第八节 研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法

又叫做 DNA 迁移率变动试验，是 80 年代初出现的用于在体外研究 DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选作分离纯化特定 DNA 结合蛋白质的一种典型的实验方法。EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay )

在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA 朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果 DNA 分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相在缩短了。所以当特定的 DNA 片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。

8.1 凝胶阻滞试验（ Gel Retardation Assay ）原理

加 DNA 结合蛋白

用放射性同位素标记待检测的 DNA 片段（亦称探针 DNA

同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成 DNA一蛋白质复合物

将它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与 DNA 保持结合状态的条件下进行电泳分离

应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA 条带位置

如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针 DNA 结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部；反之，将会形成 DNA 一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针 DNA 条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以也称这种试验为条带阻滞试验（ band retardation assay ）。

凝胶阻滞试验方法

凝胶阻滞试验用途鉴定特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针 DNA 结合的蛋白质分子（比如特异的转录因子等）

研究发生此种结合作用之精确的 DNA 序列的特异性：其办法是在 DNA一蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争 DNA 。如果竞争同一种蛋白，由于竞争 DNA 与探针 DNA 相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针 DNA 处于自由状态，自显影图片上不出现阻滞的条带，相反，如果不竞争同一蛋白，探针 DNA 仍与特定蛋白复合，呈现阻滞的条带。

使用竞争 DNA ，可间接阐明体内的 DNA 与蛋白质的相互作用。如，使用一种具有与已知转录因子结合位点的竞争 DNA ，就可以判断检测到的蛋白质是否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；如果事先引入突变，可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。

SND1, a NAC Domain Transcription Factor, a Key Regulator of Secondary Wall Synthesis in Fibers of Arabidopsis

• NAC (NAM, ATAF1,2, CUC2)

SND1 Specifically expressed in InterfascicularFibers and Xylem Cells

MYB46 Gene Is Predominantly Expressed in Fibers andVessels in Arabidopsis Inflorescence Stems

Expression of the MYB46 Gene Is Regulated by SND1

SND1 could bind to MYB46 Promoter

由“钓鱼”引发“钓蛋白”

Yeast One Hybrid

AB

CA

DA

FA

MA

XO

RB

OP

ZA

Q

V

Expressed Protein Library

Prey

Bait DNA

Reporter

AD

Bait elements Reporter(s)His lacZ

•clone element into a reporter construct and make stable yeast strain

•transfect aliquots of cDNA expression libraries that have fragments of DNA fused to yeast activator

•if the fusion protein binds to your element then the reporter gene will be activated

Prolamin-box 及其结合蛋白

指数富集配体系统进化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment ， SELEX)

• SELEX 技术起源于 20 世纪 90 年代初• 通过该技术可以自起始寡核酸库中获得能够与靶分子

（蛋白或小分子）具有高亲和力的特异性核酸序列 SELEX 技术操作流程包括：（ 1 ）人工合成库容量为 1014-1015 的随机核酸库，每条

序列均包括两端的恒定序列区及位于序列中端的随机序列区，其中随机序列区长度为 20-40 个碱基；

（ 2 ）与靶物质转录因子蛋白相作用，形成核酸 - 转录因子蛋白复合体；

（ 3 ）将不能与靶物质结合的核酸序列分离出来；（ 4 ）复合体中的核酸序列利用 PCR 反应进行扩增；（ 5 ）重复核酸 - 转录因子蛋白复合体结合 - 洗脱 - 分离

过程，直至获得高度富集的序列；（ 6 ）将经过筛选得到的核酸序列进行测序，序列拼接比

对后确定能够与转录因子结合的保守序列

Opaque2 体外进化实验

8.2 DNasel 足迹试验

尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的 DNA 与蛋白质

之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准

确部位。

要解答这个问题，则需要应用 DNasel 足迹试验（ footprinti

ng assay ）。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的 DNA

序列的部位及特性的专门的实验技术。

DNasel 足迹试验过程

首先是将待检测的双链 DNA 分子用 32P 作末端标记，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链 DNA 分子

