第六章 化学物质与蛋白质的相互作用 在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的 70% 以

上，种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。

在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。

球状蛋白三级结构的主要特征 绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋

白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有 75 ％被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一些晶体的情况相比。

可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是“非极性在内，极性在外”。大量蛋白质的 X射线晶体衍射分析统计的结果充分证明了这一规律。

存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约有 63 ％是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有 4％。约 95 ％的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约 14 ％的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。

在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常见到一些疏水的残基。这些“异常”分布的残基，致使肽链的局部结构发生“扭曲”，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。

原则上，一些相对规则的 - 螺旋和 - 折叠分布在球状蛋白的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接 - 螺旋和 - 折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的“无规”卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。

还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。

球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。

球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。

在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的 O2等。因此，生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构象的平衡态 .

球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周围常常是疏水性的：这些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白质 (酶 )的活性部位所在。

硫氧还蛋白的结构紧密结合水

亲水性残基

疏水性残基

第一节 化学物质对蛋白质的沉淀作用 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶

液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。

根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。

蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。

沉淀作用的类型

可逆沉淀

不可逆沉淀

抗体 -抗原沉淀

在温和条件下，通过改变溶液的 pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。

在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础。

1 ，无机物沉淀

当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，开始，蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶。

但当继续加入电解质时，另一种因素起作用，使蛋白质的溶解度减小，称为盐析。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。

（ 1）盐析

牢固结合水

大量溶剂水层

含高价阴离子的盐，效果比 1价的盐好。阴离子的盐析效果有下列次序：

柠檬酸盐 >PO43-＞ SO42-＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞ SCN-。

但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸镁的效果不如硫酸铵。对于 1价阳离子则有下列次序： NH4+＞ K+＞ Na+。

因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。但硫酸钠在 40C 以下溶解度较低，因而仅适用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上是 HPO42-和 H2PO4-的混合物，其作用比 PO43+差。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定 , 在 2-3mol/L (NH4)2SO4中酶可保存几年。同时由于盐的浓度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析剂。硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高 pH下会释放出氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。

（ 2）金属离子沉淀法

一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：

第一类为 Mn2+， Fe2+， Co2+， Ni2+， Cu2+， Zn2+和 Cd2+能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。

第二类为 Ca2+， Ba2+， Mg2+和 Pb2+能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。

第三类为 Ag+， Hg2+和 Pb2+能和蛋白质分子表面的巯基相结合。

金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。

在这些离子中，应用较广的是 Zn2+， Ca2+， Mg2+， Ba2+和 Mn2+，而 Cu2+， Fe2+， Pb2+， Hg2+等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。如 Zn2+可用于沉淀杆菌肽 (作用于第 4个组氨酸残基上 )和胰岛素； Ca2+(CaCO3)用于分离乳酸，血清清蛋白等。

2，等电点沉淀

蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。

等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。

等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低 pH比较敏感。

pH对 -乳球蛋白溶解度的影响

3 ，有机物沉淀

利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主要效应是水活度的降低。

当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。

在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。

（ 1）有机溶剂

有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。

一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在 20%-50% （ V/V））之间。当蛋白质的溶液 pH 接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。

（ 2）酚类化合物及有机酸沉淀

当蛋白质溶液 pH小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。

这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即 2,4,6- 三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。

单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀

4 ，聚合物沉淀

许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（ PEG）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量 PEG；而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。 PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广泛使用。

一般 PEG的分子量需大于 4000 ，最常用的是 6000 和 20000 。所用的 PEG浓度通常为 20% ，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。 PEG对后继分离步骤影响较少，因此可以不必除去。

（（ 11 ）非离子型聚合物沉淀法）非离子型聚合物沉淀法

（ 2）聚电解质沉淀法 有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在 pH值低于等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。

一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季胺盐也曾用来沉淀乳清蛋白质。聚丙烯酸能在 pH 8.8时沉淀 90% 以上的蛋白质，聚苯乙烯季胺盐能在 pH 10.4时沉淀 95% 的蛋白质。

