کشت بافت و كلون نمودن گياهي

كلون نمودن گياهی

- انجام کشت بافت2 - تهيه محيط کشت1

پايه و اساس کشت بافت ، قرار دادن يک قطعه از بافت گياهی روی محيط کشت سترون ،

تشکيل کالوس رشد و تمايز کالوس، تشکيل گياهانی هم ارز با گياه مادر

in vitroاصول اصلی کشت - ايجاد محيط استريل در شيشه بسته ، با نفوذ کم1

- ايجاد محيط کشت مصنوعی مايع و جامد2

- شرايط محيطی تقريبا ثابت دما ، رطوبت و نور3

در گياه ايجاد می کندco-tolerance- محيط کشت يک سيستم 4 استرس اول پيش تيماری برای استرس دوم است.

توليدپروتئين های چاپرون

انتقال از محيط -3کشت به خاک

انواع کشت

باال - کشت سازمان يافته : کشت بذر و کشت جنين1 اكس‍ي�ن به ن‍ياز

- کشت سازمان نيافته:2 گرفتن بافت از بخش تمايز نيافته گياه

رشد به صورت تشکيل کالوس يا سوسپانسيون سلولی استمثال : کشت مريستم ، کشت انتهای ساقه ، کشت کالوس و کشت سلول و

پروتوپالستباال بودن تراکم هورمون

- کشت حد واسط : کشت بافت تمايز يافته 3 کشت سلول و پروتوپالست با غلظت هورمونی معين

گیاه و کالوس تشکیلکامل

پس از .( P. vera L ) كشت محور جنيني پسته� روز از كشت30گذشت

روز از كشت30پس از گذشت .(P. vera L) كشت محور جنيني پسته

يك هفته پس از واكشت Zataria multifloraگياهچه هاي

سه هفته پس از واكشت Zataria multifloraگياهچه هاي

مشکل های موجود در محيط In-vitroکشت

جدا ساختن يک قطعه بافت يا سلول

(wounding) ايجاد استرس زخم

ايجاداسترس اکسيژن اکسيداتيو

)ROS )Reactive oxygen speciesتوليد

سنتتازAccالقا ژن کد کننده

افزايش توليد اتيلن در محيط کشت

افزايش پيری و عدم توسعه بافت يا ناتوانی رشد پروتوپالست

به محيط کشت مهار پيريدوکسال AVG يا AgNo3راه حل: الف- افزودن سنتتاز -ACCفسفات کوفاکتور

ايراد : اثر سميت و ايجاد موتاسيون بسته به نوع گياه

(sub culture)ب- انجام واکشت ايراد : افزايش ريسک آلودگی با باکتری و قارچ

In-vitro- وجود رطوبت باال در کشت 2

کاهش مقدار کلسيم در مريستم آپکس ساقه در نتيجه دچار نکروز آپکسی می شويم

راه حل : الف- دمای اتاق کشت را پائين انتخاب می کنيم تا رشد کم شود و از نکروز بافتی حاصل از کمبود کلسيم جلوگيری شود

ب- افزايش مقدار کلسيم کلريد به محيط کشت ، ايراد : بسته به نوع بافت و تفاوت ژنتيکی گياه حساسيت به کلر پس سولفات

کلسيم

کاهش تعرق باعث می شود حرکت آب داخل گياهچه ها کاهش يابد + کلسيم

يک عنصر کم تحرک

- باال بودن ميزان نمک های محيط مانع رشد گونه های حساس به نمک 3 (1985 )نپل ، Kalmia و Rhododendronمانند گياهان جنس

- همه کار ها بايد در شرايط استريل باشد4

Murashige and Skoog (1962)کمتر بودن نسبی ميزان نمک ها محيط کشت باعث استفاده بيشتر از اين محيط بعنوان کشت پايه شده است + باعث افزايش

سازگاری گياهچه ها در زمان انتقال به خاک

Murashige and Skoog (1962) تهيه محيط کشت

- آب مقطر استريل و ديونيزه1نکته : شيشه غالبا حاوی ذرات فوق العاده ريز سرب و ارسنيک است لذا ذخيره آب استريل

