재조합 아데노 부속 바이러스를 이용

한 유전자 형질 도입율 향상

연세대학교 대학원

의 과 학 과

김 성 진

재조합 아데노 부속 바이러스를 이용

한 유전자 형질 도입율 향상

연세대학교 대학원

의 과 학 과

김 성 진

재조합 아데노 부속 바이러스를 이용

한 유전자 형질 도입율 향상

지도교수 장 진 우

이 논문을 석사 학위 논문으로 제출함

2003 년 12 월 일

연세대학교 대학원

의 과 학 과

김 성 진

김성진의 석사 학위논문을 인준함

심사의원 장 진 우 인

심사의원 김 주 항 인

심사의원 이 희 란 인

연세대학교 대학원

2003년 12 월 일

i

차 례

그림 및 표 차례 ……………………………………………… iii

국문요약

I. 서 론 ………………………………………………… 4

II. 재료 및 방법 ……………………………………… 11

1. chemicals …………………………………………… 11

2. 세포배양 …………………………………………… 11

3. rAAV 의 생산 및 농축 …………………………… 12

4. Calcium phosphate transfection ………………… 13

5. X-gal 염색법과 유전자 형질도입율의 결정 …… 13

6. MTT assay …………………………………………… 15

7. RT-PCR ………………………………………………… 15

III. 결 과 ……………………………………………… 17

1. 아데노 바이러스의 co-infection에 의한 rAAV의

형질 전환 증가 ……………………………………… 17

2. chemicals이 암 세포 주에 미치는

세포 독성 측정 …………………………………… 19

3. rAAV 벡터에 의한 유전자 전달 효율 ………… 24

4. chemical 조합에 따른 rave의 유전자 형질

도입율의 비교 ……………………………………… 28

IV. 고 찰 …………………………………………………… 32

ii

V. 결 론 …………………………………………………… 37

참고문헌 ………………………………………………… 34

영문요약 ………………………………………………… 44

iii

그림 차례

Fig 1. Schematic representation of pAAV vector …… 8

Fig 2. A model for the role of cell surface HSPG and

FGFR1 in mediating AAV binding and entry into the host

cell ……………………………………………………………… 9

Fig 3. Constuction scheme of a recombinant adeno-

associated virus …………………………………………… 14

Fig 4. Transduction efficiency to various human cancer

cells by rAAV encoding Lack………………………………… 18

Fig 5. Cytotoxicity by sodium butyrate and trichostatin

A, histone deacetylase inhibitors ……………………… 20

Fig 6. Cytotoxicity by aphidicolin and hydroxyurea, DNA

synthesis inhibitors ………………………………………… 21

iv

Fig 7. Cytotoxicity by etopocide and camptothecin,

topoisomerase inhibitors …………………………………… 22

Fig 8. Cytotoxicity by MG-132 and tyrphostin-1,

proteosome inhibitor and EGFR inhibitor, respectively

………………………………………………………………… 23

Fig 9. RT-PCR analysis of αV integrin RNA in control

and trichostatin A treated cells ………………………… 29

Fig 10. Effect of combination of each chemical on the

transduction frequencies of rAAV vector ……………… 30

표 차례

Table 1. Effect of various chemical additives on

transduction efficiency in various human cancer cell

lines …………………………………………………………… 26

1

국문요약

재조합 아데노 부속 바이러스를 이용한 유전자 형질 도입율 향상

재조합 아데노 부속 바이러스 유전자 전달체 (recombinant adeno-assicated

virus; rAAV)는 세포 또는 조직에 전달한 유전자의 발현을 장기적으로

유도한다. 또한 신경 및 근육 세포와 조직에 대한 우수한 유전자 전달 효과와

면역 반응의 최소화 등의 장점을 가지고 있다. 그러나 rAAV 의 형질 전환율은

아직도 유전자 발현에 따른 효능을 기대하기에는 아직 미흡한 점이 많이 있다.

따라서 본 연구는 이러한 rAAV 의 낮은 유전자 형질 도입율을 개선하기 위하여

각종 화학물(chemical)을 첨가함으로써 유전자 발현율의 증대를 유도하고자

하였다.

각종 인체 암세포주를 대상으로 rAAV 수용체 (receptor) 발현을 증가시키는

trichostatin A, DNA 합성 억제제인 aphidicolin 과 hydroxyurea,

topoisomerase 저해제인 etoposide 와 camptothecin, proteosome 저해제인 MG-

132, 그리고 epidermal growth factor receptor (EGFP) 억제제인 tyrphostin-

1 을 적용하여 유전자 전달 효율성의 증대 유무를 검증하였다.

