молекулярная биомедицина. часть 2

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ

БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОМЕДИЦИНА

Часть 2

Учебное пособие для вузов

Воронеж Издательский дом ВГУ

2014

Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

2

Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 15 мая 2014 г., протокол № 9 Составители: О.А. Сафонова, А.А. Агарков, М.В. Лущик, А.В. Семенихина, Т.Н. Попова, Т.И. Рахманова Рецензент профессор кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета, д-р биол. наук, профессор Т.А. Ковалева Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и мик-робиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государствен-ного университета. Рекомендуется для студентов биолого-почвенного факультета 4-го курса очной и очно-заочной форм обучения, для магистрантов 1-го года обучения. Для направлений 020400 – Биология (бакалавриат); и 020400м – Биология (магистратура)


3

СОДЕРЖАНИЕ

Генетическая диагностика .................................................................................. 4 Введение ............................................................................................................... 4 Выделение и анализ нуклеиновых кислот ........................................................ 5

Качественный анализ нуклеиновых кислот ......................................... 5 Количественный анализ нуклеиновых кислот ..................................... 5

Некоторые ферменты, применяемые в молекулярной диагностике .............. 6 Нуклеазы и их применение .................................................................... 6 Ингибиторы РНКаз и их практическое применение ........................... 7 Рестриктазы ............................................................................................. 7

Гибридизационные методы ................................................................................ 8 Метод гибридизации в растворе .......................................................... 11 Метод гибридизации на твердом носителе ........................................ 11 Гибридизация in situ ............................................................................. 11 Блот-гибридизация ................................................................................ 13 Блот-гибридизация по Саузерну ......................................................... 14 Метод сэндвич-гибридизации ............................................................. 15 Метод разветвленной ДНК .................................................................. 16

Методы амплификации нуклеиновых кислот ................................................ 16 Полимеразная цепная реакция ............................................................. 17 ЛЛииггааззннааяя ццееппннааяя ррееааккцциияя .......................................................................................................................................... 3322 ММооллееккуулляяррннааяя ддииааггннооссттииккаа ггеенннныыхх ббооллееззннеейй ...................................................................... 3333 ММееттооддыы ппееррввииччнноойй ииддееннттииффииккааццииии ммууттаацциийй ........................................................................ 3333 ММооллееккуулляяррннооее ссккааннииррооввааннииее ииззввеессттнныыхх ммууттаацциийй .......................................................... 3388 ММееттоодд ППЦЦРР//ЛЛООЗЗ ........................................................................................................................................................................ 4400 ИИссппооллььззооввааннииее ДДННКК--ббииооччииппоовв ........................................................................................................................ 4422

ББииооииннффооррммааттииккаа ................................................................................................................................................................................................ 4444 ЦЦееллии ии ззааддааччии ббииооииннффооррммааттииккии ............................................................................................................................................ 4455 ППррииккллааддннааяя ооббллаассттьь ббииооииннффооррммааттииккии ........................................................................................................................ 4477

ААннааллиизз ггооммооллооггииччннооссттии ппооссллееддооввааттееллььннооссттеейй .................................................................... 4477 РРааззррааббооттккаа ллееккааррссттввеенннныыхх ппррееппааррааттоовв .............................................................................................. 4477 ППррооггннооззииррууюющщииее ффууннккццииии .................................................................................................................................... 4488 ППррииммееччаанниияя вв ммееддииццииннее .............................................................................................................................................. 4488 ББииооииннффооррммааттииккаа ппооссллееддооввааттееллььннооссттеейй ............................................................................................ 4499 ССттррууккттууррннааяя ббииооииннффооррммааттииккаа .......................................................................................................................... 5511 ККооммппььююттееррннааяя ггееннооммииккаа ............................................................................................................................................ 5533 ППррииммееннееннииее ннееккооттооррыыхх ммееттооддоовв ааннааллииззаа ддлляя ппооллууччеенниияя ннооввыыхх ббииооллооггииччеессккиихх ззннаанниийй ............................................................................................................................ 5555 РРааззррааббооттккаа ннооввыыхх ммееттооддоовв ааннааллииззаа ббииооллооггииччеессккиихх ддаанннныыхх ........................ 5599

РРааззррааббооттккаа ннооввыыхх ббаазз ддаанннныыхх .................................................................................................................................................... 6611 ООттккррыыттииее ллееккааррссттввеенннныыхх ппррееппааррааттоовв ии ффааррммааккооииннффооррммааттииккаа ...................................... 6644

ООттккррыыттииее ллееккааррссттввеенннныыхх ппррееппааррааттоовв .................................................................................................. 6644 ООппррееддееллееннииее ооппыыттннооггоо ссооееддииннеенниияя ........................................................................................................ 6666

ППррооггррааммммыы ппооииссккаа ........................................................................................................................................................................................ 6699


4

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Введение Среди большого числа исследовательских методов и новых техноло-

гий, обогативших клиническую медицину за последние десятилетия, важ-ное место принадлежит разработке и практическому внедрению современ-ных молекулярно-генетических методов. Они основаны на непосредствен-ном анализе молекул ДНК и РНК. На основании анализа данных молекул возможно проведение ранней и более полной диагностики ряда инфекцион-ных заболеваний, идентификация организмов (в частности, по следам кро-ви, спермы и других тканей), а также выявление генных (хромосомных) му-таций (в том числе и пренатальное), что необходимо для решения ряда кли-нических и фундаментальных задач.

Исходным материалом для проведения ДНК-диагностики заболеваний, обусловленных мутациями ядерных генов, могут служить любые клетки ор-ганизма, содержащие ядро. Обычно для этих целей используют лейкоциты, выделяемые из 5–20 мл периферической крови. В некоторых случаях (на-пример, при митохондриальных болезнях, обусловленных мутациями мито-хондриальной ДНК с преимущественной экспрессией мутации в мышечной ткани) более адекватным источником ДНК являются биоптаты мышц. Гено-диагностика может также проводиться на основе исследования ДНК, выде-ляемой из клеток эпителия полости рта, кожных фибробластов и т.д. При проведении пренатальной ДНК-диагностики у плода (обычно на 10–21-й не-деле беременности) источником ДНК служат биоптаты хориона, плаценты, клетки амниотической жидкости или лимфоциты пуповинной крови плода.

При выявлении инфекционных заболеваний исходным материалом может служить сыворотка крови, моча, мокрота, соскобы мочеполовых пу-тей и т.д.

Большинство методов анализа структуры фрагментов ДНК и РНК осуществляется с помощью различных методик электрофореза (ЭФ) в ага-розном или полиакриламидном (ПАА) гелях. В подобранных стандартных условиях именно подвижность молекул нуклеиновых кислот (НК) при элек-трофорезе является ключевым анализируемым параметром, зависящим от конкретных характеристик изучаемого фрагмента (например, от его вели-чины или конформации).

Для визуализации молекул ДНК по результатам проведенного ЭФ мо-гут использоваться окраска их нитратом серебра, бромистым этидием (дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходя-щем УФ-свете) или мечение различными флюорохромами (дающими флюоресценцию определенной длины волны при возбуждении лазерным лучом). Для окраски РНК можно также применять толуидиновый синий, метиленовый синий.


5

Более сложный метод визуализации ДНК – авторадиография – осно-ван на введении радиоизотопной метки в состав анализируемых макромо-лекул; по окончании ЭФ на гель с радиоактивно мечеными молекулами ДНК накладывается рентгеновская пленка, и положение различных фраг-ментов ДНК в геле определяется в виде соответствующих полос на прояв-ленной пленке.

Выделение и анализ нуклеиновых кислот

Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно лизировать (например, с помощью воздействия высокой температуры или детергентами). Пробоподготовка проводится также с целью удаления кле-точных белков, в частности, различных РНКаз. Для депротеинизации ис-пользуют 2 метода: 1) обработка белков протеазами (например, протеина-зой К) в присутствии ЭДТА и детергентов (например, саркозила); 2) дена-турация и экстракция органическими растворителями (например, фенолом и хлороформом). Из водных растворов геномную ДНК можно осадить добав-лением этанола или изопропанола. К настоящему времени также разработа-ны специальные сорбенты для осаждения ДНК (РНК) из раствора.

Для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков (в том числе РНКаз) можно использовать гуанидинтиоцианат – сильный денатурирующий агент.

Конечный размер получающихся фрагментов ДНК (РНК) зависит от действия клеточных нуклеаз и механического разрушения НК в процессе выделения.

После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших ис-следований необходимо определить чистоту препаратов и размер молекул. При наличии загрязнений повторно проводят обработку протеиназой К и экстракцию фенолом/хлороформом. ДНК должна быть достаточно высоко-молекулярной, чтобы можно было проводить планируемые эксперименты, а РНК должна быть интактной.

Качественный анализ нуклеиновых кислот

ДНК (одно– и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молеку-лярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК пропор-циональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеи-новых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они переме-щаются при электрофорезе.


6

Количественный анализ нуклеиновых кислот Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе наиболее ши-

роко используется 2 метода. Более простым и точным является спектрофо-тометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувстви-тельностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то кон-центрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуорес-ценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

1. Спектрофотометрический метод Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать,

измерив его оптическую плотность (D) при 260 нм. Одна единица D при-мерно соответствует концентрации двухцепочечной ДНК 50 мкг/мл и кон-центрации одноцепочечной ДНК и РНК 40 мкг/мл. Для оценки чистоты об-разцов можно использовать отношение между D при 260 и 280 нм. Для чис-тых препаратов ДНК и РНК оно должно быть равно соответственно 1,8 и 2. Если это соотношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом, и оценка концентрации будет неверна.

2. Окрашивание бромистым этидием А) Электрофоретический метод Для примерной оценки концентрации препаратов ДНК или РНК на

гель наносят разные количества маркерных нуклеиновых кислот. Концен-трацию исследуемых ДНК или РНК в образце оценивают, сравнивая интен-сивность флуоресценции образца и стандартных маркеров с известной кон-центрацией. При этом важно, чтобы образцы ДНК и РНК сравнивались с соответствующими маркерами, поскольку при одинаковом количестве ДНК и РНК интенсивность их флуоресценции в УФ-свете различается.

Б) Метод пятен Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно определить, ок-

расив раствор бромистым этидием, измерив интенсивность флуоресценции в УФ-свете и сравнив ее с флуоресценцией маркеров известной концентрации. Как и при электрофоретическом методе, маркеры должны представлять со-бой нуклеиновые кислоты соответствующего типа (т.е. ДНК или РНК).

Для количественного определения РНК можно использовать также орциновый метод, ДНК – дифениламиновый.

Некоторые ферменты, применяемые в молекулярной диагностике

Нуклеазы и их применение Нуклеазы – ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты до мо-

но- и олигонуклеотидов, по характеру своего действия относятся к фосфо-диэстеразам. Концевые мононуклеотиды отщепляются экзонуклеазами; расщепление внутри полинуклеотидной цепи осуществляют эндонуклеазы. Нуклеазы могут расщеплять РНК или ДНК (в соответствии с чем разделяют РНКазы и ДНКазы), а также и те, и другие (неспецифические нуклеазы).


7

В лабораториях нуклеазы применяют для очистки препаратов от нук-леиновых кислот определенного вида, для установления структуры иссле-дуемых нуклеиновых кислот, изучения механизма их распада и синтеза.

Нуклеазы в молекулярной клинической диагностике применяют: 1) для обеспечения отрицательного контроля в результате удаления

нуклеиновой кислоты-мишени; 2) при обработке РНКазой повышается специфичность гибридизации

ДНК-ДНК, а при обработке ДНКазой – специфичность анализа РНК; 3) для проверки специфичности зонда – обработка перед гибридиза-

цией РНКазой должна приводить к исчезновению сигнала, возникающего при связывании РНК с зондом, а ДНКазой – не должна влиять на РНК-специфичный сигнал.

Ингибиторы РНКаз и их практическое применение

РНК по сравнению с ДНК гораздо более лабильна и чувствительна к действию нуклеаз. Кроме того, РНКазы менее чувствительны к действию денатурирующих белки веществ, чем ДНКазы. Все это затрудняет получе-ние полноразмерной РНК и заставляет проводить инактивацию РНКаз од-новременно с лизисом клеток. Вся используемая вода должна быть обрабо-тана 0,1%-м диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Ингибиторы РНКаз должны использоваться везде, где это возможно: в буферах для выделения РНК, при последующих экспериментах, при хранении РНК в водных растворах. Можно выделить белковые и небелковые ингибиторы РНКаз. Белковые ин-гибиторы РНКаз производятся несколькими фирмами (например, Sigma), однако они могут денатурировать под действием определенных агентов или деградировать под действием протеаз. Некоторые фирмы (например, Sigma) производят ванадил-рибонуклеозидные комплексы. Это комплексы, образо-ванные ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеозидов, которые связываются со многими РНКазами и практически полностью их ингиби-руют. Однако они ингибируют трансляцию РНК в бесклеточной системе синтеза белка.

Рестриктазы

Рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) – это фермент бактери-ального происхождения, распознающий специфическую нуклеотидную по-следовательность длиной от 4 до 10 н.п. и разрезающий двунитевую моле-кулу ДНК в этом месте (сайте рестрикции).

В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в моле-куле ДНК различают 3 класса рестриктаз: часто-, средне– и редкощепящие. Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических мар-керов ДНК. Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиак-


8

риламидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная масса, а, значит, и физическое расстояние между сайтами.

Рестриктазы широко используются при определении первичной структуры ДНК, для картирования генов и в генетической инженерии для создания и клонирования гибридных молекул ДНК.

Гибридизационные методы

Гибридизационный анализ, или генное зондирование, – это направле-ние по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК.

В основе гибридизационных методов лежит способность нуклеино-вых кислот к гибридизации – образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов.

Зонд – меченая молекула ДНК (РНК), гибридизующаяся с изучаемым комплементарным участком геномной ДНК или РНК.

Выделяют 3 основных типа зондов:

а) фрагменты комплементарной ДНК (кДНК), входящие в состав плазмидного вектора или изолированные;

б) комплементарная РНК (кРНК), встроенная в плазмидный вектор, который содержит сайт инициации транскрипции, распознаваемый бакте-риальной РНК-полимеразой (обычно SP6);

в) синтетические некодирующие олигонуклеотиды, полученные с помощью автоматического ДНК-синтезатора.

Также в зависимости от используемой метки выделяют: 1) радиоизотопно меченые зонды. Традиционно для получения РНК– или ДНК-зондов используют ра-

диоактивно меченые с помощью 32Р, 35S, 125I, 3H нуклеотиды, которые после гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью выявляют методом авторадиографии. Преимущества: обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов. Недостатки: имеют малый период полураспада, требуют соблюдения строгих мер безопасности;

2) нерадиоактивно меченые зонды. В основе большинства методов нерадиактивного мечения лежат фер-

ментативные реакции с участием нуклеозид-трифосфатов, ковалентно свя-занных с молекулой-свидетелем, обычно биотином – витамином Н – или дигоксигенином. Использование в качестве метки дигоксигенина обеспечи-вает большую специфичность, т.к. биотин присутствует в большинстве тка-ней. Для их детекции используют гистохимические методы.

После гибридизации такие нерадиоактивно меченые зонды можно выявить: во-первых, с помощью неиммунологической системы детекции на основе авидина и стрептавидина (белков, имеющих высокое сродство к биотину) – аффинный метод – или, во-вторых, с помощью конъюгирован-


9

ных с флуоресцентным красителем или ферментом антител к зонду – имму-ноцитохимический метод.

Зонды можно метить и химическими методами, используя биотин, пришитый к высокоактивным молекулам (например, фотобиотин, биотин-гидразид, эфир биотина).

В качестве неизотопной метки можно использовать и другие соедине-ния, например, ртуть, ацетиламинофлуорен, динитрофенол и другие, но не все из них являются безопасными.

Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда-«молекулярного маяка» (рис. 1). Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. Средние 15 из них комплементарны ДНК-мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаим-но комплементарны и образуют шпильку. К 5'-концу присоединен флуорес-центный хромофор (флуорофор), а к 3'-концу – нефлуоресцентный хромо-фор (тушитель), на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуо-ресценция флуорофора тушится. Когда же 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуются с комплементарной последовательностью ДНК– или РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя, и зонд испускает свет. Температура реакционной смеси должна быть близка к комнатной, поскольку при ее повышении шпилька денатурирует, флуоро-фор и тушитель расходятся и происходит флуоресценция. Необходимо так-же, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарны соответствую-щей последовательности ДНК– или РНК-мишени.

Рис. 1. Зонд-«молекулярный маяк»


10

Кроме вышеописанных, в качестве нерадиоактивных меток могут вы-ступать вещества, рассеивающие электроны; бактериофаги; эритроциты; ме-таллы (коллоидное золото); флуоресцентные красители; хемилюминесцент-ные и биолюминесцентные вещества; липосомы; простетические группы и субстраты ферментов; модуляторы ферментов; а также сами ферменты.

