胶质瘤干胶质瘤干 // 祖细胞祖细胞放射耐受机制的初步研究放射耐受机制的初步研究

董 军 黄 强董 军 黄 强苏州大学附属第二医院神经外科苏州大学附属第二医院神经外科

治疗效果仍不满意！治疗效果仍不满意！？？

放射治疗是胶质瘤患者重要的治疗手段，放射治疗是胶质瘤患者重要的治疗手段，但绝大多数患者在照射野中复发，提示受但绝大多数患者在照射野中复发，提示受照射的肿瘤细胞群体中有一小部分细胞能照射的肿瘤细胞群体中有一小部分细胞能够耐受辐射，可能是肿瘤复发的根源 够耐受辐射，可能是肿瘤复发的根源

SinghSingh 在在 20032003 年成功分离出了胶质瘤年成功分离出了胶质瘤干细胞，并提出胶质瘤干细胞可能是干细胞，并提出胶质瘤干细胞可能是决定胶质瘤发生、发展、恶性进展、决定胶质瘤发生、发展、恶性进展、复发以及对放化疗敏感与否的关键细复发以及对放化疗敏感与否的关键细胞胞

胶质瘤干细胞可能是放射耐受的责任胶质瘤干细胞可能是放射耐受的责任细胞细胞

但其分子机制不明，有关文献报道可但其分子机制不明，有关文献报道可能与其能与其 DNADNA 损伤修复能力强有关损伤修复能力强有关

材料与方法材料与方法 人脑胶质瘤干人脑胶质瘤干 // 祖细胞系祖细胞系 SU-2SU-2 、、 SU-3SU-3 为我实验室自建，人为我实验室自建，人

脑胶质瘤细胞株脑胶质瘤细胞株 U-87MGU-87MG 、、 U-251U-251 购自购自 ATCCATCC 细胞培养试剂：细胞培养试剂：

DMEMDMEM 、、 DMEM+F12DMEM+F12 、、 FCSFCS 、、 B27B27 、、 EGFEGF 、、 bFGFbFGF 等等 PEPE 标记小鼠抗人标记小鼠抗人 CD133CD133 流式试剂盒（流式试剂盒（ Miltenyi BiotecMiltenyi Biotec ）， ），

FITCFITC 标记小鼠抗人标记小鼠抗人 NestinNestin 流式试剂盒（流式试剂盒（ R&DR&D ）， ）， PEPE 标记标记小鼠抗人小鼠抗人 GFAPGFAP 流式试剂盒（流式试剂盒（ Santa CruzSanta Cruz ），细胞周期流式），细胞周期流式试剂盒（联科生物公司），凋亡流式试剂盒 （试剂盒（联科生物公司），凋亡流式试剂盒 （ InvitrogenInvitrogen ））

CD133CD133 引物、探针、反转录试剂盒、荧光定量引物、探针、反转录试剂盒、荧光定量 PCRPCR 试剂盒 试剂盒

（ （ ShineGeneShineGene 公司）公司） DNADNA 损伤信号通路损伤信号通路 PCRPCR 芯片（芯片（ SabiosciencesSabiosciences ））

细胞培养细胞培养

将上述将上述 44 种细胞分别置于含种细胞分别置于含 10% FCS10% FCS 的的DMEM DMEM 和无血清的 和无血清的 DMEM+F12DMEM+F12 基础培养基础培养基（含基（含 2% B272% B27 添加剂、添加剂、 20ng/ml bFGF20ng/ml bFGF 和和20ng/ml EGF20ng/ml EGF ）中培养，）中培养， 4848 ～～ 72h72h 后倒置后倒置相差显微镜下观察细胞形态相差显微镜下观察细胞形态

流式细胞术检测流式细胞术检测 CD133CD133++ 细胞比例细胞比例 流式细胞术检测流式细胞术检测 Nestin+Nestin+ 细胞比例细胞比例 流式细胞术检测流式细胞术检测 GFAP+GFAP+ 细胞比例细胞比例 流式细胞术检测细胞周期流式细胞术检测细胞周期 流式细胞术检测细胞凋亡比例流式细胞术检测细胞凋亡比例

