Лекция 3

Генетические задачи решаются легко Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся их первые попытки окажутся неудачными. неудачными.

Александр Сергеевич Серебровский

1. Анализ наследования отдельных признаков у низших эукариот.

2. Анализ случайной выборки спор.

3. Тетрадный анализ.

4. Анализ совместного наследования признаков у грибов-аскомицетов:

– Тетрадный анализ независимого наследования.– Тетрадный анализ сцепленного наследования.

Картирование генов и центромеры.

Типы тетрад и октад у грибов-аскомицетовТипы тетрад и октад у грибов-аскомицетов

Неупорядоченные (нелинейные) тетрады

Упорядоченные (линейные) тетрады

Sacharomyces cerevisiae

Aspergillus nidulans

Neurospora crassa

У грибов-аскомицетов аскоспоры находятся в одной сумке – аске. Их может быть 4, или если после мейоза сразу происходит митоз – 8. Генетический анализ у низших эукариот проводится либо на случайной выборке спор, либо методом тетрадного анализа, либо путем учета митотических расщеплений. Единицей учета при анализе служат клоны или штаммы – генетически однородные культуры клеток, получаемые при бесполом размножении клеток, содержащих одно ядро.

Для количественного учета мейотических расщеплений на случайной выборке спор в моногибридном скрещивании выделяют гаплоидные продукты мейоза (аскоспоры) в потомстве гибрида, полученного от скрещивания штаммов, различающихся по одному признаку (размер или форма колоний, окраска колоний, ауксотрофность, устойчивость и т.д.). Для этого собирают споры, не загрязненные вегетативными гибридными клетками и клетками родительских форм.

Метод отпечатков (реплик), полноценная, минимальная и селективная среды.

Если родительские формы различаются по аллелям одного гена (B и b), то гетерозигота после мейоза образует два типа спор в равном количестве, и соотношение мутантных и нормальных колоний, выращенных из случайной выборки спор должен быть в этом случае примерно как 1:1. Если признак контролируется не одним, а большим числом генов, то наблюдается отклонение от этого расщепления, например 3:1.

Если в потомстве аскоспор гибрида расщепление отсутствует, то можно предположить, что признак определяется цитоплазматическим фактором.

Расщепления на случайной выборке аскоспор не отличаются от расщепления у высших эукариот в анализирующем скрещивании.

Анализ случайной выборки спорАнализ случайной выборки спор

Тетрадный анализТетрадный анализ – комплекс методов, направленных на определение генотипа особи по генотипу микроспор тетрады или четырех гамет, образованных в результате гаметического расщепления в процессе мейоза. Тетрадный анализ используется при изучении организмов, образующих стабильные, но в последствие распадающиеся тетрады (водоросли, грибы).Поскольку аскоспоры в аске некоторое время сохраняются вместе, можно учесть расщепление в каждой четверке спор, образовавшихся после одного мейоза (или четырех парах спор, если аски восьмиспоровые).

Разделение, проращивание спор и анализ.Разделение, проращивание спор и анализ.

Тетрадный анализТетрадный анализ

1 2 3 4 IIIIIIIVVVI

IIIIIIIVVVI

наличие ростаотсутствие роста

Если происходит расщепление по одной аллельной паре (B и b), то соотношение аскоспор во всех асках должно быть 2B:2b (или 4B:4b, если аски восьмиядерные), что служит прямым доказательством закона чистоты гамет. В тетрадном анализе не сокращают коэффициенты, т.е. не пишут 1B:1b, (такая запись означает, что из 4 (или 8) аскоспор проросло только 2).

ТЕТРАДЫ

Отклонения в расщеплении при моногенном контроле редки и могут быть связаны с конверсией гена. Появление значительного количества тетрад, имеющих отклонение от расщепления 2:2 по изучаемому признаку, например 4:0,3:1, свидетельствует об участии в расщеплении более одного гена. Другие причины отклонений – хромосомные перестройки, анеуплоидия и др., которые снижают жизнеспособность аскоспор и тем самым влияют на расщепление.