LacZ 를 표지 유전자로 하고 x-gal 염색법을 시행하여 분석한 결과, 본

연구에 사용한 rAAV 에 의한 유전자 전달 효율은 약 0.02% 정도로 매우 낮았다.

하지만 hydroxyurea 를 전처리 한 후의 효율은 자궁암 세포 주 Hela, 직장암

2

세포 주 HCT 116 에서 각각 25 배, 5 배, 간암 세포 주 SK-Hep1 에서는 MG-132

처리시 8.5 배 형질 전환 효율을 보였다.

각각의 chemical 을 동시 처리 (chemical combination) 하였을 때 Hela 와

MCF-7 에서 combined effect 를 관찰할 수 있었다. Hela 의 경우 camptothecin

(1.5 배) 과 MG-132 (8.5 배) 를 동시에 처리하였을 때 12 배까지 유전자 감염

효율이 증가함을 확인하였다. 또한 동일한 세포주에 hydroxyurea (1.3 배) 와

tyrphostin-1 (3 배) 를 동시 처리한 경우 8 배까지 각 chemical combination

효과를 확인할 수 있었다. 또한 MCF-7 에서도 hydroxyurea (8 배) 와

tyrphostin-1 (3 배) 을 공동 처리 하였을 때 12 배까지 유전자 전달 효율이

상승함을 알 수 있었다. 하지만, HCT 116 과 SK-Hep 1 의 경우에는 화학물의

동시 처리에 따른 유전자 전달 효율성 증대를 관찰할 수 없었다. 마지막으로,

상기 화학물들은 고농도에서 처리시 세포에 손상을 줄 수도 있으나 본 연구에

사용된 농도에서는 동시처리의 경우에도 세포에 손상을 주지 않음을 MTT

assay 로 확인하였다.

따라서 본 연구 결과로 rAAV 에 의한 유전자 전달 효율은 대상 인체 암

세포주의 종류에 따라 또한 처리한 chemical 의 종류와 작용 기작의 특성에

따라 반응도에 차이가 있음을 확인하였다. 하지만 rAAV 의 유전자 형질

도입율은 각종 화합물의 첨가 특히 서로 다른 성질을 가진 화합물의 동시

처리에 의하여 상당부분 개선되어질 수 있음을 관찰하였다. 이러한

chemical 에 의한 rAAV 유전자 전달 효율 증대 효과가 인체 종양 세포주뿐

3

아니라 신경 세포주 등에서도 유도될 수 있다면, rAAV 의 취약점을 크게

보완해 주는 것으로 그 유용성이 매우 클 것으로 기대된다.

핵심되는 말 : 재조합 아데노 부속 바이러스 (rAAV), 유전자 형질 도입율,

camptothecin, MG-132, hydroxyurea, tyrphostin-1, combined effect.

4

재조합 아데노 부속 바이러스를 이용한 유전자 형질 도입율 향상

연세대학교 대학원 의과학과

김 성 진

I. 서 론

현대 의과학 연구분야의 하나로 국내외적으로 많은 연구가 진행되고 있는

유전자 치료는 유전자의 이상으로 발생하는 선천적 유전병을 유전자 수준에서

치료하려는 신기술로 개발되기 시작하였다 1. 이후 암, 퇴행성 뇌질환, 및

감염성 질환과 같은 다양한 인체 질환의 경우에도 적절한 치료 유전자의

도입으로 치료 효과를 볼 수 있다는 가능성이 속속 밝혀지면서 그 적용

범위는 계속 증가하는 추세이다 2,3. 이러한 유전자 치료가 성공적으로

수행되기 위해서는 먼저 몇가지 선결해야 할 문제점들이 있다. 그 중 하나는

치료에 필요한 유전자를 원하는 세포안으로 안전하게 그리고 효과적으로

도입시켜 그 유전자를 발현시키기 위한 유전자 전달 기술의 확보이다. 이러한

기술의 핵심 요소는 유전자 전달체이다. 유전자 치료에 사용되는 유전자

전달체는 세포에 유전자를 전달하는 도구가 되는 것으로써, 궁극적으로는

5

인체에 적용될 것임을 고려할 때 그 자체의 독성이 낮거나 아예 없어야하며,

유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다.

