных к ле-чению иматинибом с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL, было 8 мужчин и 3 женщины. Медиана возраста составила 47 (39; 61) лет. На момент начала терапии иматинибом все больные находились в хро-

нической фазе ХМЛ. Медиана длительности заболе-вания от момента установления диагноза до момента проведения мутационного анализа в группе больных ХМЛ с обнаруженными мутациями составила 64 (23; 93) мес – минимум 18 мес, максимум более 8,5 лет. Большинство больных были предлечены, 1 пациент сразу начал лечение иматинибом. По длительности предлеченности больные разделились на 2 равные группы: 1-я группа – пациенты предлечены менее 6 мес, 2-я группа – более 29 мес (до 72 мес – 6 лет). Медиана времени предлеченности (гидроксикарба-мид, бусульфан, интерферон (ИФ), химиотерапия (ХТ) с включением цитарабина) ХМЛ до начала тера-пии иматинибом составила 6,4 (1,7; 46) мес, что сопо-ставимо с медианой предлеченности общей группы обследованных больных ХМЛ – 4 мес. Медиана дли-тельности терапии иматинибом составила 40 (28; 48) мес. Первичная резистентность к иматинибу конста-тирована у 73 % (у 8 из 11), вторичная резистент-ность – у 23 % (у 3 из 11) пациентов.

Статистическая обработка полученных нами дан-ных проводилась с использованием компьютерного пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и SPSS [13]. При сравнении групп пациентов по категориаль-ным признакам применяли критерий χ2 с поправкой Йетса. Для оценки статистической значимости разли-чий в 2 несвязанных группах применялся t-критерий Стьюдента или непараметрический критерий Манна–Уитни. Расчет кумулятивной общей (ОВ), беспрогрес-сивной (БПВ) и бессобытийной (БСВ) выживаемости проведен по методу Каплана–Майера. Выживаемость рассчитывалась от даты начала терапии иматинибом до даты наступления неблагоприятного события или последнего контакта с пациентом. При оценке ОВ со-бытием являлась смерть больного от любой причины. При оценке БПВ событием являлась прогрессия забо-левания (факт трансформации хронической фазы ХМЛ в фазу акселерации или в бластный криз, смерть больного). При расчете БСВ событиями считались: потеря полного гематологического ответа (ПГО), по-теря полного цитогенетического ответа (ПЦО), по теря большого молекулярного ответа (БМО), смерть больно-го. Одномерный анализ на предмет выявления прогно-стических факторов для ОВ, БПВ, БСВ про водился с ис-пользованием логарифмического ран гового критерия. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты и обсуждениеВ результате исследования мутации киназного до-

мена BCR-ABL были обнаружены у 30,5 % (у 11 из 36) больных ХМЛ, резистентных к иматинибу. Большин-ство выявленных мутаций относились к миссенс-му-тациям, приводящим к замене аминокислотных остат-ков, – Q252H, M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V, F359C, F486S. Всего выявлено 12 мутаций (табл. 2).


’2

01

2 Таблица 2. Мутации гена BCR-ABL у больных ХМЛ, резистентных к лечению иматинибом

№Код

больногоРасположение Мутация

1. М.промежуточ-ная последо-вательность

T315I

2. В.

P-петля

M244V, G250E

3. Б. Q252H

4. О. M244V

5. П. E255K/V

6. С. Y253Н

7. Т. G250E

8. Св. каталитичес-кий домен

F359V

9. И. F359C

10 Ка.

А-петля

F486S

11. К.

del 1086-1157(делеция 72 нуклеотидов 7-го

экзона ABL гена BCR/ABL в положении 1086-1157,

соответствующей мРНК)

Как представлено в табл. 2, 58 % (7 из 12) мутаций, выявленных в нашем исследовании, расположены на участке гена BCR-ABL, кодирующем Р-петлю. По данным S. Branford et al. мутации в локусе гена BCR-ABL, ответственном за кодировку P-петли, явля-ются причиной высокой степени резистентности к иматинибу у пациентов с ХМЛ [14]. Основанием для этого является то, что в Р-петле располагается «цель» иматиниба – АТФ-связывающий карман. Как след-ствие данных мутаций, происходит нарушение связы-вания иматиниба с белком – BCR-ABL тирозинкина-зой. У 2 (17 %) больных выявлены мутации в зоне каталитического домена. Мутации в данной зоне при-водят к чрезмерно высокой тирозинкиназной актив-ности, так как каталитический домен участвует во взаимодействии с белками-регуляторами и передаче внутриклеточных сигналов. Мутации гена BCR-ABL на участке, кодирующем А-петлю, выявлены у 17 % (у 2 из 12) больных. Регион A-петли (активационный домен) – участок тирозинкиназы, который закрывает каталитический центр при сохранении неактивной конформации BCR-ABL [15]. Мутации в регионе А-петли, так же как и Р-петли, могут изменить кон-фигурацию петлевой структуры и перевести белок в активную конформацию. Это приводит к снижению эффективности иматиниба, так как иматиниб взаимо-действует только с неактивной формой BCR-ABL-киназы.

Благодаря исследованиям in vitro доказана различ-ная степень чувствительности измененного под влия-

нием мутаций гена BCR-ABL к воздействию имати-ниба и других ИТК. Однако «прямой» перенос данных из исследований, проведенных in vitro, в кли-ническую практику не всегда возможен. Мутацией, неопровержимо подтвердившей в клинической прак-тике данные о чрезвычайно высокой резистентности к воздействию ИТК, полученные in vitro, остается мутация T315I [16, 17]. Выявление мутации T315I яв-ляется абсолютным противопоказанием к терапии иматинибом и ИТК 2-го поколения. В нашем иссле-довании мутация T315I зарегистрирована у 1 больно-го из 12 (8 %).

Обнаруженные нами мутации относятся к семи наиболее часто встречающимся мутациям гена BCR-ABL: M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, M351T, F359V. В работе S. Soverini et al. показано, что именно эти мутации составляют 85 % всех ассоциированных с резистентностью к иматинибу мутаций [2]. Из 12 вы-явленных нами мутаций к данной группе относятся 9, что составляет 75 %.

Был проведен анализ ОВ, БПВ и БСВ больных с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL и без му-таций. Общая 5-летняя выживаемость больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL (1-я группа) равна 67 %. Умерло 27 % (3 из 11) больных. В группе больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (2-я группа) общая 5-летняя выживаемость составила 94 %. Умерло 4 % (1 из 25) больных. Различия между группами ста-тистически значимы, р = 0,05 (рис. 1).

Анализ кривых БПВ показал, что 5-летняя БПВ больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL (1-я группа) составляет 45 %. Прогрессия заболе-вания констатирована у 36 % (у 4 из 11) больных. В группе больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (2-я группа) заболевание прогрессировало у 1 из 25 больных (4 %). Пятилетняя выживаемость равна 94 %.

Мес

2

Выживаемость

Событие:смерть больного

1

р = 0,05

Рис. 1. ОВ в зависимости от мутационного статуса (1 – мутации обнаружены, 2 – нет мутаций)


4’

20

12 Различия между группами статистически значимы,

р = 0,02 (рис. 2).Четырехлетняя БСВ больных ХМЛ с обнаружен-

ными мутациями гена BCR-ABL (1-я группа) равна 18 %. Событие зарегистрировано у 9 из 11 больных (82 %). Медиана выживаемости – 15 (4; 26) мес. В группе больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (2-я группа) 4-летняя БСВ составила 53 %. События зафиксированы у 9 из 25 больных (36 %). Медиана вы-живаемости – 58 (28; 88) мес. Различия между группа-ми статистически значимы, р = 0,003 (рис. 3).

Анализ выживаемости в зависимости от мутаци-онного статуса показал, что 5-летние ОВ и БПВ, 4-лет-няя БСВ достоверно ниже у больных ХМЛ с наличием мутаций гена BCR-ABL. Таким образом, в нашем ис-следовании наличие мутаций гена BCR-ABL является прогностически неблагоприятным фактором отдален-ной выживаемости при ХМЛ.

Наши данные созвучны с результатами исследова-ния A. Quintas-Cardama et al., в котором показано, что 4-летняя БСВ пациентов в хронической фазе ХМЛ, не имеющих мутаций, с одной мутацией гена BCR-ABL или более составила 56 %, 49 % и 0 % соответственно (р = 0,02); ОВ – 91 %, 69 % и 75 % соответственно (р = 0,13) [18].

В табл. 3 представлены сводные данные о течении заболевания у больных ХМЛ с выявленными мутаци-ями на фоне коррекции терапии.

Таблица составлена таким образом, что первыми представлены больные, имеющие мутации гена BCR-ABL, которые, по данным исследования in vitro, способствуют высокой резистентности к терапии иматинибом, т. е. мутантный клон не чувствителен к лечению. Графы, содержащие данные о таких боль-ных, окрашены в красный цвет (по аналогии с табли-цами половинной максимальной ингибирующей концентрации IC

50 ИТК). Графы пациентов с мута-

циями, умеренно снижающими чувствительность к иматинибу в тестах in vitro, окрашены в желтый цвет. Мутаций, характеризующих высокую чувстви-тельность к иматинибу, в нашем исследовании не было. Под обозначением мутаций указано значение IC

50 иматиниба [6, 7]. Как представлено в табл. 3, мутация T315I обнару-

жена у 1 больного ХМЛ (код пациента – М.). Больной был предлечен гидреа, цитарабином в течение 31 мес, иматиниб получал в нарастающей дозе до 800 мг. За-регистрирована первичная резистентность к лечению иматинибом. В связи с отсутствием ЦО в течение 47 мес лечения, проведено исследование мутационно-го статуса и назначен нилотиниб. Учитывая имеющи-еся на сегодняшний день данные о том, что присут-ствие мутации T315I влечет за собой полное отсутствие чувствительности как к иматинибу, так и к ИТК 2-го поколения, по получении результата мутационного анализа нилотиниб был отменен, больной переведен на терапию гидроксикарбамидом. На терапии гидро-ксикарбамидом получен малЦО. Больному рекомен-довано проведение трансплантации костного мозга. Определение мутационного статуса для данного паци-ента было крайне важным, так как продолжение назначенной терапии нилотинибом (после неэффек-тивности иматиниба) в присутствии мутации T315I могло бы привести к появлению дополнительных мутаций, быстрой прогрессии заболевания.

Мутация Y253Н выявлена у 1 больного (код паци-ента – С.). Данная мутация относится к мутациям, способствующим развитию полного отсутствия чувст-вительности к лечению иматинибом. По результатам исследований in vitro мутация Y253H приводит к уве-личению IC

50 в пролиферативном тесте (более чем

в 30 раз) и в биохимическом тесте на фосфорилирую-щую активность (в 18 раз) [6, 19].

Иматиниб данному больному был назначен через 1 мес от даты диагноза (предлеченность – ИФ, гидреа).


Мес

Рис. 2. БПВ в зависимости от мутационного статуса (1 – мутации обнаружены, 2 – нет мутаций)

Событие:– переход в фазу акселерации;– бластный криз; – смерть больного

2

р = 0,02

1


Мес

Рис. 3. БСВ в зависимости от мутационного статуса (1 – мутации обнаружены, 2 – нет мутаций)

р = 0,003

1

2

Событие:– потеря ПГО;– потеря БМО;– потеря ПЦО; – смерть больного


’2

01

2

В процессе лечения констатирована первичная рези-стентность к иматинибу. На дозе 600 мг к 22 месяцам терапии иматинибом достигнут минЦО, доза иматини-ба увеличена до 800 мг. Однако заболевание быстро прогрессировало, был потерян ГО. После выявления мутации Y253H терапия иматинибом прекращена, на-значено лечение гидроксикарбамидом. С учетом дан-ных исследований о снижении чувствительности к ле-чению нилотинибом у больных с мутацией Y253H [8, 11, 12] больному планировалось лечение дазатини-

бом. Через 2 мес лечения гидреа развился бластный криз, больной умер.

У 1 больного (код пациента – П.) выявлена мута-ция E255K/V. Пациент в течение 6 мес был предлечен гидреа, ИФ, ХТ (цитарабин). Иматиниб в нарастаю-щей дозировке до 800 мг получал в течение 37 мес. ЦО не достигнут, констатирована первичная резистент-ность к иматинибу. Определение мутационного стату-са выявило наличие мутации E255K/V, которая вызы-вает высокую степень резистентности к иматинибу.

Таблица 3. Клинический анализ группы больных ХМЛ с мутациями гена BCR-ABL

Код боль-ного

Мутация, IC

50, нм

Срок предле-ченности, мес

Предле-ченность

Срок лечения иматинибом до даты анализа,

мес

Иматиниб

ЦО БМОРезис-тент -ность

Смена терапии после мутацион-

ного анализа, срок (мес)

Исход

дозасрок, мес

М.T315I > 6400

31гидреа,

ХТ47

400600800

нило-тиниб

32691

нет нетпер-

вичнаягидреа, 23 малЦО

С.Y253Н > 6400

1ИФ,

гидреа28

400 600 800

14 8 9

мин-ЦО,

потеря ГО

нетпер-

вичнаягидреа, 2 умер

П.E255K5200/V> 6400

6ИФ,

гидреа, ХТ

37400600800

96

22нет нет

пер-вичная

ИФ, 16ХТ, 16

гидреа, 16умер

Б.Q252H

132529

гидреа, ХТИФ

16400600800

72911

нет нетпер-

вичнаянилотиниб, 2

ХТ, 1умер

О.M244V

200072

гидреа, ИФ,

миелосан33

400600800

23106

нет малЦО

нетпер-

вичная

нилотиниб, 5минЦО

потеря ГО

иматиниб, 6нет ЦО,

бластный криз

гидреа, 16 нет ЦО

Т.G250E

13502 гидреа 12

400600

93

малЦО нетпер-

вичная

нилотиниб, 3 потеря ЦО

дазатиниб, 11ЧЦОПГО

В.

M244V2000

G250E1350

70гидреа,

ХТ,миелосан

31400600800

222625

нетминЦО

нетнет

пер-вичная

– минЦО

Св.F359V1825

2 гидреа 23400 600

1319

ПЦО,потеряПЦО

нетвто-

ричная– ЧЦО

И.F359C1825

46гидреа

47400600800

131625

ЧЦО нетпер-

вичная–

ЧЦО

Ка.F486S

8,105 гидреа 61

400600800

262411

ПЦОЧЦО

ПМО, потеря ПМО

вто-ричная

дазатиниб, 6ПЦОБМО

К.del 1086-

11574 гидреа 18

400600

1829

потеряПЦО,ПЦО

потеря ПМО, БМО

вто-ричная

–ПЦО БМО

Примечание. ЦО – цитогенетический ответ; ГО – гематологический ответ; ПМО – полный молекулярный ответ; ЧЦО – частичный цито-генетический ответ; малЦО – малый цитогенетический ответ; минЦО – минимальный цитогенетический ответ.


4’

20

12Иматиниб отменен, больной получал ИФ-терапию –

16 мес, ХТ – 16 мес, гидроксикарбамид – 16 мес без эффекта. Развилась прогрессия ХМЛ, больной умер.

По результатам исследований клетки с мутацией E255K/V имеют чувствительность к дазатинибу [12].

У 1 пациента была выявлена мутация Q252H (код больного – Б.). Предлеченность гидреа, ИФ, ХТ (ци-тарабин) составила 29 мес. У больного была зарегист-рирована первичная резистентность к ХТ. Мутацион-ный анализ указал на присутствие мутации Q252H. Так как эта мутация относится к мутациям с промежуточ-ной или умеренной чувствительностью к иматинибу [6, 7], была проведена эскалация дозы иматиниба до 800 мг. Повышение дозы иматиниба не привело к улучшению результатов лечения. Исходя из иссле-дования IC

50 нилотиниба и дазатиниба, оба препарата

обладают умеренным воздействием на клон BCR-ABL, измененный под влиянием мутации Q252H. Менее чувствителен к данной мутации дазатиниб [8]. Боль-ному был назначен нилотиниб, однако заболевание прогрессировало, пациент умер.

Пациент с обнаруженной мутацией М244V (код больного – О.) имел длительный срок предлеченнос-ти – 72 мес (6 лет) гидреа, ИФ, миелосаном. У боль-ного была констатирована первичная резистентность к терапии иматинибом. Через 33 мес лечения имати-нибом при проведении мутационного анализа была выявлена мутация М244V.

Мутация М244V обладает промежуточной чувс-твительностью к иматинибу. Мнения исследователей в отношении данной мутации несколько разнятся. Увеличение дозы иматиниба может привести к улуч-шению результатов лечения – указывают A. Corbin et al. [20], T. O’Hare et al. [6] рекомендуют раннее ис-пользование ИТК 2-го поколения. В данном клини-ческом случае было проведено увеличение дозы има-тиниба до 800 мг. Корректировка терапии привела к достижению только малЦО. Так как клетки с мута-цией М244V имеют равную чувствительность к нило-тинибу и дазатинибу, больному был назначен нилоти-ниб. На фоне терапии нилотинибом в течение 5 мес пациент потерял ЦО и ГО. В связи с отсутствием воз-можности назначить другой ИТК возобновлено лече-ние иматинибом, однако заболевание прогрессировало до бластного криза. Иматиниб был отменен, больной переведен на терапию гидроксикарбамидом, получает ее в течение 16 мес, прогрессия заболевания приоста-новлена, однако ЦО более не достигнут.

У 1 пациента обнаружена мутация G250E (код больного – Т.). Срок предлеченности у данного боль-ного 2 мес с использованием гидреа. Через 12 мес терапии иматинибом в увеличенной дозе 600 мг у больного констатирована первичная резистентность к иматинибу, был достигнут малЦО.

Клетки, измененные под воздействием мутации G250E, характеризуются, по данным различных ис-следований, от промежуточного до высокого уровня

снижения чувствительности к иматинибу [6, 20] и в равной степени чувствительны к ИТК 2-го по-коления. Больному был назначен нилотиниб. Через 3 мес терапии нилотинибом констатирована потеря ЦО и больной переведен на дазатиниб. На терапии дазатинибом получен кратковременный ЧЦО, в то же время произошло снижение уровня транскрипта BCR-ABL почти в 2 раза, с 15 до 8 %, сохраняется ПГО.

Сочетание мутаций М244V и G250E было обнару-жено у 1 больного (код пациента – В.). Пациент имел большой срок предлеченности – 70 мес (более 5 лет) миелосаном, гидреа, ХТ. Получал иматиниб в дозе 400 мг, а затем 600 мг. Констатирована первичная ре-зистентность к иматинибу. До момента проведения мутационного анализа срок терапии составил 31 мес. Учитывая возраст больного на момент определения мутационного статуса (73 года), выраженную сопут-ствующую патологию и имеющиеся литературные данные о чувствительности клеток, измененных под влиянием мутации М244V и G250E, коррекция тера-пии проведена путем эскалации дозы иматиниба до 800 мг. На этом фоне был достигнут минЦО.

Мутация F359V обнаружена у 1 больного (код па-циента – Св.). Лечение иматинибом начато после 2 мес терапией гидреа. Достигнутый в срок 9 мес тера-пии ПЦО был утрачен. Констатирована вторичная резистентность к иматинибу, доза увеличена до 600 мг. При проведении мутационного исследования выявле-на мутация F359V. При продолжении терапии имати-нибом в той же дозе 600 мг у пациента был достигнут ЧЦО. По данным исследований, в том числе клини-ческих, при выявлении мутации F359V предпочти-тельнее назначение дазатиниба [8, 11, 12].

В 1 случае выявлена мутация F359С (код больно-го – И.). Предлеченность гидреа у данного пациента составляла 46 мес. Зарегистрирована вторичная резис-тентность к терапии иматинибом. На дозе 600 мг более чем через 18 мес от начала лечения был достигнут ЧЦО. Повышение дозы иматиниба до 800 мг не при-вело к улучшению ЦО. Исследование мутационного статуса проведено через 47 мес от начала терапии има-тинибом, выявлена мутация F359С. Данная мутация из группы F359V/C/I относится к числу клинически подтвержденных мутаций, снижающих чувствитель-ность к нилотинибу. Больной продолжает получать иматиниб в дозе 800 мг, сохраняется ЧЦО. В данном случае показано назначение дазатиниба [8, 11, 12].

У 1 больного обнаружена мутация F486S (код па-циента – Ка.). Больной был предлечен гидреа в тече-ние 5 мес. На дозе 600 мг иматиниба произошла поте-ря ПМО, затем ПЦО, у больного констатирована вторичная резистентность к иматинибу. Доза имати-ниба увеличена до 800 мг. При проведении мутацион-ного анализа обнаружена мутация F486S, обладающая способностью умеренно снижать чувствительность измененного клона BCR-ABL к терапии иматинибом. Чувствительность данной мутации in vitro к ИТК 2-го


’2

01

2


1. Deininger M., O’Brien S.G., Guilhot F. et al. International randomized study of interferon vs STI571 (IRIS) 8-year follow up: sustained survival and low risk for progression or events in patients with newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic phase (CML-CP) treated with imatinib. Blood 2009;114:1126 (abstr.). 2. Soverini S., Colarossi S., Gnani A. et al. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients:

by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Clin Cancer Res 2006;12(24):7374–9. 3. Nicolini F.E., Corm S., Le Q.H. et al. Mutation status and clinical outcome of 89 imatinib mesylate-resistant chronic myelogenous eukemia patients: a retrospective analysis from the French intergroup of CML (Fi(phi)-LMC GROUP). Leukemia 2006;20(6):1061–6.4. Branford S. Chronic myeloid leukemia: molecular monitoring in clinical practice.

Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007:376–83. 5. Apperley J.F. Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia. Lancet Oncol 2007;8:1018–29. 6. O’Hare T., Eide C.A., Deininger M.W. BCR-ABL kinase domain mutations, drug resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007;110:2242–9. 7. Redaelli S., Piazza R., Rostagno R. et al. Activity of bosutinib, dasatinib, and nilotinib against 18 imatinib-resistant

поколения почти равноценна [6, 7]. По данным от-дельных исследований in vitro, более эффективен при данной мутации нилотиниб [21]. Больному был назначен дазатиниб, достигнуты ПЦО и БМО.

У 1 больного обнаружена мутация в А-петле, del 1086-1157 – делеция 72 нуклеотидов 7-го экзона ABL гена BCR/ABL в положении 1086-1157, соответствую-щей мРНК (код пациента – К.). Больной был предле-чен гидреа в течение 4 мес. Достигнутые на дозе 400 мг иматиниба ПЦО и ПМО были утрачены, констатиро-вана вторичная резистентность. Доза иматиниба уве-личена до 600 мг. Оценка мутационного статуса про-ведена через 18 мес от начала терапии иматинибом, обнаружена del 1086-1157. Больной продолжил лече-ние иматинибом в дозе 600 мг, достигнуты ПЦО и БМО. В литературе клинических случаев с описани-ем этой мутации нами не обнаружено.

ЗаключениеРезюмируя анализ ответа на терапию иматинибом

у резистентных больных ХМЛ в хронической фазе за-болевания, имеющих мутации гена BCR-ABL, и резуль-таты коррекции терапии в нашем исследовании, а так-же используя литературные данные и исследования in vitro, можно сделать следующие выводы:

1. Наличие мутаций гена BCR-ABL является про-гностически неблагоприятным фактором отдаленной выживаемости при ХМЛ.

2. Исследование мутационного статуса показано всем больным ХМЛ в хронической фазе заболевания с наличием первичной и вторичной резистентности к лечению иматинибом. Коррекция лечения без учета мутационного статуса может привести к возникнове-нию новых мутаций, назначению неэффективной те-рапии и прогрессии заболевания.

3. Обнаружение мутации T315I является прямым противопоказанием к назначению ИТК и показанием к трансплантации костного мозга, альтернативным методам лечения.

4. Обнаружение мутации Y253H требует пре-кращения терапии иматинибом и назначения даза-тиниба.

5. При обнаружении мутации E255K/V терапию иматинибом прекратить, необходимо назначение ИТК 2-го поколения, по данным исследований, предпоч-тительнее дазатиниба.

6. При наличии мутаций F359V/С рекомендован перевод больных на ИТК 2-го поколения, с учетом исследований, предпочтительнее на дазатиниб.

7. При выявлении мутации Q252H лечение имати-нибом необходимо прекратить, показано назначение ИТК 2-го поколения, по данным отдельных исследо-ваний, предпочтительнее нилотиниба (в нашем на-блюдении нилотиниб был неэффективен).

8. При наличии мутации М244V иматиниб рекомен-дуется отменить, назначить ИТК 2-го поколения, с уче-том исследований in vitro, предпочтительнее дазатиниб.

9. Выявление мутации G250E требует отмены има-тиниба и назначения ИТК 2-го поколения, по данным исследований, предпочтительнее дазатиниба.

10. При обнаружении мутации F486S требуется отмена иматиниба и перевод больного на ИТК 2-го поколения, по данным отдельных исследований in vitro, большая чувствительность к нилотинибу (в нашем исследовании наблюдался положительный эффект от дазатиниба).

11. В исследовании мы наблюдали пациента с вто-ричной резистентностью к иматинибу с del 1086-1157. Эффективным было увеличение дозы иматиниба до 600 мг.

12. При обнаружении мутаций у больных старше 70 лет смену терапии необходимо проводить после оценки степени тяжести сопутствующей патологии. В нашем исследовании при наличии сочетания мута-ций М244V и G250E у пациентки 73-летнего возраста эффект достигнут эскалацией дозы иматиниба.

Результаты исследования могут быть использова-ны в качестве сравнительного материала при приня-тии решений о дальнейшей тактике лечения резис-тентных к иматинибу больных ХМЛ с клинически значимыми мутациями гена BCR-ABL.

Статья подготовлена при информационной поддержке компании «Бристол-Майерс Сквибб»


4’

20

12BCR/ABL mutants. J Clin Oncol 2009;

27:469–71.8. Soverini S., Rosti G., Iacobucci I. et al. Choosing the best second-line tyrosine kinase inhibitor in imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patients harboring Bcr-Abl kinase domain mutations: how reliable is the IC

50? The Oncologist 2011;

16:868–76. 9. Soverini S., Vitale A., Poerio A. et al. Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia patients already harbor BCR-ABL kinase domain mutations at low levels at the time of diagnosis. Haematologica 2011 Apr;96(4):552–7.10. Baccarani M., Cortes J., Pane F. et al. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2009;27(35):6041–51.11. Soverini S., Hochhaus A., Nicolini F.E. et al. BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood 2011;18(5):1208–15.

12. Baccarani M., Pileri S., Steegmann J.-L. et al. Chronic myeloid leukemia: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 23 (Supplement 7):vii72–vii77, 2012. 13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с. 14. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 2003;102:276–83. 15. Челышева Е.Ю., Шухов О.А., Лазарева О.В. др. Мутации киназного домена BCR-ABL при хроническом миелолейкозе. www.genetechnology.ru16. Минниахметов И.Р., Исламгулов Д.В., Рябчикова Н.Р. и др. Анализ мутации T315I в гене BCR-ABL1 у больных хрони-ческим миелолейкозом из Республики Башкортостан. Известия Самарского на-учного центра Российской академии наук, 2011. Т. 13, № 5(3). С. 263–267.

17. Ломаиа Е.Г., Романова Е.Г., Горюнова Е.Н. и др. Длительное течение заболевания у больного хроническим миелолейкозом с мутацией T315I гена BCR-ABL. Клиническое наблюдение и обзор литературы. Клин онкогематол 2010;3(4):375–9.18. Quintas-Cardama A., Ravandi F., Verstovsek S. et al. Outcome of patients with chronic myeloid leukemia with multiple ABL1 kinase domain mutations receiving tyrosine kinase inhibitor therapy. Haematologica 2011;96(6):918–24. 19. Куцев С.И., Вельченко М.В. Значение анализа мутаций гена BCR-ABL в оптимиза-ции таргетной терапии хронического миело-лейкоза. Клин онкогематол 2008;1(3):190–9.20. Corbin A., La Rose P., Stoffregen E. et al. Several BCR-ABL kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 2003;101(11):4611–4.21. Redaelli S., Mologni L., Rostagno R. et al. Three novel patient-derived BCR-ABL mutants show different sensitivity to second and third generation tyrosine kinase inhibitors. Am J Hematol 2012;87(11):E125–8.


’2

01

2 Влияние различных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках костного мозга на течение хронического

миелолейкоза при терапии ингибиторами тирозинкиназ

О.Ю. Виноградова, Е.А. Асеева, А.В. Воронцова, А.Г. Туркина, А.Л. Неверова, О.В. Лазарева, Е.Ю. Челышева, Г.А. Гусарова, Т.И. Колошейнова, Л.Ю. Колосова, С.Р. Горячева, М.В. Вахрушева, С.М. Куликов,

И.А. Тищенко, Л.В. Дяченко, А.И. Удовиченко, Г.А. Алимова, Е.В. Клеина, Л.А. Гребенюк, М.Л. Коннова, С.Ю. Смирнова, Н.Д. Хорошко, Е.В. Домрачева

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва

Контакты: Ольга Юрьевна Виноградова [email protected]

Возникновение дополнительных молекулярных и хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках обычно рассматривается как генетический маркер прогрессии хронического миелолейкоза (ХМЛ). Исследовано 457 больных в разных фазах ХМЛ, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) 1-го и 2-го поколения. В процессе терапии выявлено 50 случаев присутствия допол-нительных хромосомных аномалий (ДХА) в Ph+ клоне, их них в хронической фазе ХМЛ – 22 больных (Ме наблюдения с момента диагностики ХМЛ составила 117 мес, Ме терапии иматинибом – 62 мес). У 86 % пациентов в хронической фазе с аномалиями в Ph+-клетках наблюдали цитогенетическую резистентность, при этом их общая 5-летняя выживаемость составила 80 %, что достоверно ниже, чем у пациентов без ДХА (p < 0,005). Результаты терапии ИТК зависели от характера хромосомной аномалии в Ph+-клетках: при дополнительной хромосоме 8 терапия иматинибом эффективна, хотя получение полного цитогенетического ответа (ПЦО) возможно лишь в поздние сроки терапии; при дополнительных транслокациях иматиниб или ИТК 2-го поколения также позволили достигнуть ПЦО; при возникновении дополнительной Ph-хромосомы или амплификации гена BCR/ABL добить-ся полного подавления Ph-позитивного клона возможно только у трети больных лишь при использовании ИТК 2-го поколения; а присутствие дополнительных аномалий хромосомы 7 и комплексных нарушений кариотипа с вовлечением изохромосомы i(17)(q10) является признаком неблагоприятного прогноза, подразумевающего отсутствие эффекта от терапии ИТК и 1-го, и 2-го поколения.

Ключевые слова: хронический миелолейкоз, дополнительные хромосомные аномалии в Ph-позитивных клетках

Influence of different chromosomal abnormalities in Ph-positive bone marrow cells on the chronic myeloid leukemia course during tyrosine kinase inhibitors therapy

O.Yu. Vinogradova, E.A. Aseeva, A.V. Vorontsova, A.G. Turkina, A.L. Neverova, O.V. Lazareva, E.Yu. Chelysheva, G.A. Gusarova, T.I. Kolosheinova, L.Yu. Kolosova, S.R. Goryacheva, M.V. Vakhrusheva, S.M. Kulikov, I.A. Tishchenko, L.V. Dyachenko,

A.I. Udovichenko, G.A. Alimova, E.V. Kleina, L.A. Grebenyuk, M.L. Konnova, S.Yu. Smirnova, N.D. Khoroshko, E.V. DomrachevaHematological Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow

The additional molecular and chromosomal abnormalities (ACA) in Ph-positive cells usually considered as a genetic marker of chronic myeloid leukemia (CML) progression. 457 patients in different CML phases received tyrosine kinase inhibitors (1st and 2nd generation) were studied. During therapy 50 cases with additional chromosomal abnormalities in Ph+ clone (22 of them in chronic CML phase) were revealed (median follow-up from CML diagnosis – 117 months, median imatinib therapy – 62 months). 86 % of patients in chronic phase with Ph+-cell abnormalities were cytogenetic resistance, and their 5-years overall survival was 80 % which was significantly lower than in patients without ACA (p < 0.005). The treatment results depend on chromosomal abnormalities detected. In patients with additional chromosome 8 imatinib therapy is effective, although complete cytogenetic response (CCR) is achieved only in the later therapy stages. In patients with additional translocations CCR also achieved with imatinib or 2nd generation TKI. Only a third of patients with additional Ph-chromosome or BCR/ABL amplification achieved complete suppression of Ph+ clone using 2nd generation TKI. The presence of additional chromosome 7 abnormalities and complex karyotype disorders involving isochromosome i(17)(q10) are poor prognostic factors of TKI treatment failures.