Важная особенность тетрадного анализа – возможность картирования Важная особенность тетрадного анализа – возможность картирования центромеры, которая выступает в качестве генетического маркера.центромеры, которая выступает в качестве генетического маркера.В упорядоченных тетрадах картирование центромеры можно сделать на основе расщепления по одному гену, анализируя порядок расположения спор разного генотипа (А и а) в аске.В неупорядоченных тетрадах картирование центромеры можно сделать на основе расщепления по трем генам, анализируя порядок расположения спор разного генотипа в аске.Возможны два типа расхождения хромосом в мейозе, которые определяют порядок расположения спор в аске: расхождение в первом делении мейоза (рIд) и во время второго деления мейоза (рIIд).Если в мейозе в гетерозиготной клетке не происходит кроссинговер между геном и центромерой, то расхождение аллелей идет в первом делении мейоза (рIд), если происходит - во втором делении мейоза (рIIд).


коньюгация (профаза I) после I деления после II деления

коньюгация,кроссинговер в биваленте (профаза I) после I деления после II деления

aa

aa

aa

aa

aa

aa

AA

AA AA

AA

AA

AA

aa

AA

aa

AA

aa

aaAA

AA

aa

AA

aa

AA

отсутствие кроссинговера

наличие кроссинговера

Тетрадный анализТетрадный анализaa

aa

AA

AA

aa

aa

AA

AA

aa

AA

aa

AA

aa

AA

aa

AA

после митоза

после митоза

Аскоспоры в аске

Аскоспоры в аске

1

2

3

4

1

2

3

4

Расхождение аллелей в первом делении мейоза у нейроспоры. Порядок расположения спор в аске aaaaAAAA / AAAAaaaa зависит от ориентации хромосом бивалента в метафазе I деления.

Расхождение аллелей во втором делении мейоза у нейроспоры. Порядок расположения спор в аске определяется ориентацией хромосом бивалента в метафазе I деления и ориентацией хроматид в метафазе II деления. Может иметь 4 варианта: aaAAaaAA / AAaaAAaa / aaAAAAaa / AAaaaaAA.

Общие выводы:• порядок расположения спор в асках нейроспоры позволяет выявить, в каких из них произошел кроссинговер между геном и центромерой, и вычислить, расстояние между ними. • для определения частоты кроссинговера необходимо подсчитать число асков, в которых он произошел (рIIд), и определить их долю среди всех проанализированных асков. Так как в кроссоверном аске только половина спор является кроссоверными, расстояние между геном и центромерой определяют как ½ от доли кроссоверных асков.


В скрещивании между штаммом нейроспоры, продуцирующим черные споры, со штаммом, дающим споры рыжего цвета в поколении гетерозиготы обнаружены аски со следующим расположением спор (всего 146):

Число асковЧисло асковСпоры Споры

1, 21, 2 3, 43, 4 5, 65, 6 7, 87, 8

5858 черныечерные черныечерные рыжиерыжие рыжиерыжие

6262 рыжиерыжие рыжиерыжие черныечерные черныечерные

88 черныечерные рыжиерыжие рыжиерыжие черныечерные

66 рыжиерыжие черныечерные черныечерные рыжиерыжие

55 рыжиерыжие черныечерные рыжиерыжие черныечерные

77 черныечерные рыжиерыжие черныечерные рыжиерыжие

Соотношения спор разной окраски в каждом аске – 4:4, следовательно различия обусловлены аллелями одного гена. Порядок расположения спор в 26 асках свидетельствует о расхождении аллелей во втором делении, т.е. о прошедшем кроссинговере между геном и центромерой. Доля кр.асков=17,8%; расстояние 8,9.