در بطری های پالستيکی يا شيشه پيرکس می باشد

به صورت(N, P, K, S, Mg, Ca)- عناصر پرمصرف 2MgSo4 , 7H2O - KH2Po4 – KNo3 –NH4No3

NH4 نکته : در ابتدا بافت بيشتر از استفاده می کند زيرا:+

رشد کمترجذب نيترات توسط بافت مستلزم مصرف انرژی بيشتر NH4جذب بيشتر

محيط مناسب کشت را کاهش می دهد pH به تدريج +

NO3 پس جذب ازت در فرم ارجحيت می يابد -

جداگانه تهيه می کنيم ( CaCl2 )نکته : چون مقداری کلسيم با فسفر رسوب می دهد آن را

�به�صورت(B, Fe, Mn, Zn, Mo, Cu, Co) ���عناصر کم مصرف

H3Bo3 - Mno4 , 4H2O - ZnSO4 , 7H2O Na2MoO4 , 2H2O - CuSO4 , 5H2O - CoCl2 , 6H2O

مانع از (FeSO4 , 7H2O - Na2EDTA) نکته : استفاده از آهن به صورت شالته واکنش نمک ها با يکديگر شده و از رسوب آنها جلوگيری می کند.

ترتيب شالته شدن يونها به صورت : Fe2+ , Cu2+, Zn2+, Co2+, Mn2+, Ca2+

بهتر است که ماکروالمنت ها و ميکروالمنت ها جداگانه تهيه ونگهداری شود ، وقتی با هم تهيه شوند ميکروارگانيسم ها بهتر در

آنها رشد می کنندفساد سريع تر

: MSويتامين های محيط - پيريدوکسين3اسيد نيکوتينيک -2- تيامين 1

mlسوکروز در gr30کربوهيدرات : )

1000)

دليل افزودن قند در محيط کشت :محيط کشت به CO2ميزان نور و غلظت

اندازه کافی نيست

تا سيستم فتوسنتزی گياه خيلی فعال باشد

نقش های فند در محيط کشت چيستمنبع انرزی و رشد بافتريزوزنز در اثر کنش با اکسين اثر اسموتيک بر بافت ها که محرک تمايز

بافت است

تنظيم کننده های رشدبرای کشت کالوس ، پروتوپالست و

سوسپانسيون سلولی

کاهش sub cultureپس از چند بار نياز بافت به هورمون اگزوزن

سنتز هورمون آندوژن

هورمون های بکار رفته

(D - NAA- IBA, IAA 2,4) - اکسين 1

(BAو BAP- سيتو کينين ) کينيتين ، 2

سيتوکينين-تحريک رشد و نمو ، تحريک ساقه زايی

در تراکم باال

MSساير فاکتور های محيط گليسين ، اينوزيتول و کازوئين هيدرات

محيط کشتpHتعيين قبل از افزودن آگار اندازه می گيريم

pH 6/5-8/5 مناسب

خيلی پائين رودpHاگر B1- ناپايداری اکسين و ويتامين 1

- محيط کشت جامد آبکی می شود2- جذب يون های آمونيوم کند می شود3

اکسين -ريزوژنز در گياهان علفی نياز

به غلظت کم اکسين يا (IAA) اکسين ضعيف

در علظت های زياد اکسين ، تشکيل ريشه صورت

نمی گيرد بلکه

تشديد جنين زايی در کشت های سوسپانسيون

، حتی D-2,4استفاده از المقدور محدود شود زيرا :