Key words: chronic myeloid leukemia, additional chromosomal abnormalities, Ph+-cells

ВведениеСогласно современным представлениям актив-

ность аномальной BCR-ABL тирозинкиназы – про-дукта экспрессии гена BCR/ABL, образующегося в ре-зультате транслокации t(9;22)(q34;q11), – инициирует опухолевую трансформацию клеток костного мозга, ведущую к развитию хронического миелолейкоза (ХМЛ). В этом случае последующее возникновение

дополнительных молекулярных и хромосомных ано-малий в Ph-позитивных клетках (хорошо известное явление при ХМЛ) с полным основанием рассматри-вается как генетический маркер прогрессии заболева-ния. Их появление представляется отражением ге-нетической нестабильности в опухолевых клетках с высоким уровнем пролиферации [1]. Этому в нема-лой степени способствует и аномально высокая


4’

20

12 ти розинкиназная активность патологического белка

BCR-ABL, которая приводит к усилению процессов образования свободных радикалов кислорода, по-вреждающих ДНК, при одновременной дестабилиза-ции репарационных систем, ответственных за восста-новление возникающих двойных разрывов нити ДНК, а также к ингибированию апоптоза [2–10].

В клинической практике до начала лечения α-интерферонами и ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) появление дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) однозначно ассоциировали с опухолевой прогрес-сией, переходом заболевания в терминальную стадию и быстрой гибелью пациентов. У 85 % больных, развив-ших бластный криз (БК) ХМЛ, и у трети пациентов в фа-зе акселерации (ФА) в Ph-позитивных клетках обнару-живали различные клональные ДХА [1, 11, 12].

Использование α-интерферонов и ИТК для лече-ния ХМЛ позволило добиться избирательного подав-ления Ph-позитивного клона, вплоть до его полного исчезновения.

Однако у больных ХМЛ, получавших α-интер-ферон, появление ДХА в Ph-позитивных клетках опи-сывалось как этап, предшествующий наступлению ФА ХМЛ, и прогноз лечения по-прежнему оставался крайне неблагоприятным [11]. В некоторых исследо-ваниях, однако, было продемонстрировано, что в от-сутствие других признаков акселерации наличие ДХА не влияет на результаты аллогенной трансплантации костного мозга [13].

После появления иматиниба прогностическое зна-чение появления ДХА в Ph-позитивных клетках явно нуждалось в пересмотре. В целом прогноз оказался более оптимистичным. В ряде крупных исследований было показано, что результаты лечения иматинибом пациентов без ДХА и с ДХА в отсутствие других при-знаков акселерации вполне сравнимы [14]. Согласно данным Гематологического научного центра (ГНЦ), основанным на 4-летнем опыте применения имати-ниба у больных в ФА ХМЛ, достоверных различий в частоте получения и характеристике цитогенетиче-ского ответа (ЦО) на терапию в группах больных, имевших и не имевших ДХА до начала терапии има-тинибом, не получено. Их 4-летняя выживаемость со-ставила 56 % и 62 % (р > 0,05) соответственно [15, 16].

К настоящему времени возникновение ДХА пере-стали расценивать как однозначный признак наступ-ления ФА.

Тем не менее, факт появления ДХА продолжают выделять в разряд неблагоприятных (настораживаю-щих) факторов при лечении ИТК [17–20]. В самом деле, результатом появления дополнительных генети-ческих аномалий является образование потенциально более злокачественного клеточного фенотипа. Про-лиферация и выживаемость такого клеточного клона уже зависит не только от присутствия в клетках BCR-ABL тирозинкиназы. Этот момент имеет прямое от-ношение к эффективности использования для лече-

ния пациентов с дополнительными аномалиями в Ph-позитивном клоне иматиниба и других ИТК, спе-цифической мишенью которых является BCR-ABL тирозинкиназа [1]. Ряд исследователей подчеркивают значение появления ДХА в Ph-позитивных клетках как проявление наиболее общего механизма резистен-тности к лечению ИТК у пациентов, прогрессирую-щих в ФА и БК [21, 22].

Таким образом, на сегодняшний день у исследова-телей нет окончательного представления о прогнозе для больных с ДХА в Ph-позитивных клетках, получа-ющих ИТК. Нам представляется необходимым учиты-вать не только сам факт появления ДХА, но и характер выявляемых аномалий. Поэтому в ходе проведенного нами исследования мы попытались предварительно оценить степень возможного влияния различных по характеру ДХА на течение ХМЛ и эффективность про-водимой терапии.

Материалы и методыИсследуемая когорта составила 457 больных, на-

блюдаемых и получающих терапию ИТК в ГНЦ. Ци-тогенетические исследования, включающие диагнос-тику и мониторинг эффективности получаемой терапии, проведены в лаборатории кариологии ГНЦ. Анализ результатов исследования использован для оценки возможного влияния дополнительных кло-нальных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках на течение ХМЛ в условиях терапии ИТК.

Присутствие транслокации t(9;22)(q34;q11), а также других аномалий кариотипа определяли при стандар-тном цитогенетическом исследовании клеток костно-го мозга, основанном на методе G-дифференциального окрашивания хромосом. Проводился анализ не менее 20 метафазных пластинок в каждом исследуемом об-разце костного мозга. При отсутствии или недостаточ-ном количестве пригодных для анализа метафаз, а так-же при проведении необходимых дополнительных исследований применяли метод флуоресцентной гиб-ридизации in situ с использованием соответствующих ДНК-зондов фирмы Abbott Mol. При исследовании проводился анализ не менее 200 интерфазных ядер. Цитогенетический мониторинг с целью оценки эф-фективности терапии ИТК проводили в сроки, опре-деляемые рекомендациями European LeukemiaNet для ХМЛ [23].

Результаты исследования и их обсуждениеI. Общая характеристика пациентов с ДХА в Ph-позитивных клетках и результаты их терапииДля предварительной оценки возможного влияния

дополнительных клональных хромосомных аномалий в Ph+-клетках на течение ХМЛ в условиях применения препаратов с антитирозинкиназной активностью бы-ли использованы результаты ретроспективного анали-за выборки из 457 пациентов во всех фазах заболева-ния ХМЛ, наблюдаемых в ГНЦ.


’2

01

2

В данной группе больных выявлено 50 случаев присутствия ДХА в Ph+ клоне. Распределение пациен-тов по полу и фазам ХМЛ представлено в табл. 1.

Среди больных с ДХА в Ph+ клоне – 34 мужчины и 16 женщин в возрасте от 16 до 77 лет в момент выяв-ления ДХА. Срок наблюдения этих пациентов с мо-мента диагностики ХМЛ – от 19 до 255 мес.

В образовавшейся группе пациентов с ДХА в Ph+-клетках обращает на себя внимание нарушение гендерного соотношения. В то время как в общей груп-пе из 457 наблюдаемых больных примерно равное соотношение мужчин и женщин с небольшим переве-сом в сторону последних, среди пациентов с ДХА в Ph+-клетках наблюдается значительное преимущест-во мужчин, в основном среди больных в ФА и хрони-ческой фазе (ХФ). Обнаруженное нарушение гендерного соотношения наблюдается и при отдельном рассмот-рении наиболее распространенных случаев с удвоением числа копий гена BCR-ABL и дополнительной хромосо-мой 8 в Ph+ клоне. Этот факт необычен и, несомненно, требует дальнейшего изучения.

Основным периодом выявления ДХА в Ph+-клет-ках пациентов является ХФ ХМЛ – наиболее длитель-ный этап лечения иматинибом. При этом частота появления ДХА закономерно нарастает в более про-двинутых фазах заболевания. В наибольшей степени ДХА в Ph+-клетках характерны, как и следовало ожи-дать, для пациентов в БК ХМЛ (43 % общего числа пациентов в этой фазе). Однако следует отметить, что этот процент существенно ниже частоты выявления ДХА у пациентов в БК, наблюдавшейся до начала эпохи терапии ИТК и составлявшей 85 %. Это различие, по-видимому, связано со сдерживанием прогрессии ХМЛ под воздействием ИТК, несмотря на появление ДХА.

Зависимость появления ДХА в Ph+-клетках от эта-па проводимой терапии с учетом фазы заболевания представлена в табл. 2.

Следует отметить, что у 11 пациентов ДХА в Ph+-клет-ках появились до начала терапии иматинибом, причем у 2 больных они были обнаружены в ранней ХФ до на-чала какой-либо терапии, а у 9 пациентов – на фоне терапии, предшествующей применению ИТК.

У 6 больных ДХА были впервые выявлены лишь на фоне использования для лечения ХМЛ ИТК 2-го поколения (ИТК 2).

Однако у большинства пациентов ДХА в Ph+-клетках были обнаружены в период приема иматини-ба, причем 67 % пациентов находились в ХФ ХМЛ (n = 22). Медиана их наблюдения с момента диа-гностики ХМЛ составила 117 мес, медиана терапии иматинибом – 62 мес. Именно в этой группе был статистически возможен и проведен анализ частоты достижения ЦО и показателей выживаемости у па-циентов с ДХА.

Результаты анализа частоты достижения ЦО у больных в ХФ ХМЛ с ДХА в Ph+-клетках представ-лены на рис. 1.

Согласно полученным данным полный ЦО (ПЦО) в процессе терапии иматинибом был достигнут лишь у 5 (24 %) пациентов с ДХА в Ph+-клетках, что досто-верно ниже (p < 0,05) частоты достижения ПЦО у больных в ХФ ХМЛ без ДХА (56 %). Причем у всех

22 больных (14 – с дополнительной Ph) иматиниб (доза > 400 мг –

60 % больных)

14 больных ИТК 2 (11 – с дополнительной Ph)

поздний ПЦО5 больных

первичная цитогенетическая

резистентность17 (77 %) больных

потеря ПЦО2 больных

(1 – с дополнительной Ph)5 больных

не на ИТК 2,из них у 1 –

прогрессия до БК

12 больных

Рис. 1. Характеристика ответа на терапию у больных в ХФ ХМЛ с ДХА в Ph-положительных клетках, резистентных к терапии има-тинибом

Таблица 1. Распределение больных по фазам ХМЛ и по полу

Фаза

Число больных (% больных

с ДХА от общего числа)

Число мужчин : женщин

Общая выборка больных ХМЛ ХФ/ФА/БК/всего

358/78/21/457 220 : 237

Больные с ДХА в Ph+-клетках

ХФ 30 (9 %) 19 : 11

ФА 11 (14 %) 10 : 1

БК 9 (43 %) 5 : 4

Всего 50 (11 %) 34 : 16

Таблица 2. Выявление ДХА в зависимости от этапа терапии и фазы ХМЛ

Период леченияОбщее число

больныхХФ ФА БК

До начала терапии, n 2 2 – –

До терапии иматинибом (интерферон-α/миелосан/ гидреа), n

9 3 6 –

В процессе терапии иматинибом, n 33 22 5 6

После лечения иматинибом,при ИТК 2 (нилотиниб, дазатиниб), n

3 + 3 3 – 3


4’

20

125 пациентов ПЦО достигнут в поздние (через год

и позднее от начала терапии иматинибом) сроки, а у 2 из них он был потерян (вторичная цитогенетическая резистентность). В 77 % случаев (n = 17) у пациентов с ДХА в Ph+-клетках выявлена первичная цитогенети-ческая резистентность к терапии иматинибом.

Таким образом, в целом цитогенетическую резистен-тность наблюдали у 86 % больных с ДХА в Ph+-клетках. В случаях, когда дополнительная хромосомная анома-лия была представлена удвоением Ph-хромосомы, ци-тогенетическая резистентность к терапии иматинибом развивалась в 100 % случаев. У пациентов с другими дополнительными аномалиями в Ph+-клетках цитоге-нетическая резистентность развивалась в 50 % случаев.

Проведенный анализ общей и 5-летней выживаемос-ти пациентов с ДХА в Ph+-клетках представлен на рис. 2.

У больных в ХФ ХМЛ после обнаружения ДХА общая 5-летняя выживаемость составила 80 %, что достоверно ниже, чем у пациентов в ХФ без ДХА (p < 0,005). С помощью модели Кокса с переменным по времени фактором риска была проанализирована зависимость риска смерти от возникновения ДХА. Появление ДХА рассматривалось как появляющийся неблагоприятный фактор, исходя из предположения, что риск летального исхода до и после появления ДХА различен. Было показано, что риск смерти в единицу времени увеличивается с появлением ДХА более чем в 16 раз. Однако, несмотря на теоретические расчеты, появление ДХА не сопровождалось быстрой прогрес-сией ХМЛ.

Таким образом, появление ДХА в эру лечения ХМЛ ИТК не является фактором быстрого развития БК и ги-бели пациентов.

II. Особенности течения ХМЛ в зависимости от типа наблюдаемой ДХА в Ph+-клеткахСпектр наблюдаемых хромосомных аномалий

в Ph-позитивных клетках в анализируемой выборке 457 пациентов представлен на рис. 3.

В данном исследовании можно выделить 2 наибо-лее часто встречающихся варианта ДХА: удвоение Ph-хромосомы и появление дополнительной хромо-сомы 8. Удвоение Ph-хромосомы наблюдается у 58 % пациентов с ДХА в виде одиночной аномалии или в составе комплексного кариотипа. Дополнительная хромосома 8 зарегистрирована у 24 % пациентов с ДХА либо как одиночная аномалия, либо в составе комп-лексного кариотипа. Остальные аномалии можно от-нести к разряду редких событий.

Группу больных с выявленной inv(9)(p13;q22) в данной статье не рассматривали, так как она отно-сится к конституционным аномалиям кариотипа.

1. Часто встречающиеся варианты ДХА. Удвоение Ph-хромосомыУдвоение Ph-хромосомы в опухолевом клоне ранее

всегда связывали с прогрессией заболевания. Появле-ние дополнительной Ph-хромосомы и в настоящее время может представлять немалый прогностический интерес, поскольку приводит к увеличению числа ко-пий гена BCR/ABL – основной молекулярной мишени для антитирозинкиназных препаратов, применяемых при лечении ХМЛ. Среди наших пациентов с ДХА в Ph+-клетках чаще всего выявляли именно эту анома-лию. Она обнаружена в 34 % случаев наблюдения ДХА.

Надо отметить, что у 17 больных дополнительная Ph-хромосома встречалась изолированно, а у 12 паци-ентов – в сочетании с другими хромосомными ано-малиями в составе комплексных кариотипов. Так, в 8 случаях она наблюдалась в сочетании с дополни-тельной хромосомой 8, в 2 случаях – в сочетании с делецией q-плеча или моносомией хромосомы 7 и в 2 случаях – с другими хромосомными перестрой-ками у пациентов в ФА и БК ХМЛ. Началу терапии иматинибом предшествовало длительное (до выявле-ния дополнительной Ph-хромосомы Ме составила 5 лет) лечение (гидреа, бусульфан, 6-меркаптопурин, полихимиотерапия, интерферон).

Выявление ДХА у больных в ХФ

во время терапии иматинибом

Веро

ятно

сть

выж

иван

ия

время жизни годы

0 2 4 6 8

1 –

0,8 –

0,6 –

0,4 –

0,2 –

0 –

Рис. 2. Общая выживаемость у больных в ХФ ХМЛ (n = 22) от момента обнаружения ДХА в Ph-позитивных клетках

inv(9) 8 %

2Ph 34 %

i17 6 %

del 7 4 %

Комплексные перестройки

28 % Дополнительные транслокации 8 %

Трисомия 8 12 %

Рис. 3. Частота выявления различных ДХА в Ph-положительных клет-ках у больных ХМЛ (n = 50)


’2

01

2

К моменту анализа данных 15 из 29 больных умер-ли, что составило 52 %. В их число вошли все 8 (100 %) пациентов в фазе БК, 4 (24 %) пациента в ХФ и 3 (60 %) пациента в ФА.

Особый интерес представляет анализ течения за-болевания у больных в ХФ ХМЛ с удвоением Ph-хро-мосомы, достижения ими ответа на лечение (частота получения большого ЦО (БЦО) и ПЦО) и стабиль-ность полученного ЦО.

На рис. 4 представлены результаты лечения паци-ентов в ХФ ХМЛ с дополнительной Ph-хромосомой ИТК.

У 16 больных, находившихся в ХФ, продолжитель-ность терапии иматинибом до выявления дополни-тельной Ph-хромосомы различна – от 6 мес до 5,5 лет, длительность наблюдения за указанными больными составляет от 26 до 176 мес. У всех 16 больных, полу-чающих терапию иматинибом, достигнут полный ге-матологический ответ (ПГО) в срок от 3 до 6 мес.

При возникновении дополнительной Ph-хромо-сомы во время лечения иматинибом не удалось до-

биться получения БЦО или ПЦО у большинства больных, несмотря на увеличение дозы препарата. В связи с резистентностью к терапии иматинибом 14 больных переведены на терапию ИТК 2 (дазати-ниб – 10 пациентов, нилотиниб – 3 пациента, бозу-тиниб – 1 больной).

Перевод больных в ХФ на терапию ИТК 2 оказал-ся перспективным: у 79 % (n = 11) больных достигнут ПГО, у 36 % – БЦО (n = 5), у 29 % – ПЦО (n = 4). Только у 3 больных наблюдали прогрессию заболева-ния до ФА, у 2 из них впоследствии выявлена мутация Т315I в киназном домене, чем, вероятно, обусловлена неудача проведенной терапии.

Наибольший интерес вызывает динамика Ph+ кло-нов c удвоением Ph-хромосомы при применении ИТК первого и второго поколений. Например, у больного С.П.И. дополнительная Ph-хромосома была выявлена еще при терапии интерфероном, по-том ее находили во время терапии иматинибом в ХФ заболевания и дазатинибом в ФА, далее она была зарегистрирована за 8 мес до смерти больного в ре-зультате прогрессии ХМЛ. Размер клона при этом колебался от 20 до 100 %.

На рис. 5 представлена динамика ЦО у 4 больных (А.С.А., М.А.Н., С.В.В., Г.В.П.), получавших ИТК 1-й и 2-й линии. Во время приема иматиниба у всех был выявлен клон клеток с удвоением Ph-хромосомы, раз-мер которого варьировал от 10 до 100 % клеток.

Клон выявлялся у некоторых больных постоянно, как, например, у больного Г.В.П. в течение 72 мес (размер клона варьировал в пределах 25–100) или мог персистировать, как у больного А.С.А., то появля-ясь, то исчезая. После назначения ИТК 2-й линии (нилотиниб, дазатиниб, бозутиниб) во всех случаях удалось добиться подавления клона с удвоением Ph-хромосомы, а у больных Г.В.П. и М.А.Н. полного подавления Ph-позитивного клона и достижения

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 960

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

%

мес

мес

А.С.А. М.А.Н.

С.В.В. Г.В.П.

иматиниб

нилотиниб дазатиниб

бозутиниб дазатиниб

иматинибиматиниб

иматиниб

-Ph

-2Ph

0

00

Рис. 5. Длительность и стабильность ЦО у больных ХМЛ в ХФ, имеющих удвоение Ph-хромосомы, при лечении ИТК 1-го и 2-го поколения

14 больных ИТК 2

13 больных повышение дозы до 60–800 мг

2 больныхЧЦО-1 ПЦО-1

Рис. 4. Выбор терапии у больных с удвоением Ph-хромосомы в ХФ, резистентных к терапии иматинибом

3 больных непереносимость

дозы > 400 мг

16 больных иматиниб

11 больных резистентны

к увеличению дозы


4’

20

12ПЦО к 3 и 40 месяцам терапии ИТК 2-й линии. У 2 дру-

гих больных (А.С.А. и С.В.В.) добиться подавления Ph-позитивного клона к 30 месяцам терапии ИТК 2-й линии не удалось.

Таким образом, переход на терапию ИТК 2-й линии оказался эффективным для достижения ЦО у пациен-тов с удвоением Ph-хромосомы. Различия в поведении клонов с дополнительной Ph-хромосомой не повлияли на успешность терапии ИТК.

Дополнительная хромосома 8 в Ph+-клеткахПоявление дополнительной хромосомы 8 в Ph+-

клетках считалось неблагоприятным признаком, сви-детельствующим о быстрой прогрессии заболевания [11, 24, 25]. Среди наших больных трисомия хромосомы 8 в Ph- позитивных клетках обнаружена у 18 человек. Вновь обращает на себя внимание соотношение муж-чин и женщин в этой группе: 14 и 4 соответственно. У 6 пациентов дополнительная хромосома 8 выявлена как изолированная аномалия в Ph+-клетках. У 14 боль-ных она идентифицирована в составе комплексных нарушений кариотипа: в сочетании с удвоением Ph-хромосомы (n = 5), другими хромосомными нару-шениями (n = 9). На момент выявления дополнитель-ной хромосомы 8 в ХФ ХМЛ находились 6 пациентов, в ФА ХМЛ – 7 пациентов, в БК ХМЛ – 5 пациентов. У 4 пациентов дополнительная хромосома 8 впервые обнаружена до начала лечения иматинибом, у боль-шинства пациентов (n = 13) – в период лечения има-тинибом, у 1 пациента – после перехода на терапию ИТК 2-й линии.

Все пациенты получали терапию иматинибом (рис. 6). Однако 12 больным (в ФА и БК) иматиниб изначально был назначен в повышенных дозах 600–800 мг. Из 6 пациентов в ХФ ХМЛ, начавших прием препарата в стандартной дозе 400 мг, 3 больным доза иматиниба также была увеличена до 600 мг в процессе терапии (см. рис. 6). При применении высокой дозы препарата у 11 (73 %) больных удалось достичь БЦО или ПЦО. Следует отметить, что ПЦО достигнут у 2 па-циентов, находящихся в ФА ХМЛ.

Характерной особенностью лечения иматинибом больных в ХФ с дополнительной хромосомой 8 можно считать более длительные сроки достижения ЦО (БЦО был получен к 12–30 месяцам, ПЦО – к 18–30 меся-цам), который, однако, был стабильным. Интересно,

что после ухода Ph-позитивного клона у 3 больных трисомия хромосомы 8 регистрировалась в Ph-нега-тивном клоне клеток. Наоборот, у больных в ФА, не-смотря на быстрое достижение БЦО (к 6 месяцам) и ПЦО (к 12 месяцам), ответ не был стабильным. Чет-веро таких больных были переведены на терапию ИТК 2-й линии.

Таким образом, все пациенты в ХФ ХМЛ с трисоми-ей хромосомы 8 живы, у всех достигнут ПЦО, но сроки его достижения продолжительные и не соответствуют критериям оптимального ответа на терапию ИТК [23].

2. Редкие варианты ДХА в Ph+-клетках. Аномалии хромосомы 7Моносомия 7 обычно встречается у больных ост-

рым миелобластным и бифенотипическим острым лей-козом, при миелодисплазиях. При ХМЛ, по данным литературы, моносомия 7 и del(7q) в Ph-позитивных клетках выявляются, как правило, в период БК [26].

В данном исследовании среди больных с ДХА в Ph-позитивных клетках в 7 случаях были обнаруже-ны различные аномалии с участием хромосомы 7. Ка-риотипы пациентов в момент выявления дополни-тельной аномалии приведены в табл. 3.

Таблица 3. Кариотипы больных с аномалиями хромосомы 7 в Ph-пози-тивных клетках

ФИО Кариотип

Ш.Т.В.46,ХХ, ider(7q), inv(7), del(5q31), t(9;22)[7] / 46,ХХ, t(9;22)[18]

В.Н.В. 46,ХХ, t(9;22), del(7)(p13)[7] / 46,ХХ, t(9;22)[13]

Б.Ю.А. 46,ХY, del(7)(q10), t(9;22) [3] / 46,ХY, t(9;22)[22]

Г.Е.С. 46,ХХ, t(9;22), -7, +8[7] / 46,ХХ, t(9;22)[25]

С.С.И. 46,ХХ, t(9;22) der(7) [2] / 46,ХХ, t(9;22) [17]

Ф.Г.Г. 46,ХY, del(7)(q22) [12] / 46,ХY, t(9;22) [10] / 46,ХY[2]

О.С.В.51,ХXY +9, t(9;22), +13,+19, +21[5] / 46,ХY, t(9;22) del(7)(p12)[3] / 47,ХY, t(9;22), der(22) t(9;22) [1] / 46,ХY, t(9;22)[12]

Среди аномалий хромосомы 7 наблюдались деле-ции длинных и коротких плечей, моносомия хромо-сомы 7, ider(7q), inv(7).

В 3 из анализируемых случаев короткое плечо (p) хромосомы 7 было либо делетировано (пациенты В.Н.В. и О.С.В.), либо полностью отсутствовало (пациент Ш.Т.В.). Известно, что на отсутствующем участке плеча (р12 – р13) расположен ген EGFR, отно-сящийся к генам тирозинкиназ рецепторного типа, который играет важную роль в клеточной пролифера-ции, дифференцировке и апоптозе.

У 3 больных наблюдались делеции длинного (q) плеча. Обращает на себя внимание тот факт, что у больного Ф.Г.Г. del(7)(q22) изначально была обнару-

3 больных резистентность к дозе

иматиниб 400 мг – повышение дозы до 600 ПЦО

Рис. 6. Результаты терапии иматинибом у больных в ХФ ХМЛ с три-сомией хромосомы 8

3 больныхПЦО

(иматиниб 400 мг)

6 больных


’2

01

2

жена в Ph-негативных клетках, однако через 12 мес у него был выявлен клон с del(7)(q22) и удвоением Ph-хромосомы, а еще через 3 мес констатирована смерть от прогрессии заболевания.

Все больные получали иматиниб. У 3 пациентов аномалия хромосомы 7 была выявлена до начала тера-пии иматинибом, в то время как у остальных 4 боль-ных – в процессе проводимой терапии иматинибом (табл. 4).

Только у 1 больной в этой группе удалось получить БЦО и ПЦО, который сохранялся 18 мес. Двое боль-ных переведены в связи со вторичной гематологиче-ской резистентностью на терапию ИТК 2 (дазатиниб – 1, нилотиниб и дазатиниб – 1), однако и у них не удалось достичь ЦО.

Из 7 больных с аномалиями хромосомы 7 шестеро умерли от прогрессии заболевания. После выявления ДХА длительность заболевания составила от 1 до 40 мес, с медианой 2 года. У единственного оставшегося па-циента отмечается гематологическая резистентность к терапии ИТК (иматинибу, нилотинибу и дазатини-бу), что, вероятно, связано с присутствием у него му-тации T315I в гене BCR/ABL (см. табл. 4). Этот пациент также получал терапию ингибитором аурора-киназы без длительного положительного эффекта, в течение 2 последних лет проводится терапия гидреа, поддержи-вающая сохранение гематологической компенсации.

В целом создается впечатление, что аномалии хро-мосомы 7, как изолированные, так и в составе комплек-сных нарушений кариотипа, являются весьма неблаго-приятным признаком.

Изохромосома 17Изохромосома 17 состоит из зеркально отображен-

ных копий q-плеча хромосомы 17 (i(17)(q10)) с поте-рей р-плеча, на котором расположен ген р53. Продукт его экспрессии – белок р53 – регулирует транскрип-цию и активирует экспрессию генов, ответственных за остановку клеточного цикла и индукцию апоптотиче-ской гибели клеток [27].

Характерной особенностью больных с перестрой-ками хромосомы 17 в период до применения ИТК являлась низкая частота достижения ремиссий и их непродолжительность [28].

Следует отметить, что в данном исследовании изохромосома 17 впервые выявлена при терапии мие-лосаном – у 1 пациента, интерфероном в сочетании с миелосаном – у другого, при лечении иматинибом – у третьего (табл. 5). При назначении терапии ИТК все пациенты принимали иматиниб в дозе 400–600 мг в сутки.

Больной А.С.В. после диагностики заболевания получал терапию миелосаном и интерфероном в тече-ние 10 лет. После чего при цитогенетическом исследо-

Таблица 4. Характеристика больных ХМЛ с аномалиями хромосомы 7 (n = 7)

ФИО ПолНа момент выявления ДХА Длительность терапии до ДХА,

месДлительность

заболевания, месСтатус

Фаза Терапия Возраст, лет

Ш.Т.В. ж ХФ миелосан 38 36 74 умер

В.Н.В. ж ХФ иматиниб 56 10 80 умер

Б.Ю.А. м ХФ иматиниб 52 21 62 жив*

Г.Е.С. ж ФА интерферон-α 48 45 77 умер

С.С.И. ж ФА интерферон-α 21 58 63 умер

Ф.Г.Г. м ФА иматиниб 49 43 75 умер

О.С.В. м БК иматиниб 44 11 44 умер

* – выявлена мутация гена BCR/ABL – T315I.

Таблица 5. Характеристика больных ХМЛ с изохромосомой i(17)(q10) в Ph-положительном клоне (n = 3)

ФИО ДХА ПолНа момент выявления ДХА

Длительность терапии до ДХА, мес

Длительность заболевания, мес

Статус

Фаза Терапия Возраст, лет

А.С.В. i(17) м ХФинтерферон +

миелосан32 125 214 жив

Т.Н.А. i(17) ж ФА миелосан 52 108 115 умер

Б.А.И. 8+, i(17), Рh+ м БК иматиниб 32 7 25 умер


4’

20

12вании была выявлена i(17)(q10) во всех Ph-позитивных

клетках. Далее ему в течение 9 лет проводилась тера-пия иматинибом, в результате которой, на поздних сроках терапии, был достигнут ЦО (БЦО – к 4 годам, ПЦО – к 5 годам проведения терапии ИТК).

У пациента Б.А.И. изохромосома 17 выявлена в момент БК наряду с другими неблагоприятными на-рушениями кариотипа, включающими удвоение Ph-хромосомы. Пациент прожил только 7 мес.

У больной Т.Н.А. ХМЛ был диагностирован в ХФ. Терапия была начата с 2 курсов полихимиотерапии с последующим длительным приемом миелосана. Через 7 лет заболевания была диагностирована ФА. При цито-генетическом исследовании выявлена дополнительная хромосомная перестройка – изохромосома i(17)(q10).

Далее пациентка получала иматиниб в дозе 600 мг. Через 1,5 года терапии иматинибом у нее был обнару-жен комплексный кариотип с присутствием i(17) в 78 % Ph-позитивных клеток. Через 3 мес диагности-рован БК ХМЛ и еще через 3 мес наступила смерть от прогрессии заболевания. Динамика изменений карио-типа в процессе терапии приведена в табл. 6.

Следует отметить, что у пациентки изначально бы-ла выявлена сложная транслокация с участием не только стандартных локусов 9q34 и 22q11, но и хромо-сомы 15. В дальнейшем на фоне прогрессии заболева-ния наблюдалось развитие множественных наруше-ний и образование нескольких опухолевых клонов, что характерно для опухолевой прогрессии.