Предложенная в начале 1970-х годов ферментная метка получила наиболее широкое применение.

Преимущества ферментной метки: 1) многократно усиливает сигнал (в присутствии одной молекулы

фермента за короткое время образуются миллионы и миллиарды молекул продукта реакции);

2) позволяет в некоторых случаях проводить анализ без разделения вошедших в комплекс и не связавшихся компонентов;

3) позволяет регулировать свою каталитическую активность. Перед проведением ферментативной реакции необходимо разделить

свободную и связанную фракции ферментной метки. Количество образо-вавшихся комплексов, а тем самым и содержание определяемой последова-тельности, оценивают по содержанию ферментной метки. Количество мет-ки определяют по ее каталитической активности.

В зависимости от типа регистрируемого сигнала в продуктах фер-мент-субстратной реакции все субстраты можно разделить на 4 группы.

1. Хромогенные субстраты, при использовании которых продукты ре-акции – хромофоры – поглощают свет в видимой области, то есть их рас-творы окрашены.

2. Пероксид водорода. При его каталитическом расщеплении образу-ется атомарный кислород, который окисляет присутствующий в растворе хромоген с образованием хромофора.

3. Флуоресцентные субстраты. В результате воздействия фермента из них образуются продукты, которые имеют свойство поглощать свет одной длины волны, а испускать – другой. Такое явление называется флуоресценцией.

4. Хемилюминесцентные субстраты, при использовании которых про-дукты реакции поглощают кванты света, переходят в возбужденное состоя-ние и затем испускают свет определенной длины волны, то есть их раство-ры светятся.

Наибольшее применение в качестве ферментной метки нашли 3 фер-мента: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-D-галактозидаза.

Различают 2 типа гибридизационного анализа: 1. Методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомо-

генные); 2. Методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носи-

теле (гетерогенные).


11

Метод гибридизации в растворе При гибридизации в растворе искомая НК и зонд свободно взаимо-

действуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса гибридизации. Детекцию результатов гибридизации в растворе осуществ-ляют путем нуклеазного гидролиза одноцепочечных ДНК и выделения ос-тавшихся двухцепочечных гибридов, содержащих меченый зонд.

Для успешного проведения реакции гибридизации в растворе необхо-димо применять одноцепочечные зонды, неспособные к самогибридизации. Метод хорош еще и тем, что требует минимальных объемов и количеств биологического и клинического образцов, поэтому может быть использован в диагностических целях. В то же время этот метод имеет один существен-ный недостаток – на его основе можно создать диагностические тест-системы для выявления специфических фрагментов небольших участков ДНК при условии достаточно высокой концентрации искомых фрагментов или участков в исследуемом образце. Это снижает порог чувствительности до уровня ИФА и даже ниже.

Метод гибридизации на твердом носителе

Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверх-ности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерный мембранный фильтр, например, нейлоновую мембрану.

Процедура гибридизации нуклеиновых кислот в общих чертах состо-ит в следующем:

1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре (обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 °С в вакууме).

2. Нанесение меченого одноцепочечного ДНК-зонда, который при оп-ределенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.

3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшегося мече-ного ДНК-зонда.

4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

Гибридизация in situ

Гибридизация in situ (ГИС; in situ hybridization, ISH) – это метод пря-мого выявления нуклеиновых кислот в клеточных структурах в условиях, позволяющих одновременно исследовать их морфологию.

Метод гибридизации in situ основан на способности хромосомной ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК(РНК)-зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.


12

Задача осложняется тем, что при проведении ГИС приходится иметь дело с самыми разными объектами – от индивидуальных хромосом в мета-фазных пластинках до архивных залитых в парафин биоптатов. Чувстви-тельность метода ГИС ограничена возможностью проникновения зондов внутрь клеток для связывания с искомой мишенью.

Выбор конкретной методики гибридизации, оптимальной для данного эксперимента, зависит от следующих факторов:

– природа НК-мишени (методики выявления ДНК и РНК с помощью ГИС различаются);

– чувствительность; – специфичность; – вопросы практического характера (стоимость, безопасность, нали-

чие оборудования и реактивов). С помощью ГИС можно исследовать срезы толщиной 3–10 мкм. Процедура ГИС может быть представлена в виде следующей схемы: 1) предварительная обработка срезов; 2) получение и мечение зонда; 3) денатурация ДНК-мишени и зонда; 4) гибридизация одноцепочечной ДНК-мишени с зондом; 5) отмывание; 6) детекция. Предварительная обработка срезов включает: – депарафинирование срезов тканей, залитых в парафин; – демаскирование НК-мишени (необходимо разрушить сшивки НК-

мишени с другими нуклеиновыми кислотами и белками, например, с помо-щью ограниченного протеолиза протеиназой К и пепсином-HCl);

– обработку РНКазой или ДНКазой; – предгибридизацию срезов (инкубирование в не содержащей зонда

гибридизационной смеси, проводится не всегда). Для денатурации используют химические (щелочная денатурация) и

физические (термоденатурация) факторы. Денатурацию обычно проводят в присутствии формамида (ослабляет внутримолекулярные водородные связи) и солей, что позволяет снизить температуру денатурации и гибридизации.

Для проведения гибридизации иногда достаточно просто снизить температуру смеси ниже температуры плавления гибрида зонд/мишень и в этих условиях выдержать образец в течение 2–16 ч. В целом же подбор ус-ловий для проведения гибридизации (температура, время) индивидуален для каждого отдельного случая.

Оптимальная температура ренатурации (или отжига) примерно на 25 °С ниже температуры плавления (Tm) гибридной молекулы. Tm двухце-почечной молекулы ДНК – это температура, при которой 50 % дуплексов денатурировано. Один из вариантов условий гибридизации (общепринятые


13

«жесткие» условия: 50 % формамид, 2 × ССР (стандартный солевой рас-твор), 42 °С) соответствует температуре гибридизации Tm – 12 °С. Жест-кость условий можно повысить, увеличив концентрацию формамида, сни-зив концентрацию солей и повысив температуру.

В зависимости от нуклеотидного состава и числа копий исследуемой последовательности ДНК, а также поставленных задач, может изменяться содержание формамида (от 0 до 60 %), концентрация солевых буферов (от 2 × до 0,1 × ССР), температурный режим (от 37 °С до 42 °С), время (2–16 ч.) проведения гибридизации.

Необходимым условием проведения гибридизации является то, что меченый зонд должен иметь подходящий размер и присутствовать в нуж-ной концентрации.

После гибридизации проводят отмывание образцов и детекцию гиб-ридизовавшегося зонда (метод детекции зависит от типа используемого зонда).

Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого сигнала, во всех случаях необходимо ставить адекватные контрольные опыты, как положи-тельные, так и отрицательные.

Частный случай ГИС – флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). В качестве зондов в данном случае используют последовательности, меченые флуорохромами, что сокращает проведение процедуры до 7–9 часов. Дан-ный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с изотопными вариантами гибридизации: большую разрешающую способность, быстроту и безопас-ность для здоровья исследователя.

Гибридные молекулы можно выявлять с помощью различных систем иммунохимической детекции, используя флуорохромы – детекторы разных цветов. Это делает возможным выявление одновременно нескольких после-довательностей ДНК в одной клетке. Существует множество вариантов флуоресцентной детекции, например, возможно «раскрасить» таким спосо-бом все хромосомы человека, каждую своим цветом.

Анализ препаратов после FISH проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором соответствующих светофильтров.

Блот-гибридизация

Блот-гибридизация (блоттинг) – метод идентификации макромолекул, разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на твердом матриксе, путем гибридизации содержимого образцов с мечеными комплементарны-ми зондами.

Виды блоттинга: 1) вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг) – идентификация искомого

белка путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом белковых мо-лекул с меченым антителом;


14

2) нозерн-блоттинг – идентификация искомой последовательности РНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом молекул мРНК с меченым комплементарным ДНК-зондом;

3) саузерн-блоттинг – идентификация участка ДНК, содержащего искомую нуклеотидную последовательность, путем гибридизации разде-ленных гель-электрофорезом фрагментов ДНК с меченым комплементар-ным ДНК-зондом.

Блот-гибридизация по Саузерну

Блот-гибридизация по Саузерну – это классический метод блот-гибридизации; назван по фамилии автора, предложившего его в 1975 г.

Первым этапом саузерн-блоттинга (рис. 2) является выделение сум-марной геномной ДНК. Затем геномная ДНК обрабатывается одной или не-сколькими рестрикционными эндонуклеазами, после чего образующиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном геле. Далее, после денатурации ДНК, проводится процедура блоттинга – переноса фрагментов ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр (это осуществляется за счет действия осмотических сил, вакуума или электрического поля), в результате чего на фильтре фиксируется точная реплика ДНК-рестрикта.

Денатурированные фрагменты ДНК гибридизуют с радиоактивно-меченым зондом – молекулой ДНК длиной несколько сотен нуклеотидов.

После отмывки фильтра и авторадиографии на рентгеновской пленке можно оценить точное положение и длину фрагментов ДНК, комплемен-тарных использованному зонду.

Рис. 2. Схема саузерн-блоттинга


15

Таким образом, блот-гибридизация позволяет идентифицировать спе-цифические последовательности нуклеотидов в общем наборе рестрикци-онных фрагментов геномной ДНК. При наличии макроперестроек ДНК, за-трагивающих исследуемый участок, набор или размер фрагментов, с кото-рыми гибридизуется меченая проба, будет отличаться от нормы.

Нозерн– и вестерн-блоттинг проводятся аналогичным образом. Метод блот-гибридизации обладает высокой чувствительностью, одна-

ко он является весьма трудоемким, предполагает использование радиоактив-ных зондов (хотя в последнее время нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра), предъявляет высокие требования к качеству анализируемой ДНК и требует для проведения больших количеств геномной ДНК (5–10 мкг). Тем не менее, во многих случа-ях он играет ведущую роль в прямой ДНК-диагностике, в том числе в сочета-нии с другими методами.

Метод сэндвич-гибридизации

Метод является одной из разновидностей зондовой технологии. При его использовании применяются два зонда, гомологичные различным уча-сткам искомой нуклеиновой кислоты. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмы-вают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который имеет определенную метку. Процесс гибридизации проводят повторно, и при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК). Дальнейший процесс детекции проводится стандартным мето-дом (ферментно-гибридизационным, авторадиографическим, флуоресцент-ным, хемилюминесцентным).

Например, если второй зонд был связан с биотином, то его выявление может быть проведено ферментно-гибридизационным методом. Для этого в систему добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бакте-риальный аналог авидина). После отмывания добавляют биотинилирован-ный фермент щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминес-центный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесцен-цию, сопровождающую превращение субстрата в продукт.

В качестве альтернативы после гибридизации ДНК со вторым, биоти-нилированным зондом можно добавлять уже готовый комплекс стрептави-дин-фермент, имеющий сайт связывания с биотином.

Как авидин, так и стрептавидин связываются с биотином очень проч-но (константа диссоциации (Кd = 10–15); кроме того, каждый из белков име-ет четыре независимых биотинсвязывающих сайта, благодаря чему одна молекула авидина или стрептавидина может одновременно присоединять фермент и зонд, меченные биотином. Биотинилирование и связывание со


16

стрептавидином не приводят к снижению ферментативной активности. В хромогенных системах детекции в том месте, где находится гибридная ДНК, под действием фермента образуется нерастворимый краситель, а в хемилюминесцентных системах – продукт, который испускает свет.

Метод разветвленной ДНК

Искомая НК связывается с улавливающим зондом, один конец которо-го комплементарен мишени, а другой – определенному концу усиливающего зонда. При этом усиливающий зонд может быть комплементарен следующе-му зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофорами, которые по мере увеличения количества связанных зондов усиливают (хеми-, флуоро-) люминесценцию. Преимуществом данного метода является возможность ис-пользования в одной реакции нескольких улавливающих и связывающихся с мишенью зондов, что обеспечивает выявление агентов, характеризующихся значительной геномной гетерогенностью, например, ВИЧ.

Методы амплификации нуклеиновых кислот

До изобретения методов амплификации нуклеиновых кислот для до-казательства наличия инфекционного возбудителя или идентификации ге-нетической мутации использовали гибридизационные методы. Однако ДНК-зондовая диагностика имеет существенные ограничения как по своей чувствительности, так и по трудоемкости и длительности: для ее осуществ-ления необходимо выделить ДНК из не менее чем 10 000 клеток, а сам про-цесс гибридизации не может быть полностью автоматизирован. Предвари-тельная быстрая амплификация in vitro позволяет детектировать единичные микробные или мутантные клетки и в большинстве случаев делает необяза-тельным применение для детекции ДНК-гибридизации.

Открытие Карри Мюллисом в 1983 году (США) метода полимеразной цепной реакции послужило толчком к активному развитию разнообразных технологий амплификации нуклеиновых кислот.

По сути, все методы амплификации имитируют природную возмож-ность репликации ДНК. При этом in vitro происходит изолированное умно-жение гена или его фрагментов (амплификация) в миллионы раз.

Все методы амплификации могут быть разделены в зависимости от изменения температурных режимов на:

1) методы амплификации с циклической сменой температурных па-раметров: методы ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР) и их модификации;

2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот: метод изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдержи-вающая репликация последовательностей (3SR, NASBA), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB-репликазы.

Все методы амплификации состоят из трех основных этапов:


17

1) Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК) из клеток;

2) Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) ДНК (РНК).

3) Детекция продуктов, полученных на втором этапе.

Полимеразная цепная реакция В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое ме-

сто. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на прин-ципиально иную высоту – уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР, теоретически, может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК.

Чрезвычайно важную роль играет этот метод в диагностике инфекци-онных заболеваний. Внедрение в практику этого метода наряду с серологи-ческой диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют мето-ды выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных пита-тельных средах или в культуре клеток.

В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффектив-ностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых ки-слот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специ-фической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического уча-стка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные ко-пии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значитель-но превосходит по диагностической эффективности культивирование и ме-тоды прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюо-ресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления C. trachomatis.

Принцип метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция – искусственный процесс многократно-го копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК,


18

осуществляемый in vitro (рис. 3). Копирование ДНК при ПЦР осуществля-ется специальным ферментом – ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Для начала синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе необходима РНК-затравка (праймер), к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфически-ми праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется спо-собностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и свя-зываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «огра-ничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противо-положными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количе-ства копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каж-дый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:

1) денатурации, или «плавления» ДНК, когда двухцепочечная ДНК под действием высокой температуры (92–95 °С) переходит в одноцепочеч-ное состояние;

2) связывания (отжига) праймеров с одноцепочечной матричной ДНК (температура 45–60 °С);

3) элонгации, или полимеризации, или удлинения цепи. При темпера-туре 65–72 °С происходит синтез комплементарной цепи на ДНК-матрице, начинающийся от места гибридизации праймера и происходящий в направ-лении 5’→3’.

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения темпе-ратуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с оп-ределенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих цик-лах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированны-ми в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле, то есть растет с числом циклов экспоненци-ально. Число указанных циклов в ПЦР составляет обычно от 25 до 40 (через n циклов будет 2n копий исходной молекулы ДНК-мишени).

В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, вы-держивающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термо-стабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойства-ми, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-ДНК-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений


19

ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.

Таким образом, ПЦР позволяет осуществлять амплификацию в про-бирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-ДНК-полимеразы) из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), являющих-ся структурными элементами ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20–30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3’-концевым последова-тельностям антипараллельных цепей ДНК гена.

Рис. 3. Механизм полимеразной цепной реакции Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на началь-

ном этапе (20–25 циклов), после чего начинается выход на плато (после 40–45 циклов) в силу: 1) истощения dNTP и праймеров, 2) нарастающего тем-пературного повреждения Taq-ДНК-полимеразы, 3) конкуренции за фер-мент амплификонов, когда их число начнет превышать число молекул Taq-ДНК-полимеразы. При содержании в ПЦР-пробирке около 10 молекул ДНК-матриц, как правило, достаточно 35 циклов.


20

Подготовка проб для ПЦР-амплификации ДНК-матрицы Благодаря пробоподготовке происходит концентрирование исследуе-

мой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-ДНК-полимеразы (например, гемоглобина). При отсутствии такой необходимо-сти подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менин-гитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В боль-шинстве же случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов тканей, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. При этом необ-ходимо учитывать, что содержание ДНК в геномах клеток человека, гриб-ков, бактерий и вирусов различается в десятки раз (например, содержание ДНК в геноме диплоидной клетки человека составляет примерно 7 × 10–12 г, а в геноме СМV (цитомегаловируса) – 0,25 × 10–15 г).