이러한 유전자 전달체는 그 구성 물질의 유래에 따라 크게 바이러스성과

비바이러스성으로 나눌 수 있다. 비바이러스성 유전자 전달체는 주로

양이온성 지질 또는 고분자로 이루어지며, 이들은 음이온성인 DNA 와

이온결합에 의해 복합체를 형성하여 세포 내로 전달된다. 이는 바이러스성

전달체에 비하여 낮은 독성, 비면역원성, 대량생산과 취급의 용이성 등의

장점을 가지고 있으나 낮은 유전자 전달 효율이라는 큰 단점을 가지고 있다.

바이러스성 유전자 전달체 4 는 유래한 바이러스의 종류에 따라 재조합 레트로

바이러스(recombinant retrovirus), 재조합 아데노 바이러스 (recombinant

adenovirus), 재조합 아데노 부속 바이러스(recombinant adeno-associated

virus; rAAV)등이 있다 5,6,7. 한편 이들은 각기 나름대로의 장단점을 가지고

있어 대상 질환 또는 대상 세포등에 따라 달리 이용되고 있다. 이러한

바이러스성 벡터는 비바이러스성 벡터에 비하여 대체적으로 유전자 발현

효율이 월등히 높다. 하지만 잔류하고 있는 바이러스 유래 물질에 의한 독성

및 원치않는 면역반응의 유도 등 안전성이 동시에 문제점으로 지적되고 있다 8.

이들 중 rAAV 는 장기간의 유전자 발현을 유도할 수 있고, 면역 반응에 따른

부작용이 거의 일으키지 않는 장점을 가지고 있다 9. 이를 근거로 퇴행성

뇌질환 등의 치료 목적으로 신경세포에 유전자를 전달하는 유전자 전달체로

개발되기 시작하였다 10. rAAV 는 바이러스 중에서도 그 크기가 작은 편으로,

6

비병원성인 파보바이러스(parvovirus)군에 속한다. 바이러스의 게놈은 4.7

Kb 의 단일가닥 DNA (single-stranded DNA ; ssDNA)로 mRNA 와 동일한 유전자

암호를 가지는 positive 또는 그 반대인 negative strand 단일 가닥이 모두

게놈 기능을 할 수 있다 11,12.

한편 야생형 AAV 가 숙주를 감염한 후 효과적인 바이러스의 복제와 바이러스

생산을 유도 하기 위해서는 아데노바이러스가 동시에 감염되어야 한다. 최근

연구 결과를 살펴보면 AAV 의 복제에 필요한 것은 아데노 바이러스의 유전자

중 초기발현 유전자들로, E1A, E1B, E4, 그리고 E2A 등이 필요함을 알 수

있었다 13,14,15.

현재 유전자 전달체로 개발되어있는 rAAV 벡터 체계를 살펴보면, rAAV

vector 로는 대부분 AAV 중 AAV2 를 변형한 형태로 게놈의 양쪽 말단의 TR

(Terminal repeat)을 제외한 rep genes 과 cap genes 을 모두 제거한 형태가

사용되고 있다 (Fig.1). 제거된 rep genes 과 cap genes 은 rAAV 생산시

추가로 보충된다 (Fig.2)16,17,18.

현재 개발되어있는 rAAV 벡터의 유전자 전달 효능은 세포에 따라 다르다.

이는 일차적으로 바이러스가 표적세포를 인식하고 세포내로 삽입되는 반드시

필요한 세포표면의 receptor 와 coreceptor 의 분포 특성과 밀접한 관계가

있다. 바이러스의 감염은 현재 two-step process 가 널리 이해되고 있다.

rAAV 의 primary receptor (coxsackievirus adenovirus receptor and heparan

sulfate proteoglycan)를 통한 직접 침투와 adenovirus 나 HSV 같은 helper

7

virus 에 의해 결정되는 co-receptor (αv integrin)에 의한 감염이 그것이다

(Fig.2)19,20,21. 그러므로 rAAV 를 유전자 전달을 위한 벡터로 사용하고자 할

때, rAAV 의 receptor 나 co-receptor 의 발현 여부는 유전자 전달의 효능을

증가시킬 수 있는 요소중의 하나가 될 수 있다. 한편 세포내로 삽입된 rAAV

벡터를 통한 유전자 발현을 위해서는 핵내로 전달되어야만 한다 22. rAAV 는

ssDNA 를 genome 으로 가지고 있기 때문에 유전자 발현을 위해서는 전사

(transcription)시 활성이 있는 형태인 이중가닥 DNA (double-stranded DNA ;

dsDNA)로의 전환이 일어나야만 한다 15,23.