В целом анализ этой небольшой группы пациентов показал, что больные в продвинутых фазах (ФА и БК)

и комплексным кариотипом с присутствием изохромо-сомы i(17)(q10) имеют неблагоприятный прогноз, что согласуется с наблюдениями других исследователей [1].

ДХА в виде транслокаций В исследуемой группе 4 пациента имели дополни-

тельные клональные транслокации в Ph-позитивных клетках. Все больные в момент их выявления были в ХФ ХМЛ. Общая характеристика пациентов с допол-нительными клональными транслокациями приведе-на в табл. 7.

У больной О.А.Ч. при цитогенетическом исследо-вании в момент первичной диагностики обнаружили дополнительную транслокацию t(5;15) во всех иссле-дованных клетках костного мозга. Кариотип больной: 46,ХX,t(9;22)(q34;q11),t(5;15)(q31;q21) [16]. Проводили терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки, которая в дальнейшем была снижена в связи с негематологи-ческой токсичностью II–III степени. Через 6 мес те-рапии иматинибом был получен ПЦО, а к 12 месяцам терапии – полный молекулярный ответ (МО), кото-рый сохранялся 1,5 года. Через 2 года терапии имати-нибом в связи с токсичностью был сделан перерыв в терапии длительностью 5 мес, что привело к потере ПЦО и МО. При цитогенетическом исследовании Ph-хромосома была выявлена в 10 % метафаз, допол-нительная транслокация не определялась. При возоб-новлении терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки восстановлен ПЦО и МО, которые сохраняются ко времени анализа данных. Таким образом, выявленная до начала лечения иматинибом дополнительная транс-

Таблица 6. Динамика изменений кариотипа у больной Т.Н.А., выявленных в процессе терапии

ТерапияДлительность терапии, мес

Кариотип Ph-хромосома, %

До начала терапии – 46XХ,t(9;15;22) (q34;q21;q11) [20] 100

Миелосан 60 46XХ,t(9;15;22) (q34;q21;q11) [19]/46XХ, t(9;15;22) (q34;q21;q11), i(17)(q10)[3] 100

Иматиниб 1837-48 XХ, +8, +8, der(9), t(9;15;22) (q34;q21;q11), i(17)(q10) [10]/

41-46 XХ, +8,-10, der(9) t(9;15;22)(q34;q21;q11)[ 3] / 48, XХ, +8, +8, der(9), t(9;15;22) (q34;q21;q11), -13, i(17)(q10)[1] / 46XХ [4]

88

Таблица 7. Характеристика больных ХМЛ с дополнительными транслокациями (n = 4)

ФИО Пол Дополнительные транслокацииНа момент выявления дополнительных транслокаций

Другие перестройки Статус

Возраст, лет Терапия Длительность терапии, мес

О.А.Ч. ж t(5;15)(q31;q21) 53 нет 0 нет жив

Е.А.Х. ж t(1;7)(q10;p10) 34 нилотиниб 12 dup(3p) жив

М.Г.Л. м t(1;15)(q21;q22) 53 иматиниб 54 нет жив

А.П.Ю. м t(5;16)(q31;p13) 45 иматиниб 11 del(5)(p13) умер


’2

01

2 локация t(5;15) в течение последующих 5 лет ни разу не определялась, и не повлияла на сроки достижения ПЦО и ПМО.

Пациентка Е.А.Х. в течение 1 года получала тера-пию иматинибом в дозе 400–800 мг, однако после раз-вития вторичной гематологической резистентности больной был назначен ИТК 2-й линии – нилотиниб, в дозе 800 мг. Через 12 месяцев терапии нилотинибом при цитогенетическом исследовании в кариотипе вы-явлены дополнительные аномалии: транслокация t(1;7)(q10; p10) и dup(3p), которые сохранялись в тече-ние 9 месяцев (табл. 8). При контрольном цитогене-тическом анализе через 30 месяцев терапии у больной был зарегистрирован нормальный кариотип, т. е. по-лучен ПЦО, а к 33 месяцам – полный МО.

Транслокация t(1;7) встречается у больных остры-ми, чаще индуцированными, лейкозами, при миело-диспластическом синдроме и является неблагоприят-ным прогностическим признаком [29]. В случае с больной Е.А.Х. дополнительная транслокация t(1,7) не оказала неблагоприятного влияния, хотя необхо-димо отметить, что больная была резистентна к тера-пии иматинибом. Стабильный ПЦО получен при терапии нилотинибом поздно (30 мес терапии) и со-храняется пока только 6 мес.

Больной М.Г.Л. получал химиотерапию и терапию интерфероном-α, далее переведен на терапию имати-нибом в дозе 300–400 мг в сутки. Через 4,5 года тера-пии иматинибом в Ph-позитивных клетках выявлена ДХА – транслокация t(1;15)(q21;q22), которая опреде-лялась на протяжении 1 года (табл. 9). В связи с вто-ричной гематологической резистентностью к терапии иматинибом, больной переведен на лечение дазатини-

бом в дозе 100 мг в сутки. Через 6 мес терапии был до-стигнут БЦО, а через 12 мес – ПЦО и большой МО. Таким образом, у данного пациента удалось получить ЦО и МО при переходе на терапию ИТК 2. Присут-ствие дополнительной транслокации t(1;15) не ока-зало неблагоприятного воздействия на течение за-болевания.

У больного А.П.Ю. после работ по ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС был установлен диа-гноз острая лучевая болезнь III степени, а через 21 год выявлен ХМЛ. На момент диагностики в ка-риотипе, помимо Ph-хромосомы, определялась del(5)(p13). Терапия иматинибом в дозе 400–600 мг в сутки в течение 11 мес позволила получить ПГО, который потом был утерян. При цитогенетическом иссле-довании во всех клетках, помимо Ph-хромосомы, определялась дополнительная транслокация t(5;16)(q31;p13). Динамика изменений в кариотипе пациен-та представлена в табл. 10.

В связи с вторичной гематологической резистен-тностью к иматинибу больной был переведен на лече-ние нилотинибом. В результате был достигнут только ПГО, однако через 6 мес ответ был вновь утерян и кон-статирована ФА ХМЛ. Пациенту был назначен даза-тиниб в дозе 100–140 мг в сутки, который позволил добиться лишь гематологической компенсации. Через 4 мес терапии дазатинибом при цитогенетическом ис-следовании была обнаружена Ph-хромосома в 90 % клеток костного мозга без дополнительных аномалий. Однако в 20 % Ph+-клеток методом FISH выявлена амплификация гена BCR/ABL. Таким образом, в дан-ном клиническом случае наблюдалась гематологиче-ская резистентность к терапии тремя ИТК: к имати-

Таблица 8. Динамика изменений кариотипа у больной Е.А.Х.

ТерапияПродолжи-

тельность, месКариотип

Ph- хромосома, %

Дополнительные хромосомные перестройки

нилотиниб 12 46XХ,t(1;7)(q10;p10),dup(3p),t(9;22)(q34;q11), [18]/ 46XХ[2] 90 t(1,7), dup(3p)

нилотиниб 18 46XХ,t(1;7)(q10;p10),dup(3),t(9;22)(q34;q11) [11]/ 46XХ[9] 55 t(1,7), dup(3p)

нилотиниб 21 46XХ,t(1;7)(q10;p10),dup(3),t(9;22)(q34;q11) [3]/ 46XХ[17] 15 t(1,7), dup(3p)

нилотиниб 30 46XХ[20] 0 нет

Таблица 9. Динамика изменений кариотипа у больного М.Г.Л.

Терапия Продолжительность, мес Кариотип Ph-хромосома, % Дополнительные транслокации

иматиниб 5446XY,t(1;15)(q21;q22),t(9;22)

(q34;q11) [18]/ 46XY [2]90 t(1;15)

иматиниб 60 46XY,t(1;15)(q21;q22),t(9;22) (q34;q11)[20] 55 t(1;15)

иматиниб 66 46XY,t(1;15)(q21;q22),t(9;22) (q34;q11)[20] 15 t(1;15)

дазатиниб 6 46XY,t(9;22)(q34;q11)[6]/ 46XY [14] 30 нет

дазатиниб 12 46XY [20] нет нет


4’

20

12

нибу, нилотинибу и дазатинибу. Смерть больного в результате прогрессии заболевания наступила через 2 года с момента установления диагноза ХМЛ.

Следует отметить, что в данном случае имел место случай вторичного индуцированного лейкоза, возник-шего через 20 лет после воздействия ионизирующей радиации. У пациента была выявлена дополнительная хромосомная перестройка на момент диагностики ХМЛ, что могло свидетельствовать о развитии неста-бильности генома. Это единственный из 4 наблюдав-шихся пациентов, у которого последовательная тера-пия тремя различными ИТК на протяжении 2 лет не позволила получить ЦО и закончилась прогрессией заболевания и летальным исходом.

Таким образом, дополнительные транслокации у 4 исследованных больных выявлялись в разное время, как в процессе применения иматиниба или других ИТК, так и до начала лечения ИТК. В 3 из 4 случаев получен ПЦО, который достигнут в различные сроки (6–30 мес) при терапии различными ИТК (иматиниб, дазатиниб, нилотиниб).

ЗаключениеДо начала терапии ИТК появление ДХА в Ph-по-

зитивных клетках костного мозга означало быструю гибель больных от прогрессии заболевания. Результа-ты проведенного нами анализа свидетельствуют, что в условиях применения ИТК 62 % таких больных продол-жают жить, несмотря на неблагоприятный прогноз и неудачи терапии у большинства из них. Появление ДХА зарегистрировано не только до начала терапии имати-нибом, но и в период лечения, а в ряде случаев при ис-пользовании ИТК 2-й линии, однако эффективность достижения ЦО не зависит ни от времени возникнове-ния ДХА, ни от динамики изменений Ph-позитивного клона с ДХА в процессе лечения. Однако, как показал

Таблица 10. Динамика изменений кариотипа у больного А.П.Ю.

Терапия ДлительностьХМЛ, мес

Кариотип Ph-хромосома, %Дополнительные хромосомные

перестройки

начало заболевания 0 46XY, t(9;22)(q34;q11), del (5)(p13) [16] 100 del (5p)

иматиниб 11 46XY, t(9;22)(q34;q11), t(5;16)(q31;p13) [20] 100 t(5;16)

дазатиниб 22 46XY, t(9;22)(q34;q11) [18]/46XY [2]90

20 % амплификация гена BCR/ABL

анализ, результаты терапии ИТК у больных с ДХА в Ph-позитивном клоне зависят от характера ДХА.

Так, если в качестве ДХА наблюдается дополни-тельная хромосома 8, то терапия иматинибом остается эффективной, хотя получение ПЦО возможно лишь в поздние сроки терапии.

Нами показано, что в случае выявления дополни-тельных транслокаций терапия иматинибом или ИТК 2-й линии в 3 из 4 рассмотренных случаев также поз-волила достигнуть ПЦО. Однако следует отметить, что мы наблюдали разные хромосомные перестрой-ки. Из них лишь 1 транслокация t(1;7)(q10;p10) отно-сится к числу перестроек, характерных для индуци-рованных миелопролиферативных заболеваний, остальные носят случайный характер. Было бы опро-метчиво пытаться прогнозировать результаты тера-пии для редких случаев наблюдения случайных хро-мосомных перестроек в Ph-позитивных клетках.

При возникновении дополнительной Ph-хромосо-мы или амплификации гена BCR/ABL можно вполне определенно рекомендовать использовать ИТК 2, ко-торые в конечном итоге позволяют добиться полного подавления Ph-позитивного клона.

Вместе с тем, присутствие дополнительных ано-малий хромосомы 7 и комплексных нарушений ка-риотипа с вовлечением изохромосомы i(17)(q10) является признаком неблагоприятного прогноза, под-разумевающего отсутствие эффекта от терапии ИТК как первой (иматиниб), так и 2-й (нилотиниб, дазати-ниб, бозутиниб) линии.

Полученные результаты, несомненно, требуют подтверждения дальнейшими исследованиями на большем числе пациентов. Однако они позволяют ставить вопрос о прогностической значимости кон-кретных дополнительных аномалий в Ph-позитивном клоне в условиях лечения пациентов ИТК.


1. Cortes J., O’Dwyer M.E. Clonal evolution in chronic myelogenous leukemia. Hematol Oncol Clin N Am 2004;18(3):671–84. 2. O'Hare T., Eide C.A., Deininger M.W. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug

resistance, and the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007;110(7):2242–9. 3. Sattler M., Verma S., Shrikhande G. et al. The BCR/ABL tyrosine kinase induces production of reactive oxygen species in

hematopoietic cells. J Biol Chem 2000;275(32):24273–8.4. Branford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. Detection of BCR-ABL mutations in patients with CML treated with imatinib is virtually


’2

01

2 always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 2003;102(1):276–83. 5. Willis S.G., Lange T., Demehri S. et al. High-sensitivity detection of BCR-ABL kinase domain mutations in imatinib-naive patients: correlation with clonal cytogenetic evolution but not response to therapy. Blood 2005;106(6):2128–37. 6. Quintás-Cardama A., Kantarjian H., Cortes J. et al. Dasatinib early intervention after cytogenetic or hematologic resistance to imatinib in patients with chronic myeloid leukemia. Cancer 2009;115(13):2912–21. 7. Koptyra M., Falinski R., Nowicki M.O. et al. BCR/ABL kinase induces self-mutagenesis via reactive oxygen species to encode imatinib resistance. Blood 2006;108(1):319–27. 8. Nowicki M.O., Falinski R., Koptyra M. et al. BCR/ABL oncogenic kinase promotes unfaithful repair of the reactive oxygen species-dependent DNA double-strand breaks. Blood 2004;104(12):3746–53. 9. Dierov J., Sanchez P.V., Burke B.A. et al. BCR/ABL induces chromosomal instability after genotoxic stress and alters the cell death threshold. Leukemia 2009;23(2):279–86. 10. Skorski T. BCR/ABL, DNA damage and DNA repair: implications for new treatment concepts. Leuk Lymphoma 2008;49(4):610–4. 11. Cortes J.E., Talpaz M., Giles F. et al. Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy. Blood 2003;101(10):3794–800. 12. Calabretta B., Perotti D. The biology of CML blast crisis. Blood 2004;103:4010–22. 13. Clift R.A., Buckner C.D., Thomas E.D. et al. Marrow transplantation for patients in

accelerated phase of chronic myeloid leukemia. Blood 1994;84(12):4368–73. 14. O’Dwyer M.E., Mauro M.J., Kurilik G. et al. The impact of clonal evolution on response to imatinib mesylate (STI571) in accelerated phase CML. Blood 2002;100(5):1628–33. 15. Круглов С.С. Резистентность к ингиби-тору тирозинкиназ BCR-ABL у пациентов в фазе акселерации хронического миело-лейкоза. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2005. 16. Круглов С.С., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Резистентность при терапии гливеком у больных хроническим миело-лейкозом в фазе акселерации. Гематол и трансфузиол 2005;50(4):17–24. 17. Baccarani M. // Chronic Myeloid Leukemia: An Update of Concepts and Management Recommendations of European Leukemia-net. // JCO, 2009, W. 27, № 35, P. 6041-51. 18. Домрачева Е.В., Захарова А.В., Асеева Е.А. Прогностическое значение дополнительных цитогенетических аномалий при хроническом миелолейкозе. Гематол и трансфузиол 2005;50(4):37–42.19. Мартынкевич И.С., Мартыненко Л.С., Иванова М.П. и др. Дополнительные хромосомные аберрации у пациентов с хроническим миелолейкозом. Гематол и трансфузиол 2007;52(2):28–35.20. Куцев С.И., Морданов С.В., Зельцер А.Н. Прогностическое значение дополнительных хромосомных аномалий в Ph-позитивных клетках в терапии иматинибом хронического миелолейкоза. Мед ген 2009; 8(10):23–8.

21. Hochhaus A., Kreil S., Corbin A.S. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 2002;16(11):2190–6. 22. Marktel S., Marin D., Foot N. et al. Chronic myeloid leukemia in chronic phase responding to imatinib: the occurrence of additional cytogenetic abnormalities predicts disease progression. Haematologica 2003;88:260–7. 23. Baccarani M., Saglio G., Goldman J.M. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia. Recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 2006;108:1809–20. 24. Fialkow P.J., Jacobson R.J., Papayannopoulou T. Chronic myelocytic leukemia: clonal origin in a stem cell common to the granulocyte, erythrocyte, platelet and monocyte/macrophage. Am J Med 1997;63(1):125–30. 25. Hild F., Freund M., Fonatsch C. Chromosomal aberrations during interferon therapy for chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med 1991;325:132. 26. Heim S., Mitelman F. Cancer Cytogenetics. Chromosomal and molecular genetic aberrations of tumor cells. Wiley-Liss, New York, 1995. 27. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997;88(3):323–31.28. Wattel E., Preudhomme C., Hesquet B. et al. P53 are mutation associated with resistanse to chemotherapy and short survival in gematological malignancies. Blood 1994;84:3148–57. 29. Ольшанская Ю.В., Домрачева Е.В. Хромосомные перестройки при острых лей-козах. М.: МЕДпресс-информ, 2006. С. 112.


4’

20

12Инфекции, вызванные редкими плесневыми грибами,

в гематологии

И.И. Калинина1, У.Н. Петрова1, О.В. Горонкова1, Д.Д. Байдильдина1, В.В. Синицына1, Л.А. Хачатрян1, М.А. Масчан1, Г.А. Клясова2, А.А. Масчан1

1ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва;

2ФГБУ ГНЦ Минздрава России, Москва

Контакты: Ирина Игоревна Калинина [email protected]

Повсеместное распространение плесневых грибов и их смертельная опасность для иммунокомпроментированных больных делает данную проблему до настоящего времени одной из нерешенных в онкогематологии. В статье представлено описание 3 случаев развития редких плесневых грибковых инфекций у детей с онкогематологическими заболеваниями. Первый случай – девочка с ос-трым миелобластным лейкозом и развитием Acremonium spp., данный инфекционный эпизод был купирован при применении антимикотической терапии вориконазолом и восстановлении уровня гранулоцитов. У второго пациента с апластической ане-мией развился инвазивный микоз, вызванный Fusarium spp.; несмотря на проводимую комбинированную противогрибковую тера-пию и трансфузии донорских гранулоцитов, данная инфекция привела к смерти пациента. В третьем случае у больного с Mucor spp. диагноз был установлен только на аутопсии.

Ключевые слова: редкие плесневые грибы, Acremonium spp., Fusarium spp. и Mucor spp., дети с онкогематологическими заболеваниями

Infections caused by rare mold fungi in hematology

I.I. Kalinina1, U.N. Petrova1, O.V. Goronkova1, D.D. Baidildina1, V.V. Sinitsyna1, L.A. Khachatryan1, M.A. Maschan1, G.A. Klyasova2, A.A. Maschan1

1Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, Ministry of Health of Russia, Moscow;

2Russian Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow

Worldwide distribution of mold fungi and their extremely danger for immune compromise patients makes this issue one of the unsolved problems in modern oncology. Three cases of rare fungal infections in children with hematological malignancies are described. In the first case infection caused by Acremonium spp. in AML patients was controlled after voriconazole therapy and granulocytes recovery. The second patients with aplastic anemia died as a result of invasive fungal infection caused by Fusarium spp. despite of combined antifungal therapy and granulo-cytes transfusions. In the third case diagnosis of Mucor mycosis was made only at autopsy.

Key words: rare mold fungi, Acremonium spp., Fusarium spp., Mucor spp., children, oncohematological diseases

ВведениеПрогресс, достигнутый в последние годы в лече-

нии гематологических и онкологических заболеваний, связан не только и не столько с усовершенствованием специфического медикаментозного лечения, сколько со значительным увеличением возможностей сопро-водительной терапии. Особые успехи достигнуты в об-ласти контроля грибковых инфекций, при которых разработка четких диагностических и лечебных алго-ритмов вкупе с появлением новых, более эффектив-ных препаратов позволила существенно снизить летальность при инвазивных кандидозах и аспергил-лезах, которая до недавнего времени достигала 60 % [1, 2]. Хотя спектр возбудителей инвазивных микозов остается неизменным и характеризуется явным доми-нированием кандидоза и аспергиллеза, отмечается рост доли редких инфекций, вызванных широко рас-пространенными в окружающей природе мицелиаль-ными грибами, принадлежащими к гиалогифомицетам и зигомицетам [3–5]. Данные грибковые осложнения

объединяют редкость возникновения, низкая чувстви-тельность к применяемым системным антимикотикам и чрезвычайно тяжелое течение и плохой прогноз, особенно у иммунокомпрометированных пациентов.

Данный обзор мы посвятили грибковым инфек-циям, вызванным такими редкими патогенами, как Acremonium spp., Fusarium spp. и Mucor spp.

Описание клинических случаевСлучай № 1. З.К., 8 лет, диагноз: острый миелоид-

ный лейкоз, М4-вариант, первый острый период. В ка-честве противогрибковой профилактики получала итра-коназол 5 мг/кг/сут. На 18-й день от окончания двойной индукции ADE-HAM в режиме «интенсивного тайминга» на фоне глубокой миелосупрессии у ребенка развились фебрильная лихорадка, тонзиллит, гингивит и стома-тит и высыпания на коже. Высыпания имели пятнисто-папулезный характер, некоторые с везикуляцией (рис. 1).

В гемокультуре, взятой в первый день фебрилитета, выявлен рост Enterococcus spp. Получала лечение меропе-


’2

01

2

немом, амикацином, клиндамицином и валацикловиром. На 21-й день от окончания полихимиотерапии (ПХТ) (4-й день фебрилитета) появилось слезотечение из лево-го глаза. По данным компьютерной томографии (КТ) придаточных пазух носа: утолщена слизистая в передних отделах решетчатого лабиринта слева и пирамиде ви-сочной кости слева, что вкупе с клинической картиной трактовалось как синусит, по поводу чего к проводимой терапии добавлен филграстим в суточной дозе 5 мкг/кг/с подкожно. Однако состояние ребенка ухудшалось, сохра-нялась фебрильная лихорадка, увеличилось количество элементов сыпи на коже. На 23-й день после ПХТ отме-чено появление асимметричного отека мягких тканей лица слева в периорбитальной области с переходом на мягкие ткани щеки, нарастающего в динамике, а также гиперемия и отек в области внутреннего угла левого глаза, сужение глазной щели и слезотечение. Кроме того, развилась пневмония, а также клиника бурсита правого локтевого и левого коленного сустава. В гемо-грамме: Le 0,7 × 10 9/л, Hb 93 г/л, Plt 17 × 109/л. CRP 8,39 мг/дл. Учитывая выраженную отрицательную динамику, к те-рапии были добавлены линезолид, ципрофлоксацин и ам-фотерицин В (амфо-В) в дозе 1 мг/кг в сутки.

Была выполнена биопсия кожных образований с от-правкой материала на гистологическое и микробиологи-ческое исследование, по результатам которого через 11 дней был получен рост Acremonium spp. Выполнена коррекция антибактериальной и противогрибковой те-рапии: амфо-В, ципрофлоксацин, меропенем и линезолид отменены, добавлен вориконазол 14 мг/кг/сут и продол-жен филграстим. На 4-й день приема вориконазола достигнут афебрилитет и прекратилось появление но-вых высыпаний. Однако на 35-й день после ПХТ и 14-й день приема вориконазола на фоне начала «выхода» из гранулоцитопении состояние девочки ухудшилось – с отрицательной динамикой за счет новой «волны» вы-сокого фебрилитета и усугубления симптоматики бур-сита (рис. 2) в виде увеличения отека, болезненности и ограничения движений в пораженных суставах.

На серии изображений левого коленного сустава, по-лученных при помощи магнитно-резонансной томогра-фии (МРТ), было выявлено: большое количество свободной воспалительной жидкости в полости сустава; множест-венные очаговые поражения бедренной, большеберцовой и малоберцовой костей (рис. 3).

Выполнена пункция левого коленного сустава, полу-чено 42 мл вязкой мутной жидкости. Цитологический анализ жидкости: цитоз 1360/мм3, лимфоциты 24 %, моноциты 10 %, с/я 58 %, п/я 3 %, эоз 4 %, баз 1 %. При микробиологическом исследовании роста микроорганиз-мов не получено.

Таким образом, у пациентки основными проявлени-ями грибковой инфекции, вызванной Acremonium spp., были: поражение кожи, синусит, пневмония, артрит, остеомиелит. Все они были полностью купированы через 47 дней от момента развития на фоне восстановления гемопоэза: Le 4,8 × 10 9 /л (гранулоциты 3840/мкл), Hb 122 г/л, Plt 90 × 10 9/л. В дальнейшем была продолжена

Рис. 1. Элементы сыпи у больной ОМЛ, осложненным инфекцией, вызванной Acremonium spp.

Рис. 2. Поражение левого коленного сустава у больной ОМЛ, осложнен-ным инфекцией, вызванной Acremonium spp.


4’

20

12

терапия основного заболевания и пациентка умерла от сепсиса, вызванного синегнойной палочкой.

Случай № 2. Г.С., 16 лет, диагноз: приобретенная идиопатическая апластическая анемия, сверхтяжелая форма. Агенезия левой почки. При осмотре на момент поступления – пациент афебрилен, однако в области левого гребня подвздошной кости в точке выполнения трепанобиопсии был выявлен инфильтрат около 1 см в диаметре, с гнойным стержнем в центре, а также увеличение и болезненность регионарного пахового лим-фатического узла. С целью профилактики грибковой инфекции больной получал позаконазол по 200 мг 3 раза в сутки. Учитывая наличие очага инфекции мягких тканей, получал антибактериальную терапию цефепимом и ле-вофлоксацином. При проведении двукратного микробио-логического исследования отделяемого из инфильтрата роста микроорганизмов получено не было. В дальнейшем, учитывая отрицательную динамику со стороны ин-фильтрата, – увеличение размеров до 1,5 см, появление болезненности – произведена смена антибактериальной терапии на цефоперазон/сульбактам и ванкомицин, достигнута положительная динамика в виде разрешения инфильтрата и купирования болезненности. Сохранялось изменение цвета кожных покровов в этой области в ви-де гиперпигментации. Пациенту был проведен курс терапии антитимоцитарным глобулином (АТГ) (атгам в суммарной дозе 160 мг/кг) с коротким курсом метил-преднизолона 1 мг/кг/сут в течение 19 дней (профилак-тика и лечение сывороточной болезни) и назначен циклоспорин А в дозе 2 мг/кг/сут.

На основании данных КТ легких, выявившей очаг пе-рибронховаскулярной инфильтрации 5 мм в диаметре в средней доле правого легкого, доза позаконазола была увеличена до 800 мг/сут.

После завершения курса АТГ отмечались нейтропе-нический энтероколит с септическим шоком без микро-биологического подтверждения, язвенно-некротический

стоматит, гингивит с ростом Stenotrophomonas malto-philia. Пациент получал различные комбинации антибак-териальных препаратов с учетом клинической картины и чувствительности St. maltophilia. На 27-й день от на-чала курса АТГ появились фебрилитет, плохое самочувс-твие, жалобы на оссалгии и миалгии в покое. На 35-й день от начала курса АТГ отмечалось появление мелких инфильтративных элементов на коже лица, живота, груди; болезненного инфильтрата размером до 0,8 см в диаметре, с последующим увеличением, на внутренней стороне нижней трети голени. На 39-й день появился элемент диаметром 0,5 см с гиперемией окружающих тканей на нижнем веке правого глаза (рис. 4), увеличение размеров очагов на голени, что свидетельствовало о дис-семинации инфекции неустановленной этиологии. Про-должена комбинированная антибактериальная и проти-вогрибковая терапия.

С 42-го дня от начала курса АТГ, учитывая присо-единение отечного синдрома (пастозность мягких тканей лица, поясничной области, голеней, стоп), уплотнение дельтовидных мышц, дальнейшую прогрессию инфильт-ративных элементов в виде увеличения прежних и при-соединения новых элементов, к проводимой терапии добавлен каспофунгин 50 мг/сут, отменен позаконазол и назначен вориконазол 12 мг/кг/сут. На 44-й день при-соединились признаки дыхательной недостаточности, увеличилось количество «отсевов» на коже. Выполнено КТ легких: отмечено появление зон сниженной пневма-тизации разных размеров по типу «матового стекла», преимущественно в левом легком. Терапия: меропенем, тикарциллин/клавулановая кислота, ципрофлоксацин, каспофунгин, вориконазол, лосек, морфин, лазикс, инфу-зионная и трансфузионная терапия. На 46-й день от начала курса АТГ выполнена биопсия двух инфильтра-тов – в области нижней трети правой голени и на левом предплечье. В дальнейшем, учитывая диссеминацию ин-фекции на фоне антибактериальной терапии широкого

Рис. 3. МРТ костей больной ОМЛ, осложненным инфекцией, вызванной Acremonium spp. Видны множественные мелкие литические изменения

Рис. 4. Элемент сыпи у больного апластической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Fusarium spp. (правый глаз)


’2

01

2 спектра действия и 8 дней комбинированной противо-грибковой терапии вориконазолом и каспофунгином, медленный рост микроорганизмов при культуральном исследовании (плесневые грибы?), подозрение на диссеми-нированную грибковую инфекцию с поражением кожи, слизистых задней стенки глотки, мышц, легких, был добавлен липидный комплекс амфо-В. Кроме того, про-водили трансфузии донорских гранулоцитов в режиме 2–3 раза в неделю. При микробиологическом исследова-нии крови на 52-й день от начала АТГ получен рост мицелиальных грибов. Из биоптата (инфильтрат кожи) идентифицирован плесневый гриб Fusarium spp. Произ-ведена смена центрального венозного катетера (ЦВК), микробиологическое исследование конца удаленного ЦВК – роста микроорганизмов не получено. С 56-го дня от начала курса АТГ начата стимуляция гранулоци-топоэза ленограстимом 10 мкг/кг/сут внутривенно с последующим переходом на пег-филграстим в дозе 100 мкг/кг подкожно, без эффекта. На фоне проводимой антибактериальной (меропенем, тикарциллин с кла-вулановой кислотой), противогрибковой (каспофунгин 75 мг/сут, вориконазол 12 мг/кг/сут, липосомальная фор-ма амфо-В 1,5 мг/кг/сут, амфо-В 10 мг/сут) терапии, обезболивания морфином, введения колониестимулирую-щего фактора (G-CSF) и трансфузий донорских грану-лоцитов была отмечена положительная динамика в со-стоянии пациента: уменьшение кратности фебрильных подъемов до 1–2 в сутки, отсутствие новых «отсевов» на коже, купирование дыхательной недостаточности, уменьшение болевого синдрома (стоматит, миалгии, бо-лезненные очаги). Однако, несмотря на стимуляцию грану-лоцитопоэза G-CSF, сохранялся агранулоцитоз (макси-мальное количество гранулоцитов составляло 20–120/мкл). С 64-го дня от начала курса АТГ вновь отмечалось появ-ление новых «отсевов» на коже (2 инфильтративных болезненных элемента в области левой стопы с невоз-можностью вставать на левую ногу), а также болез-ненность в области локтевых суставов с невозможно-стью их полного разгибания. При рентгенографии левой стопы выявлен остеолитический очаг 1 см в диаметре в V плюсневой кости (грибковый остеомиелит?) (рис. 5); при рентгенографии локтевых суставов в локтевых отрост-ках обеих локтевых костей определялись очаги разрежения без четких контуров, а также единичный очаг деструкции в дистальном метафизе плечевой кости по латеральной поверхности и в медиальном надмыщелке. Изменения структуры костей те же, что и в костях стоп.