将将 44 种干细胞培养条件下的干细胞球通过直线加种干细胞培养条件下的干细胞球通过直线加速器对细胞进行照射速器对细胞进行照射

照射剂量分别为照射剂量分别为 5Gy5Gy 、、 10Gy10Gy 、、 15 Gy15 Gy ，分别于，分别于照射后照射后 24h24h 、、 48h48h 、、 72h72h 收集细胞，流式细胞术收集细胞，流式细胞术检测照射前后胶质瘤干检测照射前后胶质瘤干 // 祖细胞中祖细胞中CD133+ CD133+  、、 Nestin+Nestin+ 、、 GFAP+GFAP+ 细胞比例变化及细胞比例变化及实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 检测检测 CD133CD133 基因表达变化基因表达变化

采用采用 DNADNA 损伤信号通路损伤信号通路 PCRPCR 芯片检测干细胞培芯片检测干细胞培养条件下养条件下 U-87MGU-87MG 肿瘤干肿瘤干 // 祖细胞照射（祖细胞照射（ 10Gy,10Gy, 72h72h ）前后相关基因表达水平变化）前后相关基因表达水平变化

实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 检测胶质瘤干细胞与分化状态检测胶质瘤干细胞与分化状态的胶质瘤细胞中的胶质瘤细胞中 CD133CD133 基因表达水平变化基因表达水平变化

试剂盒法抽提细胞的总试剂盒法抽提细胞的总 RNARNA 逆转录成逆转录成 cDNAcDNA 加入相应的引物，按照加入相应的引物，按照 Sybr Green ISybr Green I 试剂盒说明，试剂盒说明，

以及定量以及定量 PCRPCR 仪器操作步骤，检测仪器操作步骤，检测 CD133CD133 拷贝数拷贝数。。

以人以人 GAPDH GAPDH 作为内参照，以同一份样品作为内参照，以同一份样品 CD133CD133拷贝数拷贝数 /GAPDH/GAPDH 拷贝数表示该基因在样品中的表达拷贝数表示该基因在样品中的表达水平水平

CD133CD133 基因扩增引物基因扩增引物 hPROM1F AGAGGCGTTGGAGAACATGAAChPROM1F AGAGGCGTTGGAGAACATGAAC hPROM1R GCTAGTTTTCACGCTGGTCAGAhPROM1R GCTAGTTTTCACGCTGGTCAGA

GAPDHGAPDH 基因引物序列基因引物序列 GAPDH-FGAPDH-F CCACTCCTCCACCTTTGACCCACTCCTCCACCTTTGAC GAPDH-RGAPDH-R ACCCTGTTGCTGTAGCCAACCCTGTTGCTGTAGCCA

结 果结 果

干细胞培养条件下肿瘤干细胞球与干细胞培养条件下肿瘤干细胞球与分化条件下细胞形态学比较分化条件下细胞形态学比较

U-87MG U-251 SU-2 SU-3

GCs (glioma cells)GCs (glioma cells) ：分化条件下培养的胶质瘤细胞：分化条件下培养的胶质瘤细胞

GSPCs (glioma stem /progenitor cells)GSPCs (glioma stem /progenitor cells) ：干细胞培养条件下：干细胞培养条件下的胶质瘤干的胶质瘤干 // 祖细胞祖细胞

两种培养条件下两种培养条件下 44 株细胞中株细胞中 CD133CD133、、 NestinNestin 、、 GFAP+GFAP+ 细胞比例检测细胞比例检测

U-251 SU-3 U-87MG SU-20

1

2

3

4

5

6

GCs

GSPCs

**##

*

#

CD

133+

ϸ°û

±ÈÀ

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U-251 SU-3 U-87MG SU-20

25

50

75

100GCs

GSPCs

* ##

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#

Nes

tin

+ϸ

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U-251 SU-3 U-87MG SU-20

10

20

30

40GCs

GSPCs

*#

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##

GF

AP

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CD133 Nestin GFAP0

25

50

75

100GCs

GSPCs

ϸ°û

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两种培养条件下细胞周期测定两种培养条件下细胞周期测定 G0 ～ G1 S G2 ～ M