이러한 rAAV 벡터의 유전자 전달 효율을 증대시키기 위한 시도들이

행해지고 있다. 그 중에서, 화학제에 의해 AAV 의 형질 전환이 증가된다는

사실이 많이 보고되고 있는 중이다. Trichostatin A 는 rAAV 의 co-

receptor 인 αv integrin 의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다. Etoposide

(type II topoisomerase 저해제), camptothecin (type I topoisomerase

저해제), Aphidicolin (DNA polymerase 저해제), 그리고 ribonucleotide

reductase 를 저해함으로써 DNA systhesis 를 억제하는 hydroxyurea 의 처리는

DNA repair 에 관여하는 DNA polymerase 의 발현을 순간적으로 증가시켜

rAAV 의 형질 전환율을 개선시킨다고 알려져 있다. 이는 rAAV genome 의

ssDNA 를 ds DNA 로의 전환을 촉진시키기 때문에 보여지는 현상인 것 같다 15,23.

8

Fig.1. Schematic representation of pAAV vector. This vector was designed to express an inserted gene under the control of cytomegarovirus(CMV) promoter.

그리고 EGFR (Epidermal growth factor receptor)에 의해 ssDBP (single-

stranded D-Sequence-binding protein)이 인산화되어 결과적으로 활성화 되면,

이 ssBP 는 AAV 의 single-stranded D-sequence 에 결합하여 ssDNA 의

dsDNA 로의 전환을 억제한다 30,31,32. Tyrphostin-1 은 EGFR 을 저해함으로써,

IB3 세포에서 AAV 의 형질 전환을 증가시킬 수 있다고 알려져 있다. 이러한

사실등을 바탕으로 본 연구에서는 세포 수준에서 보다 효율적인 AAV 의 유전자

전달 효율성을 증대시키기 위한 방안을 개발하고자 하였다.

ITRREP CAPITR

ITRCMV promoter Lac Z ITR

CMV promoter Lac

9

Fig. 2. A model for the role of cell surface heparan sulfate proteoglycan (HSPG) and fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) in mediating AAV binding and entry into the host cell. Co-expression of HSPG and FGFR1 is required for successful binding of AAV followed by viral entry into a susceptible cell (a). Both of which are perturbed by the ligand, β-FGF, which also requires the HSPG-FGFR1 interaction (b). (Nat Med 1999;5:71-77).

즉 상기 chemical 들이 AAV 에 의한 유전자 전달에 필요한 각각의 단계 (1)

AAV 의 receptor 를 통한 감염, (2) 감염된 AAV 의 발현을 위한 핵까지의

trafficking, (3) ssDNA 의 dsDNA 로의 전환에 관여한다는 사실에 근거하여,

각종 인체 암세포주에서 이러한 각각의 chemical 의 전처리에 따른 AAV 유전자

전달 효율성 변화를 β-galactosidase (LacZ)를 표지 유전자로하여

규명하고자 한다. 또한 chemical 처리가 세포에 어떤 독성을 유도하는지를

검증하고 유전자 전달 효율성은 증대시키나 세포에 독성은 유도하지 않는

10

적절한 chemical 처리 조건을 확보하여, 만약 서로 다른 특성을 가지는

chemical 의 combination 시 유전자 전달 효율성을 더욱 증대 시킬수 있는

가능성이 있는지를 검증하고자 하였다. 즉 다양한 성질을 가진 chemical 을

적절히 조합을 하였을 때, 두개 혹은 3 개의 chemical combination 을 통한

좀더 강력한 AAV 의 유전자 형질 도입율 향상 방안을 제시하고자 하였다.

11

II. 재료 및 방법

1. chemicals

실험에 사용된 모든 chemical 은 Sigma 에서 구입하였다. Hydroxyurea (1

M)는 phosphate-buffeded saline (PBS), 그리고 trichostatin A (5 mM),

etoposide (10 mM), camptothecin (10 mM), aphidicholin (5 ug/ml),

MG-132 (20 mM), Tyrphostin-1 (50 mM) 는 dimethyl sulfoxide (DMSO)

에 각각의 농도로 농축액을 만들어서 저장하였고, 실험시 배지 용액으로

희석하여 사용하였다. Trichostatin A (5 mM) 은 48 시간 동안

처리하였다. Hydroxyurea (4 mM), etoposide (10 uM), camptothecin

(0.1 uM),그리고 aphidicolin (5 ug/ml) 은 16 시간 처리하였다. MG-132

(20 uM) 과 tyrphostin-1 (250 mM) 3 시간 처리하였다. chemical 처리 후,

각각의 well 은 DMEM 배지로 세척한 후, 형질 전환 효율을 측정하기 위해

바이러스를 감염시켰다.