С конца января отмечалось снижение зрения справа (правый глаз). Осмотр окулиста: на OD желтоватый очажок в макуле сетчатки, складчатость сетчатки в папилломакулярном пучке – центральный хориорети-нит (вероятнее всего, грибковой этиологии). К проводи-мой противогрибковой терапии (липидный комплекс амфо-В 1,5 мг/кг/сут, каспофунгин 75 мг/сут, ворико-назол по 12 мг/кг/сут) добавлен тербинафин (ламизил) 500–750 мг/сут перорально. По данным гемограммы со-хранялась аплазия кроветворения (Le 0,6–1,0 × 10 9/л,

Hb 91 г/л, Plt 26 × 10 9/л), проводили ежедневные транс-фузии препаратов крови, гранулоцитарной массы – 2–3 раза в неделю. Клиническая картина – фебрилитет, болевой синдром в левой стопе (остеолитический гриб-ковый очаг в кости), правой голени (обширный болезнен-ный инфильтрат мягких тканей на задней поверхности голени 3 × 4 см), множественные мелкие грибковые «от-севы» на коже (пятнисто-папулезные гиперемированные плотные элементы), 4 обширных болезненных инфильт-рата мягких тканей, выступающих над поверхностью кожи, багрово-синюшного цвета (на задней поверхности правой голени 4 × 3 см (рис. 6), на передней поверхности левой голени 1 × 1 см под черным струпом, на правой яго-дице 1,5 × 2 см с черным струпом в центре, в области наружной поверхности левого голеностопного сустава 2 × 2 см), эрозивно-язвенный стоматит.

Учитывая отсутствие ответа на иммуносупрессив-ную терапию через 90 дней от начала курса АТГ, тяже-

Рис. 5. Рентгенологические изменения в V плюсневой кости у больного аплас-тической анемией, осложненной инфекцией, вызванной Fusarium spp.

Рис. 6. Некротический очаг на задней поверхности правой голени у больного апластической анемией, осложненной инфекцией, вызван-ной Fusarium spp.


4’

20

12лое течение грибковой инфекции – диссеминированного

инвазивного фузариоза на фоне аплазии кроветворения, частично поддающегося контролю на фоне лечения про-тивогрибковыми препаратами и трансфузий донорских гранулоцитов, от проведения повторного курса АТГ было решено отказаться. Инициирован поиск неродственного HLA-совместимого донора в международном регистре. Однако донор найден не был. Дальнейшее ухудшение состояния с 133-го дня от начала курса АТГ за счет про-грессирования грибковой инфекции, сепсиса: на фоне сохраняющейся лихорадки отмечалось нарастание симп-томов интоксикации, появление множественных новых грибковых «отсевов» на коже, не поддающихся подсчету, отечного синдрома, нарастание геморрагического синд-рома, выраженного болевого синдрома в мышцах. На 136-й день на фоне развития септического шока с полиорган-ной недостаточностью наступила смерть.

Случай № 3. Больной З.И., 2 года, диагноз: приобре-тенная идиопатическая апластическая анемия, сверх-тяжелая форма. Проведен курс комбинированной имму-носупрессивной терапии атгамом (АТГ) в суммарной дозе 160 мг/кг и солу-медролом 1 мг/кг/сут. Профилак-тика грибковых инфекций проводилась итраконазолом 5 мг/кг/сут. Со 2-го дня от начала курса АТГ у пациента выявлена субфебрильная лихорадка до 37,7 °С, пятнис-тая сыпь на коже туловища и конечностей, была назна-чена эмпирическая антибактериальная терапия: цефо-перазон/сульбактам и левофлоксацин. На 4-й день введения АТГ у ребенка выявлена фебрильная лихорадка, слабость, вялость, кожный геморрагический синдром, мелкопятнистая сыпь на конечностях и ягодицах (аллер-гическая реакция на АТГ? сверхранняя сывороточная болезнь с болевым синдромом?), влажный кашель. В лег-ких аускультативно выявлены единичные, сухие хрипы, дыхательной недостаточности не было. К терапии был добавлен ванкомицин. На 7-й день от начала АТГ – уси-ление фебрильной лихорадки до 3–4 подъемов за сутки, болевого синдрома, появился влажный кашель, Sat O

2

97 %. При аускультации легких – влажные хрипы, боль-ше слева. Гемодинамика стабильная. Живот напряжен, печень + 2 см, селезенка + 1 см. Стул 2 раза в сутки, жидкий. Диурез адекватный. Посев крови выполнялся 1 раз в 2–3 дня, роста микроорганизмов не выявлено. CRP 22,3 мг/дл. Получал различные комбинации анти-бактериальной терапии. По данным КТ грудной клетки (рис. 7): выявлены крупные сливные зоны пневматической инфильтрации с перифокальным снижением пневмати-зации, с положительной воздушной бронхографией, с ин-фильтрацией костальной плевры в задних отделах левого легкого. В правом легком кроме крупных инфиль-тратов присутствовало несколько более мелких пери-васкулярных уплотнений. Плеврального выпота не было.

С 8-го дня в терапию добавлены противогрибковые препараты: вориконазол 14 мг/кг/сут, каспофунгин 50 мг/м2/сут. Доза преднизолона снижена в 2 раза (0,5 г/кг/сут), однако введение препарата было продол-жено с целью профилактики сывороточной болезни, про-

водилось обезболивание морфином (боль в грудной клет-ке, животе). С 9-го дня от начала терапии АТГ отмечено появление дыхательной недостаточности – одышка до 35 дыханий в минуту, снижение Sat O

2

до 89 %. Фебрильная лихорадка до 3 подъемов за сутки. На 10-й день выявлены проявления пареза кишечника, отечного синдрома. В анализе крови: Le 1,0 × 10 9/л, Hb 89 г/л, Plt 23 × 10 9/л. Гипоальбуминемия 20 г/л, CRP 34,7 мг/дл. На 11-й день от начала курса АТГ ухудшение со-стояния за счет появления неврологической симптома-тики: правосторонний гемипарез, клонические судороги (подергивания мышц правых конечностей, мышц живо-та). Ребенок в сознании, выполняет простые команды. Зрачки OD > OS, сглаженность правой носогубной склад-ки. Осмотр невропатолога: острое нарушение мозгового кровообращения? Грибково-бактериальный энцефалит? Выполнена КТ головного мозга (рис. 8) – в левой темен-ной доле визуализировалось массивное округлое псевдо-кистозное включение с высокоплотными капсулоподоб-ными включениями. Общий размер патологической зоны 54 × 61 мм. Левый боковой желудочек сдавлен. Средин-ные структуры не смещены. Ликвородинамика не нару-шена. Субарахноидальные пространства сужены только в месте локализации патологического образования. Кра-ниовертебральный переход без особенностей. Наиболее вероятно грибковое поражение центральной нервной си-стемы – аспергиллез?

Таким образом, у ребенка со сверхтяжелой апласти-ческой анемией, вероятной инвазивной грибковой инфек-цией легких (аспергиллез?) диагностировано поражение головного мозга, вероятно, также грибковой этиологии. Продолжена противогрибковая терапия (вориконазол, каспофунгин), отменен преднизолон. В дальнейшем со-стояние мальчика стремительно ухудшалось, нарастала дыхательная недостаточность и неврологическая симп-томатика (судороги, кома), потребовавшие перевода в отделение реанимации и проведения искусственной вентиляции легких. На 13-й день от начала терапии кон-статирована смерть больного.

Рис. 7. КТ легких больного апластической анемией, осложненной ин-фекцией, вызванной Mucor spp.


’2

01

2

При проведении культурального исследования ауто-псийного материала (ткани легких, головного мозга, печени, почек) получен рост Mucor spp. (Zygomycetes).

ОбсуждениеПовсеместное распространение мицелиальных

грибов – в почве, на растениях, на пищевых продуктах и их безопасность для не иммунокомпрометирован-ных больных, но смертельная опасность для больных онкогематологического профиля требует высокой на-стороженности от врачей-клиницистов в развитии инвазивного микоза, вызванного редкими мицелиаль-ными грибами.

Усовершенствование методов микробиологиче-ского выделения и идентификации патогенных орга-низмов; широкое применение противогрибковых пре-паратов, особенно азолов и амфо-В, которые подавляют чувствительные виды и ведут к повышению вероятности инфекций, вызванных резистентными видами; более широкое применение интенсивной ПХТ и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) от неродственного или частично совмес-тимого донора стали причиной повышения часто-ты редких грибковых возбудителей. Даже несмотря на большую настороженность, диагноз инвазивного микоза порой устанавливается поздно в связи с неспе-цифичностью клинических проявлений и тяжестью состояния больного, что не позволяет провести инва-зивные диагностические процедуры. Факторы риска развития инвазивного поражения одинаковы для всех грибковых патогенов: длительная нейтропения, при-менение глюкокортикоидов и/или иммуносупрессо-ров, реакция «трансплантат против хозяина» у реци-пиентов ГСК [3, 5–9]. Диагностика данных видов

мицелиальных грибов основана преимущественно на выявлении мицелия в материале из очага пораже-ния, фунгемия выявляется редко. Серологические методы диагностики не разработаны. Чаще достовер-ный диагноз устанавливается лишь на аутопсии, поскольку инвазивная биопсийная диагностика край-не затруднена у пациентов в тяжелом клиническом состоянии и с тяжелой тромбоцитопенией. Фактичес-ки безопасное патогистологическое исследование можно выполнить только при наличии кожного пора-жения, как это было сделано у пациентов № 1 и № 2.

Acremonium spp. – мицелиальные грибы, светлоок-рашенные гиалогифомицеты. Отличаются резистент-ностью in vitro к амфо-В, эхинокандинам, флуконазо-лу и итраконазолу. Могут быть чувствительны к вориконазолу in vitro, однако клинический успех за-висит не только от чувствительности к антимикоти-кам, но прежде всего от восстановления нарушенных факторов иммунитета. У иммунокомпрометирован-ных пациентов основными клиническими проявлени-ями являются поражение легких, придаточных пазух носа, фунгемия и диссеминация. Пути проникновения грибов в организм больного – ингаляционный (лег-кие, придаточные пазухи), желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), внутрисосудистый катетер. Особенно-стью гематогенной диссеминации является частое по-ражение кожи и подкожной клетчатки [10–12].

Fusarium spp. – так же как и Acremonium spp., явля-ются мицелиальными грибами, светлоокрашенными гиалогифомицетами, могут проникать через повреж-денную кожу. В структуре плесневых грибов занимают 2-е место после инвазивного аспергиллеза. Резистент-ны in vitro к эхинокандинам, флуконазолу, итракона-золу. Чувствительны к вориконазолу, позаконазолу, амфо-В. Чаще всего возбудитель попадает в организм больного ингаляционным путем, реже – через по-врежденную кожу. Диссеминация фузариоза происхо-дит на фоне длительной и глубокой гранулоцито-пении. Особенностью является поражение глаз (специфический кератит) и поражение кожи (до 70 %) при диссеминации, элементы представляют собой бо-лезненные эритематозные папулы, подкожные узелки с очагом некроза в центре, которые превращаются в длительно незаживающие язвы с дном, покрытым черным струпом. В гемокультуре данный возбудитель определяется у 40–60 % больных. Данный патоген яв-ляется ангиоинвазивным, может поражать артерии с последующим развитием тромбозов, инфарктов. Кли-нические и рентгенологические проявления поражения легких сходны с инвазивным аспергиллезом [6, 13, 14].

Mucor spp. – мицелиальный грибок, относящийся к классу Zygomycetes. Возбудитель резистентен к азо-лам (кроме позаконазола), эхинокандинам. In vitro чувствителен к амфо-В. Клиническое течение харак-теризуется быстрым разрушением всех тканевых барь-еров, поражением сосудов, гематогенной диссемина-цией с последующим развитием тромбозов и некрозов

Рис. 8. КТ головного мозга больного апластической анемией, ослож-ненной инфекцией, вызванной Mucor spp.


4’

20

12


1. Groll A.H., Lehrnbecher T. New antifungal drugs and the pediatric cancer patient: current status of clinical development. Klin Padiatr 2005;217(3): 158–68.2. Groll A.H., Walsh T.J. Fungal infections in the pediatric patient. In: Anaissie E., McGinnis M., Pfaller M., eds. Clinical mycology. 1-st ed. N.Y.: Churchill Livingstone, 2003. Рp. 417–42.3. Marr K.A., Carter R.A., Crippa F. et al. Epidemiology and outcome of mould infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Clin Infect Dis 2002;34:909–17. 4. Pagano L., Caira M., Candoni A. et al. The epidemiology of fungal infections in patients with hematologic malignancies: the

SEIFEM-2004 study. Haematologica 2006;91:1068–75.5. Kontoyiannis D.P., Wessel V.C., Bodey G.P. et al. Zigomycosis in the 1990-s in a tertiary – care cancer center. Clin Infect Dis 2000;30:851–6. 6. Musa M.O., Al Eisa A., Halim M. et al. The spectrum of Fusarium infection in immunocompromized patients with haemotological malignancies and in non- immunocompromized patients: a single institution experience over 10 years. Br J Haematol 2000;108:544–8. 7. Nenoff P., Kelermann S., Schober R. et al. Rhinocerebral zygomycosis following BMT in chronic myelogenous leukemia. Report of a case and review of the literature. Mycoses 1998;41:365–72.

8. Gonzales C.E., Couriel D.R., Walsh T.J. Disseminated zygomycosis in a neutropenic patient: successful treatment with amphotericin B lipid complex and granulocyte colonystimulating factor. Clin Infect Dis 1997;24:192–6. 9. Singh N., Aguado J.M., Bonatti H. et al. Zygomycosis in solid organ transplant recipients: a prospective, matched case-control study to assess risk for disease and outcome. J Infec Dis 2009;200(6): 1002–11.10. Fincher R.M., Fisher J.F., Lovell R.D. et al. Infection due to the fungus Acremonium (Cephalosporium). Medicine (Baltimore) 1991;70:398–409. 11. Schell W.A., Perfect J.R. Fatal, disseminated Acremonium strictum infection

тканей. Путь инфицирования преимущественно ин-галяционный, может попадать через поврежденную кожу (травмы, ожоги) и через ЖКТ. Основными кли-ническими вариантами являются: риноцеребраль-ный – 40–50 % случаев (вовлечение в процесс тканей орбиты, лица, твердого неба, головного мозга); легоч-ный – 15–25 % (кашель, боль в груди, кровохарканье, легочное кровотечение); с поражением кожи и под-кожной клетчатки – 10–20 % (отек, гиперемия, боль, некротические язвы с черным струпом); ЖКТ – 2–7 % (боль в животе, кровотечение, некроз, перфорация); диссеминированный зигомикоз – 2–23 % (поражение любых органов и тканей) [9, 15].

Терапия. Несмотря на доступность новых эффек-тивных антимикотиков лечение редких грибковых инфекций остается чрезвычайно трудным. Для успеш-ной терапии необходимо раннее начало антимикоти-ческой терапии и восстановление противоинфекци-онной защиты [16]. Без разрешения нейтропении выздоровление от грибковой инфекции практически невозможно, медикаментозная терапия лишь препят-ствует прогрессии процесса. Таким образом, основная роль в терапии принадлежит лечению основного за-болевания, применению G-CSF и трансфузий донор-ских гранулоцитов [17–19]. Особую роль в терапии зигомикоза и фузариоза играет хирургическое иссече-ние пораженных тканей [20]. Основным препаратом выбора для терапии Acremonium spp. является ворико-назол 14 мг/кг/сут; для терапии Fusarium spp. – ворико-назол 14 мг/кг/сут или позаконазол 800 мг/сут, липид-ные формы амфо-В 3–5 мг/кг/сут; для терапии Mucor spp. – липидные формы амфо-В 3–5 мг/кг/сут [21] и позаконазол 800 мг/сут [22, 23]. Возможно проведе-ние комбинированной антимикотической терапии [24].

Прогноз при всех плесневых грибковых инфек-циях неблагоприятный, особенно у пациентов с ней-

тропенией. В данной группе летальность составляет до 100 %.

В случае № 1 эпизод грибковой инфекции (Acre-monium spp.) был купирован с помощью проведения антимикотической терапии вориконазолом, и наибо-лее важным фактором явилось восстановление коли-чества лейкоцитов. Хочется отметить, что поражение костей было установлено только после проведения МРТ-исследования, тогда как по данным рентгено-графии и КТ изменений выявлено не было. В связи с развитием данного осложнения ребенку длительное время не проводилась специфическая терапия остро-го миелоидного лейкоза.

Случай № 2 (Fusarium spp.). Возможно, заражение пациента произошло до поступления в стационар, о чем говорит наличие очага (внешне похожего на очаги, развившиеся позже) в месте выполненной по месту жительства трепанобиопсии, однако микро-биологическое исследование материала, взятого спе-циальным тампоном из некротических тканей, оказа-лось негативным, а наличие Fusarium spp. было выявлено только после проведения биопсии очагов. Следует подчеркнуть, что пациент получал позакона-зол в дозе 600 мг/сут, затем 800 мг/сут, однако это не остановило прогрессии грибковой инфекции.

Случай № 3 (Mucor spp.). Тяжесть состояния, не-специфичность клинических проявлений, быстрота течения инфекционного процесса не позволили спас-ти жизнь ребенка; диагноз грибкового поражения был установлен только после проведения аутопсии. От мо-мента развития первых клинических симптомов пора-жения легких до смерти прошло 7 дней.

Таким образом, развитие грибковой инфекции, вы-званной редкими патогенами, является до настоящего времени нерешенной проблемой в терапии пациентов с различными гематологическими заболеваниями.


’2

01

2 in a neutropenic host. J Clin Microbiol 1996;34:1333–6. 12. Roilides E., Bibashi E., Acritidou E. et al. Acremonium fungemia in two immunocompromised children. Pediatr Infect Dis J 1995;14:548–50.13. Raad I., Tarrand J., Hanna H. et al. Epidemiology, molecular mycology and invironmental sources of Fusarium infection in patients with cancer. Infect Control Hosp Epidemial 2002;23:532–7. 14. Boutati E.I., Anaissie E.J. Fusarium, a significant emerging pathogen in patients with hematologic malignancy: ten years’ experience at a cancer center and implications for management. Blood 1997;90:999–1008.15. Gonzales C.E., Rinaldi M.G., Sugar A.M. Zygomycosis. Infect Dis Clin 2002;16:895–914.

16. Caillot D., Mannone L., Cuisenier B., Couaillier J.F. Role of early diagnosis and aggressive surgery in the management of invasive pulmonary aspergillosis in neutropenic patients. Clin Microbiol Infect 2001;7 Suppl 2:54–61.17. Liles W.C., Huang J.E., Van Burik J.A. et al. Granulocyte colony-stimulating factor administered in vivo augments neutrophil-mediated activity against opportunistic fungal pathogens. J Infect Dis 1997;175:1012–5.18. Sahin B., Paydas S., Cosar E. et al. Role of granulocyte colony-stimulating factor in the treatment of mucormycosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996;15:866–9.19. Bodey G.P., Anaissie E., Gutterman J. et al. Role of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as adjuvant therapy for fungal infection in patients with cancer. Clin Infect Dis 1993;17:705–7.

20. Tedder M., Spratt J.A., Anstadt M.P. et al. Pulmonary mucormycosis: results of medical and surgical therapy. Ann Thorac Surg 1994;57:1044–50. 21. Walsh T.J., Hiemennz J.W., Seibel N.L. et al. Amphotericin B lipid complex for invasive fungal infections: analysis of safety and efficacy in 556 cases. Clin Infect Dis 1998;26:1383–96.22. Alexander B., Perfect J., Daly J. et al. Posaconazole as salvage therapy in patients with invasive fungal infections after solid organ transplant. Transplantation 2008;86:791–6.23. Peel T., Daffy J., Thursky K. et al. Posaconazole as first line treatment for disse-minated zygomycosis. Mycoses 2008;51:542–5. 24. Walsh T.J., Kontoyiannis D.P. What is the role of combination therapy in management of zygomycosis? Clin Infect Dis 2008;47:372–4.

43

4’

20

12

Р Е Д К И Е Б О Л Е З Н И : Д И Ф Ф Е Р Е Н Ц И А Л Ь Н А Я Д И А Г Н О С Т И К А

Рентгенологическая картина злокачественного остеопетроза на ранних и поздних стадиях развития

заболевания

Е.Л. Сахаровская1, И.Б. Резник1, 2, М.М. Дубровин1, Г.П. Павлова1, 3, А.Ю. Щербина1

1ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;2Израильский Университетский медицинский центр «Хадасса», Иерусалим, Израиль;

3Республиканская детская клиническая больница, Чебоксары, Республика Чувашия

Контакты: Екатерина Леонидовна Сахаровская [email protected]

Инфантильная форма остеопетроза (злокачественный остеопетроз) – самая тяжелая форма остеопетроза. Специфическая рентгенологическая картина при этом заболевании позволяет не только заподозрить, но и подтвердить диагноз. Нами были проанализированы данные 17 пациентов с инфантильной формой остеопетроза. У 13 из 17 пациентов была выявлена мутация с.807+5 G>A в гене TCIRG1 (наиболее часто встречаемая мутация остеопетроза у чувашей и марийцев). Рентгеноло-гическое исследование было выполнено всем пациентам, при этом специфические признаки остеопетроза были описаны в 100 % случаев. В исследуемой группе у всех детей независимо от возраста при рентгенологическом исследовании отмечалось повышение рентгенологической плотности костей и ранняя оссификация. Детали рентгенологической картины в значительной степени различались в разных возрастных группах. Вероятнее всего, «чувашская» мутация обуславливает и более мягкое течение заболевания, чем другие варианты злокачественной формы остеопетроза. Продолжительность жизни без лечения может достигать 6–8 лет, что позволяет обнаружить рентге-нологические признаки, ранее описанные только при взрослой (доброкачественной) форме остеопетроза.

Ключевые слова: остеопетроз, мутация, рентгенологическое исследование, дети

Radiological features of malignant osteopetrosis at early and late stages of disease

E.L. Sakharovskaya1, I.B. Reznik1, 2, M.M. Dubrovin1, G.P. Pavlova1, 3, A.Yu. Shcherbina1


2Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, Israel;3Republic Children Clinical Hospital, Cheboksary

Infantile form of osteopetrosis (malignant osteopetrosis) is the most severe form of the disease. Specific radiological signs allow to suspect and confirm the diagnosis. We analyzed the data of 17 patients with infantile osteopetrosis. In 13 from 17 patients we detected с.807+5 G>A mutation in TCIRG1 gene (most commonly seen in Chuvash and Mari). In all patients X-ray examination was performed with specific osteopetrosis signs in 100 % of cases. Regardless of age increased bone density and early ossification in this group of children were described. Details of radiological picture were significantly differing in different age groups. Most probably «Chuvash» mutation causes a less severe disease than other types of malignant osteopetrosis. Without treatment patients can survive 6–8 years that can detect radiological signs previously described only in adult (benign) osteopetrosis.

Key words: osteopetrosis, mutation, radiological examination, children

ВведениеИнфантильная форма остеопетроза (злокачествен-

ный остеопетроз) – генетически детерминированное заболевание, характеризующееся неспособностью остеокластов осуществлять резорбцию костной ткани. На сегодняшний день описаны наиболее часто встре-чаемые мутации, что делает возможным проведение пренатальной диагностики [1–5]. Клиническая пре-зентация заболевания начинается в первые месяцы жизни. Развивается депрессия костно-мозгового кро-ветворения, гепатоспленомегалия, неврологические нарушения, изменение формы черепа и лицевого ске-лета [6–8]. При рентгенологическом исследовании

выявляются патогномоничные признаки остеопетро-за. Специфическая рентгенологическая картина поз-воляет с высокой достоверностью предположить ос-новной диагноз и оценить динамику развития осложнений заболевания [9, 10]. Скорость прогресси-рования заболевания зависит от варианта генетичес-кого нарушения. В большинстве случаев продолжи-тельность жизни пациентов со злокачественной формой остеопетроза без лечения составляет 2–3 года. Тактика лечения нацелена на максимально быстрое проведение трансплантации гемопоэтических стволо-вых клеток (ТГСК), до развития необратимых ослож-нений [11, 12].

444

’2

01

2Р Е Д К И Е Б О Л Е З Н И : Д И Ф Ф Е Р Е Н Ц И А Л Ь Н А Я Д И А Г Н О С Т И К А

В настоящей работе нами систематизированы рент-генологические данные 17 пациентов с инфантильной формой остеопетроза различных возрастных групп (рис. 1).

Пациенты и методыВ исследуемую группу вошло 17 пациентов с ин-

фантильной формой остеопетроза, диагностированных в РДКБ Республики Чувашия (n = 10), РДКБ Респуб-лики Марий Эл (n = 5), Федеральном научно-клини-ческом центре детской гематологии, онкологии и им-мунологии (n = 1), РДКБ Республики Бурятия (n = 1).

Средний возраст больных составил 3,5 года (39,8 мес; от 6 месяцев до 7,5 лет). Мальчики состави-ли 70,6 % (n = 12), а девочки – 29,4 % (n = 5). Средний возраст детей на момент установления диагноза соста-вил 6,5 месяцев (от 1 до 20 месяцев).

При оценке симптомов заболевания было установ-лено, что преобладающими признаками были: гема-тологические нарушения (n = 17), наличие гепато-спленомегалии (n = 17), нарушения зрения (n = 17), гидроцефалия (n = 17). У большинства пациентов при-сутствовало нарушение дыхания в виде периодических эпизодов апноэ, храпящего дыхания (n = 13). В 12 слу-чаях отмечалось отставание психомоторного развития. Нарушение слуха к моменту диагностики наблюдалось только у 7 больных.

Четырнадцати пациентам из 17 было выполнено молекулярно-биологическое исследование ДНК на наличие мутации с.807+5 G>A в гене TCIRG1. В 13 случаях была выявлена данная мутация, ответственная за развитие аутосомно-рецессивного остеопетроза сре-ди чувашей и марийцев. У 1 ребенка азербайджанской национальности данная мутация обнаружена не была,

но при молекулярно-генетическом анализе всего гена TCIRG1 методом секвенирования были выявлены 2 ра-нее не описанные мутации в гомозиготной форме: c.479G>A и c.2415-1G>C, что подтвердило основной диагноз у этого пациента.

Рентгенологическое исследование было выполне-но всем пациентам, при этом специфические призна-ки остеопетроза были описаны в 100 % случаев.

РезультатыВ описываемой группе у всех детей независимо от

возраста при рентгенологическом исследовании отме-чалось повышение рентгенологической плотности кос-тей и ранняя оссификация. Детали рентгенологической картины при злокачественном остеопетрозе в значи-тельной степени зависят от возраста пациента, что связано с врожденным характером заболевания.

В первые месяцы жизни наибольшие изменения отмечались в костях с преобладанием губчатого вещест ва: основания черепа, позвоночника, ребер, верхних и нижних конечностей. У пациентов старше 6 месяцев повышение рентгенологической плотности носило уже генерализованный характер (рис. 2).

В 16 случаях из 17 определялся патогномоничный признак остеопетроза – двойной контур трубчатых костей, описываемый как «кость в кости» (рис. 3). У са-мого старшего пациента (7,5 лет) четких признаков данного симптома не наблюдалось, что связано с пос-тепенным разрастанием и перестройкой костной ткани.

При оценке динамики развития рентгенологиче-ской картины нам удалось отследить постепенное сужение костномозгового канала, начиная с 3-месяч-ного возраста вплоть до полного его закрытия к 2–3 годам жизни (рис. 4).

Повышенная плотность

Ранняя оссификация

Кость внутри кости

Сужение костно-мозгового канала

Диффузный склероз

Трубчатые кости по типу «колбы Эрленмейера»

Позвоночник по типу «сэндвича»

Неоднородность костной ткани

Есть

Нет

0 % 20 % 40 % 60 % 80 % 100 %

17

17

16 1

16 1

16 1

9 8

8 9

5 12

Рис. 1. Частота встречаемости рентгенологических признаков инфантильной формы остеопетроза (n = 17)

45

4’

20

12


Повышенная ломкость костей во многом может объясняться диффузным склерозом и нарушением стро-ения балок остеоидов костной ткани, которые отме-чались в 16 из 17 случаев. Частой находкой были не только очаги остеосклероза, но и патологические переломы с разрастанием толстой костной мозоли в местах повреждения (рис. 5). Последнее объясняет-ся отсутствием процесса резорбции и ремоделирова-ния костной ткани в ходе регенерации.

В губчатых костях: основания черепа, костей та-за и в особенности позвоночника с большей часто-той отмечались участки фокального склероза. В бо-ковой проекции позвонки с фокальным склерозом

Рис. 2. Рентгенография грудной клетки маль-чика в возрасте 6 месяцев с остеопетрозом. Генерализованный характер поражения кост-ной системы, повышение рентгенологической плотности костей

Рис. 3. Рентгенограмма нижних конечностей мальчика в возрасте 1 год с инфантильной фор-мой остеопетроза. Признак «кость в кости», начало формирования «колб Эрленмейера»

Рис. 4. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 1,5 лет с инфантильной формой остеопетроза. Сужение костномозго-вого канала

выглядят как «два эллипсоида, нависающие друг над другом» и описываются как «симптом сэндвича» (рис. 6). Этот признак присутствовал у 8 из 17 паци-ентов.

В длинных трубчатых костях развитие костного склероза чаще про исходит от эпифизарного хряща в направлении к диафизу. В рентгенологическом изображении подобное развитие процесса выгляде-ло в виде ряда чередующихся участков уплотнения и участков нормальной кости, расположенных па-раллельно эпифизарной линии (рис. 7). В некоторых случаях определялась осевая слоистость с полосами различной ширины.

Рис. 5. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 1 год с инфантильной фор-мой остеопетроза. Костная мозоль на месте перелома правой берцовой кости

6. Рентгенография позвоночника мальчика в возрасте 1 год 9 месяцев с инфантильной формой остеопетроза. Позвоночник – «симп-том сэндвича»

Рис. 7. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 3 года 8 месяцев с инфан-тильной формой остеопетроза. Костный скле-роз от эпифизарного хряща к диафизу в виде чередующихся участков уплотнения и участки нормальной кости

464

’2

01

2Р Е Д К И Е Б О Л Е З Н И : Д И Ф Ф Е Р Е Н Ц И А Л Ь Н А Я Д И А Г Н О С Т И К А

Изменение формы трубчатых костей по типу «кол-бы Эрленмейера» было описано только при взрослой (доброкачественной) форме остеопетроза, презенти-рующей не раньше подросткового возраста [6]. В на-шем исследовании данный признак присутствовал более чем в половине случаев – у 9 пациентов из 17, у пациентов начиная с 2,5 лет, т. е. существенно рань-ше подросткового возраста (рис. 8).

Обсуждение Остеопетроз относят к группе орфанных (редких)

заболеваний. Частота встречаемости инфантильной (злокачественной) формы в общей популяции состав-ляет 1 случай на 250 000 новорожденных (в эндемич-ных зонах до 1 на 4000), встречаемость доброкачест-венной формы 1 случай на 20 000 новорожденных [2, 5, 6]. Тяжесть течения, прогноз и подходы к лече-нию прин ципиально отличаются в зависимости от формы остео петроза. Инфантильная (злокачествен-ная) форма наследуется по аутосомно-рецессивному типу, развивается с рождения, без лечения пациенты погибают в раннем возрасте [13, 14]. Взрослая (добро-качественная) форма остеопетроза имеет аутосомно-доминантный тип наследования, диагностируется в подростковом возрасте. Характерны менее выражен-ные структурные изменения в костях, значительно более мягкое клиническое течение [6, 15]. Однако

многие рентгенологические признаки, которые опи-саны при доброкачественной форме, были нами най-дены у пациентов со злокачественной формой в воз-расте старше 2–3 лет.