В последние годы ряд фирм производит наборы для быстрой экстрак-ции ДНК или РНК из различных материалов, подвергаемых анализу мето-дом ПЦР, обычно включающие специфические сорбенты НК. Общее коли-чество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать 1 мкг, поскольку большой избыток неспецифической ДНК снижает специфич-ность и чувствительность ПЦР-амплификации ДНК-матрицы.

Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна про-водиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.

Постановка ПЦР

Пятью основными компонентами (реактивами) ПЦР являются сле-дующие:

а) фермент Taq-ДНК-полимераза; б) пара олигонуклеотидных праймеров (смысловой и антисмысловой); в) 4 типа dNTP; г) копируемая ДНК; д) ионы Mg2+. Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и ми-

неральное масло. Фермент Taq-ДНК-полимераза, полученная из термостабильных ор-

ганизмов Thermus aquaticus, при оптимальных условиях ПЦР содержится в 50–100 мкл реакционной смеси в количестве 0,5–2 единицы. Она и синтези-рует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту до заданной длины в не-сколько сотен или тысяч пар нуклеотидов.

Праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), поэтому они в реакционной смеси ПЦР при-


21

сутствуют в избытке: концентрация их составляет 0,5–1,0 мкМ. Специфич-ность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они взаимодей-ствуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепо-чечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием ГЦ-пар. Как правило, праймеры для ПЦР-детекции инфекци-онных возбудителей создают на консервативные участки их ДНК, которые редко подвергаются генетическим перестройкам.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты: dATP, dTTP, dGTP, dCTP – в реакци-онной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях от 200 до 500 мкМ, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нук-леотидов в ПЦР.

Магний необходим для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы, но оптимальная его концентрация устанавливается путем тит-рования, поскольку концентрация свободных ионов магния зависит не только от добавленного его количества, но и от концентраций нуклеиновых кислот, праймеров и dNTP, которые связывают эти ионы. Средние величи-ны концентрации магния в ПЦР составляют около 2–3 мМ.

Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермен-та. Наиболее распространен трис-НСl-буфер, который удерживает рН во вре-мя ПЦР между 6,8 и 7,8, содержит желатин или бычий сывороточный альбу-мин и неионные детергенты для стабилизации фермента, а также 50 мМ KCl.

Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси в количестве 30–40 мкл для предотвращения испарения в процессе ПЦР.

Кроме этих компонентов, необходим образец ДНК исследуемой био-логической системы – положительный контроль.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимо-сти от концентрации и количества пяти основных компонентов реакцион-ной смеси и температурного режима ПЦР, в частности, от температуры от-жига праймеров (2-я стадия ПЦР).

Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации явля-ется приборное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР яв-ляется амплификатор (термоциклер), представляющий собой аппарат, в гнезда которого устанавливаются специальные амплификационные пробир-ки, изготовленные из особого термопроводимого пластика, с реакционной смесью или предметные стекла с образцами тканей.

Амплификаторы изменяют температуру автоматически на основе за-данной программы. В термоциклерах температура металлического блока, в который помещаются пробирки, изменяется с помощью элемента Пельтье. Элемент Пельтье позволяет изменять температуру блока с большой скоро-стью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР. Современные


22

термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостен-ных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции.

К настоящему времени выпущено много разнообразных моделей ам-плификаторов. Наиболее удобными являются приборы с несколькими платформами, каждая из которых может работать по отдельной программе, что дает возможность одновременно анализировать пробы на наличие не-скольких типов возбудителей или нескольких мутаций. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.

Также для проведения исследования методом ПЦР необходимы: 1) микроцентрифуга типа Эппендорф (10–12 тыс. об./мин); 2) камера для ЭФ в гелях; 3) УФ-трансиллюминатор; 4) встряхиватель пробирок типа Эп-пендорф; 5) микротермостат; 6) фотоаппарат; 7) ламинарный шкаф и т.д.

После подготовки реакционной смеси для ПЦР пробирки плотно за-крывают крышками и ставят в амплификатор, задают программу смены температурных режимов, соответствующую амплификации исследуемого участка ДНК. Каждый цикл амплификации включает 3 температурных ре-жима: денатурацию ДНК (92–95 °С) – примерно 1 мин., отжиг праймеров (45–60 °С) – 0,5–2 мин, синтез комплементарной цепи (65–72 °С) – 1–3 мин После прохождения необходимого количества циклов процесс останавли-вают. Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1–3 ч. При необходимости оставить пробы на ночь их помещают в холодильник при +4 °С или вводят дополнительный цикл на амплификаторе: +4 °С – 12 часов или более.

Детекция продуктов амплификации Детекция методом гель-электрофореза

Выявление, или детекцию, наработанного продукта ПЦР (амплифика-

та) чаще всего проводят при помощи его электрофореза в 2–3%-м геле агаро-зы или полиакриламидном геле, содержащем бромид этидия (специфический флуоресцентный ДНК и РНК-краситель). Поглощая УФ-свет с максимальной длиной волны 256 нм, бромид этидия, связанный с участком ДНК, способен флуоресцировать, что регистрируется в видимом спектре (610–620 нм) в виде оранжевой полоски. Получаемые результаты элекрофореза амплификонов оценивают в проходящем УФ-свете на специальных приборах – трансиллю-минаторах – и сравнивают с положительным контролем (ДНК выявляемого микроорганизма или известная ДНК). При положительном результате светя-щаяся полоска ДНК находится на том же уровне, что и положительный кон-троль вследствие одинаковой молекулярной массы наработанных амплифи-конов в контроле и изучаемом положительном образце. В отрицательном


23

контроле должны отсутствовать компактные светящиеся полоски ДНК. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.

Детекция гибридизационно-ферментативным методом

с измерением интенсивности окраски образовавшегося продукта колориметрическим, флуоресцентным или хемилюминесцентным методами

Другим способом качественной и количественной оценки ПЦР явля-

ется ферментно-гибридизационный метод. Для его проведения на твердом носителе иммобилизуют ДНК-зонд, с которым в результате гибридизации взаимодействует продукт амплификации. В дальнейшем в результате аф-финного взаимодействия происходит связывание биотина и авидина с обра-зованием биотин-авидинового комплекса. При этом меченый пероксидазой авидин выявляется ферментной реакцией с субстратом и дальнейшей реги-страцией оптической плотности. В случаях, если вместо пероксидазы в ави-дин встроено флуоресцентное вещество, детекция должна осуществляться с использованием флуоресцентной техники. Возможны варианты, когда в авидиновый комплекс встраивается рутений или другие вещества, способ-ные к хемилюминесценции, и тогда оценка результатов проводится с ис-пользованием метода хемилюминесценции.

Использование одного или нескольких внутренних стандартов с из-вестным количеством копий позволяет рассчитать содержание возбудителя в исследуемой пробе.

Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности автоматизации для анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все бо-лее распространенным. В некоторых случаях применение специальных флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение ам-плификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредствен-но в реакционной пробирке.

Перспективной в настоящее время видится разработка для детекции продуктов амплификации методов лантаноидного иммунофлуоресцентного анализа. Данный метод основан на использовании в качестве метки положи-тельно заряженных ионов редкоземельных элементов – европия, самария, тербия и прозеодима, являющихся флуорохромами, причем их атомы спо-собны существовать в возбужденном состоянии продолжительное время.

Весьма перспективной является также детекция продуктов амплифика-ции с использованием флуоресцирующих моноклональных антител к специ-фическим амплификонам (цепочкам ДНК), характеризующим тот или иной геном возбудителя или участок гена с определенными искомыми свойствами (генные мутации, наследственные и онкологические заболевания и т.д.).


24

Модификации ПЦР ПЦР в реальном времени

Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реаль-

ном времени является возможность детекции накопления продуктов ампли-фикации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кине-тика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК. В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПЦР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероят-ности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории.

Один из методов количественной ПЦР в режиме реального времени базируется на использовании ДНК-зонда, комплементарного амплифици-руемой последовательности и меченного двумя флуоресцентными метками, одна из которых в исходном состоянии «поглощает» спектр флуоресценции другой. Далее в каждом цикле ПЦР (а именно, в фазе синтеза) за счет 5’-нуклеазной активности ДНК-полимеразы используемый зонд расщепляется и высвобождает 5’-метку, нарастание флуоресценции которой после возбу-ждения лазерным лучом регистрируется в реальном режиме времени и от-ражает нарастание числа молекул ПЦР-продукта (рис. 4).

Рис. 4. Количественная ПЦР в реальном режиме времени при детекции с помощью выщепления 5' концевой метки (TaqMan Assay)


25

Рис. 5. Количественная ПЦР в реальном режиме времени при детекции с использованием интеркалирующих агентов

Другой вариант ПЦР в реальном времени основан на использовании

интеркалирующих агентов: флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные моле-кулы ДНК (рис. 5). Таким образом, можно наблюдать за накоплением про-дуктов амплификации.

Рис. 6. Кривые плавления продуктов амплификации

Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть

связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифиче-


26

ского (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых «кривых плавления» (melting curves). Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно изме-ряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается (рис. 6).

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри об-ластей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в гра-фике кривой плавления. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с про-бирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и форма-лизована.

Подводя итоги, стоит отметить следующее: использование ДНК-зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов от-носится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, прайме-ров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы ко-торых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркали-рующих агентов весьма привлекательным.

Гнездная ПЦР

Разработана в целях повышения чувствительности и специфичности и проводится в 2 этапа. На первом этапе осуществляется амплификация опре-деленного гена искомой ДНК с «внешними» праймерами: проводится от 30 до 35 циклов. После этого часть амплификата (аликвоту) помещают во вто-рую пробирку с ПЦР-смесью и проводят 30–35 циклов амплификации с так называемыми «внутренними» праймерами (участки нуклеотидных последо-вательностей, отстоящие от внешних праймеров на их длину). Получаемый продукт отличается высокой специфичностью и в дальнейшем подвергается детекции.


27

Обратно-транскрипционная ПЦР Методика позволяет осуществлять ПЦР с РНК-содержащими возбу-

дителями, считывая информацию с РНК и создавая подобную ей ДНК. Вы-полнение данного процесса возможно при использовании специальных ферментов, обладающих обратно-транскрипционными свойствами и дезок-синуклеотидфосфатов. При помощи фермента обратной транкриптазы или ревертазы и одного цикла амплификации по специальной программе (+42 °С – 30 мин, +99 °С – 5 мин, охлаждение до +4 °С) осуществляется об-ратная транскрипция РНК: одна нить РНК превращается в двойную ком-плементарную ДНК, а дальше ДНК может быть амплифицирована «класси-ческой» или «гнездной» ПЦР.

ПЦР in situ (PRINS – polymerase reaction in situ)

Метод сравнительно недавно предложен для практики, аналогичен методу ГИС и позволяет проводить ПЦР на срезе или в мазке. Метод хоро-шо себя зарекомендовал и используется, в частности, в онкологии.

В данном методе отсутствует пробоподготовка. При этом использует-ся та же ПЦР-смесь, что и в «классическом» методе, однако сама реакция проходит на поверхности среза. Для проведения данной методики требуется специальный амплификатор, в котором изменяется температура воздушных потоков, создаваемых в микроколориметре, куда устанавливаются предмет-ные стекла со срезами и реакционной смесью. Детекцию результатов про-водят с использованием ферментативно-гибридизационного метода с визу-альной оценкой полученных результатов в обычном световом микроскопе.

Данный метод позволяет определить: 1) типы клеток, в которых произошли изменения; 2) распределение измененных клеток в ткани, т.е. оценить степень

повреждения; 3) провести сравнение с результатами гистологических и цитохими-

ческих исследований в адекватных условиях.

Мультиплексная ПЦР (multi-PCR, multiplex PCR) Методика позволяет проводить ПЦР с двумя-четырьмя и более не пе-

рекрещивающимися праймерами нескольких возбудителей. Мультиплекс-ная ПЦР позволяет определить в одной пробе нуклеиновые кислоты сразу нескольких возбудителей, что особенно актуально, т.к. часто при диагно-стике обнаруживаются смешанные формы инфицирования.

Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (Chlamidia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или даже четырех возбудителей (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis и Alloiococcus otitidis при хроническом гнойном отите).


28

Метод используется также часто для выявления нескольких экзонов исследуемого гена. Например, для быстрой диагностики носительства деле-ций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшенна и Бекера проводится одновременная амплификация набора наи-более часто мутирующих экзонов данного гена.

Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагмен-ты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксоно-мической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с по-мощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систе-матических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне по-рядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего яв-ляются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную струк-туру у различных прокариотических микроорганизмов.

Использование праймеров, комплементарных консервативным участ-кам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бак-терий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных мето-дов с целью идентификации бактерий, которым они принадлежат. Наиболее точным методом «молекулярной» идентификации является определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифициро-ванной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями из-вестных видов.

Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих описанный принцип идентификации, на практике обычно используются ме-нее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые, тем не менее, позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ (RFLP) – полиморфизм длины рестрикцион-ных фрагментов, или на определении электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP – анализ конформационного по-лиморфизма одноцепочечной ДНК).

ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредст-венно в клинических образцах. Следует однако отметить, что чувствитель-ность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видос-пецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплифи-кации ДНК разных видов.


29

Методы предотвращения контаминации. Устройство ПЦР-лаборатории

Потенциально высокая чувствительность ПЦР делает совершенно не-обходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связа-но с наиболее острой проблемой метода – контаминацией.

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты.

Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе электрофореза из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе про-боподготовки.

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлени-ем. Одним из них является использование фермента N-урацилгликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с исполь-зованием смеси dNTP, в которой dTTР заменен на dUTP, и после проведе-ния ПЦР все образующиеся в пробирке амплификоны будут содержать ура-цил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попав-шие в реакционную смесь амплификоны будут разрушены, тогда как на-тивная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Другим способом инактивации амплификонов служит фотохимиче-ское воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением УФ-светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации.

Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идет со 100%-й эффективностью и, соответственно, после инактивации продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фраг-мента хотя бы несколько останутся целыми. Кроме того, всегда остается риск кросс-контаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки.

Даже при таком способе, как значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25–30 циклов), риск получения ложноположительных результатов велик.

Таким образом, наиболее радикальным средством является заранее продуманная организация лаборатории. Для уверенности в отсутствии кон-таминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отри-цательными контролями. Все реактивы рекомендуется хранить разлитыми на отдельные порции (аликвоты).

Если все же, несмотря на принятые меры, обнаружены следы конта-минации, то необходимо все поверхности помещения, оборудования, пипе-


30

ток и прочее обработать 0,1 М HCl, а все используемые порции реактивов следует заменить на новые.

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на 3 зоны – по числу техно-логических операций:

1) зона подготовки реакционной смеси («чистая зона»); 2) зона пробоподготовки; 3) электрофоретическая комната. [Стрелками показаны возможные направления перемещения по зонам

ПЦР-лаборатории]. Все 3 зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными

предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха. Если первую и вторую зоны, в крайнем случае, допускается объеди-

нить (при наличии специальных боксов), то комната для электрофореза должна размещаться как можно дальше от двух других зон (другой этаж, другое здание) и иметь не связанную с другими зонами систему вентиля-ции. Это является одним из наиболее важных требований при организации ПЦР-лаборатории.

Кроме того, желательно предусмотреть отдельные помещения для пе-реодевания и хранения верхней одежды, приема пища, складское помеще-ние для лабораторных материалов. Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми УФ-лампами.

Инактивацию биологического материала проводят в автоклаве в тече-ние 1 часа при 1,5 атмосферах.

Преимущества ПЦР как метода диагностики и его применение Отмечают следующие преимущества ПЦР перед другими методами

клинической лабораторной диагностики: 1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать

любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сде-лать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молеку-лярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обу-славливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

2. Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловле-на тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбу-дителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность из-бежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Чувствительность. Возможность проведения не только качествен-ной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих ам-


31

плификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.

4. Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

5. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики. ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инку-бационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксиро-ванном) материале или биологических остатках, что важно для идентифи-кации личности или отцовства.

6. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

7. Возможность одновременной диагностики нескольких возбуди-телей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

8. Возможность экспертизы. Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства, метод ПЦР все же не ли-шен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке резуль-татов исследований. В настоящее время выделяют следующие две группы.

Первая – технологическая, подразумевающая под собой высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных ре-зультатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответст-вующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборато-рии. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР, государственный сертификат.

Вторая – клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогности-ческой оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачас-тую является необоснованным аргументом практических врачей для сомне-ния в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40–60 % лиц с обнаруженной в крови ме-тодом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболева-ние. В данной ситуации при оценке результатов исследования совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий – «инфицированность» и «инфекционная болезнь».

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в непра-вильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при


32

обследовании пациента и неверной клинической интерпретации получен-ных результатов.