聚乙烯亚胺能与蛋白质的酸性区域形成复合物，在中性时带正电，可在污水处理中作絮凝剂，也广泛用于酶的纯化中。

第二节 化学物质对蛋白质的稳定作用

许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在 37C放置的半衰期仅几个小时。

这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。

一、蛋白质不可逆失活的化学因素

强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的 pH，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。

另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，结果导致蛋白质失去活性。

1 ，强酸和强碱

2，氧化剂 各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨

酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面的巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件下，半胱氨酸可以被 Cu2+氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。

分子氧、 H2O2以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。

3 ，去污剂和表面活性剂

去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基硫酸钠， SDS ）单体加入到蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，随着加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。

4 ，变性剂

高浓度脲（ 8-10mol/L）和盐酸胍（ 6 mol/L）常常用于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。

（ 1）脲和盐酸胍

（ 2）有机溶剂

水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡

（ 3）螯合剂

结合金属离子的试剂，如 EDTA等可以使金属酶、金属蛋白失活，这是因为 EDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。

失去金属辅助因子的酶或蛋白质可以引起蛋白质构象发生较大改变，导致蛋白质活力不可逆的丧失。

但是，螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。

5 ，重金属离子和巯基试剂 在金属离子对蛋白质的沉淀作用中，一些重金属离子，如 Hg2+、 Cd2+、 Pb2+能与蛋白质分子中的半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。

巯基试剂，如巯基乙醇等通过还原蛋白质分子内的二硫键而使蛋白质失去活性，但这个过程一般是可逆的。而低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质中的巯基作用，形成混合二硫键，造成蛋白质结构发生变化，导致其失活。

Lys

Arg

水

蛋白质不可逆失活的化学因素

强酸和强碱

强的酸碱可以改变蛋白质溶液的 pH引起蛋白质表面必需基团的电离，使蛋白质的空间结构发生变化，造成蛋白质分子聚集，导致变性。

氧化剂

氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌再与巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。

表面活性剂 变性剂 重金属离子

去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露从而使蛋白质发生不可逆变性。

脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键。有机溶剂也会引起蛋白质变性失活

Hg2+、 Cd2+、Pb2+能与蛋白质分子中的半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。

三、化学物质对蛋白质的稳定作用

蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活性的能力。根据生物体内蛋白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。

通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质的结构功能与稳定性的关系等。

在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：

固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）；

添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受变性剂变性等

化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。

稳定剂

共溶剂

糖类，醇氨基酸及其衍生物无机盐，甘油，聚乙二醇等常用 1-4M浓度共溶剂来稳定蛋白质和细胞器。

抗氧化剂 底物、辅酶 金属离子 化学交联剂

半胱氨酸，2-巯基乙醇还原谷胱甘肽，二巯基赤藓醇等巯基试剂可防止巯基氧化植物抗氧化剂如儿茶酚黄酮等也具有保护作用

酶可被底物辅酶、竞争性抑制剂及反应产物等所稳定。

金属离子不仅可以影响酶的活性，还可以影响酶的稳定性如 Ca2+多位点结合使得蛋白质分子成为紧密的活性形式。

交联剂可在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或蛋白质与其他分子之间（如固定化载体）发生交联反应使蛋白质的构象稳定。

四、化学物质的共价修饰作用 化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。

该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。

生物体内蛋白质加合物的形成

许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同细胞大分子的亲核部位 (如蛋白质的巯基 )发生不可逆结合具有密切关系。

当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致 DNA 损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。

1 ，可与蛋白质发生反应的化合物

除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例如蛋白质分子中的亲核基团、 DNA、 RNA及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。

2，蛋白质分子中的可反应基团

致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。

试剂类型 化合物或前体 反应机制

烷基化芳香基化

卤代物 亲核取代

环氧化物

硫酸烷基酯

活泼的烯烃 1,4-加成

羰基化合物 醛 形成席佛碱

酰基化 有机酸酐、酰氯等 亲核取代或加成

磷酰化 有机磷 亲核取代

自由基 ·OH、 ·CCl3 自由基反应

具有亲电氮化合物 芳香胺 亲核取代

氨基酸残基侧链基团的修饰

蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。

理想情况下，修饰试剂只是有选则地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。

在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。

巯基的化学修饰 5,5'-二硫 -2-硝基苯甲酸 (DTNB)，又称为 Ellman试剂，目前已成

为最常用的巯基修饰试剂。 DTNB可以与巯基反应形成二硫键，产生的 5-巯基 -2-硝基苯甲酸阴离子在 412nm具有很强的吸收，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。