В подавляющем большинстве случаев (n = 13)в ис-следуемой группе заболевание было обусловлено на-иболее часто встречаемой («чувашской») мутацией гена TCIRG1 – с.807+5 G>A. Трем пациентам генети-ческое исследование не проводилось, однако все трое по национальности чуваши. Один ребенок азербай-джанской национальности 1 года 3 месяцев имел дру-гую мутацию. В связи с тем, что ТГСК вошедшим в эту группу пациентам не проводилась, нам удалось про-следить развитие заболевания до поздних стадий. Ве-роятнее всего, «чувашская» мутация приводит к более мягкому течению заболевания, чем при других вари-антах злокачественной формы остеопетроза. Продол-жительность жизни без лечения может достигать 6–8 лет, что позволяет обнаружить рентгенологиче-ские признаки, ранее описанные только при взрослой форме остео петроза. Атрофия зрительных нервов у этих больных наступала примерно к двум годам жиз-ни, т. е. позже «стандартной» инфантильной формы заболевания.

Из-за отсутствия резорбции происходит разрас-тание костной ткани в сторону костного канала [16, 17], что рентгенологически видно с одной сторо-ны, как сужение его просвета, а с другой стороны, виден второй, «внутренний» контур кости (признак «кость внутри кости»). Подтверждением данного предположения может служить то, что, по нашим на-блюдениям, с возрастом к моменту полной облите-рации костного мозга этот признак становится менее выраженным, а вещество кости становится однород-ным и компактным. В ходе естественной прогрессии заболевания процесс разрастания начинает затраги-вать в большей степени диафизы костей, постепенно формируя форму «колбы Эрленмейера». Эти этапы развития занимают около 5–7 лет. У детей, прошед-ших ТГСК, процесс резорбции восстановлен, поэто-му дальнейшего патологического разрастания кост-ной ткани не происходит [18, 19].

Таким образом, в зависимости от возраста паци-ента и формы заболевания рентгенологическая карти-на остеопетроза значительно отличается. При этом нам удалось показать, что у всех детей независимо от возраста при рентгенологическом исследовании отме-чаются патогномоничные признаки остеопетроза: повышение рентгенологической плотности костей и ранняя оссификация. Подобная специфическая рент-генологическая картина позволяет не только заподоз-рить, но и подтвердить диагноз.

Рис. 8. Рентгенография нижних конечностей мальчика в возрасте 6 лет с инфантильной формой остеопетроза (слева). Длинные труб-чатые кости по типу «колбы Эрленмейера» (справа)

47

4’

20

12



1. Pangrazio A., Pusch M., Caldana E. Molecular and clinical heterogeneity in CLCN7-dependent osteopetrosis: report of 20 novel mutations. Hum Mutat 2010;31(1):1071–80.2. Bhargava A., Blank R. Osteopetrosis. Emedicine Oct 13, 2009; Emedicine. medscape.com/article/123968-overview.3. Гинтер Е., Краснов М., Кириллов А. Аутосомно-рецессивный остеопетроз. Метод указания. Чебоксары, 2004. 36 с.4. Близнец И.А., Тверская С.М., Зинченко Р.А. и др. Молекулярно- генетическая причина остеопетроза в Чувашии. Мед ген 2005;4(7):315–21.5. Кириллов А.Г. Наследственные болезни в Чувашской Республике. Автореф. дис. … докт. мед. наук, 2008.6. Stark Z., Savarirayan R. Osteopetrosis. Orphanet J Rare Dis 2009;4:5.7. Steward C.G. Neurological aspects of osteopetrosis. Neuropathol Appl Neurobiol 2003;29(2):87–97.8. Fasth A. Osteopetrosis – more than only a disease of the bone. Wiley Inter Science 0.1002/ajh.21454. 18 May 2009.

9. Сахаровская Е., Stepensky P., Rheingold L. и др. Клинические проявления инфан-тильной (злокачественной) формы остео-петроза. Онкогематол 2010;4:28–32.10. Schulz A.S., Moshous D., Steward C.G., Villa A. Osteopetrosis Consensus guidelines for diagnostics, therapy and follow up. Consensus guidelines of the ESID and the EBMT: Version 0.17092009х.11. Tolar J., Bonfim C., Grewal S., Orchard P. Engraftment and survival following hematopoietic stem cell transplantation for osteopetrosis using a reduced intensity conditioning regimen. Bone Marrow Transplantation 2006;38(12):783–7.12. Stepensky P., Schulz A.S., Lahr G. et al. Successful second haploidentical SCT in osteopetrosis. Bone Marrow Transplantation 2010 Sep 20 [Epub ahead of print].13. Frattini A., Orchard P.J., Sobacchi C. et al. Defects in TCIRG1 subunit of the vacuolar proton pump are responsible for a subset of human autosomal recessive osteopetrosis. Nat Genet 2000;25(3):343–6.14. Cleiren E., Benichou O., Van Hul E. et al. Albers-Schonberg disease (autosomal

dominant osteopetrosis, type II) results from mutations in the C1CN7 chloride channel gene. Hum Mol Genet 2001;10:2861–7.15. Pangrazio A., Pusch M., Caldana E. Molecular and clinical heterogeneity in CLCN7-dependent osteopetrosis: report of 20 novel mutations. Hum Mutat 2010;31(1):E1071–80.16. Ogbureke K.U., Zhao Q., Li Y.P. et al. Human osteopetroses and the osteoclast V-H+-ATPase enzyme system. Front Biosci 2005;10(1):2940–54.17. Baron R. Anatomy and Ultrastructure of Bone. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. 4th ed, Philadelphia, 1999.18. Aker M., Shapira M.Y., Resnick I. et al. Allogeneic stem cell transplantation for the treatment of diseases associated with a deficiency in bone marrow products. Springer Semin Immunopathol 2004;26 (1–2):133–42.19. El-Tawil T., Stoker D. Benign osteopetrosis: a review of 42 cases showing two different patterns. Skeletal Radiol 1993;22(8):587–93.

484

’2

01

2Ф У Н Д А М Е Н Т А Л Ь Н Ы Е И С С Л Е Д О В А Н И Я В П Р А К Т И Ч Е С К О Й М Е Д И Ц И Н Е Н А С О В Р Е М Е Н Н О М Э Т А П Е

Оптимизация экспериментальных моделей заболевания лейкозом у человека (обзор литературы)

Д.Д. Панков1, 2, А.Г. Румянцев1

1ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;2Мемориальный онкологический центр им. Слоуна-Кеттеринга, Нью-Йорк

Контакты: Дмитрий Дмитриевич Панков [email protected]

Данный обзор литературы посвящен актуальной проблеме оценки перспективности иммунотерапии, в том числе антигенспеци-фической клеточной терапии, при помощи животных моделей. В обзоре рассматриваются разные группы животных моделей, существующих на данный момент, и описываются методы создания этих моделей от разных линий иммунодефицитных мышей до нескольких вариантов приживления опухолевых клеток в организм животного. В обзоре затрагиваются темы возможного изучения стволовых опухолевых клеток с использованием мышиных моделей для лечения лейкоза при помощи адоптивной клеточ-ной терапии, в том числе WT1. Затрагивается вопрос миграции, пролиферации человеческих лейкозных клеток в разных линиях мышей с разной степенью иммунодефицита. Предлагается сравнивать мышиную модель по иммунодефициту с клинической ситуацией у человека после курса химиотерапии, из этого следует оценка возможной эффективности иммунотерапии.

Ключевые слова: иммунотерапия, антигенспецифическая клеточная терапия, животные модели иммунодефицитных мышей, NOD/SCID, NSG, WT1

Optimization of experimental human leukemia models (review)

D.D. Pankov1, 2, A.G. Rumyantsev1


2Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA

Actual problem of assessing immunotherapy prospects including antigen-specific cell therapy using animal models was covered in this review. Describe the various groups of currently existing animal models and methods of their creating – from different immunodeficient mice to se-veral variants of tumor cells engraftment in them. The review addresses the possibility of tumor stem cells studying using mouse models for the leukemia treatment with adoptive cell therapy including WT1. Also issues of human leukemia cells migration and proliferation in a mice with different immunodeficiency degree are discussed. To assess the potential immunotherapy efficacy comparison of immunodeficient mouse model with clinical situation in oncology patients after chemotherapy is proposed.

Key words: immunotherapy, antigen-specific cell therapy, animal models, immunodeficient mice, NOD/SCID, NSG, WT1

Значительные шаги, сделанные в направлении понимания молекулярной основы онкогенеза, позво-лили наметить, а в ряде случаев и реализовать диффе-ренцированные методы лечения этой патологии, про-ецирующиеся на молекулярный уровень, включая клеточную терапию [1]. Однако многие биологически активные средства, которые при испытаниях in vitro позволяли надеяться на заметный лечебный эффект, оказываются неэффективными при весьма затратных дальнейших клинических испытаниях, что подчер-кивает значимость выбора оптимальной экспери-ментальной модели заболевания у человека при исследованиях in vivo. Особенно остро стоит вопрос об оптимальном, методически оправданном выборе преклинической экспериментальной модели для тес-тирования способов лечения онкологических заболе-ваний, планируемых для использования в детской практике, так как клинические исследования лекарст-венных препаратов у детей во многих странах ограни-чены или запрещены. А потребность в новых эффек-тивных и малотоксичных препаратах, особенно когда

речь идет об онкологии, тем более лейкозе, очень вы-сока [2, 3]. Одним из примеров такой терапии может быть антигенспецифическая адоптивная клеточная терапия, которая активно развивается на данный мо-мент. Поэтому работа с преклинической эксперимен-тальной моделью может дать результаты, которые могут помочь в ближайшем будущем с выбором при-оритетного метода лечения в клинике [4]. Мышиные модели играют особенно важную роль для оценки эффективности иммунотерапии перед ее использо-ванием в клинических условиях, таких как, напри-мер, адоптивная терапия WT1 Т-клетками для лече-ния лейкоза.

За последние десятилетия приживление челове-ческих лейкозных клеток мышам с разной степенью дефицита иммунитета проявило себя как очень эф-фективный инструмент в изучении патогенеза лейко-за. Мышиные модели могут быть в будущем одним из способов прогнозирования эффективности кон-кретного метода лечения лейкоза [5]. Это связано с рядом принципиальных обстоятельств:

49

4’

20

12

Ф У Н Д А М Е Н Т А Л Ь Н Ы Е И С С Л Е Д О В А Н И Я В П Р А К Т И Ч Е С К О Й М Е Д И Ц И Н Е Н А С О В Р Е М Е Н Н О М Э Т А П Е

1) схожесть функционирования костного мозга мышей и человека [6];

2) мышиная модель позволяет размножать опухолевые клетки in vivo для их дальнейшего изу-чения [7];

3) после приживления клеток острого лимфобласт-ного лейкоза (ОЛЛ) или острого миелобластного лей-коза (ОМЛ) в мышиной модели можно наблюдать все клинические признаки, свойственные развитию забо-левания у человека [8];

4) существует достаточное разнообразие мышиных моделей, отличающихся наличием или отсутствием цитокинов и макрофагов, Т- и В-лимфоцитов и нату-ральных киллеров (NК-клеток) [9].

Более 25 лет назад у мышей была обнаружена му-тация, которая приводит к тяжелому комбинирован-ному иммунодефициту (SCID) [10], что позволило производить им трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) без осложнения в виде от-торжения трансплантата. Трансплантация таким мы-шам лейкозных клеток и лейкозных клеточных линий позволила наблюдать у них динамику развития лейко-за, схожую с человеческой [11, 12]. Однако остаточные иммунные механизмы ограничивали пределы роста опухоли. Тогда было осуществлено скрещивание мы-шей SCID с особями линии nonobese diabetic (NOD/Lt). В результате была генерирована новая линия мышей NOD/SCID с улучшенной приживаемостью опухоле-вых клеток (NOD/LtSz-scid/scid) [13].

Хотя трансплантация NOD/SCID мышам клеток ОЛЛ позволила создать модель распространения лей-коза, схожую с аналогичными процессами у человека, работа по совершенствованию данной модели забо-левания была продолжена [14, 15]. Линия мышей (NOD/SCID) была модифицирована путем подавле-ния роста и развития NК-клеток и за счет создания дефекта γ-цепей рецептора интерлейкина 2, обозна-ченная как линия NSG. У таких особей оказалось обеспечено почти 100 % приживление опухоли, и in vivo стала возможной дифференцировка трансплантиро-ванных гемопоэтических стволовых клеток, в связи с почти полным отсутствием мышиных иммунных клеток. Иммунодефицитные мыши являются опти-мальной моделью для исследования эффективности иммунотерапии. Это позволяет оценивать действие препарата, почти полностью игнорируя вспомога-тельное участие иммунной системы организма хозя-ина [16].

Метод приживления мышам лейкемических кле-ток пациента после курса химиотерапии обладает определенной прогностической ценностью [17]. Од-нако он не является абсолютно надежным в прогно-стическом плане [18]. При разработке терапевтиче-ского подхода к лечению лейкоза у конкретного пациента, при сравнительной оценке методических приемов моделирование на экспериментальных жи-вотных может быть очень полезным.

При использовании мышиной модели как инстру-мента для прогноза развития и исхода лейкоза у паци-ента необходимо учитывать, что мы следим за раз-витием процесса с самого начала, т. е. от момента введения нескольких миллионов лейкозных клеток до их экспансии до десятков и сотен миллионов. Такая же динамика может наблюдаться у пациента после спровоцированного курсом химиотерапии состояния иммунодефицита. Поэтому считается, что мышиная модель развития опухоли сопо ставима по иммуноде-фициту с ситуацией, возникающей у человека, полу-чившего химиотерапию. Однако необходимо учиты-вать, что это сопоставление не является адекватным по клону опухолевых клеток.

При обсуждении вопроса о целесообразности про-ведения конкретному пациенту антигенспецифичес-кой терапии необходимо знать: являются ли клетки, презентирующие конкретный антиген, стволовыми опухолевыми клетками, которые обеспечивают под-держание опухолевой популяции. Если этот так, то при помощи антигенспецифической терапии принци-пиально возможно остановить или значительно замед-лить рост опухоли, которая является следствием пато-логического процесса, ведущего к возникновению новообразованной ткани с генетически измененным аппаратом клеток и нарушенной регуляцией их роста. При этом очень важно иметь в виду, что в опухоли имеются собственные стволовые клетки [19]. Их от-личает нарушение принципа плюрипотентности [20]. Опухолевые стволовые клетки способны к самооб-новлению. Один из наиболее вероятных факторов, который может быть ассоциирован с этим процессом, это – экспрессия внутриклеточного белка WT1 [21–24].

Наиболее благоприятной для применения анти-генспецифической терапии является ситуация, возни-кающая после активного и радикального (например такого, как химиотерапия) лечения больного лейко-зом, когда зрелые клетки погибли, а рост новой опу-холи (рецидив) может начаться за счет стволовых опу-холевых клеток. И если антиген WT1 экспрессируется в достаточном количестве в этих клетках, то они ста-новятся подходящей ми шенью для антигенспецифи-ческой иммунотерапии [4, 25]. Так, в работах группы Е. Дубровиной, O’Reilly было показано, что антиген-специфичный лизис опухолевых клеток эффекторны-ми WT1-специфичными Т-клетками коррелирует с пропорцией клеток, экспрессирующих этот белок в опухолевой популяции клеток [4, 20, 25].

Для изучения действия антигенспецифической терапии на стволовые опухолевые клетки необходима мышиная модель, в которой влияние NК-клеток будет незначительным, как это имеет место, например, в NSG-линии. Наличие мышей линии NSG, в орга-низме которых подавлена активность NК-клеток, мо-жет дать новый импульс для исследований in vivo по такой еще мало изученной и весьма перспективной

504

’2

01


теме, как антигенспецифическая иммунотерапия, на-правленная на опухолегенные стволовые клетки.

Исследования in vivo показали, что уровень при-живления опухоли и ее развития на мышиной модели связан с агрессивностью опухоли. Приживление опу-холи, трансплантированной мышам от пациента с ОЛЛ после химиотерапии, идет менее интенсивно, если у донора имеет место длительная ремиссия и бла-гоприятное течение заболевания [14].

Биологическое и клиническое течение заболева-ния в мышиной модели зависит не только от вида мыши, но и от тактики получения клеток из костно-го мозга: используют свежеполученные клетки, т. е. забранные напрямую от пациента, которые прижи-ваются быстрее, или размороженные, или прошед-шие генную модификацию, представляющую собой процесс, требующий нахождения клеток несколько дней в пробирке для дальнейшего их использования в животных моделях [26–29].

Способ введения клеток определяет скорость при-живления. При этом различают несколько способов введения клеток в организм мыши:

а) подкожное введение, особенностью которого является то, что можно достаточно быстро увидеть, как приживляется трансплантат, и определять его раз-меры по диаметру подкожного образования. Но при этом опухоль находится в неспецифичном для себя микроокружении, что может приводить к ложнопози-тивному результату [16], т. е. опухоль может расти в подкожной клетчатке агрессивнее, нежели в естест-венном для себя окружении. Кроме этого, было про-демонстрировано, что подкожное введение не приво-дит к метастатическому течению заболевания [16], в отличие от естественного развития онкопроцесса;

б) при внутривенном введении опухолевые клетки сначала устремляются в легкие, потом направляются в печень, где могут оставаться или полностью оттуда уйти, но основным моментом является активизация хоуминг-эффекта, т. е. миграция лимфоцитов в лим-фатические узлы и костный мозг, где начинается их активная продукция и развитие заболевания [30];

в) введение напрямую в костный мозг обеспечи-вает самый быстрый способ приживления по сравне-нию с системным введением [31].

При оценке значения состояния самой мышиной особи для приживления лейкоза обращают внимание на следующее:

а) облучение иммуносупрессивных мышей пе ред трансплантацией может улучшить приживление за счет освобождения свободного пространства в кост-ном мозге. Но, согласно последним данным, незна-чительно [15], к тому же в случае с ОЛЛ облучение может нарушать хоуминг-эффект лейкозных клеток [32];

б) остаточные мышиные клетки могут повлиять на приживление человеческих клеток на уровне про-дукции цитокинов [33];

в) у мышей, которые были трансдуцированы чело-веческими факторами роста, отмечается лучшая при-живаемость клеток ОМЛ [34–36];

г) возраст мыши влияет на скорость и уровень приживления трансплантата. Чем моложе особь, тем больше шансов на приживление [37]. Новорожденные мыши используются для того, чтобы уменьшить вли-яние собственных мышиных иммунных клеток [38];

д) выбор мышиной линии. Сравнение мышиных линий NOD/SCID и NSG показал, что в мышиной группе NOD/SCID ОМЛ-образцы из криопрезерва-ции, которые были трансплантированы напрямую в костный мозг, дали более быстрое приживление и на более продолжительный период [17]. Однако в случае с NSG мышами ситуация совсем другая, там имела место корреляция исходов у пациентов-доноров и ис-ходов развития заболевания у мыши [9, 17].

В зависимости от цели исследования могут быть использованы разные мышиные модели. Если целью является экспансия клеток или исследование биоло-гических свойств опухоли, то необходимо использо-вать модель, которая подразумевает наименее рези-стентный рост и наиболее удобное место введения клеток. Если целью стоит создание клинической си-туации у пациента, то необходимо осторожно и вни-мательно относиться ко всем факторам, начиная от выбора мышей и заканчивая способом введения опу-холевых клеток.

Агрессивный рост опухоли и возможности для ее приживления в живом организме дают возможность не только для параклинических исследований, но так-же и для изучения биологических основ опухолевого процесса. На примере мышиных моделей мы можем проводить антигенспецифическую терапию, рассчи-танную на атаку небольшого числа клеток, несущих на себе конкретный антиген, но если этот антиген на-ходится на стволовой опухолевой клетке, то возможно подавить рост опухоли целиком [39]. Всегда считалось, что стволовые клетки ОЛЛ – это фенотипически не-зрелые и редко встречающиеся клетки, что было вид-но на примере NOD/SCID мышей; но в случае с NSG мышами было показано, что более зрелые и более час-то встречающиеся клетки также обладают лейкемоген-ным потенциалом [38, 40, 41].

Существуют факторы, которые заметно уменьша-ют возможность использования мышиных моделей в преклинических исследованиях. Например, иммуно-модулирующие препараты не могут быть использованы при проведении исследований на иммунодефицитных мышах, так как их эффект может быть доказан только в иммунокомпетентном организме. Другим ограниче-нием является факт того, что стромальное окружение опухоли является не человеческим, а мышиным. У препаратов, которым требуется наличие специфи-ческих человеческих факторов, смешение человече-ских и мышиных факторов может привести к недос-товерным результатам. Самой большой проблемой

51

4’

20

12

Ф У Н Д А М Е Н Т А Л Ь Н Ы Е И С С Л Е Д О В А Н И Я В П Р А К Т И Ч Е С К О Й М Е Д И Ц И Н Е Н А С О В Р Е М Е Н Н О М Э Т А П Е

является фундаментальная разница между метаболиз-мом человека и мыши. Это ярко продемонстрировано на примере талидомида [42]. Продукты его превраще-ния в организме человека и мыши существенно раз-личаются: будучи абсолютно безвредным у мышей, у человека талидомид приводит к повреждению цепей ДНК и множественным врожденным аномалиям. По-этому создание новых «человекоподобных» мышиных моделей, в которых присутствие человеческих клеток и факторов максимально увеличено, является очень важной задачей.

В своих исследованиях Nomura Inaba из Химио-терапевтического центра в Токио (Япония) показал, что большое количество ложнопозитивных результа-тов, полученных при тестировании химиопрепаратов на мышах, связано с тем, что доза лекарственного средства, которую можно ввести мыши, в 4–5 раз вы-ше, чем та, что можно дать человеку [43–46].

Скептицизм, связанный с результатами, получен-ными в исследованиях на мышах, направленных на использование новых лекарств в клинических ис-пытаниях, связан с тем, что некоторые препараты, оказавшиеся эффективными на мышах, «не работают» у людей. Однако надо учитывать тот факт, что паци-енты, которые участвуют в клинических испытаниях, чаще всего страдают далеко зашедшим, активно мета-стазирующим, иногда толерантным к стандартной химиотерапии онкологическим заболеванием, в то время как в экспериментах на мышах лечение начи-нается через 4–7 дней после трансплантации опухоле-вых клеток. Таким образом, терапия направлена на весьма небольшой по объему аналог опухоли чело-века, еще не успевший активно метастазировать и сла-бо организованный [16]. Следовательно, речь идет о попытке сопоставить эффективность лечения на раз-

личных стадиях заболевания, что может, соответствен-но, обусловить несовпадение результатов.

Таким образом, задача выбора оптимальной экспе-риментальной модели заболевания лейкозом у человека с целью разработки эффективных методов лечения на клеточном и молекулярном уровне является очень важной и актуальной. От ее решения зависит проблема повышения эффективности преклинического этапа тес-тирования выбранной для пациента терапии.

Есть все основания считать, что на сегодняшний день именно мышиные модели заболевания лейкозом являются основой для преклинических исследований и прогнозирования эффективности выбранного метода лечения в каждом индивидуальном случае. Существую-щее разнообразие мышиных моделей позволяет исполь-зовать ту из них, которая в большей степени соответству-ет поставленной в каждом конкретном случае задаче.

При использовании мышиной модели как инстру-мента прогнозирования развития и исхода опухоли у пациента необходимо учитывать, что при создании этой модели животному пересаживается минимальное необходимое для приживления количество клеток, и в результате имеет место начальный процесс разви-тия опухоли. Поэтому мы считаем, что мышиная модель развития опухоли более всего сопоставима с ситуацией, возникающей у человека, получившего химиотерапию.

Мышиная линия NSG может служить инструмен-том для оценки эффективности и перспективности антигенспецифической терапии, проводимой элими-нации стволовых опухолевых клеток.

Мышиная модель может быть использована для изу-чения и понимания биологических характеристик не только лейкозов, но и при разработке лечения больных многими другими онкологическими заболеваниями.


1. Maschan A.A., Rumyantsev A.G. Transplantation of hematopoietic stem cells in children. Acad Mia, 2003.2. Houghton P.J., Adamson P.C., Blaney S. et al. Testing of new agents in childhood cancer preclinical models: meeting summary. Clin Cancer Res 2002;8:3646–57.3. Pui C.H., Relling M.V., Campana D., Evans W.E. Childhood acute lymphoblastic leukemia. Rev Clin Exp Hematol 2002;6:161–80; discussion 200–2.4. Doubrovina E.S., Doubrovin M.M., Sangyull L. et al. In vitro stimulation with WT1 peptide-loaded Epstein-Barr virus-positive B cells elicits high frequencies of WT1 peptide-specific T cells with in vitro and in vivo tumoricidal activity. Clinical Cancer Research 2004;10:7207–19.

5. Gutmann D.H., Hunter-Schaedle K. and Shannon K.M. Harnessing preclinical mouse models to inform human clinical cancer trials. J Clin Invest 2006;116(4):847–52.6. Boxio R., Bossenmeyer-Pourié C., Steinckwich N. et al. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol 2004;75(4):604–11. Epub 2003 Dec 23.7. Singh P., Hu P., Hoggatt J. et al. Expansion of bone marrow neutrophils following G-CSF administration in mice results in osteolineage cell apoptosis and mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells. Leukemia advance online publication 1 June 2012. 8. Baersch G., Möllers T., Hötte A. et al. Good engraftment of B-cell precursor ALL

in NOD-SCID mice. Klin Padiatr 1997;209(4):178–85.9. Meyer L.H., Debatin K.M. Diversity of human leukemia xenograft mouse models: implications for disease biology. Cancer Res 2011;71:7141–4. Published OnlineFirst November 16, 2011.10. Bosma G.C., Custer R.P., Bosma M.J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature 1983;301:527–30.11. Kamel-Reid S., Letarte M., Sirard C. et al. A model of human acute lymphoblastic leukemia in immunedeficient SCID mice. Science 1989;246:1597–600.12. Lücking-Famira K.M., Daniel P.T., Möller P. APO-1 (CD95) mediated apoptosis in human T-ALL engrafted in SCID mice. Leukemia 1994;8:1825–33.

524

’2

01


13. Shultz L.D., Schweitzer P.A., Christianson S.W. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 1995;154:180–91.14. Lock R.B., Liem N., Farnsworth M.L. et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood 2002;99:4100–8.15. Yan Y., Salomon O., McGuirk J. et al. Growth pattern and clinical correlation of subcutaneously inoculated human primary acute leukemias in severe combined immunodeficiency mice. Blood 1996 Oct 15;88(8):3137–46.16. Kerbel R.S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived – but they can be improved. Cancer Biol Ther 2003;2:134–9.17. Schmitz M., Breithaupt P., Scheidegger N. et al. Xenografts of highly resistant leukemia recapitulate the clonal composition of the leukemogenic compartment. Blood 2011;118:1854–64.18. Notta F., Mullighan C.G., Wang J.C. et al. Evolution of human BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia-initiating cells. Nature 2011 Jan 20;469(7330):362–7.19. Allegrucci C., Wu Y.Z., Thurston A. et al. Restriction landmark genome scanning identifies culture-induced DNA methylation instability in the human embryonic stem cell epigenome. Hum Mol Genet 2007; 16:1253–68.20. Knoepfler P.S. Deconstructing stem cell tumorigenicity: a roadmap to safe regenerative medicine. Stem Cells 2009 May;27(5):1050–6.21. Kanato K., Hosen N., Yanagihara M. et al. The Wilms’ tumor gene WT1 is a common marker of progenitor cells in fetal liver. Biochem Biophys Res Commun 2005;326:836–43.22. Sugiyama H. WT1 (Wilms’ Tumor Gene 1): biology and cancer immunotherapy. Jpn J Clin Oncol 2010;40(5):377–87.23. Oji Y., Ogawa H., Tamaki H. et al. Expression of the Wilms, tumor gene WT1 in solid tumors and its involvement in tumor cell growth. Jpn J Cancer Res 1999 Feb;90(2):194–204.24. Abbruzzese J.L., Evans D.B., Willett C.G. et al. Gastrointestinal Oncology 2004. Oxford University press. Pp. 689–90.

25. Doubrovina E., Carpenter T., Pankov D. et al. Mapping of novel peptides of WT-1 and presenting HLA alleles that induce epitope-specific HLA-restricted T cells with cytotoxic activity against WT-1(+) leukemias. Blood 2012 Aug 23;120(8): 1633–46.26. Pearce D.J., Taussig D., Zibara K. et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood 2006;107:1166–73.27. Meyer L.H., Eckhoff S.M., Queudeville M. et al. Early relapse in all is identified by time to leukemia in NOD/SCID mice and is characterized by a gene signature involving survival pathways. Cancer Cell 2011;19:206–17.28. Malaise M., Neumeier M., Botteron C. et al. Stable and reproducible engraftment of primary adult and pediatric acute myeloid leukemia in NSG mice. Leukemia 2011;25:1635–9.29. Yurasov S.V., Flasshove M., Vladimirskaya E.B. et al. Low density mononuclear cells from umbilical cord blood as a target for retrovirally mediated gene trans-fer. Russ J Immunol 1996 Dec;1(1):35–40.30. Fukuda S., Abe M., Onishi C. et al. Survivin selectively modulates genes deregulated in human leukemia stem cells. J Oncol 2011;2011:946936. doi: 10.1155/2011/946936. Epub 2010 Dec 23.31. Mazurier F., Doedens M., Gan O.I., Dick J.E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med 2003;9:959–63.32. Spiegel A., Kollet O., Peled A. et al. Unique SDF-1-induced activation of human precursor-B ALL cells as a result of altered CXCR4 expression and signaling. Blood 2004;103:2900–7.33. Manz M.G. Human-hemato-lymphoid-system mice: opportunities and challenges. Immunity 2007;26:537–41.34. Wunderlich M., Chou F.S., Link K.A. et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCIDIL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia 2010;24:1785–8.35. Bonnet D., Bhatia M., Wang J.C. et al. Cytokine treatment or accessory cells are required to initiate engraftment of purified primitive human hematopoietic cells transplanted at limiting doses into NOD/

SCID mice. Bone Marrow Transplant 1999;23:203–9.36. Feuring-Buske M., Gerhard B., Cashman J. et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia 2003;17:760–3.37. Ballen K.K., Valinski H., Greiner D. et al. Variables to predict engraftment of umbilical cord blood in to immunodeficient mice: usefulness of the non-obese diabetic – severe combined immunodeficient assay. Br J Haematol 2001;114:211–8.38. Kong Y., Yoshida S., Saito Y. et al. CD34þCD38þCD19 as well as CD34þCD38-CD19þ cells are leukemia-initiating cells with self-renewal capacity in human B-precursor ALL. Leukemia 2008;22(6): 1207–13.39. Alberta J.A., Springett G.M., Rayburn H. et al. Role of the WT1 tumor suppressor in murine hematopoiesis. Blood 2003 Apr 1;101(7):2570–4.40. Cox C.V., Evely R.S., Oakhill A. et al. Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells. Blood 2004;104:2919–25.41. le Viseur C., Hotfilder M., Bomken S. et al. In childhood acute lymphoblastic leukemia, blasts at different stages of immunophenotypic maturation have stem cell properties. Cancer Cell 2008;14:47–58.42. Parman T., Wiley M.J., Wells P.G. Free radical-mediated oxidative DNA damage in the mechanism of thalidomide teratogenicity. Nat Med 1999;5:582–5.43. Inaba M., Kobayashi T., Tashiro T., Sakurai Y. Pharmacokinetic approach to rational therapeutic doses for human tumor-bearing nude mice. Jpn J Cancer Res 1988 Apr;79(4):509–16.44. Tashiro T., Inaba M., Kobayashi T. et al. Responsiveness of human lung cancer/nude mouse to antitumor agents in a model using clinically equivalent doses. Cancer Chemother Pharmacol 1989;24(3):187–92.45. Inaba M., Kobayashi T., Tashiro T. et al. Evaluation of antitumor activity in a human breast tumor/nude mouse model with a special emphasis on treatment dose. Cancer 1989 Oct 15;64(8):1577–82.46. Maruo K., Ueyama Y., Inaba M. et al. Responsiveness of subcutaneous human glioma xenografts to various antitumor agents. Anticancer Res 1990 Jan–Feb;10(1):209–12.