Возможности применения метода ПЦР

в лабораторной диагностике

Наиболее эффективно и обоснованно использование метода ПЦР ДНК:

– в урологической и гинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазмен-ной инфекции, ВПЧ – вируса папилломы человека;

– в пульмонологии – для дифферециальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза;

– в гастроэнтерологии – для выявления геликобактериоза; – в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода

диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов B, C, G. – в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, он-

ковирусов, ВИЧ.

Лигазная цепная реакция Метод впервые описан в 1989 г. ЛЦР – это метод амплификации,

включающий последовательные циклы лигирования (соединения) четырех олигонуклеотидных праймеров, комплементарных цепям ДНК-матрицы. В нем используется способность ДНК-лигазы соединять 2 пары комплемен-тарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями мишени in vitro.

Основными компонентами ЛЦР являются: лигаза, 2 или 4 специфиче-ских праймера и буфер для цепной реакции.

Линейная амплификация специфических праймеров происходит при лигировании одной пары олигонуклеотидов. При использовании двух пар олигонуклеотидов, одна из которых комплементарна верхней цепи ДНК-матрицы, а вторая – нижней, достигается экспоненциальная амплификация. На первом этапе происходит гибридизация двух пар олигонуклеотидных праймеров с ДНК-матрицей при температуре +65 °С. Затем происходит ли-гирование олигонуклеотидов в месте их соединения с образованием более длинного продукта, связанного с матрицей. Специфичность реакции обеспе-чивается тем, что любое нарушение гомологии в области стыка двух олиго-нуклеотидов сразу же предотвращает их лигирование. На втором этапе реак-ционную смесь нагревают до +94 °С. При этом происходит денатурация и отделение лигированного продукта от матрицы. При последующем охлажде-нии до +65 °С процессы гибридизации и лигирования повторяются. Вновь образованные продукты лигирования выступают в качестве матриц в после-


33

дующих циклах реакции. В ходе ЛЦР происходит экспоненциальное увели-чение количества исходных продуктов лигирования. Выявление продуктов амплификации можно проводить с использованием ферментных меток.

Молекулярная диагностика генных болезней

К настоящему времени на хромосомах человека картировано около 1500 генов, мутации которых приводят к различным наследственным забо-леваниям. Молекулярная клиническая диагностика генных заболеваний да-ет ответ на вопрос, входят ли обследуемые индивидуумы или их потомки в группу повышенного генетического риска. ДНК-анализ можно использо-вать для выявления носителей генов наследственных заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики генетических нару-шений. Раньше применялись биохимические методы, основанные на выяв-лении продукта анализируемого гена. Решающим преимуществом молеку-лярной диагностики является то, что объектом исследования является непо-средственно молекула ДНК больного. ДНК-тесты не требуют экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать системы скрининга для всех заболеваний. Для молекулярной клинической диагно-стики генных болезней можно использовать, например, методы блот-гибридизации по Саузерну, ПЦР и другие.

Методы первичной идентификации мутаций

Наиболее точная информация о природе мутаций может быть получе-на с помощью метода ДНК-секвенирования, позволяющего определить пер-вичную последовательность нуклеотидов в определенном фрагменте ДНК. Однако, ввиду сравнительно крупных размеров генов и отсутствия автома-тических ДНК-секвенаторов во многих диагностических лабораториях, к методу секвенирования обычно приступают уже после того, как с помощью других методов обнаружено наличие мутации в определенном фрагменте гена, и остается только выяснить ее нуклеотидную природу. Поэтому ска-нирование мутаций обычно начинают с использования методических прие-мов, позволяющих улавливать нуклеотидные замены сразу в достаточно протяженных участках ДНК. К таким приемам относят: метод анализа кон-формационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP), метод электро-фореза в денатурирующем геле (DGGE), метод химического расщепления некомплементарных сайтов (СМС), метод гетеродуплексного анализа (НА).

Секвенирование ДНК

Существует 2 основных метода секвенирования: химический – метод Максама–Гильберта и дидезоксисеквенирование – метод Сэнджера. В пер-вом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основа-


34

нию, во втором – синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически ос-танавливая синтез на заданном основании (рис. 7).

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежен и прост в исполнении. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер – искусственно синтезированную олигонуклеотидную последова-тельность, комплементарную определенному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гибридизации праймера, то есть для образова-ния двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реак-ционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты – dATP, dCTP, dGTP и dTTР, один из которых является радиоактивным. Синтез ве-дут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидтрифосфатов, или терминато-ров синтеза – ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTР (ddNTP).

Рис. 7. Секвенирование ДНК по методу Сэнджера


35

При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида син-тез ДНК прекращается. Таким образом, в каждой из пробирок получают на-бор различающихся по длине радиоактивно меченных фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-ром на конце молекулы. После одновременного электрофоретического раз-деления этих фрагментов на четырех соседних дорожках и авторадиогра-фии размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит, и определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствую-щих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК. На каждом секвенирую-щем геле может быть определена первичная последовательность всего око-ло 500 пар оснований.

Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой

ДНК (Single Strand Conformation Polymorphism – SSCP) Метод предложен M. Orita в 1989 г., основан на регистрации различий

в электрофоретической подвижности одинаковых по величине, но разли-чающихся по пространственной организации (вследствие нуклеотидных за-мен) однонитевых фрагментов ДНК.

Рис. 8. SSCP-анализ (общий принцип) Скручивание (конформация) небольших однонитевых участков ДНК

существенно зависит от их нуклеотидной последовательности, так что за-


36

мена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к изменению их пространственной структуры (рис. 8). Метод включает ам-плификацию специфических сегментов ДНК размером от 50 до 300 п.о., обычно в присутствии меченых динуклеотидтрифосфатов, денатурацию об-разовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий ЭФ в ПА-АГ. Иногда амплификацию проводят без использования метки, но тогда для выявления ДНК на электрофореграммах используют более чувствительные по сравнению с окраской бромидом этидия методы, например, окраску азотнокислым серебром. На конформацию оказывают влияние различные внешние факторы – температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов. Оптимальный подбор этих парамет-ров позволяет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся по длине всего на один нуклеотид.

Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза

(Denaturation Gradient Gel Electrophoresis – DGGE) Метод основан на различиях электрофоретической подвижности нор-

мальных и мутантных амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК при ЭФ в денатурирующем геле. Денатурация может происходить за счет разницы температур, различной концентрации мочевины или формальдеги-да. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Объясняется это тем, что G-C связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А-Т. Кроме того, наличие участка негомо-логичного спаривания значительно облегчает денатурацию ДНК. Разрабо-тан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плав-ления в зависимости от нуклеотидной последовательности ДНК. При элек-трофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с ли-нейно возрастающим градиентом концентрации денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной после-довательности области, эквивалентной температуре плавления – Тm, т.е. та-кой температуре, при которой каждая пара оснований с 50%-й вероятно-стью может соединиться или разойтись. После начала плавления ДНК про-движение ее фрагментов в геле резко замедляется до тех пор, пока не на-ступит полная денатурация молекул. В результате будет происходить раз-деление фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Ме-тод очень чувствителен и, в отличие от SSCP, применим для более крупных амплифицированных фрагментов ДНК. Метод может быть с успехом при-менен для анализа индуцированных мутаций, т.к. позволяет улавливать му-тации даже в 1 из 100 клеток, обработанных мутагеном.

К недостаткам метода следует отнести технические сложности, свя-занные с трудностями получения хорошего градиента денатурирующего


37

агента в ПААГ. Это требует специального технического оснащения. Дру-гим недостатком метода является сложность детекции мутаций, располо-женных на концах амплифицированных фрагментов. Связано это с тем, что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денатурация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления. По-этому мутации, локализованные недалеко от границ амплифицированного участка ДНК, оказывают меньшее влияние на процесс плавления и за счет этого могут не выявляться. Во избежание этого к концам исследуемой ам-плифицированной геномной ДНК пришивают GC-последовательности раз-мером в несколько десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие участки выполняют роль своеобразных зажимов на концах молекул, и шан-сы обнаружения мутаций выравниваются, независимо от их локализации внутри амплифицированного фрагмента.

Метод гетеродуплексного анализа (Heteroduplex analysis – HA) Принцип метода – возникновение (образование) гетеродуплексов ме-

жду нормальной и несущей точковую мутацию цепочками ДНК в образце гетерозиготной по данной мутации особи. Такие гетеродуплексные двухце-почечные ДНК благодаря конформационным особенностям в местах несов-падения нуклеотидов имеют иную электрофоретическую подвижность, чем соответствующие гомодуплексы. Хотя эти различия могут быть обнаруже-ны при электрофорезе в обычном ПААГ, значительно более эффективное разделение гомо– и гетеродуплексов может быть достигнуто при использо-вании новых вариантов гелей – Hydrolink либо MDE. Детекция мутаций осуществляется как изотопным, так и неизотопными методами.

Метод химического расщепления мест (нуклеотидного) несоответствия (Сhemical Mismatch Cleavage – СМС)

Метод основан на свойствах некоторых химических агентов специфи-чески разрывать нить ДНК в месте нарушения гомологичного спаривания в результате несоответствия пар оснований вследствие точечных мутаций, т.е. в местах возникновения гетеродуплексов. С этой целью амплифицированную нормальную последовательность ДНК смешивают с избытком аналогичной тестируемой ДНК или РНК, проводят денатурацию (отжиг), после чего нор-мальная и тестируемая ДНК ренатурирует с образованием гетеродуплексов, которые подвергаются химическому расщеплению. Цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин – к тетраоксиду осмия. Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в мо-дифицированном сайте. Выявление мутаций осуществляют с помощью ме-ченых ДНК-зондов, соответствующих, как правило, нормальной последова-тельности ДНК. Такими зондами могут служить синтезированные олигонук-леотиды, клонированные последовательности ДНК или амплифицированные


38

фрагменты. После обработки соответствующими химическим агентами идентификация и локализация мутантных сайтов в тестируемом фрагменте ДНК проводится с помощью электрофореза. Современные модификации ме-тода позволяют идентифицировать до 95–100 % мутаций.

Большими преимуществами этого метода являются: 1) возможность исследовать протяженные участки ДНК – до 2 тыс. п.о., 2) способность од-новременно выявить и локализовать несколько мутаций в тестируемом фрагменте ДНК и 3) возможность одновременного использования несколь-ких ДНК-зондов для поиска мутаций – мультиплексный вариант методики.

К числу недостатков можно отнести высокую токсичность исполь-зуемых химических реактивов. Последняя может быть частично ослаблена использованием карбодимида для идентификации GT-гетеродуплексов.

Все рассмотренные выше методы детекции мутаций предполагают в качестве обязательного последующего этапа секвенирование содержащих изменения сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных замен, оценки их фенотипического проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому рассмотренные методы редко используются в практической диагностике и при популяционном скрининге гетерозигот.

Молекулярное сканирование известных мутаций

Детекцию уже известных мутаций можно проводить более простыми способами, не требующими последующего секвенирования.

Амплификация – рестрикция

Мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного ЭФ в ПАА или агарозном гелях.

Наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз, что легко выявляется по изменению длины амплифицированно-го фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой. По-этому сразу после идентификации мутации проводится компьютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализации замены основания.

Расщепление амплифицированных ДНК-фрагментов проводится по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем рестриктаз, в буфере, прилагаемом к ферменту.

Данный метод применяют, например, для диагностики серповиднок-леточной анемии.

Серповидноклеточная анемия – это генетическое заболевание, обу-словленное заменой одного из нуклеотидов в кодоне, который соответству-ет шестой аминокислоте в β-цепи молекулы гемоглобина. У индивидов, го-мозиготных по мутантному гену (S/S), эритроциты имеют необычную сер-повидную форму; это связано с искажение конформации молекулы гемо-


39

глобина вследствие замены в ней валина на глутаминовую кислоту. Му-тантный гемоглобин не может с достаточной эффективностью переносить кислород, и у таких больных развивается тяжелая анемия с прогрессирую-щим поражением сердца, легких, мозга, суставов и других органов. У инди-видов, гетерозиготных по данному гену (A/S) (носителей генетического за-болевания), эритроциты имеют нормальную форму, и симптомы заболева-ния проявляются лишь в экстремальных условиях (на большой высоте над уровнем моря либо при слишком высоких или низких температурах, когда снижается снабжение организма кислородом). Если оба родителя гетерози-готны (имеют генотип A/S), то вероятность того, что их ребенок будет го-мозиготным по мутантному гену (S/S) (т. е. будет болен серповидноклеточ-ной анемией), составляет 25 %.

Замена одного нуклеотида в β-глобиновом гене, приводящая к серпо-видноклеточной анемии, сопровождается элиминацией сайта для рестрици-рующей эндонуклеазы Cvn1. Этот фермент узнает последовательность CCTNAGG и расщепляет молекулу ДНК между основаниями С и Т (N – любой из четырех нуклеотидов). В нормальном гене эта последователь-ность имеет вид CCTGAGG, а в гене серповидноклеточной анемии – ССТGTGG. На этом различии основывается ДНК-диагностика данного за-болевания. Используя праймеры, фланкирующие сайт Cvn1, амплифициру-ют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК. Амплифици-рованный фрагмент обрабатывают Cvn1, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивают их бромистым этидием. При наличии Cvn1-сайта на электрофореграмме появляется специфический на-бор полос, отличный от такового в отсутствие Cvn1-сайта. Описанным спо-собом можно быстро установить генетический статус обследуемого, не проводя при этом процедуру гибридизации.

ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез

Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разра-ботана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутант-ных аллелях – метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза.

Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3’-конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутант-ному сайту. Именно этот праймер не полностью комплементарен матрич-ной ДНК. В нем изменяют один из нуклеотидов с 3’-конца так, чтобы в со-четании с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из известных нуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геном-ной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофо-реграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у ге-


40

терозигот появятся два дополнительных фрагмента, соответствующим по длине рестрицированным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два рестрицированных фрагмента.

Обнаружение мутаций в разных сайтах одного гена

Далеко не все генетические заболевания обусловливаются одним из-менением в гене. В большинстве случаев мутации могут возникать в разных сайтах в пределах одного гена, но приводят к одному генетическому заболе-ванию. В качестве примера можно привести β-талассемию – наследственное заболевание, связанное с утратой активности β-глобина. У гетерозиготных носителей при этом наблюдается небольшая анемия. Индивиды же, гомози-готные по одному из как минимум восьми возможных мутантных сайтов, для поддержания жизни нуждаются в регулярном переливании крови и другом лечении. Поскольку мутация в любом из восьми специфических сайтов β-глобинового гена может приводить к β-талассемии, необходимо провести по крайней мере восемь разных тестов. Такая диагностика возможна, хотя доро-гостоящая. Поэтому для скрининга мутаций в разных сайтах одного гена бы-ла разработана стратегия ПЦР/гибридизация, основанная на проведении од-ной реакции. Для этого синтезируют набор специфических 20-нуклеотидных зондов, каждый из которых полностью комплементарен фрагменту гена-мишени, несущему известную мутацию. К 3'-концу каждого присоединен гомополимер poly(dT) длиной примерно 400 нуклеотидов, с помощью кото-рого ДНК-зонд связывается с заранее отмеченной точкой на найлоновом фильтре, а остальная его часть остается свободной и может гибридизоваться. Сегменты тестируемой ДНК, каждый из которых включает по одному из возможных мутационных сайтов, одновременно амплифицируют с помощью ПЦР, причем один праймер из каждой пары на 5'-конце помечен биотином. Амплифицированные фрагменты ДНK-мишени гибридизуют с зондами, пришитыми к фильтру, в условиях, обеспечивающих гибридизацию только полностью комплементарных последовательностей. В гибридизационную смесь добавляют стрептавидин, связанный с щелочной фосфатазой (можно использовать пероксидазу хрена или уреазу). После гибридизации промыва-ют фильтр и добавляют неокрашенный субстрат. Если имеет место полное соответствие между амплифицированным сегментом ДНК-мишени и специ-фическим зондом, то на фильтре появится цветная точка. На один и тот же фильтр можно нанести несколько точек, соответствующих целому ряду раз-ных специфических зондов. Проанализировав эту цветную мозаику, можно идентифицировать один из возможных сайтов мутации.

Метод ПЦР/ЛОЗ

Не все генетические нарушения, приводящие к появлению дефектных генов, сопровождаются утратой или изменением сайтов рестрикции, поэто-


41

му для обнаружения однонуклеотидных замен применяют и другие подхо-ды. В одном из них объединены ПЦР и метод, основанный на лигировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), – ПЦР/ЛОЗ.

Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А-Т, а в том же сайте мутантного гена – G-C. Зная нуклеотидные последовательности, фланкирующие 106-й нук-леотид, можно синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента, прилегающих к данному сайту и комплементарных противоположным це-пям. Основная особенность этой пары олигонуклеотидов состоит в том, что 3'-концевой нуклеотид одного из них (зонд X) комплементарен основанию, находящемуся в 106-м положении нормальной последовательности, а 5'-концевой нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду, примы-кающему к 106-му нуклеотиду. При отжиге этих зондов с содержащей нор-мальную последовательность ДНК-мишенью (амплифицированной мето-дом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакци-онную смесь ДНК-лигазы зонды Х и Y ковалентно сшиваются. Если же эти зонды отжигаются с мутантной ДНК, в которой произошла замена 106-го нуклеотида, то некомплементарный ему 3'-концевой нуклеотид зонда Х не может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему гибридизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды Х и Y. Можно синтезиро-вать и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие по-следовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зон-дов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае отжига с нормальной мишенью. Таким обра-зом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигирование зондов и отсут-ствие его.

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5'-конец зонда Х ме-тят биотином, а 3'-конец зонда Y – дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибри-дизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в пластиковую лунку, покры-тую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания (удаления несвязанного конъюгата) добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т.е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, зна-чит, лигирования не было.

Располагая двумя парами зондов, можно установить генетический ста-тус любого человека. Например, ДНК гетерозиготных носителей дает поло-


42

жительный ответ с обеими парами зондов; ДНК лиц, обладающих двумя ко-пиями нормального гена, – только с тем набором зондов, который содержит нуклеотид, комплементарный нормальному сайту; и, наконец, ДНК индиви-дов с двумя измененными копиями гена – только с набором зондов, детекти-рующим мутантный сайт. Чтобы минимизировать необходимое для анализа количество исходной ДНК, перед гибридизацией участок ДНК-мишени, со-держащий тестируемый сайт, амплифицируют с помощью ПЦР. ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом. Все стадии роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов в день.

Использование ДНК-биочипов

Этот метод является одним из наиболее перспективных в современ-ной молекулярной биологии (рис. 9). ДНК-микрочип (олигонуклеотидный микрочип) представляет собой миниатюрную пластину-матрицу, в ячейки которой с помощью специальных автоматизированных микрометодов нане-сен упорядоченный набор из десятков, сотен и даже тысяч иммобилизован-ных олигонуклеотидов.

Рис. 9. Технология ДНК-биочипов (общий принцип)


43

Данные олигонуклеотиды специфически гибридизуются с разнообраз-ными флюорохромно-меченными молекулами ДНК (например, продуктами амплификации исследуемых генов или молекулами кДНК – продуктами об-ратной транскрипции тканевых РНК), после чего образовавшиеся дуплексы облучаются лазером, а результат флюоресценции фиксируется с помощью сканирующего конфокального микроскопа и анализируется с использовани-ем соответствующего компьютерного программного обеспечения.

В формате биочипов могут быть реализованы многие из таких методов анализа нуклеотидных последовательностей, как автоматическое секвениро-вание, «минисеквенирование» и др. Последние достижения в данной области связаны с применением фотолитографических и полупроводниковых техно-логий, позволяющих упорядоченно фиксировать на микрочипе до 400 000 и более олигонуклеотидов (каждый – на участке площадью около 20 микрон!), а также с разработкой методов синтеза олигонуклеотидов in situ, основанных на доставке необходимых реагентов в нужные сайты микрочипа с помощью устройств, действующих по принципу струйного принтера.

Применение на практике технологии ДНК-биочипов принципиально позволяет проводить автоматизированный и эффективный анализ большого числа известных мутаций и полиморфизмов, осуществлять быстрое секве-нирование крупных фрагментов ДНК, а также одномоментно анализировать экспрессию большого числа генов изучаемой ткани в заданный интервал времени, что сулит поистине уникальные возможности в изучении основ функционирования генома.


44

БИОИНФОРМАТИКА Под биоинформатикой обычно понимают использование компьюте-

ров для решения биологических задач. Биоинформатика оформилась как самостоятельная дисциплина в на-

чале 80-х годов XX века. Поводом к возникновению этой области науки по-служило открытие эффективного метода определения нуклеотидных после-довательностей. В1978–80 гг. были определены несколько полных последо-вательностей размером около 4 тыс. оснований (букв) – плазмиды pBR322, вируса саркомы зеленой мартышки SV40, бактериофага ФХ-174. Стало яс-но, что последовательности длиной в несколько тыс. оснований не могут быть проанализированы вручную. Появилась необходимость в компьютер-ных методах обработки таких массивов информации. Задачи, которые тогда стояли часто были очень простыми – найти открытую рамку, сайты рест-рикции, сходство двух последовательностей, оттранслировать нуклеотид-ную последовательность в белок. Этот круг задач определялся потребно-стями экспериментаторов. Хотя уже в то время стали формулироваться и более сложные задачи, некоторые из них до сих пор нельзя считать оконча-тельно решенными, – поиск генов, физическое картирование, поиск сигна-лов в последовательностях, предсказание вторичной структуры РНК. Био-информатика оформилась как самостоятельная, хотя и вспомогательная, ветвь науки в январе 1980 г., когда вышел специальный компьютерный вы-пуск биологического журнала «Nucleic acids research».

Впрочем, первые работы по биоинформатике, посвященные анализу последовательностей, появились раньше (в конце 60-х – начале 70-х годов ХХ века). Это теперь уже классические работы по сравнению аминокислот-ных последовательностей белков – построение матрицы сравнения амино-кислотных остатков (Дейхофф), алгоритма выравнивания последовательно-стей (Нидельман, Вунш). Другое направление исследований было связано с анализом возможных вторичных структур транспортных РНК. В результате Эйген обнаружил, что все тРНК можно уложить в характерную структуру, похожую на клеверный лист. Этот результат сразу вошел в учебники по мо-лекулярной биологии, и только через 12 лет было экспериментально пока-зано, что это предсказание верно.

Следующий этап связан с увеличением количества прочитанной ин-формации. Количество расшифрованных последовательностей перевалило за тысячу, размеры последовательностей стали достигать сотни тысяч. Это привело к тому, что возникла необходимость хранения и доступа к инфор-мации. Так появились первые банки последовательностей – банк Лос-Аламос, база данных EMBL, базы данных по аминокислотным последова-тельностям. Появился новый класс задач – быстрый поиск сходства в бан-ках последовательностей. Следует отметить, что объем прочитанной ин-


45

формации примерно совпадал со скоростью роста мощности компьютеров удвоение за полтора года. Однако некоторые задачи имеют нелинейную за-висимость сложности от размера данных. Поэтому по-прежнему остро сто-ят вопросы создания эффективных алгоритмов.

Ситуация стала меняться с появлением проектов расшифровки пол-ных геномов, в том числе генома человека. Если до этого периода задачи ставились так – есть последовательность, про которую уже многое извест-но; найти что-нибудь еще. Теперь же компьютерный анализ выходил на первый план. Требовалось проанализировать полный геном и найти в нем новые особенности – новые гены, сигналы регуляции и т.п. И если раньше компьютерный анализ шел после эксперимента, то теперь результаты ком-пьютерного анализа часто определяют направление исследований. Более того, часто данные компьютерного анализа являются самостоятельными биологически значимыми результатами.

В настоящее время биоинформатика стала существенным элементом биологической науки, способной не только обслуживать потребности экс-периментаторов, но также и продуцировать собственные результаты.

Биоинформатика в подавляющем большинстве мировых научных центров понимается как синоним вычислительной молекулярной биологии.

Есть несколько основных направлений этого раздела науки, в зависи-мости от исследуемых объектов:

• биоинформатика последовательностей; • структурная биоинформатика; • компьютерная геномика.

Цели и задачи биоинформатики Основополагающий принцип биоинформатики состоит в том, что

биополимеры, например, молекул нуклеиновых кислот и белков могут быть преобразованы в последовательности цифровых символов. Кроме того, для представления мономеров аминокислотных и нуклеотидных цепей необхо-димо лишь ограниченное число алфавитных знаков.

Подобная гибкость анализа биомолекул с помощью ограниченных алфавитов привела к успешному становлению биоинформатики. Развитие и функциональная мощь биоинформатики во многом зависят от прогресса в области разработки аппаратных средств и программного обеспечения ЭВМ. Простейшие задачи, стоящие перед биоинформатикой, касаются создания и ведения баз данных биологической информации.

По сути, предмет биоинформатики включает в себя три компонента: 1) создание баз данных, позволяющих осуществлять хранение круп-

ных наборов биологических данных и управление ими; 2) разработка алгоритмов и методов статистического анализа для оп-

ределения отношений между элементами крупных наборов данных;


46

3) использование этих средств для анализа и интерпретации биологи-ческих данных различного типа – в частности, последовательностей ДНК, РНК и белков, белковых структур, профилей экспрессии генов и биохими-ческих путей.

Цели

Цели биоинформатики следующие: 1) Организовывать данные таким образом, чтобы исследователи име-

ли доступ к текущей информации, хранящейся в базах данных, и могли вносить в нее новые записи по мере получения новых сведений.

2) Развивать программные средства и информационные ресурсы, ко-торые помогают в управлении данными и в их анализе.

3) Применять эти средства для анализа данных и интерпретации по-лученных результатов таким образом, чтобы они имели биологический смысл.

Задачи

В целом задачи биоинформатики состоят в анализе информации, за-кодированной в биологических последовательностях. Последнее предпола-гает следующее:

1. Обнаружение генов в последовательностях ДНК различных орга-низмов.

2. Развитие методов изучения структуры и (или) функции новых рас-шифрованных последовательностей и соответствующих структурных об-ластей РНК.

3. Определение семейств родственных последовательностей и по-строение моделей.

4. Выравнивание подобных последовательностей и восстановление филогенетических деревьев с целью выявления эволюционных связей.

Помимо перечисленных выше задач, следует упомянуть еще один важнейший вопрос биоинформатики – обнаружение мишеней для медика-ментозного воздействия и отыскание перспективных опытных соединений.

Предмет

Биоинформатика осуществляет следующие виды деятельности. 1) Управление биологическими данными и их обработка; сюда вхо-

дит их организация, отслеживание, защита, анализ и т. д. 2) Организация связи между учеными, проектами и учреждениями,

вовлеченными в фундаментальные и прикладные биологические исследо-вания. Связь может включать в себя электронную почту, пересылку файлов, дистанционный вход в систему, телеконференции, электронные информа-ционные табло и, наконец, учреждение сетевых информационных ресурсов.


47

Организация наборов биологической информации, документов и литерату-ры, а также обеспечение доступа к ним, их поиска и выборки.

3) Анализ и интерпретация биологических данных с применением вычислительных методов, как-то: визуализация, математическое моделиро-вание, а также построение алгоритмов высокопараллельной обработки сложных биологических структур.

Прикладная область биоинформатики

В расшифровке смыслового содержания последовательностей наме-тились два различных аналитических направления:

1) согласно первому подходу ученые опираются на методы распозна-вания регулярных комбинаций, посредством которых обнаруживают подо-бие последовательностей и, следовательно, выявляют эволюционно связан-ные структуры и функции;

2) согласно второму подходу используют методы предсказания ah initio – для прогнозирования трехмерных структур и, в конечном счете, выве-дения функции непосредственно по линейной последовательности. Прямое предсказание трехмерной структуры белка по его линейной последовательно-сти аминокислот – важнейшая цель биоинформатики.

Анализ гомологичности последовательностей

Одна из движущих сил биоинформатики – поиск подобий между раз-ными биомолекулами. Помимо систематической организации данных, идентификация белковых гомологов имеет прямое практическое примене-ние. Теоретические модели белков обычно основаны на структурах близких гомологов, определенных опытным путем.

Всякий раз, когда ощущается недостаток биохимических или струк-турных данных, могут быть выполнены исследования на дрожжеподобных низших организмах, а результаты могут быть распространены на гомоло-гичные молекулы более высоких организмов, например, человека. Более то-го, данный подход упрощает проблему понимания сложных геномов: за счет непосредственного анализа простых организмов и последующего рас-пространения тех же самых принципов на более сложные. Это могло бы привести к опознаванию потенциальных мишеней для медикаментозного воздействия путем испытаний на гомологах основных микробных белков.

Разработка лекарственных препаратов

Опирающийся на биоинформатику подход к открытию лекарств дает важное преимущество. С помощью биоинформатики могут быть описаны генотипы, сопряженные с патофизиологическими состояниями, что в прин-ципе позволит опознать соответствующие молекулярные мишени. Посред-ством программного транслятора по известной последовательности нуклео-


48

тидов может быть определена вероятная аминокислотная последователь-ность кодируемого белка.

В случае принятия такого подхода методы изучения последовательно-стей могли бы применяться для поиска гомологов у опытных организмов; и на основании подобия последовательностей было бы возможно моделиро-вать структуру конкретного белка, взяв за основу экспериментально уста-новленные структуры. И наконец, стыковочные алгоритмы могли бы проек-тировать молекулы, потенциально связывающиеся с моделируемой структу-рой, прокладывая тем самым путь для биохимических испытаний, прове-ряющих биологическую активность этих молекул уже на физическом белке.

Прогнозирующие функции

Благодаря технологии массового просмотра данных можно получить ответ на ряд вопросов, касающихся эволюционных, биохимических и био-физических характеристик исследуемых биомолекул. Возможно устано-вить: а) специфические мотивы в структуре белков, соответствующие опре-деленным филогенетическим группам, б) общность между различными мо-тивами, наблюдаемыми у отдельных организмов, в) долю аналогичных мо-тивов, общих для родственных организмов, г) степень родства, выведенного из тривиальных эволюционных деревьев, и д) различие метаболических пу-тей у разных организмов.

Кроме того, на основании того факта, что мотивы в структуре белка часто связаны с определенными биохимическими функциями, можно полу-чать данные относительно функций белка. На основании анализа структур-ных данных можно составить карту взаимодействий всех белков того или иного организма.

Применение в медицине

Приложения к медицинским наукам затрагивают главным образом анализ экспрессии генов. Как правило, это предполагает сбор данных об экспрессии в клетках, пораженных различными заболеваниями, и сравнение этих измерений с нормальными уровнями экспрессии. Обнаружение генов с измененной в пораженных клетках экспрессией создает основу для объяс-нения причин болезни и указывает потенциальные мишени для лекарствен-ных препаратов.

Располагая подобной информацией, можно разрабатывать соединения, которые связываются с экспрессируемым белком. Далее могут быть прове-дены эксперименты на микроматрицах, чтобы оценить реакцию на фармако-логическое воздействие полученного опытного соединения; подобная ин-формация может помочь также в разработке тестов для обнаружения или прогноза токсичности опытных лекарств на стадии клинических испытаний.

Объединение биоинформатики с экспериментальной геномикой мо-жет открыть путь для многих достижений, которые приведут к коренным


49

изменениям в будущих программах здравоохранения. К ним можно отнести послеродовое определение генотипа с целью оценки восприимчивости или устойчивости индивидуума к определенным болезням и патогенам, предпи-сание уникального сочетания вакцин, уменьшение затрат на лечение за счет повышения эффективности терапии и предупреждения рецидивов заболе-вания. Вкупе все эти новшества могут привести к разработке индивидуаль-ных пищевых рационов и выявлению заболеваний на ранних стадиях.

Кроме того, программы медикаментозного лечения могли бы специ-ально подбираться к конкретному пациенту и болезни, и таким образом обеспечивать наиболее эффективный курс лечения с минимальными побоч-ными эффектами. В частности, проект «Геном человека» принес несомнен-ную пользу судебной медицине и фармацевтической промышленности, привел к открытию многих полезных и вредных генов, внес неоценимый вклад в развитие представлений об эволюции человека и, кроме того, спо-собствовал разработке методов диагностики болезней, возможных ослож-нений и генетически обусловленных реакций на терапевтическое воздейст-вие, а также развитию индивидуальных подходов к лечению, методов обна-ружения мишеней для лекарственных препаратов и, наконец, становлению генотерапии.

Биоинформатика последовательностей

Этот раздел биоинформатики занимается анализом нуклеотидных и белковых последовательностей. В настоящее время разработаны эффектив-ные экспериментальные методы определения нуклеотидных последова-тельностей. Определение нуклеотидных последовательностей стало рутин-ной хорошо автоматизированной процедурой.

В результате рутинной хорошо автоматизированной процедуры уже получено огромное количество генетических текстов. Так, в базе данных EMBL на 15.02.2007 хранится 87 000 493 документов с описанием нуклео-тидных последовательностей, содержащих в целом 157 545 686 001 симво-лов (нуклеотидов), что соответствует примерно библиотеке в 105 толстых томов с убористым шрифтом. Найти нужный ген в EMBL, это все равно, что найти цитату в такой библиотеке. Без помощи компьютера сделать это очень трудно. А число данных экспоненциально растет.