2. 세포배양

본 실험에 사용된 SK-Hep1 (ATCC HTB-52) 은 간암세포주이며, U251 은

뇌암세포주이다. HCT116 (ATCC CCL-247) 은 결장암 세포주이며, MCF-7

(ATCC HTB-22) 은 유방암 세포주이고, HeLa (ATCC CCL-2) 은 자궁경부암

세포주이다. 293T (ATCC CRL-11268) 세포는 SV40 large T 항원으로

형질전환된 293 세포이다. 모든 세포 주는 10 % 우태아 혈청 (GIBCO BRL,

12

Grand island, NY, USA) 과 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin 과

50ug/ml streptomycin 이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium

(Gibco BRL, Grand island, NY, USA) 으로 배양액으로 항생제

penicillin/streptomycin (GIBCO BRL, Grand island, NY, USA) 을

첨가하여 5 % CO2의 존재하에 37 ℃ 항온 배양기에서 배양하였다.

3. rAAV 생산 및 농축

293T 세포를 10 개의 15 cm 배양접시에 1 × 10 7 이 되도록 분주하였다.

rAAV-LacZ (Stratagene, Lajolla, CA,USA) 을 생산하기 위하여 3 plasmid

system (Stratagene, Lajolla, CA,USA) 을 사용하였다. 그 제품에서

제공하는 pAAV-LacZ 벡터, pRep-Cap 벡터, pHelper 를 1:1:1 의 비율로

calcium phosphate transfection 방법으로 10 X 15 cm 플레이트에

transfection 시켰다. 2 일 후 세포와 배양액을 회수하였다. 3 번의

얼림과 녹임을 반복한 뒤 DNase I (10 ug/ml) 를 37 ℃에서 30 분간

처리한 후, 원심분리 (3,700g, 4℃, 20min) 하였다. 상층액을 분리한 후

1/3 volume 의 saturated (NH4)2SO4를 첨가하였다. 4℃에서 10 분간 방치한

후 원심분리 (5,000g, 4℃, 20min) 하였다. 상층액을 분리한 후 2/3

volume 의 saturated (NH4)2SO4 를 첨가하였다. 4℃에서 20 분간 방치한 후

원심분리 (10,000g, 4℃, 20min) 하였다. 침전된 Pellet 을 PBS (pH

7.5)로 잘 녹인후 5ml ultracentrifuge tube 로 옮긴 후, VTI 90 rotor

13

(Beckman, Palo Alto, CA, USA) 에서 71,000 rpm 으로 16 ℃에서 3 시간

동안 초원심분리하였다 16,17 .

4. Calcium phosphate transfection

Calcium phosphate transfection 은 ProFection Mammalian Transfection

systems (Promega, Obispo, CA, USA) 에 따라 시행하였다. 3 ug DNA 를 25

ul 의 2.5 M CaCl2 가 포함된 증류수와 섞어 최종 부피가 250 ul 가 되게

하였다. CaCl2 와 섞인 DNA 용액을 저어주면서 2 X HBS 용액 (HEPES

buffered saline ; 50 mM HEPES, pH7.1, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4)

250 ul 를 한방울씩 떨어뜨렸다. 혼합용액을 transfection 대상 세포가

깔려 있는 배양접시에 천천히 떨어뜨렸다. 16 시간 후 배지를 제거한 후,

새로운 배지로 바꾸어 주었다.

5. X-gal 염색법과 유전자 형질도입율의 결정

X-gal 염색을 위해서 세포들은 고정액 (1% formaldehyde, 1%

glutaraldehyde in dH2O) 에서 5 분간 고정한 후, 2 mM MgCl2가 포함된

ferricyanide, 2 mM MgCl2 in PBS)으로 37 ℃에서 4~16 시간 동안

반응시켰다. rAAV 의 유전자 형질도입율은 감염 48 시간후에 X-gal

염색으로 결정하였다.

14

Fig.3 Construction scheme of a recombinant adeno-associated virus. pAAV-lacZ, pAAV-RC, and pHelper were co-transfected into 293T cells using calcium phosphate transfection. Recombinant AAV vectors were purified as described in material & methods16,17,24.