К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И , С И М П О З И У М Ы , С О В Е Щ А Н И Я 53

4’

20

12

МатериалыV I I I Р о с с и й с к о г о с и м п о з и у м а

« Б и о л о г и ч е с к и е о с н о в ы т е р а п и и о н к о л о г и ч е с к и х

и г е м а т о л о г и ч е с к и х з а б о л е в а н и й »

Москва, 1–3 февраля 2013 г.

К О Н Ф Е Р Е Н Ц И И , С И М П О З И У М Ы , С О В Е Щ А Н И Я544

’2

01

2 Молекулярные механизмы движения хромосом в митозе

Ф.И. АтауллахановФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии

им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, Москва; Центр теоретических проблем физико-химической

фармакологии РАН, Москва; физический факультет ФГБОУ ВПО «Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова»

В последние 5–6 лет был в значительной степени выяснен механизм работы нанодвигателя, обеспечи-вающего движение хромосомы при делении клетки. Оказалось, что хромосомы двигает машина, механизм работы которой уникален и не имеет аналогов ни в биологии, ни в технике, ни в других областях науки. Главными движителями хромосом являются микро-трубочки. Эти трубки, имеющие диаметр в 25 нм и со-стоящие из одного белка – тубулина, могут запасать химическую энергию в виде механического напряже-ния, которое потом используется для движения хро-мосомы. Проведенное нами исследование динамики деполимеризации такой трубки с помощью лазерного динамометра показало, что они могут развивать до-вольно большие по молекулярным меркам силы – до 70–80 пиконьютон (R. McIntosh, F. Ataullakhanov et al. Cell, 2008; R. McIntosh, F. Ataullakhanov. J Cell Sci, 2010). Эти силы микротрубочка развивает в ходе про-цесса, называемого «катастрофой», – стенки микротру-бочки растрескиваются вдоль ее оси и образующиеся длинные узкие «протофиламенты» изгибаются наружу и толкают специальный комплекс белков, связанных с хромосомой. Кинетохорный комплекс белков, обес-печивающих динамическое сопряжение движения хро-мосомы с разбирающимся концом микротрубочки, формирует сложное устройство, структуру и работу ко-торого мы только начинаем понимать. Возможные гипотезы об устройстве этого комплекса будут проана-лизированы и сопоставлены с экспериментальными данными.

Моделирование неонатального роста эмбриональной опухоли

И.В. Бегун1, О.В. Красько2, О.И. Быданов1, О.В. Алейникова1

1ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»

Министерства здравоохранения Республики Беларусь; 2Объединенный институт проблем информатики Национальной академии наук Беларуси, Минск,

Республика Беларусь

Задача исследования. Моделирование динамики роста эмбриональной опухоли в раннем неонатальном периоде.

Пациенты и методы. Для выполнения экстраполя-ции обобщены результаты первичной ультразвуковой визуализации новообразования у 133 детей обоего по-ла в возрасте от 1 до 729 дней (медиана – 301 день) с морфологически подтвержденными эмбриональны-ми опухолями: гепатобластомой, нейробластомой и нефробластомой. Известно уравнение роста массы

М(t) = M02

tDT ,

аналогично, разделив массу на плотность ткани и ло-гарифмируя, можно записать

log2V(t) = t

DT + log2V

0.

Принимая гипотезу линейного роста периода удвоения для эмбриона (Г.П. Седова, 2008) и выдвигая гипотезу о подобии параметров роста эмбриональной опухоли и наиболее интенсивно растущего в периоде от зачатия до 2 лет организма, нами рассматривалось уравнение

log2V(t) =

tb + k × t + log

2V

0 (1),

где t – время; V(t) – объем опухоли в зависимости от времени; V

0 = V(t = 0) – объем в момент времени;

t = 0; DT = b + k × t – время удвоения как линейная функция. Если за t = 0 принять некий момент в ран-нем неонатальном периоде, то b интерпретируется как DT данного момента, k – постоянная скорость роста DT. Основная задача заключалась в оценке па-раметров нелинейного уравнения (1): DT (период удвоения опухоли в раннем неонатальном периоде) и k c учетом различий в объемах типов опухолей. Рас-четы выполнялись в статистическом пакете R.

Результаты. Для характеристики предклинической фазы неонатального роста эмбриональной опухоли построена нелинейная регрессионная модель по урав-нению (1), даны оценки параметров в момент времени t = 0 (момент раннего неонатального периода жизни младенца). Расчетные параметры модели:


4’

20

12

Нозо- логи-

ческаяформа

DT (средн.)

для неона-

тального периода

95 % ДИ

р

Скорость прироста DT (дней за день)

95 % ДИ

р

ниж

н.

верх

н.

ниж

н.

верх

н.

Для всей группы

25,42 3,96 46,88 0,02183 0,21 0,17 0,26 < 0,0001

Полученные данные могут быть полезны для опре-деления «перинатальной визуализационной точки от-счета роста» эмбриональной злокачественной опухоли.

Экспансия ЕК-клеток в присутствии EBV-трансформированной

лимфобластоидной клеточной линии и интерлейкина-2

Е.П. Вашкевич, А.В. Тарасова, Т.В. ШманГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»

Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Для экспансии естественных киллерных (ЕК, CD3-CD56+) клеток используют различные стиму-ляторы, в том числе фидерные клетки, например, EBV-трансформированную лимфобластоидную клеточ-ную линию (LCL), которую получают путем заражения нормальных В-лимфоцитов вирусом Epstein–Barr. Целью данной работы была оценка влияния LCL, полу-ченной в нашей лаборатории, на рост ЕК-клеток in vitro.

Объектом исследования являлись селектирован-ные иммуномагнитным способом ЕК-клетки перифе-рической крови доноров (n = 6). Клетки культивиро-вали в среде AIM-V с добавлением 10 % AB сыворотки человека, L-глютамина и антибиотиков в присутствии или без LCL, облученной дозой 50 Гр, и интерлейкина (ИЛ) 2 (500 МЕ/мл) в течение 21 суток со сменой сре-ды каждые 3–4 дня с добавлением или без ИЛ-2.

На 7, 14 и 21-е сутки определяли прирост клеток в культуре с использованием красителя трипанового синего; субпопуляционный состав лимфоцитов (окраска антителами к CD3, CD56, CD69) и противо-опухолевую активность против линии К-562 опреде-ляли методом проточной цитофлуориметрии.

При экспансии селектированных клеток наблю-дали активный рост ЕК-клеток в присутствии LCL и/или ИЛ-2 на 2-й неделе культивирования, который увеличивался к 21-м суткам. При этом прирост ЕК в присутствии LCL + ИЛ-2 на 21-е сутки составил 23,5 ± 5,8 раза и был значительно выше, чем в при-

сутствии только ИЛ-2 – 8,8 ± 2,0 (p = 0,08). Чистота популяции ЕК-клеток после экспансии на 21-е сутки составила 81,9 ± 3,5 %. В образцах без добавления ИЛ-2 роста ЕК не наблюдалось.

Также было показано, что экспансия с использо-ванием ИЛ-2 и его комбинации с LCL достоверно (p < 0,05) увеличивала количество активированных (CD69+) ЕК-клеток с 3,8 % на 0-й день до более чем 80 % на 21-е сутки. При анализе противоопухолевого действия экспансированных в присутствии LCL и/или ИЛ-2 ЕК-клеток получено достоверное (p < 0,05) по-вышение их цитотоксичности до 60 % на 21-е сутки по сравнению с таковой на 0-й день.

Таким образом, нами показана возможность экс-пансии и активации обогащенной популяции ЕК-кле-ток в присутствии LCL.

Эволюция представлений о роли свободных радикалов

в патогенезе болезней человека

Ю.А. ВладимировКафедра медицинской биофизики

факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Первые исследования роли свободных радикалов в сложных химических и биологических системах бы-ли выполнены под руководством академика РАН Н.М. Эмануэля в Институте химической физики им. Н.Н. Семенова РАН. В основе проводимых иссле-дований было изучение реакций цепного окисления полиненасыщенных жирных кислот. Следующий важ-ный шаг по изучению роли свободных радикалов в биологических системах был сделан Д. Харманом, который исследовал влияние антиоксидантов (пере-хватчиков свободных радикалов) на продолжитель-ность жизни животных и развитие дегенеративных заболеваний при старении. Результатом этих исследо-ваний стало появление свободно-радикальной теории старения. Важным этапом развития представлений о роли свободных радикалов в метаболизме стало об-наружение Фридовичем и МакКордом фермента су-пероксиддисмутазы – фермента, субстратом которого является супероксидный радикал. Открытие суперок-сиддисмутазы стало важной вехой на пути детального понимания механизма участия свободных радикалов в реакциях, протекающих в норме в клетках и тканях. Интересным аспектом таких исследований стал тот факт, что реакции взаимодействия радикалов друг с другом сопровождаются свечением и за протеканием и интенсивностью этих реакций можно наблюдать, используя метод хемилюминесценции. Применение метода хемилюминесценции для изучения свободно-радикальных процессов в биологических системах позволило построить схему реакций и смоделировать


’2

01

2 процессы, протекающие в полиненасыщенных липид-ных системах, где индукция свободных радикалов про-исходит под действием ионов двухвалентного железа. Исследование реакций перекисного окисления липи-дов позволило понять важную роль этого процесса в из-менении структуры и функции биологических мембран при развитии патологических процессов. В последние годы благодаря исследованиям, проводимым в нашей лаборатории и в некоторых лабораториях за рубежом, стало известно, что свободные радикалы играют веду-щую роль в реакциях запрограммированной клеточной гибели (апоптозе). В основе этих реакций лежит обра-зование комплекса цитохрома и анионных фосфоли-пидов, и появления у этого комплекса пероксидазной активности. Все перечисленные выше исследования однозначно доказывают, что свободные радикалы за-нимают важное место в жизнедеятельно сти организма.

Клеточный биочип для исследования костного мозга детей с острыми лейкозами

А.О. Доронина1, 3, А.Н. Хвастунова1, 2, О.С. Федянина2, Ф.И. Атауллаханов1, 2, 3, С.А. Кузнецова1, 2, 3

1Лаборатория биофизики ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

2ЦТП ФХФ РАН, Москва; 3лаборатория физической биохимии системы крови

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва

Основополагающими методами при диагностике онкогематологических заболеваний являются микро-скопическое (морфологическое) исследование клеток крови и костного мозга и иммунофенотипирование. Однако невозможность проведения этих исследований на одних и тех же клетках может приводить в ряде слу-чаев к противоречиям при формулировке диагноза. Нашей группой разработан метод, совмещающий в се-бе определение поверхностных антигенов лейкоцитов с возможностью проведения их полноценного морфо-логического исследования.

Метод основан на использовании клеточного био-чипа. Биочип представляет собой прозрачную под-ложку, на которой иммобилизованы антитела к 36 поверхностным антигенам лейкоцитов. При инкуба-ции биочипа с суспензией лейкоцитов клетки, несу-щие определенный поверхностный антиген, связыва-ются с иммобилизованными антителами. После отмывки на поверхности биочипа остаются области, покрытые лимфоцитами, несущими тот или иной по-верхностный антиген, морфология которых затем ис-следуется стандартными цитологическими методами. Таким образом, биочип позволяет исследовать морфо-логию клеток крови, для которых известен один из ее поверхностных CD-антигенов.

Данным методом были исследованы лейкоциты, полученные методом гипотонического лизиса эритро-цитов из пунктата костного мозга детей с острыми лейкозами, поступивших на лечение в ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Показано соответствие опре-деляемых с помощью биочипа морфологии и иммуно-фенотипа опухолевых клеток результатам, получен-ным стандартными диагностическими методами (с помощью морфологического исследования клеток в мазке и методом проточной цитометрии).

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31275.

Применение методов MLPA, ПЦР и FISH для выявления амплификации

гена MYCN и делеции 1P у пациентов с нейробластомой

А.Е. Друй1, 2, 3, Г.А. Цаур1, 3, А.М. Попов1, 3, О.М. Плеханова1, С.Н. Тупоногов1, Е.В. Шориков1, 3, Л.И. Савельев1, 2, 3, С.В. Цвиренко1, 2, Л.Г. Фечина1, 3

1ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург;

2ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург;

3ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург

Клиническое течение нейробластомы во многом определяется биологическими свойствами опухолевых клеток. При этом с большой частотой выявляются аберрации, связанные с увеличением или уменьшени-ем числа копий (амплификации и делеции) опреде-ленных хромосомных регионов, и ряд из них имеют неблагоприятное прогностическое значение в отноше-нии общей и бессобытийной выживаемости пациен-тов. К данным молекулярно-генетическим маркерам относятся амплификация гена MYCN и делеция корот-кого плеча хромосомы 1 (del1p), их точное опреде-ление необходимо для корректной стратификации больных на группы риска и выбора оптимальной те-рапевтической стратегии. На сегодняшний день пред-ложено большое количество молекулярно-генетиче-ских методов, служащих для выявления аберраций, связанных с изменением числа копий отдельных генов или хромосомных локусов, среди них полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в режиме реального вре-мени (ПЦР-РВ), FISH, сравнительная геномная гиб-ридизация, анализ однонуклеотидных полиморфиз-мов и др. Относительно новой методикой является множественная лигазно-зависимая амплификация зондов (MLPA), основанная на амплификации олиго-нуклеотидных зондов, специфичных к анализируемым локусам, при условии лигирования их составных час-тей. Целью исследования явилось проведение качест-венного сравнения результатов определения количес-


4’

20

12тва копий гена MYCN и del1p методами MLPA, ПЦР,

ПЦР-РВ и FISH.Сто двадцать шесть образцов ДНК, выделенной

из ткани опухоли 122 больных нейробластомой, были исследованы методом MLPA с использованием набо-ров SALSA P251 и P252 (MRC Holland) и ПЦР-РВ для выявления амплификации MYCN. Из них 23 образца нейробластомы анализировались методом FISH. Определение del1p было выполнено 70 пациентам с помощью анализа вариабельного числа тандемных повторов микросателлитных локусов в области корот-кого плеча хромосомы 1 (ПЦР VNTR), 22 пациентам – с помощью FISH.

Амплификация гена MYCN была выявлена мето-дами MLPA и ПЦР-РВ в 22 образцах ткани опухоли от 21 пациента. В 6 из 23 образцов нейробластомы, исследованных методом FISH, была выявлена ампли-фикация MYCN. В данных образцах аберрация опре-делялась как с помощью MLPA, так и с помощью ПЦР-РВ. Таким образом, качественная сходимость результатов анализируемых методик достигла 100 %. В 7 из 70 образцов была определена del1p с использо-ванием ПЦР VNTR, в 6 (8,57 %) из них делеция была выявлена MLPA. В 2 (2,86 %) образцах del1p опреде-лялась только MLPA и в 1 (1,43 %) – только ПЦР VNTR. В 61 (87,14 %) образце делеция не была обна-ружена ни одним методом, качественная сходимость результатов составила 95,71 %. При сравнении резуль-татов выявления del1p методами ПЦР VNTR и FISH расхождения были получены в 2 (9,09 %) случаях, еще в 2 образцах делеция была обнаружена обоими ме-тодами. При этом сходимость результатов состави-ла 90,91 %.

Таким образом, все анализируемые методики, предложенные для выявления аномалий, связанных с изменением числа копий отдельных регионов, про-демонстрировали высокую качественную сходимость результатов. Все они, включая технологию MLPA, мо-гут быть применены в клинической практике для оп-ределения прогностических биологических маркеров.

Подбор условий для in vitro дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в хондрогенном

направлении

А.А. Жерносеченко, Я.И. ИсайкинаГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»


Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обла-дают способностью дифференцироваться по хондро-генному пути под воздействием ряда ростовых факто-ров in vitro. Подтверждением дифференцировки может

служить синтез клетками протеогликанов и различных типов коллагена.

Цель – подбор условий для in vitro дифференци-ровки МСК в хондрогенном направлении.

Материалы и методы. МСК, полученные из кост-ного мозга доноров, дифференцировали в 3D-системе под воздействием трансформирующего ростового фактора TGFβ1 или TGFβ3, инсулиноподобного рос-тового фактора IGF, дексаметазона и аскорбиновой кислоты в течение 28 дней. Оценка экспрессии генов коллагена 1, 10 и аггрекана проводилась методом RT-qPCR. Материалом для иммуногистохимического исследования синтеза коллагена II являлись МСК до и после дифференцировки в присутствии TGFβ1, инкубированные с раствором первичных антител ан-ти-COL2A1 (1 : 50) и раствором вторичных антител: Alexa Fluor 488 (1 : 400) с последующим анализом на конфокальном микроскопе Leica. Гистологиче ский анализ проводили окраской толуидином синим и са-франином О.

Результаты. Гистологическое окрашивание культу-ры клеток после 7 суток дифференцировки в присут-ствии как TGFβ1, так и TGFβ3 показало более интен-сивную окраску толуидином синим и сафранином О по сравнению с недифференцированными МСК, что является доказательством синтеза клетками кислых мукополисахаридов, характерных для хондроцитов. Изменение степени интенсивности флуоресценции Col2A в культуре МСК с 16,42 ± 2,38 на 0-й день до 56,15 ± 5,50 на 28-й день дифференцировки свиде-тельствует об активации клетками синтеза коллагена II, причем характерным является основная его локализа-ция в составе внеклеточного матрикса. При культиви-ровании МСК в присутствии TGFβ3 на 21-е сутки выявлена более интенсивная экспрессия коллагена X (0,09 (00024–2,694)) и аггрекана (0,15 (0,0234–0,158)), но более низкая экспрессия коллагена I (0,0001 (0–256)), чем при использовании TGFβ1 (0,0595 (0,032–0,135), 0,0994 (0,667–0,262) и 0,0029 (0,00159–0,0041) соот-ветственно). Таким образом, полученные нами резуль-таты могут свидетельствовать о том, что приоритет-ным ростовым фактором для дифференцировки МСК в хондроцитоподобные клетки может быть TGFβ3.

Кинетическая хемилюминесценция как метод оценки антиоксидантной

активности

Д.Ю. Измайлов, Ю.А. ВладимировФакультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным для изучения реакций с участием свободных радикалов и действия антиоксидантов, поскольку он позволяет осуществить непосредствен-


’2

01

2 ное детектирование свободных радикалов, а также регистрировать кинетику образования свободных радикалов.

Антиоксиданты оказывают различное влияние на кинетику хемилюминесценции – одни антиокси-данты преимущественно влияют на интенсивность свечения, другие вызывают появление задержки све-чения на начальном этапе (латентный период). Как следствие, в хемилюминесцентных методах до сих пор не существует единых и универсальных характеристик антиоксидантного действия. Наиболее адекватным методом анализа антиоксидантного действия различ-ных веществ может служить математическое модели-рование кинетики хемилюминесценции.

Показано, что влияние антиоксидантов на кине-тику хемилюминесценции может быть описано одной общей реакцией взаимодействия антиоксиданта со свободными радикалами. По значению константы этой реакции антиоксиданты можно условно разде-лить на «сильные» и «слабые». Сильные антиоксидан-ты, обладающие высокими значениями константы скорости реакции взаимодействия с радикалами, вы-зывают полное подавление свечения на начальных этапах. Слабые антиоксиданты имеют низкие значе-ния константы скорости реакции взаимодействия с радикалами и для них характерно частичное подав-ление интенсивности свечения в течение длительного периода времени.

Таким образом, математическое моделирование позволяет объяснить характер влияния антиоксидан-тов на кинетику хемилюминесценции и предложить универсальный параметр для оценки и сравнения антиоксидантной активности различных веществ.

Получение противоопухолевой вакцины на основе аутологичных дендритных

клеток для иммунотерапии пациентов с опухолями головного мозга

Я.И. Исайкина, Р.Л. Высоцкая, Т.В. Шман, Е.П. Вашкевич

ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»


Глиобластома является одной из наиболее агрессив-ных первичных опухолей головного мозга, поэтому применение иммунотерапии, а именно вакцины на ос-нове дендритных клеток (ДК) в качестве адъювантной, является многообещающим, так как направлено на ак-тивацию противоопухолевого ответа пациента.

Целью работы было оценить фенотипические и функциональные свойства генерированной in vitro вакцины ДК, разработать схему проведения вакцино-

терапии и осуществить подбор эффективной дозы вводимых клеток.

Вакцину ДК генерировали in vitro из моноцитов пациентов, культивируя их в присутствии IL-4 и GM-CSF и нагружая лизатом аутологичных опухолевых клеток. Фагоцитарную активность ДК определяли по степени поглощения ими опухолевого гомогената методами проточной цитофлуориметрии и конфокальной мик-роскопии. В смешанной культуре с лимфоцитами оце-нивали противоопухолевую активность вакцины ДК по экспрессии CD107а на лимфоцитах и антигенпре-зентирующую функцию – по степени активации и пролиферации Т-лимфоцитов.

Результаты. Полученная вакцина содержала 83,55 ± 6,87 % клеток, экспрессирующих CD83+СD209+. После инкубации с опухолевым гомогенатом уровень флуоресценции ДК в области спектра испускания PKH-26, которым был обработан гомогенат, составил 90,8 ± 4,8 %, что свидетельствовало о высокой фаго-цитарной активности ДК. При культивировании лим-фоцитов в присутствии вакцины ДК наблюдалось увеличение популяции CD3+CD8+, CD3+CD8- и CD3+ в 13,0 ± 6,6; 20,9 ± 8,2 и 17,3 ± 6,0 раз соответственно по сравнению с контролем (p < 0,05), а также досто-верное повышение по сравнению с контролем акти-вированных CD3+CD8+CD69+ (p < 0,05). Относитель-ное количество CD3+107a+ и CD3+CD8+107a+ клеток было в 2 раза выше, чем в контроле (p < 0,05). Таким образом, вакцина ДК способна индуцировать актива-цию и пролиферацию Т-лимфоцитов в смешанной культуре. Установлена рекомендуемая доза ДК для полу-чения иммунологического эффекта, равная 1,0–1,2 × 107

клеток, минимальная доза – 0,5–0,7 × 107 и влияние кумулятивной дозы вакцины ДК на иммунный ответ. Разработан метод вакцинотерапии, включающий по-лучение опухолевого лизата из клеток опухоли паци-ента, проведение пациенту процедуры лейкафереза после окончания химиолучевой терапии, генерация вакцины ДК in vitro и ее введение в дозе 0,7–1,2 × 107 внутрикожно, в следующем режиме: 1-я вакцина – день 7–8 после лейкафереза; 2-я и 3-я вакцины – с ин-тервалом в 2 недели после первой, 4-я и каждая по-следующая вакцина – 1 раз в месяц.

Прогностическая значимость L- и Н-изоферритинов

при миелодиспластических синдромах

Ж.М. Козич, Л.А. Смирнова, Д.К. НовикГУ «Республиканский научно-практический центр

радиационной медицины и экологии человека», Гомель, Беларусь; ГУ «Белорусская медицинская академия последипломного образования», Минск, Беларусь

Миелодиспластический синдром (МДС) – это ге-терогенная группа заболеваний, объединенных общи-


4’

20

12ми признаками: цитопенический синдром, наличие

дисмиелопоэза и высокая частота трансформации в острый лейкоз.

В 1997 г. с целью оценки прогноза и выбора так-тики лечения для пациентов с впервые установлен-ным диагнозом МДС была разработана Шкала IPSS (International Scoring Prognostic System – Междуна-родная Шкала оценки прогноза). Используя эту си-стему, пациентов с МДС подразделяют на группы низкого и высокого риска. Согласно этой Шкале па-циенты РАИБ-1 и РАИБ-2 относятся к высокой груп-пе риска с низкой общей выживаемостью, поэтому необходим поиск новых прогностических маркеров для определения тактики ведения и лечения таких пациентов.

Гиперферритинемия описана ранее как при раз-личной онкопатологии, так и при ряде гемобластозов. В последние годы обнаружено, что ферритин рассмат-ривают как биомаркер, связанный с пролиферирую-щим опухолевым клоном.

В нашем исследовании мы определяли уровень H- и L-изоферритинов у пациентов с МДС РАИБ-1 и РАИБ-2 и провели оценку взаимосвязи изучаемых показателей с общей выживаемостью пациентов с МДС, рассчитанной с момента постановки диагноза. Оценка взаимосвязи производилась с использованием регрессионного анализа Кокса. При этом только для принадлежности пациентов к одной из подгрупп с вы-соким (> 1500 мкг/мл) или низким (< 1500 мкг/мл) уровнем L-ферритина (p = 0,01) была достигнута ста-тистическая значимость. Относительный риск смерти при уровне L-ферритина больше 1500 мкг/мл составил 7,06 (95 % ДИ 1,39 – 35,77; p = 0,018).

Общая выживаемость у пациентов с МДС с уров-нем L-ферритина менее 1500 мкг/мл значительно выше по сравнению с пациентами с уровнем L-ферритина более 1500 мкг/мл, где не только снижена общая выжи-ваемость, но и повышен риск трансформации в острый лейкоз. Уровень содержания L-ферритина может быть использован как дополнительный параметр для выяв-ления вероятности трансформации МДС в острый лей-коз, так как отражает стадию процесса.

Значение молекулярно-генетической диагностики BCR-ABL1 у детей с хроническим миелолейкозом

В.А. Лавриненко, Т.В. Савицкая, А.Н. Лилей, Р.И. Юцкевич



Молекулярная диагностика химерного онкогена BCR-ABL1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) является самым чувс-

твительным методом мониторинга ответа на терапию у пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ). С началом использования ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) (иматиниба и др.), позволяющих достигать мо-лекулярного ответа на лечение, все большее значение приобретает стандартизация лабораторных методов мониторинга и интерпретации результатов, а также изучение механизмов устойчивости к ИТК.

Цель работы: анализ молекулярного ответа у детей с ХМЛ и оценка минимальной резидуальной болезни (МРБ), сравнение уровня МРБ в костном мозге (КМ) и периферической крови (ПК), изучение причин по-тери ответа на ИТК.

Материалы и методы. В исследование включены 25 детей с ХМЛ. Мониторинг МРБ на терапии имати-нибом проводили методом количественной РВ-ПЦР (EAC, 2003) в образцах КМ и/или ПК. В качестве стандартов использовали наборы Ipsogen (Франция). Метод секвенирования использовали для определения точечных мутаций в гене BCR-ABL1. Цитогенетиче-ские исследования проводили с использованием ме-тодов FISH и дифференциальной окраски (G).

Результаты. Медиана уровня BCR-ABL1/ABL1 на момент постановки диагноза составила 1,3 (0,46–2,05). Медиана уровня МРБ составила на 3-й месяц лече-ния 5 (0,3–47) %, на 6-й месяц – 0,36 (0,03–35) %, на 12-й месяц – 0,41 (0,001–133) %, на 15-й месяц – 0,065 (0,006–126) %, на 18–24-й месяц – 0,024 (0,0001–150) %. Для определения клинической значимости МРБ в ПК уровни BCR-ABL1/ABL1 сравнивали в 80 парных КМ и ПК. Уровень кор-реляции составил r = 0,8805, p < 0,05 (для КМ сред- нее = 1,1622 %, медиана = 0,0189 %; для ПК сред- нее = 1,1044 %, медиана = 0,0192 %).

Потерю ответа на иматиниб наблюдали у 5 паци-ентов, причинами которой явилась мутация BCR-ABL1-E255V у 1 пациента; а также могло стать появление дополнительных хромосомных перестроек: +der(22)t(9;22)(q34;q11) у 2 больных и del(21)(q22) у 1 пациен-та на этапах лечения, появление одновременной экс-прессии 2 транскриптов b2a2 + b3a2 у 1 пациента с на-чалом потери ответа на терапию.

Выводы. Для мониторинга МРБ у пациентов с ХМЛ возможно использовать ПК. Механизмы ре-зистентности к иматинибу у детей разнообразны и включают как точечные мутации, так и дополни-тельные хромосомные перестройки.


’2

01

2 Клиническая эффективность комбинации бендамустина

и ритуксимаба в лечении пациентов с рецидивами и/или рефрактерными

формами хронического лимфолейкоза

А.И. Лукина1, С.В. Сёмочкин2, В.Л. Иванова3, Н.К. Хуажева3, Л.А. Муха3, Е.Г. Аршанская3,

И.Е. Лазарев3, М.М. Панкрашкина1, В.В. Птушкин1

1ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

2ГБОУ ВПО «Российский научно-исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова»

Минздрава России, Москва; 3ГУЗ «Городская клиническая больница им. С.П. Боткина»

Департамента здравоохранения г. Москвы

Цель настоящего исследования заключалась в оцен-ке клинической эффективности комбинации бенда-мустина и ритуксимаба у больных с рецидивами и/или рефрактерным течением хронического лимфолейкоза (ХЛЛ).

Пациенты и методы. В исследование включено 20 пациентов (мужчин – 15, женщин – 5) с рецидива-ми и/или рефрактерным ХЛЛ. Семнадцать (85 %) па-циентов получили терапию по схеме BR: бендамустин 90 мг/м2 в/в в день 1 и 2 + ритуксимаб 375 мг/м2 в день 1 цикла 1 и 500 мг/м2 в последующие циклы. В 3 (15 %) случаях назначался бендамустин в монорежиме в дозе 100 мг/м2 в дни 1 и 2 каждые 28 дней. Планировалось проводить 6 циклов терапии.

Результаты. Медиана возраста больных составила 63,4 (52–77) года. У 10 (50 %) пациентов была установ-лена стадия С по Binet. В 2 (10 %) случаях пациенты имели del17p. Семь (35 %) были с рецидивами, 13 (65 %) – рефрактерными. Медиана количества линий предшест-вующей терапии – 2 (1–6). Большинство пациентов ранее получали флударабин – 15 (75 %), ритуксимаб в комбинации с полихимиотерапией – 17 (85 %) и в качестве поддерживающей терапии – 9 (45 %). Наи лучшим ответом на предшествующую терапию была полная ремиссия (ПР) у 5 (25 %), частичная ре-миссия (ЧР) – у 8 (40 %) и стабилизация болезни (СБ) – у 5 (25 %) больных. При медиане наблюдения 5,6 мес от начала терапии бендамустином живы все пациенты. Не зарегистрировано ни одной смерти вследствие токсичности. Медиана количества циклов проведенной терапии составила 4 (2–6). Ответ оценен у 17 (85 %) пациентов: ≥ ЧР достигли 9 (53%) из 17 па-циентов, СБ – 6 (35 %). Не ответили на лечение 2 (12 %) пациента. Вероятность достижения ≥ ЧР была выше у пациентов, получивших менее 3 линий терапии (p = 0,004), и в случае рецидива заболевания против рефрактерности к предшествующему лечению (p = 0,01). Не влияли на вероятность достижения от-

вета предшествующая терапия флударабином, нали-чие “bulky disease”, В-симптомов и С-стадия (p < 0,05).

Выводы. Комбинация химиотерапии BR является эффективным и безопасным методом лечения реци-дивирующего и/или рефрактерного ХЛЛ после флу-дарабинсодержащих режимов.