Например, геном небольшой бактерии – это непрерывная строка дли-ной в 1–10 миллионов символов, и далеко не вся ДНК кодирует белки. Пер-вый тип биоинформатической задачи – это задача поиска в нуклеотидных последовательностях особых участков: кодирующих белки, кодирующих РНК (например, тРНК), локусов связывания с регуляторными белками и других. И это не всегда простые задачи, например, гены эукариотических организмов состоят из чередующихся «осмысленных» и «бессмысленных» фрагментов (экзонов и интронов), и расстояние между «осмысленными»


50

фрагментами может достигать тысяч нуклеотидов. После того, как найден ген, необходимо выявить, что он кодирует и какую функциональную на-грузку несет.

Если речь идет об участке ДНК, кодирующем белок, то с помощью весьма простой операции – трансляции с использованием известного гене-тического кода можно получить соответствующие аминокислотные после-довательности. Из известных на сегодня 4 273 512 белков около 94 % по-следовательностей – это именно такие гипотетические трансляты, и больше о них ничего не известно.

Но биологические объекты – это объекты, возникшие в процессе эво-люции. Сравнительно-эволюционный подход – один из мощнейших подхо-дов в биологии. Например, функция белка из одного организма хорошо экспериментально изучена, в другом организме нашли белок с похожей аминокислотной последовательностью. Можно предположить, что второй (неизвестный) белок выполняет ту же или схожую функцию. И здесь сразу возникает несколько вопросов. Во-первых, что значит похожая последова-тельность? Как сравнивать последовательности? При какой степени сходст-ва последовательностей можно предполагать, что белки выполняют сход-ные функции?

Сравнение последовательностей (выравнивание) является важнейшей задачей биоинформатики.

Крупным успехом биоинформатики является создание программы Blastp и ClustalX. Но в настоящее время постоянно совершенствуют методы выравниваний.

Можно привести много примеров того, как сравнительно-эволюционный подход в сочетании с биоинформатическими методами по-рождает новое биологическое знание.

Генетические тексты – тексты с большой долей шума, сравнивая род-ственные последовательности, в ряде случаев удается отфильтровать шум и выявить сигнал, например, короткую последовательность нуклеотидов, спо-собную связываться с белком-регулятором, или аминокислотные остатки в ферменте, отвечающие за связывание субстрата. Чтобы быть уверенными в результате, в биоинформатике используют теорию вероятности и математи-ческую статистику.

Таким образом, основные задачи биоинформатики, связанные с ана-лизом отдельных последовательностей, состоят в следующем:

1. Выравнивание и определение сходства двух последовательностей. 2. Построение множественных выравниваний. 3. Распознавание генов. 4. Предсказание сайтов связывания регуляторных белков. 5. Предсказание вторичной структуры РНК.


51

Создание новых экспериментальных технологий ставит перед биоин-форматикой целый ряд новых задач. Например, развитие масс-спектрометрии позволяет в одном эксперименте проанализировать весь на-бор белков, присутствующий в клетке. Для решения этой задачи необходим совместный анализ спектров масс и геномов. Открытие новых биологиче-ских явлений и механизмов также приводит к появлению новых задач.

Хорошим примером служит открытие РНК интерференции, за кото-рую в 2006 году дали Нобелевскую премию по физиологии. Это открытие вызвало появление целого ряда биоинформатических работ, посвященных поиску участков связывания микроРНК и новых микроРНК. Многие наход-ки были затем подтверждены экспериментально.

Структурная биоинформатика

Каждый белок, помимо своей уникальной последовательности амино-кислот, из цепочки которых состоит его молекула, обладает еще и уникаль-ным способом укладки этой цепочки в пространстве. Задачу предсказания укладки по последовательности можно, в принципе, тоже считать задачей биоинформатики, но это задача в своем общем виде еще слишком далека от своего решения. Поэтому структурная биоинформатика занимается анали-зом пространственных структур, уже определенных экспериментально.

Структур белков известно намного меньше, чем последовательностей белков. Это связано с тем, что экспериментальные процедуры для опреде-ления структуры намного сложнее, дороже, и к тому же (в отличие от сек-венирования) не являются «рутинными», то есть их результат вовсе не га-рантирован. Тем не менее, на начало 2007 года для анализа доступны более 30 000 структур, что тоже немало (доступных белковых последовательно-стей – несколько миллионов). Среди них как структуры отдельных белко-вых молекул, так и структуры комплексов белков с ДНК, РНК, другими хи-мическими веществами. Например, большинство лекарств представляют собой химические вещества, чьи молекулы способны связываться – образо-вывать комплексы – с молекулами тех или иных белков (как правило, в ре-зультате такого связывания белок оказывается неспособен выполнять свою природную функцию, что и обеспечивает эффект лекарства).

Исследование механизма действия лекарств имеет большое практиче-ское значение, поэтому определением структуры комплексов молекул бел-ков с молекулами лекарств занимаются многие экспериментальные группы. Как результат – большое количество доступных для компьютерного анализа структур комплексов.

Примеры задач структурной биоинформатики: 1. определение участков белковой молекулы, важных для той или

иной функции данного белка (в биоинформатике часто вместо «определе-ние» говорят «предсказание», поскольку компьютерный анализ не может


52

иметь результатом научный факт, а лишь более или менее достоверное предсказание, которое должно быть затем проверено экспериментами);

2. сравнительный анализ структур родственных белков, классифика-ция белков на основе их пространственной структуры;

3. анализ структур комплексов двух или нескольких молекул белка, комплексов молекул белка с другими молекулами; предсказание воздейст-вия молекул химических веществ (в частности, потенциальных лекарств) на молекулы белков;

4. предсказание структуры белка по структуре белка с похожей по-следовательностью (в такой ситуации задача предсказания укладки часто разрешима).

Основными направлениями биоинформатики являются: 1. эволюция, поиск и функциональный анализ генов в последователь-

ностях, 2. функциональный анализ и расшифровка геномов, 3. экзон-интронные взаимодействия, 4. классификация и характеристика белков, 5. сравнительная геномика и протеомика, 6. вопросы эволюции белков и геномов, 7. филогенез, 8. структурная биология, 9. разработка специализированных пакетов программ и сетевых сер-

висов. Построение структурных моделей в биоинформатике проводится с

использованием компьютерных средств (3D графика), что предполагает изображение геометрии объекта, его поверхности, среды объекта, цвета и оттенков. Существуют методы изменения цвета объекта, чтобы показать освещение с того или иного места и рассеянный свет, сформировать тень. Изображение, располагающееся на экране, может быть легко преобразова-но. Рассматриваются структуры белков и нуклеиновых кислот (анализ структурных особенностей, моделирование, предсказание вторичной и тре-тичной структур, определение параметров спирали нуклеиновых кислот).

Анализируются сложные биологически важные макромолекулы. Что-бы понять структуру сложной молекулы, необходимо рассмотреть не одну, а несколько структурных моделей.

Например, пространственное расположение цепи в макромолекуле высокомолекулярного соединения лучше понять с использованием ленточ-ной модели (рис. 10(I)), а нахождение поверхностных групп и взаимодейст-вие между атомами в макромолекуле удобно рассмотреть, применив мо-дель, построенную из сфер с радиусом Ван-дер-Ваальса (рис. 10(II)).


53

Рис. 10. Ленточная модель (I) и модель, построенная из сфер с радиусом Ван-дер-Ваальса, строения белка

Компьютерные программы позволяют выделять в биополимере от-

дельные фрагменты сочетанием различных моделей. На рисунке 11 показа-на ленточная модель белка с выделенными фрагментами глицина.

Рис. 11. Ленточная модель белка с выделенными фрагментами глицина Детали макромолекул рассматривают, укрупняя изображение. Хими-

ческие элементы имеют определенные цвета (углерод – серый, водород – белый и т.д.), что облегчает восприятие структуры. Кроме того, на элемен-тах структуры можно вводить символьные обозначения.

Компьютерная геномика

В настоящее время определены полные или почти полные последова-тельности геномов многих организмов. Прочтение полной нуклеотидной последовательности какого-либо генома не является самоцелью. На самом


54

деле это является первым шагом для исследования того, как функционирует та или иная клетка. Исследование геномов бактерий проводится для того, чтобы исследовать метаболизм бактерий и, в случае патогенных организ-мов, найти потенциальные мишени для лекарств. С другой стороны, изуче-ние геномов может позволить найти новые метаболические пути или фер-менты, которые будут применены в биотехнологическом производстве (на-пример, витаминов). В течение как минимум полувека сотни лабораторий исследовали кишечную палочку (E. coli). Но даже такой весьма изученный организм имеет как минимум 25 % абсолютно не охарактеризованных ге-нов. Значительное число секвенированных геномов принадлежат организ-мам, о которых вообще нет каких-либо других экспериментальных данных.

Экспериментальное определение функции только одного гена требует интенсивной работы одной лаборатории как минимум в течение нескольких месяцев. Компьютерный же анализ позволяет с известной степенью точно-сти охарактеризовать несколько тысяч генов силами небольшой группы примерно за неделю. Разумеется, компьютерный анализ не исключает экс-периментальную проверку, однако в этом случае экспериментальная работа существенно упрощается.

Компьютерный анализ геномов состоит из следующих основных эле-ментов:

1. Предсказание генов в последовательностях. При этом в некоторых случаях удается даже найти ошибки в последовательности.

2. Предварительный функциональный анализ по сходству и другим особенностям белковых последовательностей.

3. Сравнительный анализ геномов. 4. Исследование регуляции работы генов. 5. Поиск «пропущенных» генов. Представим себе, что в клетке есть

цепочка реакций, преобразующих вещество А в вещество Б, а затем вещест-во Б в вещество В. При этом ген, ответственный за первую реакцию известен и в клетке присутствует, а для второй реакции гена не нашли. Это и есть пропущенный ген. На самом деле вторая реакция осуществляется, и пробле-ма заключается в том, чтобы найти в геноме подходящую кандидатуру.

6. Исследование транспортеров (генов, обеспечивающих перенос пи-тательных веществ в клетку и выброс вредных веществ из клетки)

Сравнительная геномика принесла уже несколько значительных от-

крытий и «закрытий». В качестве «закрытия» можно привести, триклозан, который считался универсальным антибактериальным препаратом. Он вхо-дит в состав широко разрекламированного мыла «Safeguard». Его мишенью является белок, закодированный в гене fabI. Этот белок катализирует одну из реакций синтеза жирных кислот – необходимого компонента любой клетки. При этом у животных нет аналога этого белка, поэтому такой пре-


55

парат безопасен для человека. Компьютерный анализ бактериальных гено-мов показал, что стрептококки не имеют белка fabI, а его функцию выпол-няет совсем другой белок fabR. Поэтому триклозан не действует на стреп-тококки. Одним из ярких открытий геномики является открытие принципи-ально новой системы регуляции – рибопереключателей. Это специфическая структура РНК, которая стабилизируется при непосредственном связыва-нии с низкомолекулярным веществом и блокирует синтез матричной РНК. Предсказание структуры и механизма действия было блестяще подтвер-ждено экспериментально.

Другой класс исследований, проводимых компьютерной геномикой – полногеномный анализ и исследование эволюции. В частности, с помощью массового анализа было обнаружено, что альтернативный сплайсинг в ге-нах человека является скорее правилом, чем исключением. Эволюционный взгляд на проблему позволяет выдвинуть гипотезу о том, что сплайсинг, в частности, альтернативный сплайсинг, является эффективным механизмом для эволюции, позволяющим без значительного риска для генома переби-рать варианты последовательностей.

Массовый анализ большого количества геномов показал, что, по крайней мере у безъядерных организмов (бактерий и архебактерий), явле-ние горизонтального переноса генов между видами является весьма распро-страненным явлением – от 10 до 30 % генов в этих геномах горизонтально перенесены из других видов.

Применение некоторых методов анализа для получения новых биологических знаний

Существует широкий спектр методов и инструментов для компью-терного анализа биологических данных. Здесь можно упомянуть и BLAST – наиболее популярный сервис для поиска похожих последовательностей в базах данных, и программы множественного выравнивания аминокислот-ных последовательностей, и программы предсказания вторичных структур РНК, программы визуализации пространственных структур, программы моделирования динамики пространственных структур и многое другое.

Упорядочивание, выравнивание (alignment) – важнейший метод, ис-пользуемый в биоинформатике для анализа последовательностей. Сущест-вуют парное (pairwise alignment) и множественное (multiple sequence alignment, MSА), локальное и глобальное выравнивания. Суть метода со-стоит в том, что в двух или нескольких последовательностях производится поиск идентичных или похожих участков. Поскольку в процессе эволюции генов могут происходить мутации, вставки или делеции, то допускается до-бавление в последовательности «пробелов» (gaps) для получения лучшего результата. В результате такого выравнивания можно выявить нуклеотиды или аминокислоты и их группы (мотивы), имеющиеся во всех сравнивае-


56

мых последовательностях в определенных позициях. То есть можно с большой долей вероятности говорить о том, что именно эти «консерватив-ные» участки и есть биологически активные сайты в белках, поскольку они не подверглись изменениям в процессе эволюции. С другой стороны, ис-пользуя данный метод и задавая в качестве параметра поиска определенный профиль (некоторую последовательность нуклеотидов или аминокислот), можно определить родственные протеины или ДНК и тем самым просле-дить эволюцию изучаемой последовательности. Анализ результатов множе-ственного выравнивания аминокислотных последовательностей различных белков или участков ДНК, выделенных из разных организмов, может по-мочь проследить путь этого белка или гена от организма, в котором он про-явился впервые и до более поздних видов. Таким образом, применяя MSА, можно ответить на вопросы происхождения того или иного вида, а, зная частоту мутаций, можно определить его примерный возраст. Парное вырав-нивание аминокислотных последовательностей двух белков, третичная структура одного из которых неизвестна, позволяет сопоставить первичные структуры. При хороших показателях выравнивания можно говорить о го-мологии, о сходстве строения и функции исследуемых протеинов и смоде-лировать пространственную (3D) структуру. При этом установлено, что белки, имеющие не менее 40–50 % гомологии в аминокислотных последо-вательностях, будут иметь похожие третичные структуры. Следовательно, можно предполагать, что и функции таких белков могут быть похожими.

Структурная биология белка, являясь частью биоинформатики, широ-ко использует ее методы и математический аппарат для решения различных задач, связанных с пространственной организацией белка.

Доказано, что именно третичная структура протеина определяет его биологические функции, поэтому чрезвычайно важно знать не только по-следовательность аминокислот, составляющих белок, но и их взаимное рас-положение в пространстве. На сегодняшний день существует 2 основных экспериментальных способа определения третичной структуры белка – это рентгеноструктурный анализ и ядерно-магнитный резонанс (ЯМР). Полу-ченные в результате этих исследований данные после обработки заносятся в специальные банки данных – pdb, SRS и SRS3d, SCOP, CATH, pfaM и т.д. Оба метода не лишены недостатков и трудностей при выполнении исследо-вания. Биоинформатика использует совершенно другие подходы для пред-сказания и визуализации третичной структуры белковых молекул: поиск и моделирование гомологов (homology modeling), предсказание на основе за-конов квантовой механики и молекулярной динамики (Аb initio prediction), предсказание вторичной структуры на основе статистических данных, рас-познавание фолда (fold recognition или threading), и, наконец, выравнивание структуры (structural alignment). Однако эти методы не могут предсказать точной 3D структуры, поскольку основаны на поиске в различных базах


57

данных уже существующих структур гомологов неизвестной молекулы или на статистически достоверных зависимостях между определенными после-довательностями аминокислот и элементами вторичной структуры.

Методы молекулярной динамики требуют огромных вычислительных мощностей и многих лет расчетов (Ab initio). Наилучшие результаты (80–95 %) дает совмещение этих методов. Биоинформатика может дать ответы на вопросы, связанные с четвертичной структурой белка и его взаимодейст-вием с лигандами (docking). Основываясь на 3D структурах взаимодейст-вующих молекул и их физических свойствах (гидрофобность, электроста-тический заряд, гибкость отдельных цепей, способность к образованию во-дородных связей) можно предсказать места контакта или связывания этих молекул, рассчитать характеристики связывания. Это позволяет моделиро-вать малые молекулы, способные избирательно активировать или блокиро-вать активные центры целевого протеина. Такое моделирование широко ис-пользуется в разработке новых лекарств, несмотря на то, что требует боль-ших вычислительных и временных ресурсов.