体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的 DNas

el （它可沿着靶 DNA 作随机单链切割）消化 DNA 分子，并控制酶的用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取物中不存在与 DNA 结合的特异蛋白质，经 DNasel消化之后便会产生出距放射性标记末端 1个核苷酸、 2个核苷酸、 3个核苷酸等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的 DNA 片段梯度群体。

从此混合物中除去蛋白质之后，将 DNA 片段群体加样在变性的 DN

A 测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于 DNas

el切割产生的不同长度 DNA 片段组成的序列梯度条带。但是，如果有

一种蛋白质已经结合到 DNA 分子的某一特定区段上，那么它就将保护

这一区段的 DNA免受 DNasel 的消化作用，因而也就不可能产生出相

应长度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋

白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人

们形象地称之为“足迹” 。

足迹试验的优点

形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定 DNA 片段之间

的结合区域。

如果使用较大的 DNA 片段，通过足迹试验便可确定其中不

同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布

状况。

如同凝胶阻滞试验一样，也可以加入非标记竞争 DNA ，来

消除特定的足迹，据此确定其核酸序列的特异性。

DNasel 足迹试验发展

目前还出了若干种其它类型的足迹试验。例如，自由羟基足迹试验及菲咯琳铜足迹试验，硫酸二甲脂（ DMS ）足迹试验等。

硫酸二甲脂（ DMS ）足迹试验。它所依据的原理是， DMS 能够促进DNA 中裸露的 G甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的 G残基作特异的化学切割。假如有一种蛋白质同 DNA 分子中的某一区段结合，在它的保护下，区域内的 G免受六氢吡啶的切割，于是在 DNA 片段的序列梯中，便不存在具这些 G残基末端的 DNA 片段，故出现个空白区域，此即通常所说的足迹。

与其它足迹试验不同，由于 DMS 足迹试验中被切割的是 G残基，因此可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的 DNA区段中的特异碱基。

8.3 甲基化干扰试验

应用甲基化干扰试验（ methvlation interference assay ）技术，

可以检测靶 DNA 中特异 G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质

结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNA 与蛋

白质之间相互作用的模式。

甲基化干扰试验的具体操作

先用硫酸二甲脂（ DMS ）处理靶 DNA ，控制反应条件，使平均每条 DN

A 分子只有一个 G甲基化，而后将这些局部甲基化的 DNA 群体同含有 D

NA 结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并作凝胶阻滞试验。经电泳分离之后，从凝胶中切取出具有结合蛋白质的 DNA 条带和没有结合蛋白质的 DNA 条带，并用六氢吡啶处理之，于是甲基化的 G 残基被切割，非甲基化的 G 残基则不被切割。显而易见，如果某个 G 因甲基化而不与蛋白质结合，那么六氢吡啶对这个甲基化 G 残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的 DNA 分子上表现出来。相反地，如果一个特殊的 G 残基在DNA 与蛋白质的结合中不起作用，那么六氢吡啶对这个 G 残基的切割作用，则在同蛋白质结合的 DNA 分子及不同蛋白质结合的 DNA 分子中均可观察到（图 2 － 44 ）

甲基化干扰试验的用途

甲基化干扰试验不仅可以用来研究蛋白质与 G残基之间的联系，而且同样也可以用来研究 DNA 结合蛋白质与结合位点中的腺嘌呤 A残基之间的联系作用。

头一个办法是使所有的嘌呤残基甲基化，以便同时研究甲基化的 G和 A

残基对蛋白质与 DNA 结合的干扰效应。

第二种办法是使用焦碳酸二乙脂（ DEPC ）特异性修饰 A ，而使之易受六氢吡啶的切割作用。对于研究诸如像具有相对少数 G残基的八聚体基序（例如 OCt－ 1 ， OCt－ 2 等，它们可与八聚体结合蛋白质结合）这样的序列而言，这些甲基化干扰试验技术具有特别的价值，因为只要研究 G残基的甲基化干扰，就可获得有用的信息。