Влияние профилактического рентгеновского облучения

на жизнеспособность резидуальных лейкоцитов компонентов крови

Н.П. Масленникова1, М.В. Пешикова2, И.И. Спичак1, 2, Е.В. Жуковская3

1ГБУЗ «Челябинская областная детская клиническая больница»;

2ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России;

3ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, Москва

Актуальность. Для предотвращения развития пост трансфузионной реакции «трансплантат против хозяина» у пациентов с онкогематологическими забо-леваниями применяется рентгеновское облучение компонентов крови. Процедура облучения контроли-руется исключительно дозиметрическими методами. На сегодняшний день нет стандартизованной методи-ки валидации процедуры профилактического облуче-ния компонентов крови с контролем качества конеч-ного продукта.

Целью исследования мы поставили изучение коли-чественного и качественного состава резидуальных лейкоцитов компонентов крови, а также динамику изменения этих показателей при воздействии профи-лактического рентгеновского облучения суммарной дозой 25 Грей.

Материалы и методы. Материалом для исследова-ния послужили эритроцитная масса, обедненная лей-коцитами (n = 25) и фильтрованные эритроциты (n = 25). Рентгеновское облучение образцов ком-понентов крови проводилось на установке RadGil (Gilardoni, Италия) суммарной дозой 25 Грей за 30 мин. Жизнеспособность остаточных лейкоцитов определялась методом проточной цитометрии на про-точном лазерном цитофлюориметре Facs Canto II (Becton Dickinson, США). Гейтирование проводилось по интенсивности экспрессии CD45. Жизнеспособ-ность лейкоцитов оценивалась по включению клетка-ми витального красителя Via-Probe™ (BD Biosciences), содержащего 7-Амино-актиномицин D (7-AAD). Каж-дый образец анализировался до и сразу же после рент-геновского облучения, отсроченный эффект изучали через 4 и 24 ч.

Результаты. Особенности цитометрического ана-лиза резидуальных лейкоцитов компонентов крови


4’

20

12обусловлены следующим: низкая концентрация лей-

коцитов (0,23 ± 0,09 × 10 9/л), их низкая жизнеспособ-ность (70,1 ± 4,1 %), изменение морфологических характеристик клеток в процессе заготовки и хра-нения. Нами выявлено достоверное снижение коли-чества витальных лимфоцитов в облученной пробе (64,74 ± 4,33 %) сразу после облучения на 5,36 ± 0,63 % (р = 0,04) по сравнению с исходной и необлученной пробами.

Выводы. Определение количества жизнеспособ-ных лимфоцитов в компонентах крови методом про-точной цитометрии с использованием витального красителя 7-AAD может включаться в контроль качест ва профилактического облучения гемакомпо-нентов.

Механизмы действия низкоинтенсивного лазерного излучения

Т.В. Мачнева, А.Н. ОсиповГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Минздрава России, Москва

Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) нашло широкое применение в различных областях современной медицины. Однако подбор доз и выбор вида излучения осуществляется в основном эмпири-ческим путем, и результаты лазерной терапии не всегда оказывают положительное действие. Важную роль в этом процессе играют акцепторы лазерного излуче-ния. При этом фотоакцепторами могут являться, на-пример, эндогенные (ЭП) и экзогенные порфирины и другие соединения. Количество ЭП возрастает при целом ряде патологических состояний, в том числе при раневых процессах и при шоковых состояниях. Выявление роли ЭП может позволить добиться боль-шего эффекта в профилактике и лечении многих патологических состояний, например раневых про-цессов и эндотоксического шока. Кроме того, данные патологические состояния являются показательными моделями исследования эффектов НИЛИ при разви-тии воспалительных процессов и нарушении микро-циркуляции соответственно.

Целью работы было исследование роли ЭП в дейст-вии лазерного излучения в норме и при эксперимен-тальных патологических состояниях – раневом процес-се и эндотоксическом шоке у крыс, а также выявление патофизиологических мишеней действия НИЛИ.

В наших экспериментах мы использовали низко-интенсивное лазерное излучение в красном (632 нм), синем (442 нм) и зеленом (530 нм) диапазонах спектра. Обнаружили, что облучение животных НИЛИ увели-чивало супероксиддисмутазную активность, актив-ность раневых экссудатов и плазмы крови, при этом наиболее существенные изменения наблюдали при патологических состояниях. При исследовании лазер-индуцированных изменений функциональной актив-

ности полиморфно-ядерных лейкоцитов раневых экс-судатов и крови крыс обнаружили аналогичные зависимости. Указанные эффекты зависели от дозы и длины волны излучения. Также исследовали уровень перекисного окисления липидов мембран лейкоцитов и эритроцитов. Обнаружили и исследовали зависи-мость выявленных эффектов от количества ЭП. Вы-явили возможную роль ЭП как первичных акцепторов НИЛИ в эффектах на супероксиддисмутазную актив-ность и функциональную активность лейкоцитов.

Измерение экспрессии изоформ гена IKZF1 при остром лимфобластном

лейкозе методом RQ-PCR

А.Н. Мелешко, И.В. ПрохореняГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»


Современные методы молекулярно-генетических исследований в диагностике острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) в последние годы выявили нарушения в ряде генов, вовлеченных в патогенез этого заболева-ния. Среди них интерес представляют гены транс-крипционных факторов (ТФ), специфически контро-лирующие лимфоидную дифференцировку, такие как pax5, EBF-1, IKZF1 (Ikaros), IKZF2 (Helios), IKZF3 (Aiolos). Структурные изменения в этих генах обнару-жены у 40 % больных В-линейным ОЛЛ, особенно для pax5-гена (31,7 %) и Ikaros (28,6 %).

Ikaros, кодируемый геном IKZF1, является ключе-вым транскрипционным фактором, регулирующим ранние этапы дифференцировки Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток и дендритных клеток. Частичный или полный knock-out гена Ikaros у мышей ведет к высокой частоте спонтанных лейкозов и лимфом, а также к аутоиммунным заболеваниям.

Белок Ikaros в ДНК-связывающем домене содер-жит 4 структуры «цинковых пальцев». Ген Ikaros вклю-чает 7 экзонов и транскрибируется в виде по меньшей мере 8 различных изоформ посредством альтернатив-ного сплайсинга с использованием альтернативных экзонов. Так, длинные Ik-1, Ikx, Ik-2 и Ik-3, которые содержат по меньшей мере 3 «цинковых пальца», со-храняют высокоаффинное ДНК-связывание и лока-лизуются в ядре. Короткие изоформы Ik-4–8, которые имеют менее 3 «цинковых пальцев», теряют свою ДНК-связывающую активность и локализуются в ци-топлазме. Такие изоформы сохраняют способности образовывать гетеродимеры с полными изоформами, что приводит к потере их транскрипционной актив-ности, поэтому они получили название доминантно-негативных изоформ (DN-Ik).

Нами был разработан метод ПЦР-анализа в реаль-ном времени для количественного измерения уровня


’2

01

2 экспрессии отдельных изоформ гена Ikaros. Незави-симо оценивалась экспрессия длинных изоформ Ik1, Ikx, Ik2 и коротких Ik4, Ik5, Ik8, Ik6. Экспрессия оце-нивалась в относительных единицах относительно экспрессии контрольного гена ABL. В исследование включены 49 образцов костного мозга от 36 больных ОЛЛ, включая 19 рецидивов и 13 парных случаев. Де-вять образцов здорового костного мозга составляли контрольную группу. В лейкозных клетках профиль экспрессии изоформ гена Ikaros в большинстве случа-ев сходен с таковым для нормального костного мозга. При этом отмечено снижение уровня экспрессии изо-форм гена Ikaros относительно здорового костного мозга, достоверно для Ikx, Ik2, Ik4 и Ik8. В 31 % случаев ОЛЛ наблюдалась аберрантная сверхэкспрессия Ik6, превышающая средний уровнь экспрессии этой изо-формы у остальных пациентов (или здоровый костный мозг) на 2–3 порядка. Это основное качественное из-менение в экспрессии гена Ikaros при ОЛЛ. В парных случаях первичный диагноз – рецидив (2-й рецидив) сохраняется сверхэкспрессия Ik6, либо сохраняется его отсутствие. Сверхэкспрессия Ik6 не является фак-тором возникновения рецидива, но может выступать в качестве инициального события при развитии пер-вичного лейкоза.

Аномалии кариотипа у детей с острым лейкозом в Пермском крае

Д.В. Меркурьев1, 2, Н.Б. Мерзлова2, О.Е. Никонова1

1ГБУЗ ПК «Пермская краевая детская клиническая больница»;

2ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера»

Цель исследования – выявить частоту и структуру аномалий кариотипа при остром лимфобластном лей-козе (ОЛЛ) в Пермском крае.

Материалы и методы. Цитогенетическое исследо-вание клеток костного мозга проведено у 60 детей с первично диагностированным ОЛЛ в возрасте от 11 месяцев до 14 лет (медиана – 4 года); анализирова-лось не менее 11 метафаз.

Результаты. Клональные аномалии кариотипа вы-явлены у 38 (63,3 %) детей. Наиболее часто (18 детей, 30 %) диагностировалась высокая гипердиплоидия (51–67 хромосом), встречавшаяся при В-II и B-III ва-риантах ОЛЛ. У 10 (55,5 %) из 18 больных в составе высокогипердиплоидного кариотипа верифицирова-лись структурные аберрации, самой частой из которых была инвертированная дупликация длинного плеча хромосомы 1 (3 пациента). При этом в 1 случае эта дупликация сочеталась с неслучайной транслокацией t(9;12)(p12;р13). У других пациентов с гипердиплои-дией структурные аномалии были представлены транслокациями t(12;14)(p13;q11), t(14;18)(q21;q21),

t(16;17)(p13.3;q11.2), делецией del(6)(q15q22), маркер-ными хромосомами.

Одной из частых аномалий при ОЛЛ явилась транслокация t(4;11)(q21;q23) – она отмечена у 3 детей с B-I ОЛЛ. В 1 случае она являлась единственной аберрацией, в другом сочеталась с изохромосомой 7 (по длинному плечу), у 3-го пациента имелся минор-ный субклон с дупликацией 1q. У единичных больных при В-линейных ОЛЛ выявлялись транслокации t(9;22)(q34;q11), несбалансированная t(1;19)(q23;p13), t(12;21)(р13;q22), t(6;11)(p21;q13), инверсия inv(12)(p11.2q13). Комплексный кариотип отмечен у 2 детей с В-ОЛЛ. В 1 случае отмечалось сочетание транслока-ций t(1;12)(q21;p13) и t(9;12)(p11;р13) с делецией del(9)(q22). У другого пациента верифицированы del(9)(p22), inv(1)(p13q25), моносомия хромосомы 4 и мар-керная хромосома.

При Т-линейном ОЛЛ чаще выявлялась t(11;14)(p13-p15;q11) – в 1 случае в сочетании с t(X;7)(q22;q34), в другом – в сочетании с t(8;11)(p12;q13). У 2 детей с Т-ОЛЛ наблюдались транслокации с вовлечением 20q – t(2;20)(p21;q12) и t(12;20)(p13;q11.2).

Выводы. Клональные аномалии кариотипа диа-гностировались у 63,3 % детей с ОЛЛ. В структуре аберрантного кариотипа преобладала высокая гипер-диплоидия (30 %), сопровождавшаяся в половине слу-чаев наличием структурных хромосомных аномалий.

Факторы прогноза клинического течения хронического лимфолейкоза

Е.Л. Назарова, М.Г. Крюкова, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина

ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови»

ФМБА России

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – один из вари-антов В-клеточных опухолей лимфатической системы, который характеризуется разнообразием клинических проявлений и вариантов течения. В ряде случаев от-мечается довольно благоприятное течение заболева-ния, в других наблюдается крайне агрессивный харак-тер лейкозного процесса. В этой связи большое внимание уделяется поискам маркеров выраженной агрессии опухолей. К ним относится, прежде всего, определение уровня сывороточной тимидинкиназы, принимающей участие в синтезе ДНК и клеточном делении. Ее уровень значительно повышается при опухолях, характеризующихся усиленной пролифера-цией клеток, по этому ее используют в качестве мар-кера темпа роста злокачественных клеток, а также для контроля лечения, установления стадии заболевания и его прогноза.

Целью исследования явилась оценка диагностиче-ской и прогностической значимости активности


4’

20

12 тимидинкиназы, а также уровней ряда цитокинов

у пациентов с впервые выявленным ХЛЛ. Исследованы сыворотки периферической крови

40 больных в возрасте от 43 лет до 81 года (медиана воз-раста составила 59 лет). Активность тимидинкиназы определялась с использованием наборов реагентов для радиоферментного анализа. Параллельно проводились исследования содержания сывороточных цитокинов/ хемокинов с помощью иммуноферментного анализа.

Уровень тимидинкиназы в исследуемой группе пациентов достоверно превышал соответствующий показатель у здоровых лиц (17,67 Ед/л vs 6,3 Ед/л; p < 0,05). На основании расчета коэффициента ранго-вой корреляции Спирмена выявлено, что показатель активности тимидинкиназы в сыворотке перифери-ческой крови свыше 30 Ед/л коррелировал с повышени-ем концентраций интерлейкинов (IL) 2, IL-10 и IL-18.

Следовательно, с учетом того, что высокое содер-жание тимидинкиназы отражает активный пролифе-ративный потенциал опухолевых клеток, исследова-ние уровней IL-2, IL-10 и IL-18 в случаях впервые выявленного В-ХЛЛ может быть рекомендовано в ка-честве критериев неблагоприятного течения опухоле-вого процесса уже на ранних этапах диагностики.

Иммунологические и генетические особенности при аутоиммунном

лимфопролиферативном синдроме

А.С. Невмержицкая, А.А. Мигас, С.О. Шарапова, М.В. Белевцев



Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЛПС) – генетическое заболевание, приводящее к дефекту FAS-зависимого апоптоза лимфоцитов, характеризующееся лимфаденопатией (ЛАП), гепато-спленомегалией и аутоиммунной патологией. Вторым после лимфопролиферации, наиболее частым клини-ческим проявлением АЛПС является аутоиммунная патология, а именно иммуноопосредованные цитопе-нии (иммунная тромбоцитопения (ИТП), аутоиммун-ная гемолитическая анемия (АИГА), нейтропения), которые встречаются более чем в 70 % случаев.

Диагноз АЛПС был выставлен 5 пациентам со-гласно диагностическим критериям National Institutes of Health International Workshop (2009). Медиана воз-раста на момент исследования периферической крови составила 5 лет (д – 3, м – 2). Для оценки иммуноло-гических параметров пациентов была взята группа здоровых доноров с соответствующей медианой по возрасту (n – 23, м – 14, д – 10). Исследование суб-популяций лимфоцитов в периферической крови пациентов и доноров (CD3+ Т-лимфоциты, CD19+

В-лимфоциты, CD16+CD56+ натуральные килле-ры, CD3+HLADR+ активированные Т-лимфоциты, CD3+CD4+ Т-хелперы, CD3+CD8+ цитотоксические Т-клетки) проводилось методом проточной цитофлуо-риметрии. Осуществлено молекулярно-генетическое исследование гена Fas.

У пациентов с АЛПС помимо лимфопролифера-ции в 80 % случаев отмечались аутоиммунные гемато-логические нарушения в виде АИГА и/или ИТП.

Было выявлено, что в группе пациентов с АЛПС достоверно превышают возрастную норму следующие показатели в абсолютных значениях CD3+ Т-лимфо-циты (р = 0,0006), CD3+ HLADR активированные Т-лимфоциты (р = 0,01), CD3+CD4+ Т-хелперы (р = 0,006), CD3+CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (р = 0,001), IgG (р = 0,02), IgA (р = 0,001). В относитель-ном составе популяций лимфоцитов достоверные раз-личия обнаружены только для лимфоцитов с феноти-пом CD3+CD8+ (р = 0,002) и CD3+ HLADR (р = 0,001).

Мутация была найдена у 4 из 5 пациентов. У 3 па-циентов мутации в виде аминокислотных замен лока-лизованы в 9-м экзоне гена Fas и были получены по наследству. У 1 пациентки de novo делеция со сдви-гом рамки считывания локализована в 7-м экзоне. Особенностью гена Fas является вариабельная пенет-рантность. Часто у членов семьи носителей мутации нет клинических проявлений либо они представлены очень мягким фенотипом, не снижающим качество жизни. Так, у двоих пациентов отцы-носители не име-ли клинической картины заболевания.

Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков

и хромосомные аберрации при хроническом лимфолейкозе

В.А. Овсепян, В.А. Росин, С.В. БаранчиковаФГБУН КНИИГиПК ФМБА России

Целью настоящей работы являлось изучение воз-можной ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) – цитохро-ма P450 1A1 (CYP1A1), глутатион-S-трансфераз μ1 (GSTM1), θ1 (GSTT1) и π1 (GSTP1) – с типом наибо-лее часто приобретаемых хромосомных нарушений лейкозных клеток при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ) на момент диагностики.

В анализ включены результаты исследований по-лиморфизма указанных генов и FISH-анализа 69 боль-ных ХЛЛ (средний возраст 61,2 года). Материалом для исследования полиморфизма послужила ДНК, выде-ленная из лейкоцитов венозной крови больных стан-дартным методом фенольно-хлороформной экстрак-ции. Детекцию делеционного полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 проводили методом мультиплексной


’2

01

2 полимеразной цепной реакции (ПЦР). Генотипирова-ние же полиморфизмов A2455G (Ile462Val) в гене CYP1A1, A1578G (Ile105Val) и в GSTP1 выполняли методом ПЦР с последующим анализом полиморфиз-ма длин рестрикционных фрагментов. Анализ наибо-лее часто встречающихся хромосомных нарушений у больных ХЛЛ проводился с помощью панели ДНК-проб (зондов), состоящей из 2 коктейлей: LSI p53/LSI ATM (SpectrumOrange/SpectrumGreen) и LSI D13S319/LSI 13q34/CEP 12 (SpectrumOrange/SpectrumAqua/Spec-trumGreen).

Теоретическим основанием для осуществления настоящей работы послужило предположение, соглас-но которому полиморфные варианты вышеуказанных генов могут быть вовлечены в патогенез ХЛЛ, в част-ности за счет влияния на уровень внутриклеточного генотоксического фона, который сам по себе уже спо-собен модулировать стабильность генома. В результа-те проведенного исследования впервые показана возможная ассоциация гомозиготного носительства мажорного (полноценного) аллеля GSTP1*105Ile с про-гностически благоприятной моноаллельной интерсти-циальной делецией 13q14.3 при ХЛЛ, являющейся на момент диагностики единственным хромосомным нарушением в лейкозных клетках, содержание которых составляет не более 70 % от общего количества проана-лизированных клеток. Среди больных с подобной делецией гомозиготы по мажорному аллелю встреча-лись чаще, чем носители хотя бы 1 минорного (непол-ноценного) аллеля (35,7 % против 64,3 % у гомозигот χ2 = 4,09; p < 0,05; OR = 3,40; 95 % CI = 1,00–11,60).

Роль анионных фосфолипидов в передаче сигналов

при апоптотических процессах

А.Н. Осипов, М.Н. Пучков, Е.А. КорепановаКафедра общей и медицинской биофизики

медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Хорошо известно, что в основе многих важнейших заболеваний (например, онкологических или иммун-ных) лежит нарушение запрограммированной кле-точной гибели (апоптоза), которое приводит либо к неполной гибели мутировавших клеток, либо к из-быточной гибели клеток, необходимых организму. Научиться управлять такими процессами – одна из актуальных задач современной науки. Благодаря не-давним исследованиям молекулярных и клеточных механизмов апоптоза стало известно, что одну из глав-ных ролей в процессе апоптоза играет цитохром С, который может образовывать комплексы с отрица-тельно заряженными фосфолипидами, и в первую очередь с кардиолипином. Образование комплекса кардиолипин – цитохром С приводит к изменению

структуры активного центра цитохрома С и превраще-нию его в пероксидазу, т. е. появлению у цитохрома С способности окислять различные субстраты в присут-ствии пероксида водорода. К таким субстратам в пер-вую очередь относятся липиды мембран митохондрий, окисление которых приводит к появлению в мембра-нах дефектов, через которые цитохром С может вы-ходить в цитоплазму клетки и активировать каспазы, сериновые протеазы, от которых главным образом и зависит развитие апоптоза в клетке. В предлагае-мой работе были проведены исследования перокси-дазной активности комплекса цитохрома С и кар-диолипина на модельных бислойных липидных мембранах. Опыты показали, что благодаря взаимо-действию комплекса цитохрома С и кардиолипина с мембраной могут образовываться каналы шириной около 2 нм, достаточные для выхода цитохрома С в цитоплазму. Полученные результаты позволяют сде-лать вывод о ключевой роли анионных фосфолипидов в развитии апоптотических процессов и о возможно-сти регуляции таких реакций посредством изменения количества анионных фосфолипидов в мембране.

Исследование проапоптогенных механизмов противоопухолевого

эффекта флавоноидов корней солодки

С.И. Павлова1, 3, М.Д. Цицуашвили1, М.А. Тимаков2, И.Г. Козлов1, 2

1ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 2ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва; 3ФГБОУ ВПО «Чувашский

государственный университет им. И.Н. Ульянова», Чебоксары, Республика Чувашия

В предыдущих исследованиях нами было показа-но, что флавоноиды корней солодки (ФКС) подавля-ют пролиферацию как активированных лимфоцитов, так и опухолевых клеток. Ингибирование пролифера-ции лимфоцитов ФКС не было связано с индукцией апоптоза, а сопровождалось изменением баланса Т-хелперных цитокинов и снижением секреции ин-терлейкина 2. Однако антипролиферативный эффект ФКС по отношению к опухолевым клеткам мог быть реализован через другие механизмы. Целью настоящей работы являлось исследование проапоптогенных эф-фектов ФКС в культуре опухолевых клеток различно-го происхождения. В экспериментах использовались клеточные линии человека: A-431, U-373, GL-6 и U-937, которые культивировали в среде RPMI-1640 (U-937) или DMEM (A-431, U-373, GL-6), содержа-щей сыворотку и антибиотики. К преинкубированным в течение 24 ч клеткам добавляли ФКС (20 мкг/мл) и продолжали инкубацию 24–72 ч. Апоптоз оценива-ли путем окрашивания фиксированных клеток про-пидий йодидом цитометрическим методом.


4’

20

12Диаграммы флуоресценции ДНК распределялись

преимущественно на 3 пика. Через 24 ч после внесе-ния ФКС в культуру уровень апоптоза недостоверно увеличивался на 5–15 %, что сопровождалось значи-мым (p < 0,05) снижением диплоидного (соответству-ет G

1/G

0 фазам клеточного цикла) и повышению тет-

раплоидного (соответствует G2/M фазам клеточного

цикла) пиков гистограмм. Такие изменения могут сви-детельствовать о нарушении вхождения клеток в фазу митоза – остановке клеточного цикла в G

2/M-фазе.

Спустя 48 ч инкубации с ФКС происходило увели-чение доли апоптозирующих клеток на 20–40 % (p < 0,05) по сравнению с контрольными пробами. Че-рез 72 ч инкубации этот показатель увеличивался, воз-растание апоптоза под влиянием ФКС сопровожда-лось снижением уровней как пролиферирующих, так и покоящихся клеток, что выражалось в уменьшении численности тетра- и диплоидных клеток по сравне-нию с 24–48-часовой инкубацией.

Таким образом, на основании анализа диаграмм флуоресценции ДНК-пропидий можно заключить, что ФКС обладают проапоптогенным эффектом по отно-шению к различным линиям опухолевых клеток (A-431, GL-6, U-373, U-937) в условиях in vitro, что, по-види-мому, является следствием остановки флавоноидами солодки опухолевых клеток в G

2/M-фазе клеточного

цикла.

Особенности иммунофенотипа острого лимфобластного лейкоза

у детей первого года жизни

А.М. Попов1, 2, Г.А. Цаур1, 2, Т.Ю. Вержбицкая1, 2, О.В. Стренева1, 2, Е.В. Шориков1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Л.Г. Фечина1, 2

1ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург;

2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург;

3ГБОУ ВПО УралГМА, Екатеринбург

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей первого года жизни характеризуется высокой частотой выявления перестроек гена MLL, особенным, отлича-ющимся от более старших детей, профилем экспрес-сии генов и крайне неблагоприятным прогнозом. Цель исследования – описание иммунофенотипа ОЛЛ у де-тей первого года жизни. В исследование было вклю-чено 64 пациента (29 мальчиков и 35 девочек) с ост-рым лейкозом (ОЛ) в возрасте от 0 до 11 месяцев включительно. Частота выявления ОЛЛ составила 67,19 % от всех ОЛ у детей первого года жизни, что было несколько реже, чем у более старших детей (87,69 %). В исследуемой группе преобладал BI-ОЛЛ (60,46 %), на долю же наиболее частого в других воз-растных группах BII-ОЛЛ приходилось лишь 30,23 %.

Отсутствие экспрессии или низкая экспрессия CD10, CD20 и CD22, а также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL. Диаг ностическая эффективность выявления экспрес-сии NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой. Экспрессия CD34 и CD65 была более характерна для пациентов с наличием MLL-AF4(+). Таким образом, иммунофе-нотип ОЛЛ из В-линейных предшественников у детей младше 1 года существенно различается в зависимос-ти от наличия или отсутствия перестроек гена MLL. Экспрессия NG2, CD45, CD133, CD15, а также слабая экспрессия или отсутствие экспрессии CD10, CD20 и CD22 позволяют прогнозировать наличие какой-ли-бо перестройки гена MLL при ОЛЛ у детей первого года жизни, при этом наибольшей диагностической эффективностью обладает наличие экспрессии NG2.

Исследования геминовых белков и эритроцитов при помощи

термолинзовой и оптоакустической микроспектроскопии

М.А. Проскурнин1, Д.А. Недосекин2, В.П. Жаров2,

Д.С. Волков1, Е.С. Рындина1, Т.А. Горькова1

1 Химический факультет ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова;

2 лазерные лаборатории Арканзасского университета медицинских наук, Филлипс-Классик, Литл-Рок,

Арканзас, США

Термолинзовая и оптоакустическая микроспект-роскопия (ТОМ) – наиболее чувствительные силовые лазерные методы абсорбционной спектроскопии, до-полняющие традиционные, – применены для опреде-ления геминовых белков в водных растворах, а также гемоглобина в индивидуальных эритроцитах.

Предложены условия термолинзового определе-ния гемоглобина в плазме крови без предварительно-го концентрирования, а также цитохрома C. Предел обнаружения составляет 0,1 пг для энергии 0,5 мДж и 10 пг для энергии 5 мкДж. Облучаемый объем 80 мкм3 делает возможным использовать ТОМ для оп-ределения гемоглобина в отдельных эритроцитах.

При помощи ТОМ на модели мышей с нормаль-ной (nu/nu) и с генетически модифицированной кровью (STOCK Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg(HBA-HBBs)41Paz/J) показаны различная концентрация гемоглобина в нормальных эритроцитах и характер-ных эритроцитах в крови больных серповидной кле-точной анемией. Кроме того, показано различное распределение гемоглобина в эритроцитах здоровой крови и в крови с серповидными эритроцитами, а также разная пороговая устойчивость нормальных и серпо-


’2

01

2 видных эритроцитов к действию низкоэнергетического импульсного лазерного излучения. Это в сумме поз-воляет разрабатывать методики диагностики состава крови на основе ТОМ.

Оценка функциональной активности нейтрофилов методом

хемилюминесценции

Е.В. Проскурнина, И.В. Образцов, Ю.А. ВладимировФакультет фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ им. М.В. Ломоносова

Хемилюминесценция широко востребована в фун-даментальных и прикладных исследованиях в биологии и медицине. Достоинствами хемилюминесцентных ме-тодов являются высокая чувствительность, специфич-ность хемилюминесцентного отклика и относительная простота эксперимента. В большинстве работ, посвя-щенных применению хемилюминесценции в целях медицинской практики, изучаются реакции активных форм кислорода, в частности респираторный взрыв гранулоцитов под действием различных стимулов.

Проблема оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов не теряет актуальности до настоящего времени. Эта информация имеет цен-ность прежде всего при воспалительных процессах, в том числе аутоиммунных и неопластических. Сущест-вует ряд методик оценки активности, но большинство из них трудоемки и субъективны или требуют исполь-зования сложного дорогостоящего оборудования, что исключает их использование в качестве скрининговых тестов.

В исследовании определены оптимальные условия пробоподготовки и хемилюминесцентного анализа нейтрофилов цельной крови. Разработана методика хемилюминесцентного анализа функциональной активности фагоцитов цельной крови, основанная на последовательном внесении 4β-форбол-12-миристат-13-ацетата и N-формил-метионил-лейцил-фенил-аланина в клеточную суспензию и последующей регистрации активированной люминолом хемилюми-несценции. Обследована контрольная группа доноров для использования в качестве базы сравнения при диа-гностическом использовании хемилюминограмм. По-казаны различия в хемилюминограммах, полученных от доноров и пациентов с термической травмой. Пред-ложены критерии оценки хемилюминограмм; постро-ены пределы значений показателей, свидетельствую-щих о благоприятном прогнозе течения ожоговой болезни.

Генетические субтипы анемии Фанкони . Случай неблагоприятного исхода при мутации в гене FANCC

А.С. Романцова, С.О. Шарапова, О.В. АлейниковаГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»


Анемия Фанкони (АФ) – это генетически и фено-типически гетерогенное рецессивное заболевание, ко-торое характеризуется различными врожденными аномалиями, прогрессивной панцитопенией и пред-расположенностью к гемобластозам и солидным опу-холям. Генетической основой АФ являются мутации в 15 генах FANC, которые формируют соответствую-щие комплементарные группы. Мутации чаще всего встречаются в генах FANCA, FANCC и FANCG (65 %, 10 % и 15 % соответственно) и приводят к нарушению пролиферации, повышенной клеточной гибели, уве-личению числа генетически поврежденных клеток и повышенному риску развития неоплазий, который коррелирует с возрастом.

Целью работы было проведение генетической диа-гностики наиболее распространенных субтипов АФ, диагностированной в Республике Беларусь.

Мутационный анализ генов FANCA, FANCC, FANCG был проведен методом SSCP и с ресеквенированием ДНК из мононуклеаров периферической крови, с последующим сопоставлением результатов с базой данных (www.rockefeller.edu/fanconi/mutate, GenBank:NM_000136.2 (cDNA)).

Скрининг гена FANCA был проведен у 9 пациентов. Мутации выявлены у 5 (55,6 %) человек – 2 крупные делеции, 2 аминокислотные замены и 1 со сдвигом рамки считывания. Мутационный анализ генов FANCC, FANCG был выполнен еще у 9 пациентов с АФ. Мута-ция выявлена у 1 пациента (обнаружены 2 гетерози-готные мутации в гене FANCC).

При АФ с мутацией в гене FANCC выявлена новая клинико-генетическая ассоциация. Диагноз АФ (резидент Украины) был выставлен в 11 лет (ДЭБ-ин-дуцированные разрывы наблюдалась в 38 % хромосом) и подтвержден в РНПЦ детской онкологии и гемато-логии (Минск, Беларусь) в 16 лет на основании кли-нико-лабораторных и цитогенетических исследова-ний. В 17 лет обнаружена гепатоцеллюлярная аденома правой доли печени (терапия андрогенами не прово-дилась), а также, как осложнение АФ, выставлен диаг-ноз миелодиспластический синдром (МДС), рефрак-терная анемия с избытком бластов (МДС, РАИБ), через 5 мес после трансформации в МДС девочка умерла.

Мутация в гене FANCC в экзоне 12 с.1207 T>C, об-наруженная в нашем исследовании, описывается при АФ в литературе впервые, так же как и ее сочетание


4’

20

12с крайне редкой мутацией в интроне 7 c.844-1 G>C.

