实验八 蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定

(1) 了解重组蛋白表达的方法和意义。 (2) 了解亲和层析分离纯化的方法。

实验原理

克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的 80% 。

本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌 BL21 中，在 37℃ ， IPTG 诱导下，超量表达携带有 6 个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（ NTA ）使镍离子（ Ni2+ ）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（ MCAC ）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

材料与试剂

试剂• [1] LB 液体培养基： Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl

10g, 用蒸馏水配至 1000mL.

• [2] 氨苄青霉素： 100mg/mL

• [3] 上样缓冲液 (GLB) ： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.0

• [4] Washing Buffer （ UWB ）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3

• [5] Elution Buffer( 洗脱 ): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0

• [6] IPTG

实验步骤

• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导• 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌

BL21 菌株于 5mL LB 液体培养基中 （含 100ug/mL 氨苄青霉素）， 37℃ 震荡培养过夜。

• 2. 转接 1mL 过夜培养物于 100mL （含 100ug/mL 氨苄青霉素） LB 液体培养基中， 37℃ 震荡培养至 OD600 = 0.6 - 0.8 。取 10ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。

• 3. 加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l, 37℃ 继续培养 1-3h.

• 4. 12 ， 000rpm 离心 10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于 -20℃ 或 -70℃ 冰箱中。

• 二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化

• 1. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融 50ml 菌体沉淀，加入5mL 上样缓冲液 GLB, 用吸管抽吸重悬 , 4 12000rpm ℃ 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。

• 2. NTA 层析柱的准备：在层析柱中加入 1mL NTA 介质，并分别用 8mL 去离子水， 8mL 上样缓冲液 GLB 洗涤。 ( 调速0.5ml/2 分钟 ) 。

• 3. 细胞裂解液 3mL 以 10-15mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液。

• 4. 洗脱杂蛋白：用 50mL 洗涤缓冲液 UWB 以 10-15mL/h 流速洗柱，分别取 10ul 洗涤开始与结束时的样品用于 SDS-PAGE 分析。

• 5. 洗脱目标蛋白：用 10mL 洗脱缓冲液洗柱，每管 0.5 － 1 mL ，共收集 6 － 10 管，分别取 10ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。

• 1 ．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。• 2 ．制分离胶：按所需的浓度配制 12.5 ％分离

胶。30%Acr-Bis

Tris-HCl pH 8.8

H2O 10%AP TEMED

5ml 3ml 4ml 120ul 20ul

灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）

• 3 ．制浓缩胶：按所需的浓度配制 4% 的浓缩胶，配方如下：

30%Arc-Bis

Tris-HCl pH 6.7

H2O 10%AP TEMED

400ul 750ul 1800ul 50ul 10ul

4. 4. 灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内凝聚后，将装置放入电泳槽内 ,, 加入电泳缓冲加入电泳缓冲液液 ,, 小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。地加以整理。

• 5 ．加样：取大肠杆菌和 BSA 蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样 10L。

• 6 ．电泳：先恒压 80V ，待样品进入分离胶后，调电压为 120V （恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约 0.5cm 时，停止电泳。

7 ．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉 , 剥下凝胶，准备染色。

8 ． 凝胶染色：使用考马斯亮蓝 R250染色。两块胶（小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖上盖子用微波炉加热约 15-20秒，摇床振荡 15 分钟，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（ 25% 乙醇， 7.5% 乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同，脱色两次，每次 10 分钟。

注意事项 (1) Acr 和 Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。 (3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。（ 6 ）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。 (7) 稀释 5×SDS/ 电泳缓冲液至 1× 浓度灌入电泳槽，需 800毫升。

1. 将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。

2. 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。

3. 将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。

4. 取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容器。

5. 将底座的开关打开，并向外拨动透明的架子，使中间空隙增大，放入电极架。

6.如图所示将电极架往下压（约 1~2mm ），使底面完全接触。

7.关上底座开关。 8.放入电泳槽内，加上加样架加样。注意加样架与刚才制胶所用的梳子齿数必须一致。