有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在 255nm处光吸收具有较大的增强效应。

氨基的化学修饰 有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸 (TNBS)就是其中非常有效的一种。 TNBS与赖氨酸残基反应，在 420 nm和 367nm能够产生特定的光吸收。

在蛋白质序列分析中，用于多肽链 N-末端残基的测定的化合修饰方法 --2， 4-二硝基氟苯 (DNFD) 法、丹磺酰氯 (DNS) 法和 )苯异硫氰酸酯 (PITC) 法都是常用的氨基修饰方法。

羧基的化学修饰 水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团，目前已成为一种应用最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。

咪唑基的化合修饰 焦碳酸二乙酯 (DPC)是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的 1个氮羧乙基化，并且使得在 240 nm处的光吸收增加。该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。

四、蛋白质光谱探针 蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经

常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。

所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。

蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等分子光谱探针。

蛋白质吸光探针

金属探针

双缩脲在碱性溶液中与 Cu2+生成紫红色化合物的反应。肽和蛋白质化合物都有双缩脲反应，生成紫红色化合物，在 540nm具有光吸收。

双缩脲法

Folin-Lowry法

将双缩脲试剂和 Folin酚试剂 (磷钼酸盐磷钨酸盐）结合使用，在蛋白质发生双缩脲反应之后，再和 Folin酚试剂反应，此试剂在碱性条件下被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，生成颜色更深的化合物，在 640nm具有光吸收，可测定 25-250ug蛋白质

双辛可宁酸法

在碱性条件下，肽键与铜离子反应生成 Cu(I), Cu(I) 再与 BCA反应形成紫色络合物，在 565nm测量吸光度。二喹啉甲酸（又称双辛可宁酸法的试剂比 Folin-Lowry法的试剂稳定 ,干扰少

染料探针

染料探针是蛋白质分析中种类最多应用最广的一类探针，该法是利用蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借助染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。

溴酚蓝

是一种研究性能优良的探针试剂，该试剂颜色对比度为 160nm,反应在 pH3.2左右进行，在 600nm测量吸光度。

考马斯亮蓝

在酸性条件下，染料考马斯亮兰 G-250 与蛋白质结合后其吸收峰从 465移至 595nm处，而颜色也由棕黄色转为深兰色。蛋白质与染料生成复合物颜色的深浅与其浓度成比例关系。该方法使用方便，反应时间短，染色稳定成为灵敏度最高的染料探针分析方法。

蛋白质荧光探针

蛋白质中存在着 Tyr、 Trp、 Phe残基，能够吸收 270～ 300nm的紫外光而发出紫外荧光。

当测定体系中加入小分子配体时，小分子配体与蛋白质发生相互作用 , 会导致蛋白质荧光的猝灭，利用小分子配体对蛋白质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与小分子配体的作用类型及结合部位等。

荧光探针的条件

（ 1），探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合，并且结合比较牢固；

（ 2），探针的荧光必须对环境条件敏感； （ 3 ），蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的

结构和特性。 在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定及与金属离子结合的计量化学等。

常用的蛋白质荧光探针有： 1- 苯胺基 -8-萘磺酸 (ANS) 、 2- 对甲苯胺基萘 -6- 磺酸 (TNS) 、 1-(N-二甲胺 )萘 -5-磺酸 (DNS)和荧光胺等。

NH SO3- H3C N

H

SO3-

1- 苯胺基 -8-萘磺酸 (ANS) 2- 对甲苯胺基萘 -6-磺酸 (TNS)

,,,- 4(对磺苯基 )卟啉 ( TPPS4) ,,,- 4 (对羧苯基 )卟啉 (TCPP)