293

T

pAAV-lacZ

pAAV-RC

pHelper

15

유전자 형질도입율은 100 배의 해상도를 가지 현미경에서 플레이트의

크기와 확대비율 세포수를 계산하여 결정하였는데 현미경상에서 네 곳

이상의 부위를 무작위로 정하여 전체 세포중 염색된 세포의 비율을

계산하였다.

6. MTT assay

96 well 플레이트에 각각 암세포를 1 X 104 세포/ 200 ul 가 되게

분주하였다. 다음날 sodium butyrate, trichostatin A 는 72 시간,

hydroxyurea , etoposide, camptothecin, aphidicholin 는 20 시간. MG-

132, tyrphostin-1 는 2 시간씩 암 세포주에 처리한 후, 배지를 제거하고

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, 5

mg/ml) 용액을 120 ul 씩 첨가하여 37 ℃ 항온기에 반응시켰다.

4 시간후에 MTT 용액을 제거하고 50 ul 의 DMSO 를 첨가한 후, 540 nm 에서

흡광도를 측정하여 세포의 상대적 생존율을 측정하였다.

7. RT-PCR

αv integrin 을 감지하기 위한 RT-PCR 은 다음과 같은 방법으로

진행되었다 27. total RNA 는 TRIzol (Invitrogen, Rockvile, MD,USA)를

사용하여 추출하였다. Genomic DNA 의 오염을 제거하기 위하여, 전체

16

RNA(1 ug)에 RQ1 RNase-free Dnase (Promega, Obispo, CA, USA)를

1 시간동안 37 ℃ 항온수조에서 반응시켰다. 역전사 반응은 Moloney

murine leukemia virus reverse transcriptase (Invitrogen, Rockvile,

MD, USA)와 Oigo(dT)15 primer (Pomega, Obispo, CA, USA)를 가지고

수행되었다. 역전사 반응의 1 ul 를 취하여 αv integrin 와 GAPDH

프라이머를 사용하여 PCR 을 시행하였다 : αv integrin 5’(sense),

TAAAGGCAGATGGCAAAGGAGT 과 αv integrin 3’(antisense),

CAGTGGAATGGAAACGATGAGC. GAPDH 5’(sense)-CCT TCA TTG ACC TCA ACT AC-

3’, GAPDH 3’(antisense), GGA AGG CCA TGC CAG TGA GC. PCR 반응은

95℃에서 30 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 1 분 간격으로 35 회

실시하였다. PCR 생성물은 1% 아가로스젤에서 분리하였고, ethidium

bromide 염색하에서 UV 를 조사하여 관찰하였다.

17

III. 결 과

1. 아데노 바이러스의 co-infection 에 의한 rave 의 형질 전환 증가

아데노 바이러스는 rAAV 의 형질 전환에 영향을 준다고 알려져있다 15.

아데노 바이러스의 초기 유전자 발현은 재조합 아데노 부속 바이러스의

replication - translational activation (E1A), mRNA maturation (E1B and

E4 ORF6), 그리고 translation enhancement (VA and E2A) - 이 효율적으로

일어날 수 있도록 도움을 준다.

본 연구에서는 아데노 바이러스가 rAAV 벡터의 유전자 전달 효율에

영향을 주는지를 알아 보기 위하여 뇌암 (U251), 결장암 (HCT116), 간암

(SK-Hep1), 그리고 유방암 (MCF-7) 등의 암 세포주를 이용하였다. rAAV

자체의 감염능을 알아보기 위하여, rAAV-LacZ 바이러스를 각 세포당 1000

개의 바이러스 (1000 particles/cell)를 감염시켰다. 감염 2 일 후에 형질

도입율을 X-gal 염색으로 결정하였다. rAAV-LacZ 바이러스 (1000

TU/cell)의 감염효율은 극히 일부분의 세포만을 감염 (0.02%이하)시켰다.

예상된 바와 같이, 아데노 바이러스의 co-infecion 에 의한 rAAV 의 유전자

전달 효율은 10 배~100 배까지 증가되었다 (Fig. 4, Table 1).

18

Fig. 4. Transduction efficiency to various human cancer cells by rAAV encoding LacZ. Cells were seeded into 48-well plate. At 24 h later, the cells were infected with rAAV-lacZ (1000 particles/cell) with/without Ad (MOI=5) for 2 h. Transduction efficiency was determined by X-gal staining at 48 h post-infection. (Magnification, 200X).