U-251 （ GCs ）

U-251 （ GSPCs ）

SU-3 （ GCs ）

SU-3 （ GSPCs ）

U-87MG （ GCs ）

U-87MG （ GSPCs）

SU-2 （ GCs ）

SU-2 （ GSPCs ）

60.28%±1.93% 18.79%±1.35% 20.91%±1.47%

83.09%±1.86% 3.38%±0.79% 13.53%±1.15%

51.66%±1.27% 29.93%±1.19% 18.41%±1.21%

60.83%±1.89% 23.27%±0.92% 15.87%±1.62%

53.03%±1.66% 18.28%±1.13% 28.69%±0.85%

61.64%±2.52% 15.24%±1.36% 22.41%±1.43%

58.85%±2.71% 16.37%±1.74% 24.72%±1.51%

72.14%±2.29% 9.43%±0.82% 18.41%±1.66%

G0~G1 S G2~M0

25

50

75GCs

GSPCs

ϸ°û

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两种培养条件下细胞周期测定两种培养条件下细胞周期测定

两种培养条件下两种培养条件下 44 株细胞株细胞凋亡细胞比例的检测凋亡细胞比例的检测

U-251 SU-3 U-87MG SU-20.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7GCs

GSPCs

*#

**##

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GCs GSPCs0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

µò

Íöϸ

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©

两种培养条件下各细胞株中两种培养条件下各细胞株中 CD133CD133基因表达水平测定基因表达水平测定

U-251 SU-3 U-87MG SU-2

GCs 0.081±0.009 0.065±0.007 0.134±0.012 0.109±0.010

GSPCs 0.213±0.013 0.376±0.019 0.311±0.016 0.461±0.014

U-251 SU-3 U-87MG SU-20.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 GCs

GSPCs

*

##

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#

CD

13

3Ïà

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结果结果

干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞系中干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞系中CD133+CD133+ 、、 Nestin+Nestin+ 细胞比例及细胞比例及 CD133CD133 基因基因表达水平均明显高于分化培养条件（表达水平均明显高于分化培养条件（ PP ＜＜0.010.01 ），干细胞培养条件下，），干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞各胶质瘤细胞球体中球体中 G0G0 ～～ G1G1 期细胞比例高于分化条件期细胞比例高于分化条件下贴壁生长的瘤细胞，而凋亡细胞比例较后下贴壁生长的瘤细胞，而凋亡细胞比例较后者为低者为低

干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞系中干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞系中Nestin+Nestin+ 细胞占绝大多数，细胞占绝大多数， CD133+CD133+ 细胞波动细胞波动于于 1%1% ～～ 5% ，提示干细胞培养条件下所获，提示干细胞培养条件下所获得的细胞球为干细胞和祖细胞的混合细胞群得的细胞球为干细胞和祖细胞的混合细胞群

CD133+CD133+ 细胞比例越高，细胞球形态越规则细胞比例越高，细胞球形态越规则、越致密、干性强、越致密、干性强

流式细胞术检测四株流式细胞术检测四株 GSPCs GSPCs 放射后放射后CD133+CD133+ 细胞比例的变化细胞比例的变化

5Gy 10Gy 15Gy0

10

20δÕÕÉäÕÕÉäºó24hÕÕÉäºó48hÕÕÉäºó72h

CD

13

3+

ϸ°û

±ÈÀ

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四株四株 GSPCs GSPCs 放射后放射后Nestin+Nestin+ 细胞比例的变化细胞比例的变化

5Gy 10Gy 15Gy0

25

50

75

100δÕÕÉäÕÕÉäºó24h

ÕÕÉäºó48hÕÕÉäºó72h

Ne

sti

n+

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四株四株 GSPCs GSPCs 放射后放射后GFAP+GFAP+ 细胞比例变化细胞比例变化

5Gy 10Gy 15Gy0

10

20

30δÕÕÉäÕÕÉäºó24hÕÕÉäºó48hÕÕÉäºó72h

GF

AP

+ϸ

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Àý

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实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 检测各检测各 GSPCsGSPCs 放射放射后后 CD133CD133 基因表达水平变化基因表达水平变化