DMS 化学干扰的主要局限性

它只能使 G和 A残基甲基化，而不能使 T和 C残基甲基化。

尽管如此，它仍不愧为足迹试验的一种有效的补充手段，可以

鉴定足迹区段中 DNA 与蛋白质相互作用的精确位置。

8.4 体内足迹试验

上面所讨论的这三种方法有一个共同的不足之处，即它们都是在体外进

行的试验。因此人们自然会问，这些结果能够确切地反映活细胞内发生

的 DNA 一蛋白质相互作用的真实情况吗？为了解答这个问题，科学工作

者又设计出了一种体内足迹试验体系。然而究其实质而言，这种技术无

非是体外 DMS 足迹试验的一个变种而已。

体内足迹试验的方法

用有限数量的化学试剂 DMS 处理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞内

的浓度恰好导致天然染色质 DNA 中的 G残基发生甲基化。

而后从这些细胞中提取 DNA ，并加入六氢吡啶作体外消化。

同体外足迹试验一样，能同某种特殊蛋白质因子结合的 DNA区段，其上

的 G残基就不会被 DMS甲基化，因而也就不会被六氢吡啶所切割。

同对照的体外裸露 DNA 所形成的序列作比较，就会发现由完整的活细胞

染色质 DNA 形成的序列中，缺少了 G残基没有被切割的相应条带（图 2

－ 45 ）。

体内足迹试验优缺点

显而易见，与应用克隆 DNA 片段所作的体外足迹试验的结果相比，经体内足迹试验从染色质总 DNA 中所获得的任何一种特异 DNA 的数量，都是微不足道的。因此，有必要通过 PCR扩增特异的靶 DNA ，以获得足够数量的 D

NA 样品。如今体内足迹试验已发展成为研究在完整的活细胞内， DNA 一蛋白质结合位点及检测结合位点中碱基突变效应的一种极有效的手段。

应用凝胶阻滞试验、 DNasel 足迹试验、甲基化干扰试验，以及体内足迹试验等多种用于研究 DNA 与蛋白质相互作用的基本实验手段

• 有助于深入地探讨基因启动子元件的结构与功能，及其与蛋白质转录因子之间相互作用的有关细节；

•揭示mRNA 转录超始和终止的分子本质与主要步骤；

• 阐明在发育过程中基因表达调节的时空特异性；

• 以及外源基因在转基因植株中表达的分子机理等等。

这些研究结果，将为我们提供大量重要的信息，以最终弄清基因表达调节的真实内容。

重要知识点：1 、研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法有哪些？2 、凝胶阻滞试验原理是什么？

3 、用图示的方法说明 DNasel 足迹试验的过程。

4 、甲基化干扰试验有什么用途？

5 、什么是体内足迹试验？

由于提取 DNA 的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同， DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。