При изучении совместного наследования признаков у грибов При изучении совместного наследования признаков у грибов аскомицетов используют либо анализ случайной выборки аскомицетов используют либо анализ случайной выборки спор, либо метод тетрадного анализа. При использовании спор, либо метод тетрадного анализа. При использовании обоих методов оценивают обоих методов оценивают тип тетрадтип тетрад. Расщепление . Расщепление (соотношение) разных типов тетрад, по двум и более (соотношение) разных типов тетрад, по двум и более генам определяется:генам определяется:• локализацией генов в одной или разных группах сцепления;локализацией генов в одной или разных группах сцепления;• расстоянием генов от своих центромер. расстоянием генов от своих центромер.

Различают Различают • тетрадный анализ независимого наследования признаков;тетрадный анализ независимого наследования признаков;• тетрадный анализ сцепленного наследования признаков тетрадный анализ сцепленного наследования признаков

Анализ совместного наследования признаков Анализ совместного наследования признаков у грибов-аскомицетову грибов-аскомицетов

При независимом наследовании у аскомицетов с упорядоченными При независимом наследовании у аскомицетов с упорядоченными тетрадами (октадами) по каждому гену образуется 6 типов тетрадами (октадами) по каждому гену образуется 6 типов тетрад: ген тетрад: ген A -A - AAaa, aaAA, AaAa, aAaA, AaaA, aAAaAAaa, aaAA, AaAa, aAaA, AaaA, aAAa;; ген ген B - BBbb, B - BBbb, bbBB, BbBb, bBbB, BbbB, bBBbbbBB, BbBb, bBbB, BbbB, bBBb; образование равновероятностное ; образование равновероятностное при отсутствии сцепления с центромерой (более 33%). При этом при отсутствии сцепления с центромерой (более 33%). При этом образуется три типа тетрад с разным сочетанием генов образуется три типа тетрад с разным сочетанием генов A A и и BB::((I) P – I) P – родительский дитип: родительский дитип: AB, AB, ab, ab;AB, AB, ab, ab;(II) N – (II) N – неродительский дитип: неродительский дитип: Ab, Ab, aB, aB;Ab, Ab, aB, aB;(III) T – (III) T – тетратип, содержит 4 разных генотипа: тетратип, содержит 4 разных генотипа: AB, Ab, aB, abAB, Ab, aB, ab.. T-T-тип тетрад возникает только при кроссинговере между генами тип тетрад возникает только при кроссинговере между генами и их центромерами.и их центромерами.

Тетрадный анализ независимого наследованияТетрадный анализ независимого наследования

AA

AAaa

aaотсутствие кроссинговера

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

bb

bbBB

BB

ABAB

ABAB

abab

abab

AbAb

AbAb

aBaB

aBaB

Тип тетрад

PP

NN


AA

AAaa

aa

кроссинговер между одним

геном и его центромерой

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

ABAB

aBaB

AbAb

abab

ABAB

AbAb

aBaB

abab

Тип тетрад

TT

TT

aa

aaAA

AA

BB

BBbb

bb

aa

aaAA

AA

bb

bbBB

BB

aBaB

ABAB

abab

AbAb

abab

aBaB

AbAb

ABAB

TT

TT

AA

aaAA

aa

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

BB

bbBB

bb

aa

AAaa

AA

BB

BBbb

bb

aa

aaAA

AA

bb

BBbb

BB


P – родительский дитип Расщепление по гену А

N – неродительский дитип рIд рIIдT - тетратип AAaa aaAA AaaA aAAa AaAa aAaA

РасщеплениепогенуB

рIдBBbb AB, AB, ab, ab aB, aB, Ab, Ab AB, aB, ab, Ab aB, AB, Ab, ab AB, aB, Ab, ab aB, AB, ab, Ab

bbBB Ab, Ab, aB, aB ab, ab, AB, AB Ab, ab, aB, AB ab, Ab, AB, aB Ab, ab, AB, aB ab, Ab, aB, AB

рIIд

BbbB AB, Ab, ab, aB aB, ab, Ab, AB AB, ab, ab, AB aB, Ab, Ab, aB AB, ab, Ab, aB aB, Ab, ab, AB

bBBb Ab, AB, aB, ab ab, aB, AB, Ab Ab, aB, aB, Ab ab, AB, AB, ab Ab, aB, AB, ab ab, AB, aB, Ab