باعث موتاسيونمانع ار فتوسنتز

تشديد تشکيل کالوس

محيط کشت جامد

محاسن- بعنوان پشتيبان و نگهدارنده بافت 1

کشت يافته محيط کشتpH- تثبيت کننده 2vitrification- جلوگيری از رشد پديده 3

معايب آگار تاثير سديم و مسغلظت باالی

سمی بر بافتافزايش استرس اسموتيک

توسط آگار سيتوکينينجذب شديد باعث براحتی در اختيار بافت قرار

نگيرد

مایع کشت محیط

محاسن- رشد بافت سريع تر1- عوض کردن محيط کشت آسان تر و 2

ارزانتر- عدم وجود مشکل جذب سيتوکينين3- تهيه کشت سوسپانسيون سلولی تا 4

سلول ها به هم نچسبند

معايبگياهچه - مشکل شيشه ای شدن بافت ها ) 1

(ها نيمه شفاف ، ضخيم ، ترد و شکننده - کاهش قطبيت و تمايز سلول ها در نتيجه 2

کاهش مورفوژنز تماس سلول ها

انتقال بافت و محيط کشت به يک محل استريل

انجام کشت

انتقال به اتاق کشت روشنايی h 16 تاريکی / C 25 h 8°دما

لوکس10000ميزان نور

انواع آلودگی پس از کشت

روز يک پرده سفيد 2-3- اگزوژن : 1رنگ اطراف بافت

- آندوژن : پس از يک ماه پرده سفيد 2ظاهر می شود

افزودن آنتی بيوتيک باعث فيتو توکسيک و گزينش گونه های مقاوم

ميکروارگانيسم

پس ار تهيه محيط کشتاستريل نمودن محيط کشت

At 5/1 – 15 و فشار C 121°- اتوکالو 1

سرعت ، سهولت ، نابودی ميکروب ها و عدم جذب مواد

و تجزيه مواد کشت مانند pH 5/0-3/0کاهش ويتامين ها

قهوه ای شدن قند ها - استريل کردن با فيلتر2

وجود مواد حساس به حرارت در محيط های مايع

معايب وقتگير ، جذب مواد و عبور احتمالی ويروسها

استريل مواد گياهی درصد مانع دهيدراته 70- الکل 12 -H2O2 10%% 1- هيپوکلريت سديم 3

هر مرحله سه بار شتشو

انتقال نمونه از محيط کشت ، به خاک

ex vitroپس گياهچه ها هنوز در شرايط اتوترف نيست

تعرق کوتيکولی و باز ex vitroدر شرايط بودن

روزنه ها آب زيادی از دست می دهند

حمله انواع پاتوزن هاex vitro در شرايط

نتيجه : نابودی گياهچه ها

ويژگی های گياهچه های رشد يافته در In vitroشرايط

ا- داشتن برگ های نازک و نرم با توان فتوسنتزی پايين

- کوتيکول گياه توسعه کمی دارد)کمی 2موم کوتيکوالری(

- روزنه ها به خوبی عمل نمی کنند 3

- فضای خالی مزوفيل در اين گياهان 4بزرگتر است

- ارتباط ضعيف سيستم آوندی ريشه و 5ساقه

- عدم کنش ريشه گياه با باکتری ها و 6قارچ های خاک

راههای افزايش سازگاری گياهچه ها استفاده از محيط های کشت با کاهش تدريجی قند

به تدريج رطوبت نسبی را در شرايطIn-vitroکاهش داد ، الف- باز کردن درب ظرف کشت و قرار دادن آن به مدت چند روز در يک محيط

تشکيل کوتيکول و توسعه سيستم آوندیاستريل

ب- همزمان افزايشCO2 ، (1986 و نور محيط ) دستجاردنيز و همکاران

تيمارگياهچههاباSAبکارگيریاگزوژندرگياهچههایتنباکوافزايشمقاومتنسبتبهاسترس

آبيوتيکوبيوتيکهای)Murphy et al. 2000 (

فروبردناندامهایهوايیدرمحلولاکسين

قراردادن گياهچه ها در خاک استريل

-استفاده از قارچ کش ها نظير پريوکورN.در خاکی که الک ريز رد شده است

پوشاندن سطح محل کشت طبيعی با پالستيک باعث افزايشRH

exنقش اسيد ساليسيليک درافزايش مقاومت گياهچه ها نسبت به شرايط vitroچيست؟

ROS همراه با افرايش SAافرايش

افزايش بيان دامنه ای از ژن های دفاعی

(PRS)افزايش پروتئين های وابسته به استرس

(SAR)ايجاد پديده مقاومت سيستميک اکتسابی

افزايش مقاومت گياهجه در برابر پاتوژن ها و استرس های آبيوتيک

کاربرد های کلون نمودن گياهی

- توليد متابوليت های ثانويه در کشت بافت1روش:

ژنوتيپ گياهی با توليد متابوليت ثانويه باال

تشکيل کالوس گياه

کشت فطعات کال در محيط کشت مايع بر روی شيکر اربيتال

علت استفاده از اين روش سنتز شيميايی مواد گياهی با خواص دارويی ميسر نباشد

منبع گياهی محدود نواحی اکولوژيکی محدود باشد

ثانویه متابولیت و سلولی سوسپانسیون کشت تولید

چند نکته در توليد متابوليت گياهی

توليد متابوليت ثانويه در بافت تمايز يافته

بهترين نوع کشت متابوليت ثانويه وارد محيط کشت شودپس بايد نفوذ پذيری غشاء و ديواره را نسبت به عبور متابوليت افزايش داد دی

متيل سولفوکسيد

mediumآزاد شدن آنزيم ها توسط گياه به

پس بايد محيط به طور مداوم عوض شود

از بين رفتن تاثير فيدبک منفی ناشی از تجمع در نتيجه ميزان متابوليت متابوليت

متابوليت های ثانويه مواد آللو شيميکال بعنوان مکانيسم دفاعی جهت مهار پاتوژن ها يا گياهان ديگر توليد

می شوند

متابولیت خرابی

چند مثال ازتوليد متابوليت های ثانويه در محيط کشت

بعنوان داروی ضد سرطان از کاتارانتوس vinblastineالف- توليد

, furanocomarins) توليد کومارين ها Ammi majus , Ruta graveolensب- umbelliferone) داروی ضد التهاب و تهيه اسپکتورانت درمان ms آنتی باکتريال ،