第九节 DNA 的提取与纯化

脱氧核苷酸

DNA 的化学组成

基本单位：

P

脱氧核糖 含氮碱基

磷酸脱氧核糖含氮碱基

脱氧核苷酸

元素组成：C H O N P

组成脱氧核苷酸的碱基：胞嘧啶（ C ）胸腺嘧啶（ T ）

腺嘌呤（ A ）鸟嘌呤（ G ）

因此，脱氧核苷酸也有 4 种　　　

腺膘呤脱氧核苷酸

A

胞嘧啶脱氧核苷酸

C

鸟瞟呤脱氧核苷酸

G T

胸腺嘧啶脱氧核苷酸

• 四种构成 DNA 的碱基：腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶

构成 RNA 的特殊碱基——尿嘧啶

N

N NH

N

NH2

HN

N NH

N

O

H2N

N

NH

NH2

O

NH

NH

O

O

NH

NH

O

O

• 脱氧核糖核苷酸的组成：

+

N

NN

N

NH2

O

HOH

HHHH

HON

N NH

N

NH2

O

HOH

HHHH

HOOH

N

NN

N

NH2

O

HOH

HHHH

OP-O

O-

O OHP-O

O-

O

碱基

脱氧核糖核苷酸

脱氧核苷

磷酸

脱氧核糖

• 核苷酸的组成：N

NN

N

NH2

O

HOH

HHHH

HON

N NH

N

NH2

N

NN

N

NH2

O

HOH

HHHH

OP-O

O-

O OHP-O

O-

O

碱基

核苷酸

核糖核苷

磷酸

核糖

+O

OHOH

HHHH

HOOH

DNA 的结构模式图

从图中可见 DNA 具有规则的双螺旋空间结构

放大

DNA 的空间结构

A

A

A

T

T

T

G

G

G

G

C

C

C

A T

C（ 1 ） DNA 分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构。

DNA 分子的结构特点

DNA 分子的结构小结

★化学组成：

基本组成单位：四种脱氧核苷酸

一分子含氮碱基一分子脱氧核糖

一分子磷酸

★空间结构规则的双螺旋结构

两条脱氧核苷酸长链碱基对氢键碱基互补配对原则

★分子结构的多样性和特异性

DNA 分子具有稳定性、多样性和特异性

稳定性：DNA 分子的双螺旋结构是相对稳定的。这是因为在 DNA 分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸链稳固的并联起来。另外，碱基对之间纵向的相互作用力也进一步加固了 DNA 分子的稳定性。各个碱基对之间的这种纵向的相互作用力叫做碱基堆积力。它是芳香族碱基 π 电子间的相互作用引起的。现在普遍认为碱基堆积力是稳定 DNA 结构的最重要因素。再有，双螺旋外侧负电荷的磷酸基团同带正电荷的阳离子之间形成的离子键，可以减少双链间的静电斥力，因而对 DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。

DNA 分子的特性

多样性：DNA 分子由于碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化，因而构成了 DNA 分子的多样性。例如，一个具有 4000 个碱基对的 DNA 分子所携带的遗传信息是 44000 种，即 102408 种。

特异性：不同的 DNA 分子由于碱基对的排列顺序存在着差异，因此，每一个 DNA 分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，从而使 DNA 分子具有特异性。

1．核酸的两性性质及等电点

与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如 DNA 的等电点为 4～ 4.5 ，RNA 的等电点为 2～ 2.5 。

2．核酸的水解

（ 1 ）酸或碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和 RNA 对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在 0.1 mol/L NaOH溶液中， RNA几乎可以完全水解，生成 2′- 或 3′-磷酸核苷； DNA 在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与 RNA核糖基上 2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在 RNA水解时， 2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。

（ 2 ）酶水解 生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以 DNA 为底物的 DNA水解酶（ DNases ）和以 RNA 为底物的 RNA水解酶（ RNases ）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（ 3′-端或 5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。

3 核酸的紫外吸收

在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在 260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。

大肠杆菌基因组 DNA

一、质粒 DNA 的提取

分离质粒 DNA 的方法众多， 其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂 ( 如 Triton 或 SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质粒 DNA释放法、酸酚法等。

1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 DNA 原理

◆碱裂解法由 Birnboim和 Doly设计并于 1979年发表，基于染色体 DNA 与质粒 DNA 变性与复性的差异而达到分离目的。

◆在 pH高达 12.5的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

◆当以 pH4.6的 KAc 高盐缓冲液调节其 pH至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构。

◆通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA 、蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

plasmid DNA

The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.