Ассоциированный с данной генетической аномалией фенотип представлен апластической анемией средней тяжести с синостозом локтевой и лучевой костей обе-их рук, а также довольно ранним развитием быстро прогрессирующей доброкачественной опухоли печени (гепатоцеллюлярной аденомы) и прогностически крайне неблагоприятного гемобластоза (МДС, РАИБ).

Роль трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в терапии

вторичного острого миелоидного лейкоза у детей

И.П. Ромашевская1, 2, Н.Н. Савва2, Н.П. Литвинко2, О.В. Алейникова2

1ГУ РНПЦ РМиЭЧ, Гомель, Беларусь;2ГУ «Республиканский научно-практический центр

детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Введение. Современная стратегия терапии острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей основана на ис-пользовании риск-адаптированной интенсивной по-лихимиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Больные со вторичным ОМЛ относятся к группе неблагоприятного прогноза. Наибольший противолейкемический эффект наблю-дается при аллогенной ТГСК. На основании совре-менных достижений в изучении ОМЛ кооперативной группой Россия – Беларусь был разработан протокол терапии ОМЛ-ММ, по которому в Республике Бела-русь с 2000 г. лечились дети и подростки со вторичным ОМЛ.

Цель. Оценить результаты лечения и исход вторич-ного ОМЛ у детей и подростков в ракурсе сравнения с de novo ОМЛ с учетом проведения ТГСК.

Материал и методы. В исследование были включе-ны 7 пациентов со вторичным ОМЛ и 103 пациента с de novo ОМЛ, получавших лечение по программе ОМЛ-ММ-2000/2006 в период с 2000 по 2009 г. Анали-зировались результаты лечения вторичного ОМЛ в ра-курсе сравнения с группой высокого риска de novo ОМЛ (n = 40). Статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 6.0.

Результаты и обсуждение. Достижение полной ре-миссии отмечено у всех 7 пациентов со вторичным ОМЛ, а в группе высокого риска de novo ОМЛ у 5-й части больных зафиксирована смерть в индукции и от-сутствие ответа на лечение, однако различия не были статистически значимыми (p > 0,2). У пациентов груп-пы высокого риска de novo ОМЛ достоверно чаще раз-вивались рецидивы заболевания (p = 0,05) за счет группы больных, получивших аутоТГСК. В полной продолжительной ремиссии находится 71 % пациентов

со вторичным ОМЛ, что выше в сравнении с группой de novo ОМЛ (p = 0,06). В связи с неблагоприятным прогнозом у пациентов со вторичным ОМЛ им всем была показана аллоТГСК, однако она была выполне-на у 5 (71,4 %) из 7 детей. Двадцать одному пациенту высокой группы риска de novo ОМЛ была выполнена ТГСК. В группе вторичного ОМЛ ТГСК выполнялась чаще – 71,4 % против 52,5 % пациентов с de novo ОМЛ.

Выводы. У пациентов со вторичным ОМЛ ремис-сия была достигнута в 100 % случаев. В полной про-должительной ремиссии находится 71 % пациентов со вторичным ОМЛ, что выше в сравнении с группой высокого риска de novo ОМЛ (p = 0,06). У пациентов группы высокого риска de novo ОМЛ достоверно чаще развивались рецидивы заболевания (p = 0,05) за счет группы больных, получивших аутоТГСК. Общая вы-живаемость для больных вторичным ОМЛ составила 75 %. Рецидивы ОМЛ были ведущими причинами смерти в обеих сравниваемых группах. Посттранс-плантационная выживаемость пациентов со вторич-ным ОМЛ составила 80 % за счет проведения аллоТГСК, но статистически значимых различий не выявлено в сравнении с группой высокого риска de novo ОМЛ, где чаще проводилась аутоТГСК (p > 0,1).

Пероксидазная активность цитохрома С, усиленная фосфатидилхолином в присутствии фосфолипазы D

Г.О. Степанов, А.Н. ОсиповГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Минздрава России, Москва

Уже на протяжении многих лет проблема апоптоза не теряет своей актуальности по причине участия дан-ного процесса в патогенезе онкологических заболева-ний. При этом все новые особенности молекулярных взаимодействий в этом процессе появляются в миро-вой научной литературе еженедельно. Одним из клю-чевых моментов в развитии апоптоза является выход из митохондрий цитохрома С, которому предшествует появление у последнего высокой пероксидазной активности. Данная активность стимулируется при взаимодействии цитохрома С с ненасыщенным кар-диолипином или фосфатидной кислотой, но никогда до сегодняшнего дня в этом процессе не участвовал фосфатидилхолин. Более того, ненасыщенный фос-фатидилхолин в большинстве исследований выступал как отрицательный контроль. В нашей работе пред-ставлен новый факт – фосфатидилхолин может в де-сятки раз увеличивать пероксидазную активность цитохрома С в присутствии фосфолипазы D, и эта ак-тивность может регулироваться при действии оксида азота и лазерного излучения.

Мы показали, что в присутствии фосфолипазы D в системе фосфатидилхолин – цитохром С резко по-


’2

01

2 вышается пероксидазная активность за счет фермен-тативной наработки ненасыщенной фосфатидной кислоты из фосфатидилхолина, а фосфатидная кис-лота является сильным активатором пероксидазной активности цитохрома С. При этом, если в системе присутствуют диолеоилфосфатидилхолин и фосфоли-паза D, то пероксидазная активность увеличивалась в 90 раз; если липиды предварительно экстрагирова-лись из митохондрий, то в 18 раз; и при работе с целы-ми митохондриями в 3 раза.

Во всех экспериментах при продолжительной ин-кубации фосфатидилхолина с фосфолипазой D на-блюдается незначительное уменьшение пероксидаз-ной активности цитохрома С после ее многократного увеличения. Данный факт опосредован действием сте-рических факторов межмолекулярного взаимодействия и подтверждается методами флуоресценции триптофа-на 59 и ЭПР-спектроскопии с этопозидом. Главным результатом нашего исследования стало подтверждение возможности значимого увеличения пероксидазной активности цитохрома С (тесно связанной с инициа-цией апоптоза) при действии фосфа тидилхолина в ус-ловиях ее инкубации с фосфолипазой D.

Анализ мутаций гена CEBPA в группе нормального кариотипа при остром

миелоидном лейкозе у детей

М.В. Стёганцева, А.М. Кустанович, Р.И. Юцкевич, Н.А. Соколова, О.В. Алейникова



C/EBPA относится к семейству CCAAT/энхан-серсвязывающих белков (CEBP), регулирующих ба-ланс процессов пролиферации и терминальной диф-ференцировки. С мРНК гена может транслироваться как белок размером 42 кДА, так и доминантно-нега-тивная изоформа размером 30 кДА, в которой отсут-ствует N-концевая область, включающая трансакти-вационный домен 1 (TAD1). Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) с мутацией CEBPA включены в клас-сификацию ВОЗ и составляют 7–24 % от общего числа случаев ОМЛ. Наиболее часто они встречаются у па-циентов с нормальным кариотипом (НК). Мутации в ДНК-связывающем домене (bZIP) приводят к нару-шению C/EBPA-опосредованной регуляции клеточ-ного цикла, что сопровождается увеличением коли-чества бластных клеток. Если же мутации затрагивают TAD, то экспрессия CEBPA смещается в сторону изо-формы р30. Выбор CEBPA в качестве объекта исследо-вания обусловлен возможностью его использования в качестве мишени для мониторинга минимальной остаточной болезни, а также прогностического и клас-сификационного маркера.

Мутации в гене CEBPA были проанализированы у 17 пациентов с НК ОМЛ с использованием секвени-рования. Мутации в кодирующей области были обна-ружены у 5 человек (35 % НК ОМЛ). В 4/5 случаев (80 %) определялись мутации со сдвигом рамки счи-тывания. У 1 (20 %) из пациентов мутация затрагивала bZIP домен, в 3 случаях – один из TAD-доменов. В 1 случае определялась двойная мутация, приводящая к изменению нуклеотидной последовательности в до-менах TAD1 и bZIP, что, как считают, ассоциировано с благоприятным прогнозом (S. Fröhling et al., 2004). У 4 пациентов – 1 c мутацией и 3 без мутации (28 % НК ОМЛ) – определялась вставка 6 нуклеотидов, затра гивающая полиморфную область в домене TAD2 (B.J. Wouters et al., 2007). Пациенты с мутацией CEBPA характеризовались повышенным содержанием лейко-цитов и более высокой частотой экспрессии CD34 (p < 0,05). В 2 раза чаще в группе CEBPA-позитивных лейкозов встречался М2-подтип ОМЛ (80 % vs 40 %, p > 0,05). Анализ выживаемости не выявил достовер-ных различий между пациентами с наличием и отсут-ствием мутации CEBPA в группе с НК ОМЛ.

Мутации гена CEBPA встречаются у трети пациен-тов с НК ОМЛ. CEBPA-позитивные лейкозы характе-ризуются повышенным лейкоцитозом и уровнем экс-прессии CD34. Отсутствие различий по параметрам выживаемости в проанализированной группе может объясняться как малым размером проанализирован-ной выборки, так и тем, что в анализ были включены пациенты с различным типом мутаций (моно-/биал-лельные) в гене CEBPA.

Репарация индуцированных разрывов ДНК в нормальных гемопоэтических

и лейкемических стволовых клетках in vitro

А.В. Тарасова, Т.В. ШманГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»


Высокий уровень репарации ДНК в лейкемиче-ских стволовых клетках (ЛСК) обеспечивает их рези-стентность к химиопрепаратам и облучению. Целью работы было сравнить эффективность репарации ДНК в лейкемических клетках и нормальных гемопоэтиче-ских стволовых клетках (ГСК) после воздействия на них этопозида.

Исследовали мононуклеарные клетки костного мозга 8 доноров и 10 пациентов с острым лимфобласт-ным лейкозом (ОЛЛ). После 3 и 24 ч инкубации с это-позидом (VP-16, 10 мкг/мл) часть клеток окрашивали анти-CD45-PE-Cy7, CD34-PC-5 и CD38-PE антите-лами. Затем клетки фиксировали параформальдеги-


4’

20

12дом и ледяным этанолом, дополнительно окраши-

вали анти-γH2AX-AlexaFluor488 (Ser139) антителами и анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC-500.

Клетки с фенотипом СD34+СD38-СD19+ наиболее часто рассматривают в качестве потенциальных ЛСК при ОЛЛ (K. Wilson, 2010). По полученным нами дан-ным, корреляция между количеством лейкозных кле-ток в популяциях СD34+СD38- и СD34+СD38-СD19+ составила 0,98 (р < 0,05).

Было установлено, что через 3 ч инкубации с VP-16 количество ЛСК с фенотипом CD45lowCD34+CD38-, экспрессирующих γH2AX, составило 55,1 ± 8,8 %, а через 24 ч – 36,1 ± 9,3 %. Для ГСК-доноров было характерно отсутствие репаративного ответа – уровень γH2AX-позитивных CD45lowCD34+CD38--клеток со-ставил 22,2 ± 4,4 % через 3 ч и 23,8 ± 4,7 % через 24 ч. Можно предположить, что ранние ГСК с разрывами ДНК элиминируются из организма, чтобы предотвра-тить передачу поврежденной или «некорректно» репа-рированной ДНК последующим клеточным поколе-ниям, тогда как эффективная репарация ДНК в ЛСК с фенотипом CD45lowCD34+CD38- обеспечивает их ус-тойчивость к генотоксическому воздействию. При этом клетки доноров с более зрелым CD45lowCD34+CD38+-фенотипом характеризовались значительно более вы-сокой способностью репарировать ДНК и снижением количества γH2AX-позитивных клеток с 47,7 ± 9,6 % до 25,4 ± 5,8 %, тогда как лейкемические клетки с дан-ным фенотипом репарировали ДНК менее интенсив-но и уровень γH2AX-экспрессирующих клеток сни-жался с 74,8 ± 6,3 % до 65,1 ± 10,4 %.

Антиоксидантная активность биологических жидкостей как критерий

функционального состояния антиоксидантной системы человека

Ю.О. Теселкин, О.Б. ЛюбицкийКафедра общей и медицинской биофизики

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва

Известно, что оксиданты – свободные радикалы, активные формы кислорода, азота и другие – являют-ся необходимыми участниками многих физиологиче-ских процессов в живой клетке. Вместе с тем, высокая реакционная способность делает их чрезвычайно ток-сичными для биологических систем. В норме регуля-ция продукции оксидантов в тканях и органах челове-ка осуществляется многоуровневой антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения раз-личной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты. Однако нарушение баланса между оксидантами и антиоксидантами в сторону первых

может привести к развитию оксидативного стресса − неконтролируемого усиления свободнорадикальных реакций, в результате которого происходит окисли-тельное повреждение различных биомолекул. Так, установлено, что активация свободнорадикальных реакций играет важную роль в патогенезе нейродеге-неративных, сердечно-сосудистых, бронхолегочных и других заболеваний. В связи с этим важной задачей медико-биологических исследований является изуче-ние антиоксидантного потенциала организма человека.

Один из подходов, позволяющих оценить состоя-ние антиоксидантной системы человека, заключается в определении антиоксидантной активности (АОА) его биологических жидкостей. АОА биологической жид-кости – это интегральный показатель, отражающий способность входящих в ее состав антиоксидантов противодействовать развитию свободнорадикальных реакций в какой-либо модельной системе. Для коли-чественной оценки величины АОА биологической жидкости ее выражают через концентрацию стандар-тного антиоксиданта, например тролокса или аскор-биновой кислоты.

В наших исследованиях с использованием метода хемилюминесценции показано, что АОА биологиче-ских жидкостей человека может служить дополни-тельным клиническим лабораторным показателем, применение которого повышает эффективность про-водимых лечебных мероприятий, в том числе антиок-сидантной терапии. При этом объем исследуемой био-логической жидкости (например, сыворотки крови) составляет не более 10–20 мкл. Это дает возможность осуществлять забор крови из пальца, что очень важно при динамическом наблюдении за больными.

Использование процессного подхода для совершенствования качества

получения криопреципитата

Л.В. Удалова1, Н.М. Поздеев2

1ГУЗ «Липецкая областная станция переливания крови»;2 ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России

Введение. В современной практике управления качеством производственных процессов наиболее пер-спективным является применение процессного под-хода. Его использование позволяет рассматривать производственную деятельность как единую систему взаимосвязанных процессов, вносить изменения в од-ни, не ухудшая при этом другие, производить эффек-тивную оптимизацию использования человеческих и материальных ресурсов.

Материалы и методы. Использование процессного подхода для управления технологическими этапами получения криопреципитата с регламентируемым содержанием фактора VIII базировалось на методоло-гии функционального моделирования IDEFO.


’2

01

2 Результаты исследования. Разработана функцио-нальная модель получения криопреципитата, позво-лившая определить в конечном продукте «Крио-преципитат» зависимость содержания фактора VIII в количестве не менее 70 МЕ (элемент выхода) от тем-пературы и способа размораживания исходного сырья, в качестве которого используется плазма свежезамо-роженная (элемент входа). Описание и идентификация технологических этапов с применением процессного подхода позволили организовать работу по производ-ству криопреципитата с максимальным сокращением движения полупродукта по отделению и сокращению времени пребывания его в условиях комнатной тем-пературы. Анализ критических точек, определенных в ходе построения функциональной модели, выявил объективную необходимость использования для по-лучения криопреципитата строенных (500/400/400) полимерных контейнеров и внесения изменений в по-рядок организации работы, исключив ошибки на эта-пах этикетировки и маркировки.

Заключение. Доказана необходимость и возмож-ность управления производством криопреципитата с помощью процессного подхода. Построение функ-циональной модели получения криопреципитата по-зволило стандартизовать процедуру, обозначило необ-ходимость внесения изменений в наиболее важные этапы производства с целью улучшения качества ко-нечного продукта.

Процессный подход позволяет оценить влияние внесенных изменений на результаты деятельности, ве-дет к оптимизации работы оборудования и персонала.

Эффективность лечения по протоколу MLL-Baby прогностически

неблагоприятного MLL/AF4 позитивного острого лимфобластного лейкоза

у детей младше года

Л.Г. Фечина1, 2, Е.В. Шориков1, 2, О.П. Хлебникова1, О.В. Стренева1, 2, М.С. Карачева1, 2, Г.А. Цаур1, 2,

А.М. Попов1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Д.В. Литвинов4, Н.В. Мякова4, С.Р. Варфоломеева4, К.Л. Кондратчик5,

Д.А. Перегудов6, А.В. Шамардина7, Э.Г. Бойченко8, Е.В. Лапотентова9, О.В. Алейникова9,

А.И. Карачунский4, Г. Хенце10, А.Г. Румянцев4 1ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1»,

Екатеринбург; 2 ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ГБУЗ ВПО

УралГМА, Екатеринбург; 4ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

5Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 6ГУЗ «Московский областной онкологический диспансер», Балашиха;

7ГУ «Нижегородская областная детская клиническая больница», Нижний Новгород;

8ГУЗ «Детская городская больница № 1», Санкт- Петербург; 9ГУ «Республиканский

научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» Министерства

здравоохранения Республики Беларусь; 10Медицинский центр Charite, Университет

им. Гумбольдта, Берлин, Германия

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей младше года в 70 % случаев сопровождается пере-стройками с участием MLL-гена, наиболее неблагопо-лучной из которых является MLL/AF4. По данным международных публикаций ведущих исследователь-ских групп, результаты лечения детей с этой генети-ческой перестройкой до настоящего времени являются крайне неудовлетворительными.

В России был разработан оригинальный протокол MLL-Baby для лечения младенческих ОЛЛ с включе-нием полностью трансретиноевой кислоты (АТРА), с 2003 г. было пролечено 28 детей с перестройкой MLL/AF4, что составило 34 % от числа всех включен-ных в исследование MLL-Baby пациентов.

Медиана возраста больных составила 3 мес (от 0 до 11 мес), инициальный лейкоцитоз 99 × 109/л (1,8 × 109/л – 612 × 109/л). Инициальный нейролейкоз был зарегистрирован у 9 (32 %) пациентов. На этапе индукционной терапии погибло 4 (14,3 %) ребенка, а на этапе консолидирующей терапии, во время про-ведения блоков высокого риска, погибло также 4 (14,3 %) ребенка в сроки от 1,3 до 2,5 мес с момента начала противоопухолевой терапии. Из 24 младенцев, достиг-ших ремиссии, у 9 (32 %) пациентов были зарегистри-рованы очень ранние рецидивы. Одиннадцать (39,3 %) пациентов находятся в длительной клинико-гемато-логической ремиссии. Бессобытийная выживаемость составила 0,38 ± 0,09, а безрецидивная выживае-мость – 0,54 ± 0,11.

Полученные результаты показали, что на протоко-ле MLL-Baby удалось добиться снижения частоты раз-вития рецидивов в самой неблагополучной группе па-циентов в возрасте до 1 года, страдающих ОЛЛ с t(4;11).

Сокращение частоты токсических летальных исходов на терапии путем оптимизации условий и ка-чества лечения младенческих лейкозов позволит добиться улучшения показателей долгосрочной бес-событийной и безрецидивной выживаемости.


4’

20

12Использование клеточного биочипа

для дифференциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза

и лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки

А.Н. Хвастунова1, 2, А.О. Доронина1, 3, О.С. Федянина2, Ф.И. Атауллаханов1, 2, 3, С.А. Кузнецова1, 2, 3

1Лаборатория биофизики ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва;

2ЦТП ФХФ РАН; 3лаборатория физической биохимии системы крови ФГБУ ГНЦ Минздрава России, Москва

Успешная диагностика онкогематологических заболеваний базируется на сочетании иммунофено-типирования, морфологического и молекулярно-био-логического анализа клеток крови. Однако невозмож-ность проведения анализа поверхностных антигенов и морфологического исследования на одних и тех же клетках может затруднять дифференциальную диа-гностику волосатоклеточного лейкоза и лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки с циркулирую-щими ворсинчатыми лимфоцитами, для которой не-обходимо определение иммунофенотипа ворсинчатых лимфоцитов, составляющих в некоторых случаях всего несколько процентов от всех лимфоцитов перифери-ческой крови и костного мозга.

Клеточный биочип представляет собой прозрачную подложку, на которой иммобилизованы антитела к 36 поверхностным антигенам лейкоцитов. При инку-бации биочипа с клеточной суспензией клетки связы-ваются с иммобилизованными антителами. После от-мывки на поверхности биочипа остаются области, покрытые лейкоцитами, несущими тот или иной по-верхностный антиген, морфология которых исследуется стандартными цитологическими методами. С помощью клеточного биочипа были исследованы лимфоциты периферической крови 27 пациентов с подозрением на волосатоклеточный лейкоз. Показано, что у больных волосатоклеточным лейкозом (у 23 из 27) ворсинчатые лимфоциты связываются с антителами к CD11c (100 % случаев), CD19 (100 % случаев), CD20 (100 % случаев), CD25 (96 % случаев), CD103 (100 % случаев). В пери-ферической крови 3 из оставшихся 4 пациентов было обнаружено небольшое количество ворсинчатых лим-фоцитов, положительных по CD19 (1–10 % от общего числа В-лимфоцитов и небольшое количество CD11с+ лимфоцитов, но ворсинчатых клеток среди них не бы-ло). У больных данной группы на основании иммуно-фенотипирования, гистологических и цитохимических исследований была диагностирована лимфома из кле-ток маргинальной зоны селезенки. Таким образом, кле-точный биочип может быть использован для диффе-ренциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза.

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31275.

Молекулярно-генетические аспекты прогнозирования острого

лимфобластного лейкоза у детей

С.А. Ходулева1, И.П. Ромашевская2, Т.В. Хартон1, А.Н. Демиденко2, Е.Ф. Мицура2, О.В. Жук2

1УО «Гомельский государственный медицинский университет», Беларусь;

2ГУ РНПЦ РМиЭЧ, Гомель, Беларусь

С целью оценки молекулярно-генетических изме-нений методом полимеразной цепной реакции с об-ратной транскрипцией проведено исследование клеток неопластического клона при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей. Всего обследовано 35 детей с впервые выявленным ОЛЛ в возрасте от 10 месяцев до 17 лет, средний возраст составил 6 лет и 11 месяцев, соотношение мальчиков и девочек – 1,3 : 1. Молеку-лярно-генетические аномалии выявлены у 29 % паци-ентов. В 60 % случаев обнаружена t(12;21)TEL/AML, при этом преимущественно (83 %) у детей в возраст-ной группе от 1 до 10 лет, и только в 17 % случаев в воз-расте старше 10 лет. Все дети с данной транслокацией имели В-клеточную иммунологию бластных клеток, причем пре-пре-В вариант, который относится к фак-торам с благоприятным прогнозом, встречался в 67 %. Инициальный уровень лейкоцитов у всех пациентов был менее 10 × 109/л. Во всех случаях ОЛЛ с t(12;21)TEL/AML достигнута полная ремиссия, однако в 17 % случаев диагностирован ранний костномозговой ре-цидив. Период наблюдения составил 10 лет. Трансло-кация t(9;22) BCR/ABL выявлена у 1 ребенка мужско-го пола, в возрасте 6 лет, бластные клетки имели В-клеточную природу (пре-В-вариант). Анализ уровня инициального лейкоцитоза показал, что количество лейкоцитов было в пределах до 30 × 109/л. Достигнута полная ремиссия, период наблюдения составил 8 лет. Транслокация t(1;19) E2A/PBX1 диагностирована у 2 детей. Все дети на момент постановки диагноза были старше 10 лет, иммунофенотип бластов в поло-вине случаев соответствовал пре-пре-В варианту, в половине – Т-клеточному варианту. Инициальный лейкоцитоз в 100 % был в пределах 10–30 × 109/л. Несмотря на неблагоприятные факторы, все дети до-стигли полной ремиссии. Период наблюдения соста-вил от 2 до 6 лет. Транслокация t(11;19)MLL/ENL выявлена в 10 % случаев. Наличие t(11;19)MLL/ENL, ассоциированной с инициальным лейкоцитозом, Т-клеточным вариантом, мужским полом, возрастом до 2 лет, может быть рассмотрена как неблагоприят-ный прогностический фактор, так как в данном случае наблюдалась резистентность к проводимой полихими-отерапии.


’2

01

2 Перестройки 11q23/MLL у детей первого года жизни с острым

миелоидным лейкозом

Г.А. Цаур1, 2, Е.В. Флейшман3, Т.Л. Гиндина4, О.М. Плеханова1, А.М. Попов1, 2, О.И. Сокова3,

О.В. Алейникова5, Е.В. Волочник5, А.С. Демина1, 2,

О.В. Каленник6, И.И. Калинина7, Н.П. Кирсанова5, К.Л. Кондратчик8, А.М. Кустанович5, Т.В. Наседкина6,

В.А. Овсепян9, Ю.В. Ольшанская7, А.В. Попа3, Т.О. Ригер1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 10, О.В. Стренева1, 2,

Е.В. Шориков1, 2, C. Meyer11, R. Marschalek11, Л.Г. Фечина1, 2

1ГБУЗ CO «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2ГБУЗ СО «Институт медицинских кле-точных технологий», Екатеринбург; 3ФГБУ «Российский

онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва; 4Институт детской гематологии и транс-

плантологии им. Р.М. Горбачевой ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский универ-ситет им. акад. И.П. Павлова»; 5ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гема-тологии и иммунологии» Министерства здравоохране-ния Республики Беларусь; 6ФГБУН «Институт молеку-

лярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва; 7ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава

России, Москва; 8Морозовская детская городская клиническая больница, Москва; 9ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России; 10ГБОУ ВПО УралГМА, Екатеринбург; 11Diagnostic Center of Acute Leukemia, Institute of Phar-

maceutical Biology/ ZAFES, Goethe-University of Frankfurt, Франкфурт-на-Майне, Германия

Нами проведен анализ результатов цитогенетиче-ского и молекулярно-генетических исследований (FISH, различные варианты полимеразной цепной реакции) у 57 пациентов в возрасте младше 1 года с ос-трым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Перестройки 11q23/MLL были выявлены у 28 (49 %) детей. Самыми частыми были транслокации t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 – в 32 % случаев и t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 – в 28 % случаев. Перестройки 11q23/MLL встречались приблизительно с равной частотой у паци-ентов младше и старше 6 месяцев (p = 0,904). В группе пациентов с перестройками 11q23/MLL острый моноб-ластный лейкоз (FAB М5) наблюдался достоверно чаще, а острый мегакариобластный лейкоз (FAB М7) – досто-верно реже, чем в группе пациентов, у которых измене-ния 11q23/MLL не были обнаружены (р = 0,024 и р = 0,001 соответственно). У 6 (50 %) из 12 пациентов, которым проводилось определение точки разрыва в гене MLL, она располагалась в интроне 9. Дополнительные хромосом-ные аномалии у пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL и известным кариотипом были выявлены в 33 % случаев, комплексный кариотип – в 24 %. Также нами дана детальная характеристика редких вариантов пере-

строек MLL, включая MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9, а также частичного тандемного повтора в гене MLL при ОМЛ у пациентов первого года жизни. Пока-зана важность комбинирования цитогенетического и молекулярно-генетических методов для корректного установления типа перестройки 11q23/MLL.

Сравнение антипролиферативной эффективности флавоноидов корня

солодки и доксорубицина in vitro

М.Д. Цицуашвили1, С.И. Павлова2, 3, И.Г. Козлов1, 2

1ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва; 2ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия

Рогачева Минздрава России, Москва; 3ФГБОУ ВПО ЧГУ им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Республика Чувашия

Противоопухолевый антибиотик доксорубицин ши-роко используется в терапии онкологических заболева-ний различного генеза. Однако в ряде случаев отмечено развитие резистентности некоторых опухолей к этому препарату, что представляет существенную проблему для практической онкологии. Известно, что низкомолеку-лярные полифенольные соединения растительного про-исхождения, флавоноиды, обладают широким спектром биологической активности. Есть сведения, что в основе механизма антипролиферативного эффекта флавонои-дов лежит ингибирование фосфорилирования внутрик-леточных сигнальных молекул. Целью данного исследо-вания явилась оценка и сравнение рост-ингибирующей активности фла воноидов корня солодки (ФКС) и док-сорубицина (Sigma, США) по отношению к опухолевой линии K-562/DOX, резистентной к данному цитоста-тику. Оценка пролиферации лейкозных клеток проводи-лась с помощью радиоизотопного метода. Клетки засе-вали в 96-луночный планшет в концентрации 1,0 × 104 клеток/лунку и инкубировали в течение 24 ч. Далее в опытные лунки вносили ФКС (0,1–20 мкг/мл) и док-сорубицин (10-8–10-5 М). Затем во все лунки добавляли АТФ (100 μМ) и радиоактивную метку 3Н-тимидин (1 мкКю/мл) и продолжали инкубацию еще в течение 24 ч. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы этанола до конечной концентрации 1 %. Проли-ферацию оценивали путем измерения радиоактивности включенного в ДНК 3Н-тимидина; результат выражали в процентах к контролю. Исследуемые агенты подавляли пролиферацию клеток дозозависимо: ФКС (10–20 мкг/мл) – до 30–35 %, доксорубицин (10-6–10-5 М) – до 30–40 %, при этом он не оказывал эффекта в терапевтиче-ских концентрациях 10-8–10-7 М. При совместном вве-дении ФКС (20 мкг/мл) и доксорубицина в опухолевую культуру пролиферация клеток линии K-562/DOX инги-бировалась в большей степени: эффект комбинации был равен сумме эффектов отдельных препаратов. Таким об-разом, комбинация ФКС с доксорубицином приводит к усилению противоопухолевого эффекта in vitro.

ТЕРАПИЯ ВЫСОКИХ ДОСТИЖЕНИЙ

ЗАО «Рош-Москва» Официальный дистрибьютор «Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.» (Швейцария) Россия, 107031 МоскваТрубная площадь, дом 2 Бизнес-центр «Неглинная Плаза» Тел.: + 7 (495) 229-29-99Факс: + 7 (495) 229-79-99 www.roche.ru

Показания. Неходжкинская лимфома Рецидивирующая или химиоустойчивая В-клеточная, СD20-положительная неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности или фолликулярная. Фолликулярная лимфома III-IV стадии в комбинации с химиотерапией у ранее нелеченных пациентов. Фолликулярная лимфома в качестве поддерживающей терапии после ответа на индукционную терапию. СD20-положительная диффузная В-крупноклеточная неходжкинская лимфома в комбинации с химиотерапией по схеме CHOP. Хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией у пациентов, ранее не получавших стандартную терапию. Рецидивирующий или химиоустойчивый хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией. Ревматоидный артрит (активная форма) у взрослых в комбинации с метотрексатом при непереносимости или неадекватном ответе на текущие режимы терапии, включающие один или более ингибиторов фактора некроза опухолей (ФНО-а). Безопас-ность и эффективность препарата у детей не установлены. Противопоказания. Гиперчувствительность к ритуксимабу, любому компоненту препарата или к белкам мыши, острые инфекционные заболевания, выраженный первичный или вторичный иммунодефицит. Правила приготовления и хранения раствора. Необходимое количество препарата набирают в асептических условиях и разводят до расчетной концентрации (1-4 мг/мл) в инфузионном флаконе (пакете) с 0.9% раствором натрия хлорида для инфузий или 5% раствором декстрозы (растворы должны быть стерильными и апирогенными). Приготовленный инфузионный раствор Мабтеры физически и химически стабилен в течение 12 ч при комнатной температуре или в течение не более 24 ч при температуре от 2 до 8 °С. Мабтеру вводят внутривенно, инфузионно (медленно), через отдельный катетер. Нельзя вводить в/в болюсно или в виде в/в инъекций. Дополнительная информация в инструкции по применению.

Онкогематология 2012 год № 4

Documents