Визуализация и интуитивно понятное представление биологических данных является одной из задач, решаемых в вычислительной биологии. Известно, что до 90 % всей информации человек получает от органов зре-ния, поэтому очень важно, чтобы исследователи обладали инструментари-ем, позволяющим визуализировать макромолекулы и их комплексы и мани-пулировать ими. Для эффективной работы с пространственными структу-рами белков, их группами, комплексами «белок–ДНК», «белок–лиганд» и т.д. существует специализированное программное обеспечение, позволяю-щее выбирать нужные структуры из банка данных и отображать исследуе-мую молекулу или группу в виде, удобном для понимания и анализа. Также многие пакеты имеют средства для создания несложных анимаций, расчета и минимизации потенциальной энергии молекул по одному или нескольким методам и моделирования частей исследуемой молекулы de novo, то есть предоставляют инструментарий для осуществления in silico мутаций, по-строения петель, реконструкции гомологов, изменения протомеров радика-лов аминокислот, осуществления докинга (предсказание связывания рецеп-тора и лиганда), что чрезвычайно важно при проектировании новых лекар-ственных средств. На сегодняшний день исследователю доступны как сво-бодно распространяемые программные продукты, так и коммерческие паке-ты. Наиболее известным и бесплатным программным обеспечением, в то же время обладающим мощными возможностями для визуализации и модели-рования белков, является deepView-Swiss PDB Viewer (разработчик – the Swiss institute of bioinformatics). Программа позволяет производить базовые операции над данными (рис. 12).


58

Рис. 12. Окно программы Swiss PDB Viewer. Белок кальмодулин

(PDB ID– 1CFC) В пакете имеется возможность вычислять и минимизировать потен-

циальную энергию молекулы по методу GROMACS96, основанному на мо-лекулярной динамике, выполнять моделирование гомологов (процедура проводится на удаленном сервере SwiSS-Model), строить выравнивание по-следовательностей аминокислот и производить структурное выравнивание молекул белков. Пользователь может производить базовые операции над полипептидной цепью – строить петли, выполнять мутации, изменять кон-формации цепи под контролем диаграммы торзионных углов (Ramachandran plot). Имеется также возможность взаимодействовать с этой программой при помощи скриптов, что может позволить автоматизировать рутинные операции.

В распоряжении молекулярных биологов имеются и куда более мощ-ные коммерческие продукты. Пакетом, обладающим огромным потенциа-лом в области молекулярного моделирования, развитым графическим аппа-ратом и в то же время позволяющим пользователю сразу начать работу, то есть имеющим понятный интерфейс, является Accelrys Discovery Studio. Это программное обеспечение и само по себе вполне способно удовлетво-рить большую часть запросов биолога, исследующего белки, но, будучи расширено путем подключения к Accelrys Pipeline Pilot Server, превращает-ся в мощную платформу для моделирования, симуляции и конструирования белков, их комплексов, изучения их взаимодействия в динамике, проекти-рования белков и проведения qSaR (quantitative structure-activity relationship – комплекс протоколов, широко используемый при разработке новых лекарственных средств).


59

Программный комплекс предоставляет возможность не только изу-чать различные уровни организации белков, но и осуществлять докинг, ис-следовать свойства сайтов связывания протеинов, выполнять сложные си-муляции при помощи инструментов молекулярной динамики и многое дру-гое (рис. 13).

Серверная часть Discovery Studio открывает доcтуп к базам данных и инструментам NCBi (national center for biotechnology information), протоко-лам для исследований в области протеомики, фармакологии, анализа после-довательностей и многого другого. Успехи медицины в настоящее время напрямую зависят от понимания процессов, происходящих на молекуляр-ном уровне.

Большинство этих программ представлены в Интернете и имеют весьма удобный пользовательский интерфейс. Однако очень важно пони-мать границы применимости тех или иных методов. Любой компьютерный анализ биологических данных является экспериментом (только сделанным не в пробирке) и к нему предъявляются те же требования – важна четкость постановки и необходим соответствующий контроль. Значительная часть биоинформатических работ сделана именно с применением уже сущест-вующих средств. Для проведения такого рода работ, как правило, нет необ-ходимости уметь программировать. Достаточно только внимательно анали-зировать результаты работы уже готовых программ. При этом часто биоин-форматический анализ предшествует постановке эксперимента.

С другой стороны массовый (например, геномный) анализ требует использования простейших программ собственного исполнения.

Современные исследования, касающиеся самых актуальных областей, таких как разработка лекарств против вируса иммунодефицита человека и рака, ведутся именно на уровне генов, белков, управляющих транскрипци-ей, и механизмов регуляции этих процессов. Таким образом, связь биоло-гии, медицины и информационных технологий в ближайшие десятилетия будет укрепляться, поэтому особую важность приобретает проблема препо-давания биоинформатики в вузах медико-биологической направленности.

Разработка новых методов анализа биологических данных

Иногда существующие программы недостаточны для решения постав-ленных задач, или существующие программы имеют недостаточную точ-ность, или для интересующей исследователя биологической задачи нет под-ходящих средств, или появился новый тип данных. В этом случае приходит-ся разрабатывать новые алгоритмы и программы. Таких примеров множест-во. Даже алгоритмы для такой классической задачи, как построение множе-ственного выравнивания имеет достаточно сильные ограничения. Современ-ная биоинформатика при разработке новых алгоритмов широко использует достижения теории вероятностей, математической статистики, информатики.


60

Рис.

13.

Окно программ

ы D

isco

very

Stu

dio.

Осуществлён докинг

кальмодулина на

Mlc

k (m

yosi

ne li

ght c

hain

kin

ase)

. Кальмодулин

связан с α-спиралью

кальмодулин

-связывающего пептида

(Т17

11-Т

1774

). Видны

вторичные и третичны

е структуры

, поверхность

кальмодулина и интерф

ейс взаимо

действия

. Доступные инструменты

расположены

слева

от

3D

окна

, а протоколы

для

проведения глубокого изучения

взаим

одействующих

молекул

и сим

уляций

– справа.

Окна сообщений

и вспом

огательной

инф

ормации об

исследуемых структурах

расположены

снизу


61

Львиная доля новых разработок в биоинформатике относится к при-менению реализованного на ЭВМ программного обеспечения (в том числе протоколов), предназначенного для сбора и (или) обработки биологических данных. Эти изобретения подпадают под общую категорию изобретений в области ЭВМ и подразделяются на изобретения, реализованные на ЭВМ, и изобретения, использующие машиночитаемые носители информации. Все эти изобретения имеют две составляющие: а) программное обеспечение и б) аппаратные средства ЭВМ.

Например, основанная на критерии подобия автоматизированная систе-ма распознавания новых групп последовательностей нуклеотидов в заданном наборе нуклеотидных последовательностей может включать в себя устройство ввода, память и процессор (в качестве аппаратных компонентов системы), а также набор данных или метод использования команд, хранимых в памяти и выполняемых процессором, – как программное обеспечение системы.

Разработка новых баз данных

Биоинформатика анализирует факты, полученные экспериментальной биологией.

Исходная информация рождается в тысячах экспериментов, независимо проводимых по всему миру с разными целями. Полученные данные экспери-ментатор сравнивает со всем набором уже имеющихся в банке (рис. 14).

Эти банки содержат первичную, зачастую грязную, информацию. Да-лее эта информация перерабатывается, в том числе с привлечением научной литературы. В результате возникают литературные, курируемые и вторич-ные банки данных. Информация в них, как правило, заслуживает большего доверия. Однако, создание новых курируемых банков данных – весьма тру-доемкая работа.

Например, определив в опыте нуклеотидную последовательность но-вого гена с неизвестной функцией, исследователь может узнать, имеются ли у других организмов похожие гены и какую функцию они выполняют? Мо-жет оказаться, что ген человека, связанный с каким-либо заболеванием, по-хож, например, на бактериальный ген с известной функцией. Это даст нить для дальнейших исследований по определению роли гена в заболевании.

Если исследователь не нашел в банке открытой им последовательно-сти, он посылает ее туда, пополняя банк. Существуют хранилища любой информации и аннотированной, т.е. отобранной экспертами информации. В функции банков включается хранение, систематизация, обновление инфор-мации и обеспечение доступа к ней. Это требует огромных компьютерных мощностей. Кроме того, появилась высокопрофессиональная когорта экс-пертов. Для сохранения информации банки данных созданы в США, Евро-пе, Японии, они в значительной степени дублируют друг друга, но это по-зволяет не потерять накапливаемую человечеством информацию в случае форс-мажорных обстоятельств.


62

Рис. 14. Схема анализа экспериментальных данных Существуют самые разные банки данных (рис. 15). Некоторые банки просто содержат информацию, не систематизируя ее. Классифицирующие банки данных сканируют информацию в первич-

ных банках, выделяя и объединяя в ней сходные элементы (например, схо-жие последовательности часто указывают на эволюционную связь между генами, то же справедливо и для белков). Так создаются банки, описываю-щие целые эволюционные семейства генов и белков.

Одновременно с описанными банками данных существуют банки на-учных публикаций. Каждая статья, выходящая в номере любого научного журнала, помещается в банк и аннотируется так, чтобы другой ученый мог легко найти ее через Интернет. Крупнейшая on-line библиотека медико-биологических публикаций PubMed содержит около 16 миллионов статей за последние 50 лет. В настоящее время разрабатываются алгоритмы по поис-ку информации среди таких сложных баз, как библиотеки научных статей.

Интегральные банки данных и энциклопедии выполняют необычайно важную функцию, объединяя в себе всю известную информацию о кон-кретном гене, белке, организме или о чем-то другом. Они обобщают ин-формацию из большого числа других банков данных и постоянно обновля-ют ее. Такие банки могут служить отправной точкой для нового исследова-ния или способом подробного ознакомления с последней информацией об интересующем гене или белке.


63

Рис.

15.

Разнообразные банки данных:

1 –

хранят нуклеотидные последовательности

генов,

2 –

ами

нокислотны

е

последовательности

белков,

3 –

метаболические карты

передачи сигналов

либо взаимн

ого превращения

вещ

еств

в клетке

, 4 –

содержат

данны

е о трехмерном

строении мо

лекул,

5 –

генетические карты

хромосом


64

Открытие лекарственных препаратов и фармакоинформатика Лекарственный препарат – химическое вещество, молекула которого

взаимодействует с мишенью (биологической молекулой) внутри организма и посредством такого взаимодействия вызывает тот или иной физиологиче-ский эффект. Молекулярные мишени обычно относятся к белкам. В зависи-мости от производимого ими эффекта, лекарства могут оказывать благо-творное или вредное влияние на организм. Цель фармацевтической про-мышленности состоит в разработке медикаментов, обладающих определен-ными целебными эффектами и предназначенных для излечения многих за-болеваний, особенно болезней человека.

Лекарственным препаратом можно назвать только такое химическое со-единение, которое отвечает следующим требованиям: оно должно быть безо-пасным, эффективным, устойчивым (и химически, и метаболически), легко усвояемым (должно быстро всасываться и переноситься к участку воздейст-вия), фармацевтически доступным (путем выделения из естественных источ-ников или химического синтеза) и оригинальным (патентоспособным).

Открытие лекарственных препаратов

Разработку новых медикаментов можно проводить двумя методами: эмпирическим и рациональным. Эмпирический метод – это слепой метод проб и ошибок; его называют также методом черного ящика. Тысячи хими-ческих соединений испытывают на патогенах или опытных организмах, да-же не зная мишень, на которую препарат воздействует, и механизм его дей-ствия. Впрочем, иногда может произойти случайное открытие, подобное открытию пенициллина.

Обычно на медикаментозную активность проверяют тысячи химиче-ских соединений. Как правило, лишь одно из 10 000 может действительно поразить мишень. В подобного рода подходах никто не знает заранее, ка-кую мишень препарат атакует и каков сам принцип воздействия. Рацио-нальный подход начинается с ясного знания мишени и механизма, приво-дящего к ее поражению. Открытие лекарственных препаратов включает в себя задачи обнаружения мишени и поиска снаряда. Мишень относится к причинному фактору болезни, а снаряд – к активной молекуле, которая взаимодействует с этим причинным фактором.

При медикаментозном лечении болезни лекарства взаимодействуют с мишенями, которые так или иначе способствуют развитию болезни, влияют на их активность и таким образом производят различные положительные эффекты. Терапевтическая мишень может быть эндогенной (белок, синте-зируемый в организме пациента, которому назначен препарат) или, в случае инфекционных заболеваний, – экзогенной (белок, производимый болезне-творным организмом). Медикаменты либо стимулируют, либо подавляют активность белка-мишени.


65

Опознавание и утверждение мишени На самом деле разработка препарата оказывается не столь легкой зада-

чей. Это невероятно сложный, продолжительный и дорогостоящий процесс. Получение препарата начинается с установления потенциально подходящей мишени болезни. Этот процесс называют опознаванием мишени. Здесь нужно изучить все, что известно о самой болезни, о возможных причинах заболева-ния, ее симптомах, генетике, эпидемиологии, связи с другими болезнями – че-ловека и животных – и, наконец, обо всех известных методах ее лечения.

Прежде всего, должна быть выяснена причина заболевания, распро-странение болезни в популяции, развитие болезни в организме пациента, биохимические и физиологические изменения, наблюдаемые у пациентов, и т. д. В прошлом опознавание мишени проводили в основном ввиду меди-цинской целесообразности. Теперь опознавание мишени зависит не только от медицинской потребности, но и от таких факторов, как успех сущест-вующих методов терапии, деятельность конкурирующих компаний – про-изводителей лекарственных средств, а также от оценки перспектив рынка.

Типы мишеней

Мишенями для медикаментозного воздействия обычно являются биомолекулы, например, ферментов, рецепторов или ионных каналов. При-менимость того или иного фермента в качестве мишени зависит от того, на-сколько он важен для выживания патогена. Если этот фермент оказывается мало существенным, то такая мишень не представляет никакой ценности. Если терапевтическая мишень находится внутри организма, то флуктуации ее активности должны соответствовать колебаниям серьезности (тяжести) заболевания. Только в том случае, когда удается установить высокий уро-вень значения воздействия на мишень для эффективного контроля над хо-дом заболевания, мишень может быть признана адекватной данной болезни.

Как только мы удостоверились в правильности выбора мишени, мы можем определить ее модуляторы. Модуляторы мишеней делятся на поло-жительные и отрицательные (табл. 1).

Таблица 1

Список положительных и отрицательных модуляторов Биомолекулы Положительные

модуляторы Отрицательные модуляторы

Ферменты Рецепторы

Ионные каналы

АктиваторыАгонисты

Деблокаторы

Ингибиторы Антагонисты Блокаторы

Оценка и утверждение

За опознаванием мишени следует процесс ее утверждения. Последний предполагает всесторонние испытания терапевтического потенциала моле-кулярной мишени. Этот процесс может включать в себя моделирование бо-


66

лезней на опытных животных и анализ данных об экспрессии генов и бел-ков. Путем сравнения уровней экспрессии генов в нормальном и болезнен-ном состоянии новые медикаментозные мишени могут быть обнаружены in silico. Этим целям могут, служить испытания на микроматрицах.

Как только ген, который в болезненном состоянии обнаруживает «по-вышающую или понижающую регуляцию» (экспрессируемый на более вы-соком или низком уровне, чем в нормальной ткани), установлен, определя-ют его природу с помощью методов биоинформатики. Кроме того, посред-ством программы «БЛАСТ» проводят поиск подобных ему генов или бел-ков в базах данных последовательностей. Подобные гены и белки помогают определять функцию подверженного регуляции гена. Если оказывается, что мишень принадлежит к одному из классов структур, которые очень легко поддаются медикаментозному воздействию (рецепторы, ферменты или ионные каналы), то создатель препарата может вздохнуть с облегчением.

Адекватная мишень должна обладать высоким терапевтическим пока-зателем, то есть должна быть гарантия существенного терапевтического эффекта при введении такого препарата. Если мишенью является известный белок, то активность к связыванию может быть измерена непосредственно. Потенциальный противомикробный препарат может быть испытан путем наблюдения его воздействия на рост культуры патогенных микроорганиз-мов. Эффект некоторых соединений можно проверять на эукариотических клетках, выращенных в культуре тканей. Если какое-либо лабораторное животное восприимчиво к данной болезни, то испытания медикамента мо-гут быть проведены на группе опытных животных.

Признаки

Если найденная мишень является ферментом, то изучают следующие признаки: активный центр и участвующие в его формировании аминокис-лоты, наличие или отсутствие кофактора, число водородных доноров и ак-цепторов, находящихся в активном центре, топология активного центра.

Если мишень оказывается биохимическим веществом или субстратом какого-либо фермента, то проводят оценку следующих факторов: размер мо-лекулы, ее химическая природа, наличие групп, показывающих донорную или акцепторную емкость (по отношению к водороду), побочные продукты метаболизма и возможности химической модификации этого соединения.

Определение опытного соединения

После окончательного утверждения мишени начинается поиск ле-карств, которые взаимодействуют с этой мишенью. Этот процесс называет-ся созданием снаряда и состоит в поиске опытных соединений, то есть ве-ществ, обладающих частью желательной биологической активности иде-ального лекарственного препарата.