Genomic DNA

闭合环状的质粒 DNA ，在变性后不会分离，复性快；

DNA双链

变性

DNA 单链

复性

强碱

中性

(1) 原理

染色体线性 DNA和或有缺口的质粒 DNA 变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质— SDS 复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

变性

（ 2 ） 所用的试剂作用

① 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1 ， 4糖苷键。 在碱性条件（ pH>8 ）下有活性。

② 葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械力（震荡）的作用而降解。

③EDTA

Mg2+ 、 Ca 2+ 的螯合剂，可抑制 DNA酶的活性，防止 DNA 被酶降解。

④NaOH-SDS

NaOH ：强碱，提供 pH>12 的碱性条件，使 DNA双链变性。 SDS: 离子型表面活性剂，溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白— SDS” 复合物，使蛋白质（包括 DNA酶）变性沉淀。

冰醋酸把醋酸钠溶液的 pH调到 4.8 。

用来中和 NaOH 变性液，使 DNA 复性。高浓度的 NaAc 有利于变性的大分子（蛋白质、 DNA 、 RNA 等）沉淀。

用于沉淀 DNA 。⑥ 无水乙醇

DNA 分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去 DNA 分子的水环境。可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全。

⑤ NaAc/ KAc -HAc 缓冲液

⑦ RNase A

降解 RNA渣滓。 以免提取后的 DNA 中含有小分子的 RNA 。

⑧ TE缓冲液DNA 保存液。 由 Tris-HCl和 EDTA 配制。

Tris-HCl 不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA 抑制 DNA 酶，防止 DNA 被酶降解。

蛋白变性剂，酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 苯酚会残留在 DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化 DNA) 。

⑨ 酚 -氯仿 选用

以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。

（（33

）大肠杆菌质粒

）大肠杆菌质粒DNA

DNA

的提取步

的提取步

骤骤 1 ，收集细胞沉淀

2 ，加入溶液 I ， II ， III

酚 -氯仿抽提 氯化铯密度梯度离心

Solution I 的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。

第一步：溶菌

50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0) ， 10mM EDTA ， 4-5mg/ml 溶菌酶 ， RNase A

pET28c(+)pET28c(+) 电泳结果 电泳结果

溶液 II 破坏细胞膜，蛋白质和 DNA 变性。

第二步：破膜，蛋白质和 DNA 变性

Solution II 的配制：

第三步：中和溶液 III 使 DNA 复性、并促使蛋白质 -SDS 复合物和染色体 DNA 、 RNA沉淀。Solution III 的配制：

0.2N NaOH ， 1.0%SDS

3M 醋酸钠（用冰醋酸调 pH 至 4.8 ）

溶液 II 破坏细胞膜，蛋白质和 DNA 变性。

第二步：破膜，蛋白质和 DNA 变性

Solution II 的配制：

第三步：中和溶液 III 使 DNA 复性、并促使蛋白质 -SDS 复合物和染色体 DNA 、 RNA沉淀。Solution III 的配制：

0.2N NaOH ， 1.0%SDS

3M 醋酸钠（用冰醋酸调 pH 至 4.8 ）

最重要的是：

2. 影响质粒 DNA产量的因素

菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。

一般要使用 endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如 DH5 、 JM109 、 XL1-Blue等。

（ 1 ）受体菌株

endA 基因编码核酸内切酶Ⅰ，在 Mg2+ 的存在下可将双链 DNA 消化成 7bp 的寡核苷酸片断。

这是直接决定 DNA产量的重要因素之一。

（ 3 ）质粒大小

分子量大的质粒，拷贝数少。

（ 2 ）质粒拷贝数

质粒本身的性质所决定。

若干常用质粒的理论产量

质粒名 分子大小 bp 拷贝数 质粒产量 g/ml

pGEM pUC pBR322 ColE1 pACYC pSC101

2700 2700 4400 4500 4000 9000

300-700 500-700 >25 >15 ≈10 ≈6

1.8-4.1 2.9-4.1 >0.32 >0.15 ≈0.09 ≈0.12

二、基因组或其他 DNA 的提取

一般过程及原理：

1. 细菌基因组 DNA 的制备

（ 1 ）细胞裂解10%SDS和蛋白酶 K 。 37 oC 温育。

不用 NaOH !