BbBb AB, Ab, aB, ab aB, ab, AB, Ab AB, ab, aB, Ab aB, Ab, AB, ab AB, ab, AB, ab aB, Ab, aB, Ab

bBbB Ab, AB, ab, aB ab, aB, Ab, AB Ab, aB, ab, AB ab, AB, Ab, aB Ab, aB, Ab, aB ab, AB, ab, AB

Образование разных типов тетрад при независимом наследовании и отсутствии Образование разных типов тетрад при независимом наследовании и отсутствии сцепления между генами и их центромерами в дигибридном скрещивании сцепления между генами и их центромерами в дигибридном скрещивании AB x abAB x ab

Соотношение тетрад разного типа при независимом наследовании и отсутствии сцепления генов с центромерами составляет 6P: 6N: 24T или 1P: 1N: 4T. Соответственно частоты возникновения тетрад каждого типа будут составлять f(P)=f(N)=1/6=0,167 или 16,7%; f(T)=4/6=0,667 или 66,7%;

Ход анализа.Ход анализа.1.1. Из аска по порядку извлечь споры.Из аска по порядку извлечь споры.2.2. Прорастить их на питательных средах (полноценной, минимальной, Прорастить их на питательных средах (полноценной, минимальной,

селективных).селективных).3.3. Определить фенотипические проявления признака.Определить фенотипические проявления признака.4.4. Определить генотип анализируемого организма – генотип споры. Определить генотип анализируемого организма – генотип споры. 5.5. Определить тип тетрады.Определить тип тетрады.6.6. Сформировать группы для асков с тетрадами определенного Сформировать группы для асков с тетрадами определенного

генотипа. генотипа. 7.7. Определить соотношение асков с тетрадами разных типов (Определить соотношение асков с тетрадами разных типов (P, N, T)P, N, T)..8.8. Выдвинуть гипотезу о генотипах родительских организмах и Выдвинуть гипотезу о генотипах родительских организмах и

характере наследования признаков. характере наследования признаков. 9.9. Осуществить статистическую проверку соответствия выдвинутой Осуществить статистическую проверку соответствия выдвинутой

гипотезы с полученными результатами.гипотезы с полученными результатами.10.10. Заказать пироженные и кофе или только кофе.Заказать пироженные и кофе или только кофе.


В упорядоченных тетрадах генотип каждой споры и тип тетрады В упорядоченных тетрадах генотип каждой споры и тип тетрады определяют по росту колоний, выросших из спор, извлеченных из определяют по росту колоний, выросших из спор, извлеченных из аска по порядку, на полной, минимальной и селективной средах. аска по порядку, на полной, минимальной и селективной средах. Число селективных сред зависит от числа маркеров, используемых Число селективных сред зависит от числа маркеров, используемых в скрещивании. Затем суммируют аски с одинаковым типом в скрещивании. Затем суммируют аски с одинаковым типом тетрад, определяют соотношение асков с тетрадами разных тетрад, определяют соотношение асков с тетрадами разных типов (типов (P, N, T)P, N, T) и по и по XX22 проверяют соответствие опытного проверяют соответствие опытного расщепления с теоретически ожидаемым – расщепления с теоретически ожидаемым – 1P: 1N: 4T.1P: 1N: 4T. Применение Применение метода метода XX22 возможно лишь в том случае, когда количество возможно лишь в том случае, когда количество проанализированных тетрад не менее 30.проанализированных тетрад не менее 30.

При сцеплении между генами нарушается соотношение разных При сцеплении между генами нарушается соотношение разных типов тетрад, свойственное независимому наследованию: типов тетрад, свойственное независимому наследованию: увеличивается доля тетрад (увеличивается доля тетрад (I) P – I) P – родительского дитипа (родительского дитипа (AB, AB, AB, AB, ab, abab, ab) и уменьшаются доли ) и уменьшаются доли (II) N – (II) N – неродительского дитипа (неродительского дитипа (Ab, Ab, Ab, aB, aBAb, aB, aB) и ) и (III) T – (III) T – тетратипа (тетратипа (AB, Ab, aB, abAB, Ab, aB, ab).).P-P-тип тетрад возникает при мейотическом делении в отсутствии тип тетрад возникает при мейотическом делении в отсутствии кроссинговера и при наличии двойного кроссинговера на участке кроссинговера и при наличии двойного кроссинговера на участке между генами с участием двух хроматид.между генами с участием двух хроматид.