و ضد قارچ

داروی خلط آور و اسپکتورانتemetine توليد Cephaelis ipecacuanhaج-

و hyoscyamine مانند tropane توليد آلکالوئيد های Solanaceaeد- گونه های مختلف Scopolamine

گشاد کننده مردمک ، ضد اسپاسم ، بی حس کننده درد و مسکن

راههای افزايش متابوليت های ثانويه

کشت همزمان بافت گياهی با يک ميکروارگانيسم يا بافت co-cultivation- انجام 1گياهی ديگر

از طريق سيستم ژنتيک گياه S.Mباکتری يا گياه فعال کننده Ruta. graveolens و Ammi. Majusمثال : کشت همزمان

Ammi. Majus Ruta. Graveolens FCتوليد

تمايز - ايجاد استرس های تغذيه ای کمبود نيترات رشد 2

- استفاده از تنظيم کننده های رشد که تمايز کال 3

مانند آگروباکتريوم ريزوژنز باعث افزايش بيومس ريشه جنس elicitor- استفاده از4Panex

و افزايش سافونين )تری ترپن (

- اپتيمم نمودن رشد سلول ها ی گياهی در بيوراکتور ها5

سوبسترا و پیشساز بعنوان آمبلیفرون

- بيماری شناسی گياهی 2امکان مطالعه تاثير پاتوژن خاص بدون دخالت عوامل ميکروبی ديگر

در اصالح نباتات

توليد شيمر ها ،

توليد گياهان تريپلوئيد و تتراپلوئيد

القای موتاسيون در شرايط ابن ويترو مانند ايجاد انواع جهش يافته گل های داوودی با رنگ های متنوع

- در كشت جنين .............1الف- با تشكيل كالوس همراه است ب- نوعي كشت سازمان نيافته

استج- غالبا نياز به افزودن هورمون به محيط دارد د- در موارد خاص از ژيبرلين

استفاده مي شود

-به هنگام كشت بافت ، اولين پيامد ناشي از استرس زخم چيست؟2 در محيط ب- افزايش توليد اتيلنROSالف- افزايش توليد

- سنتتاز ACCج-القاء سنتز اسيد ساليسيليك د- الفاء ژن

نمي باشند؟- گياهچه هاي حاصل از كشت بافت ، با كدام مشكل مواجه 3الف- نكروز آپكسي حاصل از كلسيم ب- فعال نبودن چندان سيستم

فتوسنتزي ج- تجمع اتيلن در محيط د- تعرق شديد

- تهيه كدام ماكرو المنت، بايد جداي از ماكروالمنت ها ديگر صورت بگيرد؟4 P د- K ج- Ca ب- Mg الف-

5 به هنگام كاهش -pH مشاهده نمي شود؟ محيط كشت ،كدام اثرالف- ناپايداري اكسين ب- سفت تر شدن محيط كشت جامد

B1ج- كاهش جذب يون هاي آمونيوم د- ناپايداري ويتامين

- كداميك از معايب محيط كشت جامد مي باشد؟6الف- مشكل رشد شيشه اي بافت ب- كاهش تمايز بافت ها

ج- كمبود سيتوكينين د- ترد و شكننده بودن گياهچه ها

انجام نشود؟- كدام يك از اعمال زير به هنگام تهيه محيط كشت بهتر است ، 7 ب- استفده از آهن به D-2,4الف- استفاده از

صورت شالته محيط كشت قبل از افزودن آگار د – تهيه جداگانه ماكروالمنت pHج- تعيين

ها و ميكروالمنت ها

8 به منظور حذف كدام نوع آلودگي، از آنتي بيوتيك استفاده مي شود و تاثير -منفي اين كار چيست؟

الف- آندوژن – قهوه اي شدن قند ها ب- آندو ژن – پديده فيتوتوكسيكج- اگزوژن – قهوه اي شدن بافت ج- اگزوژن - پديده

فيتوتوكسيك

9 بكار بردن كدام عامل ، هنگام انتقال گياهچه به خاك ، سيستم فتوسنتزي-گياه را فعال

مي كندالف- كاهش تدريجي تراكم قند محيط كشت ب- افزايش نور

محيط د- CO2ج- افزايش SAباهاگياهچهتيمار

- كدام عامل باعث افزايش توليد متابوليت ثانويه نمي شود10 ب- ايجاد استرس های تغذيه ای co-cultivationانجام الف-

ج- كاهش تمايز بافت د – عوض كردن مداوم محيط كشت

بقایی : بهروز تنظیم و تهیه