67

Качества снаряда Молекула-снаряд должна иметь следующие желательные качества: а) потенцию (способность эффективно модулировать мишень), б) растворимость (она должна быть легко растворима в воде для более

быстрого эффекта), в) умеренную липофильность (способность проникать через плазма-

тическую мембрану), г) метаболическую устойчивость (не должна слишком быстро разру-

шаться в организме; желателен также длительный срок хранения), д) биологическую усвояемость (быстрое всасывание в организме и в

то же время медленное выведение для поддержания активности), е) специфичное связывание белков, ж) слабую или нулевую токсичность.

Поиск опытных соединений Известно несколько стратегий поиска опытных соединений: 1) интуитивная прозорливость – за счет «случайных» наблюдений и

опытов (открытие пенициллина Александром Флемингом); 2) изыскание естественных источников – заимствования из различ-

ных направлений традиционной медицины (хинин из коры хинного дерева); 3) изучение всей известной информации о субстратах, лигандах или

ингибиторах, а также о механизме активности белка-мишени и выбор по-тенциально активных соединений на основании анализа собранных данных;

4) испытание лекарств, показавших свою эффективность в лечении аналогичных заболеваний;

5) массовые отборочные испытания близких по составу или функции веществ;

6) обзор сведений о побочных эффектах, отмеченных в практике применения существующих лекарств;

7) перебор и проба тысяч соединений «вслепую»; 8) компьютерное моделирование и автоматическое проектирование

ab initio.

Оптимизация опытного соединения Первичное опытное соединение, найденное одним из вышеприведенных

способов, должно быть оптимизировано. Оптимизация заключается в моди-фикации контрольных соединений с целью получения их производных (кон-курсных лекарств) с возможно лучшими терапевтическими профилями. На-пример, высокая доступность препарата предполагает легкое всасывание и быстрый перенос к мишени. В свою очередь это требует метаболической ус-тойчивости лекарства. Для этого необходим надлежащий профиль раствори-мости – препарат должен достаточно хорошо растворяться в воде (для обеспе-


68

чения всасывания), но его растворимость не должна превышать определенный порог (иначе он будет немедленно выведен из организма); его растворимость в жирах должна быть достаточна для проникновения сквозь мембраны клеток, но недостаточной для его причисления к жировым запасам.

После модификации конкурсные лекарства оценивают по качеству, принимая во внимание такие факторы, как легкость синтеза и приготовле-ния лекарственной формы. Затем оптимальное соединение регистрируют как новый разработанный препарат и направляют на клинические испыта-ния. Это самая длительная и дорогостоящая стадия процесса разработки препарата. Именно по этой причине большая часть проектов останавливает-ся перед этим этапом. Клинические испытания призваны определить уро-вень безопасности и переносимости препарата при лечении пациентов и оп-ределить его метаболический путь в организме.

Стадии испытаний

Испытания лекарственных препаратов проводят в несколько стадий. Доклиническая стадия: Испытания на опытных животных. Стадия 1. Нормальные (здоровые) добровольцы. Стадия 2. Оценка безопасности и эффективности воздействия на па-

циентов, выбор дозы и режима приема. Стадия 3. Сравнение эффекта в группах пациентов, принимающих

новый препарат и плацебо, или компаратор; на этой стадии ожидают апро-бацию от соответствующих регулятивных органов и принимают решение о выпуске лекарства в продажу.

Стадия 4. Длительное отслеживание побочных реакций, о которых сообщают фармацевты и доктора.

Вклад различных научных направлений в развитие методики разра-

ботки лекарственных препаратов. В развитие методики разработки лекарственных препаратов неоцени-

мый вклад внесли геномика, протеомика, комбинаторная химия и техноло-гия высокопроизводительных отборочных испытаний. Геномика и протео-мика коренным образом изменили подход к опознаванию и утверждению молекулярных мишеней. Традиционно мишени для медикаментозного воз-действия оценивались путем наблюдений над пациентами и подбора опыт-ных соединений, дающих желательный клинический эффект.

С появлением геномики и, в частности, полной последовательности генома человека и ее функционального анализа, тысячи новых потенциаль-ных мишеней могут быть опознаны по последовательности, структуре и функции.

Для построения алгоритмов для моделирования взаимодействий бел-ка-мишени с молекулами препарата важна биоинформатика. Благодаря это-


69

му стала возможной именно рациональная разработка препаратов, где на основании данных о структуре белка предсказывают тип лигандов, взаимо-действующих с данной мишенью, и таким образом прокладывают путь к открытию снаряда.

В последнее время для опознавания опытных соединений начали при-менять систематические методы. Эти методы основаны на высокопроизводи-тельных отборочных испытаниях, в которых открытие снарядов ускорено за счет высокопараллельных форм для анализа (например 96-луночных план-шетов). В свою очередь внедрение таких технологий требует собрания боль-ших химических библиотек для проведения испытаний. Это стало возмож-ным благодаря методам комбинаторной химии, посредством которых боль-шое число различных соединений может быть синтезировано путем объеди-нения и разделения реагентов между очередными стадиями реакции.

Программы поиска

Прежде чем проводить отсеивающие эксперименты в лабораторных условиях, имеет смысл попытаться собрать как можно больше информации о потенциальных взаимодействиях препарата с мишенью.

Одним из путей получения таких данных является автоматический отборочный поиск в химических базах данных (на соответствие молекуляр-ной мишени с известной структурой). В других случаях структуру соедине-ния можно попытаться определить по подобию с установленной структурой близкой гомологии или предсказать ее с помощью алгоритма протягивания. Если структура белка-мишени известна, то можно применять основанные на критерии адекватности алгоритмы распознавания потенциальных взаи-модействующих лигандов.

Таблица 2

Программное обеспечение имитационного моделирования стыковки, предназначенное для загрузки на ПК

или диалоговой работы в «Интернете» УУР Ж/К Oписание Доступ

1 2 3 4 http://www.scripps.edu/ pub/olson-web/dock. autodock/index.html http://swift.embl- heidelberg.de/ligin/

Г Ж

Autodock LIGIN, устойчивое предска-зание взаимодействия белка с лигандом; ограничено ма-лыми лигандами

Загрузка на ЭВМ с ОС «Юникс» и «Линукс» Загрузка на ЭВМ с ОС «Юникс» или как часть па-кета «УОТИФ» (WHAYIF)


70

Окончание табл. 2 1 2 3 4

http://www.bmm.icnet. Uk/docking/ http://reco3.musc.edu/ gramm/ http://cartan.gmd.de/ flex-bin/FlexX

Ж Ж Г

FTDock и сопутствующие программы. RPScore и mMultiDock могут прогнози-ровать взаимодействия меж-ду белками. Опираются на библиотеку преобразований Фурье GRAMM (Global Range Mole-cular Matching – сопоставле-ние молекул в глобальном масштабе (ГРАММ)) эмпири-ческий метод, основанный на таблицах валентных углов. Достоинство «ГРАММа» со-стоит в возможности работы со структурами низкого каче-ства FlexX вычисляет оптималь-ные молекулярные комплек-сы, состоящие из леганда, связанного на активном уча-стке, и белка, и ранжирует результат

Загрузка на ЭВМ с ОС «Юникс» и «Линукс» Загрузка на ЭВМ с ОС «Юникс» или «Уиндоус» Работа в «Рабо-чем пространстве FlexX» при под-ключении к сер-веру

Примечание. Ж означает «жесткий»; Г означает «гибкий»; эти буквы показывают, что программа оценивает лиганд в качестве жесткой (Ж) или гибкой (Г) молекулы.

К настоящему времени разработано большое число алгоритмов сты-

ковки, которые пытаются подобрать маленькие молекулы к участкам свя-зывания, анализируя информацию о пространственных ограничениях и энергии связей (табл. 2).

Стыковочные алгоритмы

К наиболее общепризнанным алгоритмам (программам) стыковки мож-но отнести «Автодок» (Autodock), «ДОК» (DOCK) и «КомбиДОК» (Combi-DOCK). В «ДОКе» расположение атомов на участке связывания преобразует-ся в упорядоченное множество шаров, называемых точками участка. По рас-стояниям между шарами алгоритм рассчитывает точные размеры участка свя-зывания; вычисленные размеры сопоставляются с информацией из базы дан-ных химических соединений. Найденным соответствиям между участком свя-


71

зывания и потенциальным лигандом назначаются доверительные счета, после чего лиганды ранжируются согласно их полным счетам.

«КомбиДОК» рассматривает каждый потенциальный лиганд как кар-кас, на котором расположены определенные функциональные группы. Сна-чала алгоритм предсказывает возможные варианты стыковки путем анализа расположения шаров (только тех, которые находятся на каркасе), после чего проверяет на совместимость отдельные функциональные группы, используя разнообразные сочетания вращений связей. Наконец, алгоритм производит стыковку и вычисляет общий счет комплекса.

Химические базы данных можно просматривать не только на соответ-ствие участку связывания (поиск взаимодействий комплементарных моле-кул), но также и некоторому лиганду (поиск взаимодействий идентичных молекул). Известно несколько алгоритмов сравнения двумерных или трех-мерных структур и построения профилей подобных молекул.

Установление трехмерной структуры мишени (рентгеноструктурный анализ, ЯМР-интраскопия) есть необходимое условие разработки соедине-ния, которое должно или связываться с ней, или воздействовать на нее. Со-единение выбирают из существующей библиотеки химических соединений путем комбинаторной стыковки структур. Опытные соединения из библио-теки поочередно состыковывают с активным участком молекулярной ми-шени (путем перебора вариантов комплементарной установки). Эта предва-рительная установка in silico сокращает число соединений, которые необхо-димо синтезировать и испытывать in vitro, так как базы данных содержат необходимые (для имитационного моделирования) описания химических свойств и методов синтеза соединений.

Анализ активных центров

Специальный алгоритм имитационного моделирования тщательно анализирует активный участок молекулярной мишени и выстраивает опыт-ное соединение из отдельных фрагментов. Поверхность молекулярной ми-шени, которая должна взаимодействовать со снарядом, может быть окру-жена различными химическими средами, например, зонами гидрофобности, образования водородных связей или каталитической зоной. В эти области последовательно помещают фрагменты гипотетического соединения. Ори-ентация фрагментов дает ключи к пониманию конечной формы опытного соединения.

Для данного вида анализа активных участков применяют программы GRID, GREEN, HISTE, HINT, BUCKTS и др. Иногда целая молекула сразу вписывается в рецепторный или активный участок. «ДОК» – программа, ал-горитм которой построен по принципу «подгонки форм» (рис. 16, 17). Она перебирает все возможные способы подогнать лиганд к рецепторному уча-


72

стку. Участок связывания в молекуле рецептора или фермента содержит области образования водородных связей, а также гидрофобные области.

Первоначально программа помещает и ориентирует молекулу-прототип в активном участке таким образом, чтобы картина была удовле-творительной с точки зрения соответствия, по крайней мере, части энергий связи. Затем последовательно добавляет и подгоняет дополнительные фрагменты до тех пор, пока не будет найдено соответствие всем энергиям связи. Программа «КЛИКС» (CLIX) моделирует варианты расположения точек активного участка и затем ищет в базе данных химические структуры, которые удовлетворяли бы такой имитации.

Программа КОСА

(«количественное отношение структура–активность») При разработке лекарственных препаратов опытные соединения оп-

тимизируют путем добавления к молекулярному каркасу различных функ-циональных групп и проверки каждого производного соединения на его биологическую активность. Если на моделируемой молекуле есть несколько открытых позиций, которые можно заместить, то общее количество моле-кул, которые должны быть проверены во всестороннем отборочном анали-зе, является очень большим.

Синтез и отбор всех этих молекул потребовали бы значительных вре-менных затрат и производственных усилий, – тем более что львиная доля мо-лекул не обладала бы никакой полезной функцией. Оценка по КОСА позволит отобрать только те молекулы, которые с наиболее высокой вероятностью бу-дут иметь полезную активность, и таким образом продвинуться к цели хими-ческого синтеза. КОСА означает «количественное отношение структура–активность» (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR) и представляет собой выраженное в математической форме отношение, которое описывает взаимосвязь структуры молекулы с ее биологической активностью.

А

Б

Рис. 16. Окно Hex: представление в виде проволочного каркаса. А – моле-кулы энзима RmlD (Rv3266c) и лиганда 1 lza до момента стыковки;

Б – очень тесный контакт молекул энзима RmlD (Rv3266c) и лиганда 1 lza после момента стыковки


73

А

Б

Рис. 17. Окно Hex: А – вид гармонической поверхности молекул энзима RmlD (Rv3266c) и лиганда 1 lza после их полной стыковки; Б – мультип-ликационная модель комплекса молекул энзима RmlD (Rv3266c) и ли-

ганда 1 lza Здесь, по существу дела, молекулы рассматриваются как совокупности

молекулярных свойств (параметров), организованных в виде таблицы. Про-грамма «КОСА» просматривает эти данные и пытается находить совмести-мые отношения между отдельными параметрами и биологическими функ-циями и таким образом определить набор правил, которые могут быть ис-пользованы для назначения счета новым молекулам при оценке их потенци-альной активности. КОСА обычно выражают в виде линейного уравнения:

, где P1–Pn – параметры (молекулярные свойства), установленные для каждой молекулы в опытном наборе; C1–Cn – коэффициенты, рассчитываемые пу-тем подгонки параметров молекул к их биологическим функциям.

Как только опытные молекулы определены, они должны быть опти-мизированы в плане потенции, избирательности и фармакокинетических свойств. О высокой биологической усвояемости (всасывании в желудочно-кишечном тракте) говорит наличие следующих четырех качеств: число до-норов водородной связи < 5, акцепторов водорода < 10, относительный мо-лекулярный вес < 500 и липофильность < 5. Лекарства, нацеленные на цен-тральную нервную систему, должны обладать достаточной проницаемо-стью гемоэнцефалического барьера.


74

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Электронный каталог Научной библиотеки ВГУ. – Режим доступа –

(http://www.lib.vsu.ru) 2. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение /

Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с. 3. Иллариошкин С.Н. ДНК-диагностика и медико-генетическое кон-

сультирование / С.Н. Иллариошкин. – М. : Медицинское информационное агентство, 2004. – 207 с.

4. Примроуз С. Геномика. Роль в медицине / С. Примроуз, Р. Твай-мен. – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008. – 277 с.

5. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммуно-логия / Л.Б. Борисов. – М. : Мед. информ. агентство, 2001. – 734 с.

6. Иллариошкин С.Н. ДНК-диагностика и медико-генетическое кон-сультирование / С.Н. Иллариошкин. – М. : Медицинское информационное агентство, 2004. – 207 с.

7. Иммуноферментный анализ / ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхофф. – М. : Мир, 1988.

8. Коничев А.С. Молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А. Сева-стьянова. – М. : Academia, 2003. – 400 с.

9. Лопухов Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микро-биологической диагностике / Л.В. Лопухов, М.В. Эйдельштейн // Лабора-торная диагностика (КМАX). – Т. 2, № 3.

10. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгорит-мы) справочник / под ред. А.И. Карпищенко. – СПб. : Интермедика, 1997. – 304 с.

11. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: справочник : в 2 т. / под ред. А.И. Карпищенко. – СПб. : Интермедика, 1999. – Т. 2. – 656 с.

12. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – М. : Мир, 1999. – 558 с.

13. Игнасимуту С. Основы биоинформатики / С. Игнасимуту. – М.-Ижевск : НИЦ «Регуляторная и хаотическая динамика», Институт компью-терных исследований, 2007. – 320 с.

14. Бородовский М. Задачи и решения по анализу биологических по-следовательностей / М. Бородовский, С. Екишева. – М.-Ижевск : НИЦ «Ре-гуляторная и хаотическая динамика», Институт компьютерных исследова-ний, 2008. – 440 с.

15. Гланц С. Медико-биологическая статистика / пер. с англ. // С. Гланц. – М. : Практика, 1998. – 459 с.

16. Нефедов Е.И. Современная биоинформатика / Е.И. Нефедов, Т.И. Субботина, А.А. Яшин. – М. : Горячая линия. – Телеком, 2005. – 272 с.


75

Учебное издание

Сафонова Ольга Анатольевна, Агарков Александр Алексеевич, Лущик Марина Валерьевна,

Семенихина Анастасия Владимировна, Попова Татьяна Николаевна, Рахманова Татьяна Ивановна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОМЕДИЦИНА

Часть 2

Учебное пособие для вузов

Редактор И.Г. Валынкина Компьютерная верстка Е.Н. Комарчук

Подписано в печать 23.12.2014. Формат 60×84/16 Усл. печ. л. 4,3. Тираж 50 экз. Заказ 638

Издательский дом ВГУ

394000, г. Воронеж, пл. Ленина, 10

Отпечатано в типографии Издательского дома ВГУ 39400, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3


молекулярная биомедицина. часть 2

Healthcare