Тетрадный анализ сцепленного наследованияТетрадный анализ сцепленного наследования

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

ABAB

ABAB

abab

abab

Тип тетрад

PP

отсутствие кроссинговера

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

ABAB

ABAB

abab

abab

PP

двойной кроссинговер на участке между генами с участием двух хроматид


AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

Тип тетрадAA

AAaa

aa

BB

bbBB

bb

ABAB

AbAb

aBaB

abab

TT

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

BB

bbbb

BB

ABAB

AbAb

abab

aBaB

TT

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

bb

BBBB

bb

AbAb

ABAB

aBaB

abab

TT

одиночный кроссинговер на участке между генами с участием двух хроматид

двойной кроссинговер на участке между генами с участием трех хроматид

AA

AAaa

aa

BB

bbBB

bb

AA

AAaa

aa

BB

bbBB

bb

двойной кроссинговер на участке между генами с участием четырех хроматид

AA

AAaa

aa

BB

BBbb

bb

AA

AAaa

aa

bb

bbBB

BB

AbAb

AbAb

aBaB

aBaB

NNAA

AAaa

aa

bb

BBBB

bb

Тетрадный анализ сцепленного наследованияТетрадный анализ сцепленного наследованияЗакономерности и выводы:

-при сцепленном наследовании резко уменьшается доля N-тетрад, так как они возникают только при двойном кроссинговере между генами с участием четырех хроматид;-доля T-тетрад зависит от расстояния между генами и от расстояния между каждым из них и центромерой;-Если частота P-тетрад больше , чем частота N-тетрад, а частота T-тетрад меньше чем ⅔, то это одназначно свидетельствует о сцеплении генов.Так как N-тетрады содержат четыре, а T-тетрады только две кроссоверные хроматиды (споры), то расстояние между генами A и B (DAB) можно определить по частоте N- и T-тетрад:

DAB = f (N) + ½f(T) , в % кроссинговера или сМ.

Так как наблюдаемая частота рекомбинантов не всегда равна истинной частоте произошедших обменов (в случае, когда гены расположены далеко друг от друга), так как множественные обмены по своим последствиям не отличаются от одиночных, а некоторые из них не проявляются фенотипически, вводят поправку. При этом для определения расстояния используют формулу:

DAB = -33,33ln(1-1,5f (T)) , в стрейнах (Стертевант и Холдейн).

Если гены локализованы в разных хромосомах, но тесно сцеплены со своими центромерами, то f(P)=f(N), а f(T)<2/3, так как для появления T-тетрад необходимо прохождение кроссинговера между геном и центромерой. Чем ближе ген расположен к центромере, тем реже появляются T-тетрады. Следовательно, возникновение P и N тетрад при тесном сцеплении генов с центромерами не связано с кроссинговером, поэтому их соотношении остается равным 1:1.

Тетрадный анализ сцепленного наследованияТетрадный анализ сцепленного наследованияПри скрещивании двух штаммов дрожжей, различающихся по трем генам (а) s, t, u X (A) +++ в потомстве гетерозигот, выращенных на соответствующих селективных средах, получили следующие результаты тетрадного анализа:

Число тетрад Тип тетрад

59 stu stu STU STU

53 sTu sTu StU StU

26 stU StU sTu STu

30 sTU STU stu Stu32

200 stu StU sTu STU

Тип тетрад для каждой пары Тип тетрад для каждой пары геновгенов Число Число

тетрадтетрадs - ts - t s - us - u t - ut - u

P P P 59N P N 53T T N 26T T P 30T P T 32

АнализОпределяем тип тетрад и расщепление по каждой паре отдельно:

Гены s и u локализованы в одной хромосоме на расстоянии 14 % кроссинговера.Ген t локализован в другой хромосоме и тесно сцеплен со своей центромерой.