（ 3 ）沉淀 DNA

0.6倍体积的异丙醇。

（ 2 ） DNA 纯化

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵 )除去多糖，酚 -氯仿 - 异戊醇除去蛋白。

一般过程及原理：

动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。

（ 1 ）组织粉碎

2. 哺乳动物细胞基因组 DNA 的抽提

0.5%SDS和 0.1mg/ml 蛋白酶 K 。 50 oC 温育。（ 2 ）细胞裂解

（ 3 ）纯化 DNA

用苯酚和酚 -氯仿抽提除去蛋白质污染。

SDS 是离子型去垢剂（ detergent ），可以使细胞膜崩解。

CH3—(CH2)11—O—S—ONa

O

O

（ 5 ）除去 RNA污染 用 RNase 。

用 2倍体积的无水乙醇。

（ 4 ）沉淀 DNA

（可以加入 1/10 体积的 3M 醋酸氨辅助沉淀）

一般过程及原理： （ 1 ）组织粉碎

用液氮冷冻后研磨成细粉末。

3. 从植物组织中制备 DNA

（ 2 ）细胞裂解

用 2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵 /2巯基乙醇）。

或 1% SDS和蛋白酶 K 。 65 oC 温育。

用 0.6倍体积的异丙醇（ -20 oC ）。

（ 3 ）纯化 DNA

用苯酚和酚 -氯仿抽提除去蛋白质污染。（ 4 ）沉淀 DNA

（ 5 ）除去 RNA污染

用 RNase A 。

（可以加入 1/10 体积的 3M 醋酸氨辅助沉淀） 。

（三） DNA 的纯化

根据实验要求不同，有时需要高纯度的 DNA ，对提取的 DNA 样品须进一步纯化并除去溴化乙锭 (EB) 。

常用的 DNA 纯化方法有：低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化铯 - 溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、 “基因纯”试剂纯化等。

原理： DEAE纤维素是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的 DNA 分子。

将 DEAE纤维素膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，继续电泳直至所需回收的 DNA 片段刚好转移到膜上。取出 DEAE纤维素膜，低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出 DNA 分子。

该法操作比较简单，可同时回收多个 DNA 片段，对 500bp～ 5kb的 DNA 片段回收率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。但 DNA 片段大于 5kb时，因结合力增大而回收率下降。至 10kb或为单链 DNA时，其与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于 10kb的 DNA 片段的回收，也不能回收单链 DNA 。

DEAE纤维素膜插片电泳法

该法是从低熔点琼脂糖凝胶中切出含待回收 DNA 的凝胶块，利用其纯度高、熔点低（ 65℃）及凝固温度低（ 30℃）的特点，在室温大于 30℃，琼脂糖仍为液态的情况下，对 DNA 片段进行回收的方法。

根据不同的提取纯化方案，又可分为有机试剂提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法和琼脂水解酶（ agarase ）法。有机试剂法以酚、氯仿抽提 DNA ，可以有效回收 0.5kb～ 5kb 的 DNA 片段。

玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠（ NaI ）溶液或高氯酸钠溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以结合 DNA ，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将 DNA洗脱下来。玻璃珠（或玻璃粉）洗脱法较有机试剂提取法快，但回收率略低。

琼脂水解酶法对切下的含 DNA 的凝胶块进行消化，将琼脂糖水解为二糖，释放的 DNA 用酚抽提，乙醇沉淀回收。

低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法

电泳洗脱法包括两个主要步骤，一是将待回收的 DNA 片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的小容积溶液中；二是分离纯化出 DNA 片段。

按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。

其中，透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收 DNA 片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳，使 DNA 分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收 DNA 分子。

该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的 DNA片段，但可有效回收从 200bp至大于 50kb 的 DNA ，尤其对大于 5kb 的 DNA 有良好的回收率。

电泳洗脱法

透析袋电洗脱法步骤 1. 适用于小剂量 DNA 纯化和酶切 DNA 片段回收。2. DNA 样品在琼脂糖凝胶电泳分带。3. 切取含待纯化 DNA 带的琼脂糖凝胶块，装入透析袋，