U-251 SU-3 U-87MG SU-2

放射前 0.213±0.013 0.376±0.019 0.311±0.016 0.461±0.014

剂量剂量 5Gy 10Gy 15Gy 5Gy 10Gy 15Gy 5Gy 10Gy 15Gy 5Gy 10Gy 15Gy

放射后24h

0.287±

0.018

0.704±

0.024

0.514±

0.016

0.529±

0.017

1.048±

0.026

0.766±

0.021

0.522±

0.021

0.603±

0.023

0.433±

0.013

0.792±

0.018

1.085±

0.021

0.817±0.016

放射后48h

0.328±

0.011

1.006±

0.027

0.729±

0.021

0.608±

0.014

1.217±

0.015

1.060±

0.018

0.581±

0.017

0.772±

0.022

0.461±

0.016

0.871±

0.015

1.163±

0.017

0.958±0.013

放射后72h

0.437±

0.014

1.203±

0.023

0.872±

0.017

0.843±

0.008

1.416±

0.022

1.195±

0.013

0.672±

0.011

1.299±

0.014

0.583±

0.016

1.007±

0.022

1.283±

0.026

1.158±0.013

5Gy 10Gy 15Gy0.0

0.5

1.0

1.5δ ÕÕÉäÕÕÉäºó24 hÕÕÉäºó48 hÕÕÉäºó72 h

CD

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PCRPCR 芯片芯片 (96(96 基因基因 )) 检测检测 U-87MGU-87MG GSPCs GSPCs 10Gy10Gy

照射后照射后 72h DNA72h DNA 损伤信号通路基因变化损伤信号通路基因变化 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A ABL1 ANKRD17 APEX1 ATM ATR ATRX BRCA1 BTG2 CCNH CDK7 CHEK1 CHEK2

B CIB1 CIDEA CRY1 DDB1 DDIT3 DMC1 ERCC1 ERCC2 EXO1 FANCG FEN1 XRCC6

C GADD45A GADD45G GML GTF2H1 GTF2H2 GTSE1 HUS1 IGHMBP2

IP6K3 XRCC6BP1 LIG1 MAP2K6

D MAPK12 MBD4 MLH1 MLH3 MNAT1 MPG MRE11A MSH2 MSH3 MUTYH N4BP2 NBN

E NTHL OGG1 PCBP4 PCNA AIFM1 PMS1 PMS2 PMS2L3 PNKP PPP1R15A PRKDC RAD1

F RAD17 RAD18 RAD21 RAD50 RAD51 RAD51L1 RAD9A RBBP8 REV1 RPA1 SEMA4A SESN1

G SMC1A SUMO1 TP53 TP73 TREX1 UNG XPA XPC XRCC1 XRCC2 XRCC3 ZAK

H B2M HPRT1 RPL13A GAPDH ACTB HGDC RTC RTC RTC PPC PPC PPC

基因扩散图基因扩散图

1.E-06

1.E-05

1.E-04

1.E-03

1.E-02

1.E-01

1.E+00

1.E+01

1.E+02

1.E+03

1.E-06

1.E-05

1.E-04

1.E-03

1.E-02

1.E-01

1.E+

00

1.E+

01

1.E+

02

1.E+

03

Control Sample

Te

st

Sa

mp

le

U-87MG GSPCs U-87MG GSPCs 放射前后放射前后 DNADNA 损伤损伤通路相关基因变化通路相关基因变化 3D3D 图图

12

34

56

78

910

1112

AB

CD

EF

GH

0.10

1.00

10.00

Fo

ld D

iffe

ren

ce

(T

es

t/C

on

tro

l)

Column Row

Test Sample

Control Sample

简称 全称 染色体位置 上调 / 下调差异倍数

BRCA1 Breast cancer 1, early onset 17q21-q24 -2.13

DMC1DMC1 dosage suppressor of mck1

homolog,meiosis-specific homologous recombination (yeast)

22q13.1 -3.11

GML Glycosylphosphatidylinositol anchored molecule like protein

8q24.3 4.71

GTSE1 G-2 and S-phase expressed 1 22q13.2-q13.3 -3.24

IP6K3 Inositol hexakisphosphate kinase 3 6p21.31 2.19

N4BP2 Nedd4 binding protein 2 4p14 4.24

NBN Nibrin 8q21-q24 -2.05

PPP1R15A Protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 15A

19q13.2 2.74

RAD50 RAD50 homolog (S. cerevisiae) 5q23-q31 2.42

SEMA4ASema domain, immunoglobulin domain (Ig),

transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4A

1q22 3.46

TREX1 Three prime repair exonuclease 1 3p21.31 2.34

XPA Xeroderma pigmentosum, complementation group A

9q22.3 4.31

BRCA1BRCA1 是一肿瘤抑制基因，编码一核磷是一肿瘤抑制基因，编码一核磷酸蛋白，其功能是维持基因组的稳定性，酸蛋白，其功能是维持基因组的稳定性，该基因下调使得细胞增殖、修复的抑制解该基因下调使得细胞增殖、修复的抑制解除除 (-2.13) (-2.13)