SK-Hep1 U 251HCT 116 MCF-7

Mock

rAAV – lacZ

rAAV + Ad5

Rad-lacZ

(MOI=5)

19

2. Chemicals 이 암 세포주에 미치는 세포 독성 측정

Chemical 처리에 의한 재조합 아데노 부속 바이러스 벡터의 유전자 전달

효율에 관한 연구를 하기 위하여 뇌암 (U251), 자궁경부암 (Hela), 결장암

(HCT116), 간암 (SK-Hep1), 그리고 유방암 (MCF-7) 등의 암 세포주를

이용하였다. 화학제로는 rAAV 의 수용체 발현을 증가시키는 sodium

butyrate, trichostatin 와, type II topoisomerase 저해제인 etoposide,

type I topoisomerase 저해제인 camptothecin , DNA polymerase 저해제인

aphidicolin, 그리고 ribonucleotide reductase 를 저해함으로써 DNA

systhesis 를 억제하는 hydroxyurea 와 MG-132, tyrphostin-1 등 rAAV 의

유전자 전달 효율에 관여한다고 알려진 것들을 사용하였다. 우선, 세포에

독성을 미치지 않는 각 화학제의 적절 농도를 결정하기 위하여 각각의

chemical 을 처리한 후 48 시간만에 MTT assay 를 시행하였다. Fig. 5 에서

보면, NaB 의 경우 3mM 의 농도에서 세포가 생존율에 거의 영향을 미치지

않음을 알 수 있고, 그 농도로 rAAV 의 유전자 전달 효율 관련 실험에

이용하였다. TSA 의 경우는 10 nM 의 농도가 적절함을 알 수 있다 (Fig. 5).

Aphidicolin, hydroxyurea, etoposide, 그리고 camptothecin 은 각각 5

ug/ml, 4 mM, 10 uM, 그리고 1 uM 의 농도까지 세포가 저항성이 있음을 알

수 있다 (Fig. 6, 7).

20

Fig. 5. Cytotoxicity by sodium butyrate and trichostatin A , histone deacetylase inhibitor. Cells were plated at a density of 1 x 103/well in 96-well plates. Sodium butyrate (A) or trichostatin A (B) was respectively added, and the cells were allowed to grow for 48 h. The cell viability was measured by MTT assay.

Sodium Bytyrate (NaB)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

140.0

0 0.01 0.3 1 3 9 27 81

(mM)

cell

viabili

ty(%

of

mock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

Trichostatin (TSA)

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

0 1 3 10 30 90 270 8100

(nM)

cell

viabili

ty

(% o

f m

ock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

B

A

21

Fig. 6. Cytotoxicity by aphidicolin and hydroxyurea, DNA synthesis inhibitors. Cells were plated at a density of 1 x 103/well in 96-well plates. Aphidicolin (A) and hydroxyurea (B) was respectively added, and the cells were allowed to grow for 16 h. The cell viability was was measured by MTT assay.

Hydroxy Urea

0

20

40

60

80

100

120

00.

10.

41.

34.

012

.036

.0

108.

0

(mM)

Cell

viabili

ty(%

of

mock-treate

d)

U251

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

B

Aphidicolin

0

20

40

60

80

100

120

0 0.16 0.5 1.6 5 15 45 135

(ug/ml)

Cell

viabili

ty(%

of

mock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

A

22

Fig. 7. Cytotoxicity by etoposide and camptothecin, topoisomerase inhibitors. Cells were plated at a density of 1 x 103/well in 96-well plates. Aphidicholin (A) and camptothecin (B) was respectively added, and the cells were allowed to grow for 16 h. The cell viability was measured by MTT assay.

Camptothecin

0

20

40

60

80

100

120

0 0.03 0.1 0.3 1 3 9 12

(uM)

cell

viabili

ty

(% o

f m

ock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

Aphidicolin

0

20

40

60

80

100

120

0 0.16 0.5 1.6 5 15 45 135

(ug/ml)

Cell

viabili

ty

(% o

f m

ock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

A

B

23

Fig. 8. Cytotoxicity by MG-132 and tyrphostin-1, proteosome inhibitor and EGFR inhibitor, respectively. Cells were plated at a density of 1 x 103/well in 96-well plates. MG-132 (A) and Tyrphostin-1 (B) was added, and the cells were allowed to grow for 2 h. The cell viability was measured by MTT assay.