Расщепление Расщепление s-t:s-t:59P:53N:88T, 1:1:4 x2=32,9 p<0,01. P=N, T< 2/3,-гены в разных хромосомах, -тесно сцеплены со своими центромерами.

Расщепление Расщепление s-u:s-u:144P:56T, P>N, T< 2/3, N=0, -гены сцеплены Dsu= ½*56/200=14%Dsu= -33,33ln(1-1,5*56/200)=18.1%

Расщепление Расщепление t-u:t-u:89P:79N:32T, P=N, T< 2/3, -гены в разных хромосомах,-тесно сцеплены со своими центромерами.


При скрещивании двух штаммов нейроспоры: дикого типа и ауксотрофа по аденину и триптофану (A) ++ X (a) ade try получили следующие результаты тетрадного анализа:

Число асковЧисло асковаскоспорыаскоспоры

1 и 21 и 2 3 и 43 и 4 5 и 65 и 6 7 и 87 и 8147 ade try ade try + + + +91 ade try ade + + try + +23 ade try + + ade try + +22 ade + ade + + try + try8 ade try + try ade + + +

7 ade try + + + try ade +

2 ade + + try ade + + try

Задачи:Задачи:-определить сцеплены ли гены;определить сцеплены ли гены;-если гены сцеплены, то определить их положение относительно если гены сцеплены, то определить их положение относительно центромеры, построить карту;центромеры, построить карту;-если гены не сцеплены, то локализовать их относительно их центромер если гены не сцеплены, то локализовать их относительно их центромер (по возможности).(по возможности).

Можно ли на основании приведенных данных картировать эти гены? Можно ли на основании приведенных данных картировать эти гены? Сказать все, что Вы думаете по этому поводу…Сказать все, что Вы думаете по этому поводу…

Тетрадный анализ сцепленного наследованияТетрадный анализ сцепленного наследованияПри скрещивании двух штаммов нейроспоры: дикого типа и ауксотрофа по аденину и триптофану (A) ++ X (a) ade try получили следующие результаты тетрадного анализа:

Число Число асковасков (300)(300)

аскоспорыаскоспоры

1 и 21 и 2 3 и 43 и 4 5 и 65 и 6 7 и 87 и 8

147 ade try ade try + + + +91 ade try ade + + try + +23 ade try + + ade try + +22 ade + ade + + try + try8 ade try + try ade + + +7 ade try + + + try ade +2 ade + + try ade + + try

АнализОпределяем тип октад и их соотношение.Определяем тип октад и их соотношение.

170P : 24N : 106T - Уменьшение доли N-октад по сравнению с P-октадами и появление T-октад в количестве меньшем чем 2/3 свидетельствует о сцеплении генов.

На основании этих данных строим карту участка хромосомы, включающего центромеру, гены ade и try:

Определяем расстояние между генамиОпределяем расстояние между генами ade ade и и trytryПроцент кроссинговера между ними

cоставляет:f(N) + ½f(T) = 24/300 + ½*106/300 = 0,257*100%

= 25,7% ±2,5%Определяем тип октад и расщепление по

каждому гену отдельно:

Расщепление по гену Расщепление по гену ade:ade:В 40 асках расхождение аллелей гена ade

произошло во втором делении мейоза: ade+ade+ (23+8+2) и ade++ade (7)

Соответственно расстояние между геном ade и центромерой составляет:

½ 40/300 = 0,066 * 100% = 6,6%

Расщепление по гену Расщепление по гену try:try:В 123 асках расхождение аллелей гена try

произошло во втором делении мейоза: try+try+ (91+23+7) и +try+try (2)

Соответственно расстояние между геном try и центромерой составляет:

½ 123/300 = 0,205 * 100% = 20,5%

6,6 % 20,5 %ade try

Лекция 3

Documents