进行电泳 1-2h后，再反向电泳 1-2min 。4. 吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。5. 转移上清液到另一离心管中，加入 2倍体积无水乙醇

混匀，于 -20℃放置过夜沉淀后，离心后上清液，最后把沉淀物溶于 TE缓冲液中， -20℃保存备用。

聚丙烯酰胺凝胶中回收 DNA 的标准方法是压碎与浸泡法。

将含待回收 DNA 条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使 DNA洗脱出来。

该法能很好回收小于 1kb 的单链或者双链 DNA ，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段 DNA回收的较好方法。

依分子量不同，其回收率从小于 30%至大于 90% 不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中，再进行 DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱，可以缩短双链 DNA的回收时间。

聚丙烯酰胺凝胶中回收 DNA

通过凝胶电泳回收的 DNA 样品和氯化铯 -溴化乙锭连续梯度离心制备的 DNA样品，因检测需要而含有溴化乙锭 (EB) ，会影响限制性核酸内切酶的切割，因此有必要去掉插入到 DNA中的 EB ，常采用的方法有：正丁醇 (或异戊醇 )抽提或 Dowex 树脂层析法等。

DNA 的浓缩 当提取的 DNA 溶液的浓度达不到实验要求时，必须进行 DNA 溶液的浓缩。实验室常用的方法有： 乙醇沉淀法、 正丁醇抽提法和 聚乙二醇浓缩法等。

三、 DNA 的定量和纯度测定

1. 紫外光谱法

DNA （或 RNA ）在 260nm波长处有特异的紫外吸收峰。

用微量比色杯（ 10l ）在紫外分光光度计直接测定。

原理：

蛋白质在 280nm 处有吸收峰

• DNA 样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、 EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。

2

•衡量所提取 DNA 的纯度可用OD260与OD280的比值 ,OD260/OD280对 DNA 而言其值大约为 1.8 。

• 当OD260/OD280大于 1.8则可能有 RNA污染。• 当OD260/ OD280小于 1.8时则有蛋白质污染。

溴化乙锭（ EB ）能插入 DNA 分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。

2. 琼脂糖凝胶电泳估计（ EB荧光分析法 ）

原理：

与已知浓度的 DNA 电泳带荧光强度对比，就可以估计出 DNA含量。

一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的 DNA 标准混合液对比得知。

DNA 分子量Marker 有许多公司的商品，使用非常方便。如 DNA 的 HindⅢ酶切物等。

四、 DNA 分子量的估计

MarkerMarker

DNA ladder

28kb

2500bp2300bp

1300bp900bp750bp200bp

5000bp20kb

1000bp900bp800bp700bp600bp

500bp

400bp

300bp200bp100bp

DNA Marker

RNA 的分离和纯化

• 细胞中的核酸： DNA和 RNA 。• RNA ： rRNA 、 tRNA 、 mRNA 。• 一个典型哺乳动物细胞约含 10-5μg RNA 。 － 80%～ 85% rRNA(28S 、 18S 、 5S rRNA) 。 － 15%～ 20%低分子量 RNA( 如 tRNA 、核内

小分子 RNA 等）。 － 1%～ 5% mRNA 。

• 实验成败关键：创造一个无 RNase 的环境– 去除外源性 RNase 的污染： DEPC(焦碳酸二乙脂 )– 抑制内源性 RNase 的活性

•RＮ ase 阻抑蛋白（ RＮ asin ，非竞争性抑制剂）•氧铜核糖核苷复合物硅藻土

RNA 的抽提与纯化

•总 RNA 的制备•真核生物mRNA 的纯化

–从总 RNA 中，用寡聚 (dT)中亲和层析柱分离mRNA 。可应用 Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚 (A)mRNA。将用生物素标记的寡聚 (dT)引物与细胞总 RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚 (dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA 。

RNA 的电泳检测

• RNA 的浓度和纯度可通过测试其 OD260来判断， OD260 为 1时相当于浓度为 40μg/mL。

• 检测：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。