GMLGML 编码蛋白能够抑制编码蛋白能够抑制 TT 细胞的活性，细胞的活性，进而降低后者的肿瘤细胞杀伤活性进而降低后者的肿瘤细胞杀伤活性 (4.71)(4.71)

IP6K3IP6K3编码蛋白属于编码蛋白属于 IPKIPK家族，负责家族，负责InsP6InsP6 转变为转变为 InsP7InsP7 ，而，而 InsP7InsP7 增多有增多有助于修复损伤的助于修复损伤的 DNADNA 双链双链 (2.19) (2.19)

N4BP2N4BP2 升高后编码的蛋白能够结合并水升高后编码的蛋白能够结合并水解解 ATPATP ，并增强，并增强 DNADNA 损伤修复转录及基损伤修复转录及基因修复能力因修复能力 (4.24)(4.24)

NBNNBN编码蛋白属于编码蛋白属于 MRE11/RAD50MRE11/RAD50双链损伤修复蛋白家双链损伤修复蛋白家族的一员，它下调后可激活族的一员，它下调后可激活 DNADNA 损伤检查点及增强损伤检查点及增强 DNADNA损伤修复能力损伤修复能力 (-2.05)(-2.05)

PPP1R15APPP1R15A 在细胞处于生长停滞及在细胞处于生长停滞及 DNADNA 损伤时其转录水损伤时其转录水平增高，而且平增高，而且 PPP1R15APPP1R15A 激活后可抑制激活后可抑制 P53P53 的稳定性并的稳定性并使其活性下降，从而减少细胞凋亡使其活性下降，从而减少细胞凋亡 (2.74)(2.74)

RAD50RAD50编码的蛋白可与编码的蛋白可与 MRE11 MRE11 及及 NBS1NBS1 形成复合物，形成复合物，而这个复合物在肿瘤细胞照射后能够修复损伤的而这个复合物在肿瘤细胞照射后能够修复损伤的 DNADNA双双链、激活细胞周期关卡、保持端粒酶稳定性链、激活细胞周期关卡、保持端粒酶稳定性 (2.42)(2.42)

SEMA4ASEMA4A 在照射后升高能够提升细胞的免疫及修复能力在照射后升高能够提升细胞的免疫及修复能力(3.46)(3.46)

TREX1TREX1主要是编码主要是编码 3‘->5’DNA3‘->5’DNA 核酸外切酶，此酶对人核酸外切酶，此酶对人DNADNA 多聚酶有校正作用，照射后此基因上调，有助于校多聚酶有校正作用，照射后此基因上调，有助于校正损伤的正损伤的 DNADNA 多聚酶，修复多聚酶，修复 DNADNA双链双链 (2.34)(2.34)

XPAXPA编码一锌指蛋白，而此锌指蛋白与编码一锌指蛋白，而此锌指蛋白与 DNADNA切除修复有切除修复有关，故照射后关，故照射后 XPAXPA升高能提升升高能提升 DNADNA 损伤双链修复能力损伤双链修复能力(4.31)(4.31)

结论结论

CD133+CD133+ 胶质瘤干细胞在放射后显示出较胶质瘤干细胞在放射后显示出较强的耐受放射性及放射损伤修复能力，是强的耐受放射性及放射损伤修复能力，是耐受放射主体细胞耐受放射主体细胞

CD133+CD133+ 细胞放射耐受的分子机制与放射细胞放射耐受的分子机制与放射后增强了肿瘤干细胞的双链损伤修后增强了肿瘤干细胞的双链损伤修复、复、 DNADNA切除修复能力，及对人切除修复能力，及对人 DNADNA 多多聚酶的校正，下调一些抑癌基因表达、以聚酶的校正，下调一些抑癌基因表达、以及将及将 P53P53去功能化以减少凋亡等相关 去功能化以减少凋亡等相关

欢迎指导交流！欢迎指导交流！董军 董军 1396215730113962157301

djdongjun@163.comdjdongjun@163.com