Ty rphostin-1

0

50

100

150

0 9.2 27.7 83.3 250 500 750 1000

(mM)

Cell

viabili

ty (

% o

f m

ock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

MG-132

0

20

40

60

80

100

120

0 0.6 2.2 6.6 20 60 180 540

(uM)

Cell

viabili

ty(%

of

mock-treate

d)

U251

Hela

MCF-7

SK-Hep1

HCT116

B

A

24

또한 MG-132 은 20uM , tyrphostin-1 은 250mM 의 농도가 적당함을 알 수

있다 (Fig. 8). SK-Hep1 의 경우는 27mM turphostin-1 의 농도부터 세포가

민감하게 반응함을 알 수 있다. 대체로 SK-Hep1 와 Hela cells 는 모든

chemicals 에 민감하게 반응하는 편이었다. Hela cells 에 hydroxyurea 를

처리한 경우는 실험 결과가 일관적이지 않아서 생략하였다.

3. rAAV 벡터에 의한 유전자 전달 효율

rAAV 자체의 감염능을 알아보기 위하여, rAAV-LacZ 바이러스를 각

세포당 1000 개의 바이러스 (1000 particles/cell) 를 감염시켰다. 감염

2 일 후에 형질 도입율을 X-gal 염색으로 결정하였다. rAAV-LacZ 바이러스

(1000 TU/cell) 의 감염효율은 극히 일부분의 세포만을 감염 (0.02%이하)

시켰다. 다음으로는 chemicals 의 처리에 의해 rAAV 에 의한 유전자 전달

효율이 증가되는지를 알아보고자 하였다.

Etoposide (type II topoisomerase inhibitor), camptothecin (type I

topoisomerase inhibitor), aphidicolin (DNA polymerase inhibitor) ,

그리고 ribonucleotide reductase 를 저해함으로써 DNA systhesis 를

억제하는 hydroxyurea 의 처리는 DNA repair 에 관여하는 DNA

polymerase 의 발현을 순간적으로 증가시켜 rAAV 의 형질 전환율을

개선시킬 수 있다고 알려져 있다. 이는 증가된 DNA polymerase 가 ss AAV

genome 을 ds DNA 로의 전환을 촉진시키기 때문에 보여지는 현상인 것 같다.

25

이런 화학제가 각각의 세포에서 효과를 보이는지 알아보기 위하여 각각의

시약을 처리한 후, 그 형질전환 효과를 비교해 보았다. 각 chemical 의

효과는 사용된 세포에 따라 다른 결과를 보였다 (Table 1). HCT 116

cells 에서는 hydroxyurea (5.2 배), trichostatin A (3.7 배) 의 처리시

높은 유전자 전달 효율을 보여 주었다. SK-Hep1 에서는 MG-132 (8.5 배) 의

처리시 비교적 유전자 전달 효율이 높았고, MCF-7 의 경우에는

aphidicolin (1.6 배), Hela cells 의 경우에는 hydroxyurea (25 배) 의

처리가 유전자 전달 효율을 높여 주었다. 이러한 결과는 세포내에

존재하는 각기 다른 환경에 따라, 각각의 chemical 반응이 달라질 수

있음을 반영한다. 또한, 같은 농도의 chemical 을 각각의 세포에 처리를

하였을 때, 세포가 받는 cytotoxicity 도 각각 달랐다.

Peptide aldehyde MG-132 는 proteasome 의 강한 inhibitor 이다. rAAV 의

감염은 세포 내에 존재하는 proteasome 에 의하여 제거 되어질 수 있다.

따라서 자연상태에서 rAAV 에 의한 유전자 전달 효율은 proteasome

activity 에 의해 제한적일 수 있다. 본 실험에서는 MG-132 를 처리하였을

때, SK-Hep1 cells 의 경우에는 MG-132 (8.5 배) 처리시 효율이 증가

되었다 (Table 1). 그러나 다른 세포에 처리하였을 때는 그 효과가

미비하였거나, 세포에 많은 손상을 주었다.

26

Table 1. Effect of various chemical additives on transduction efficiency

in various human cancer cell lines

SK-Hep1 HCT 116 MCF-7 Hela

AAV only

TSA

Aphi

HU

Etopo

Campto

MG-132

AAV + Ad

1.00

0.00

4.70

0.00

0.85

0.00

8.50

104.72

1.00

3.75

2.45

5.22

2.51

0.00

0.00

63.06

1.00

0.00

0.73

1.64

0.10

0.00

0.00

14.05

1.00

0.00

0.00

25.00

0.00

2.00

0.00

750.00

Each of the cells was seeded onto a 48-well plate and treated with

each chemical. After optimal treatment of each chemical, the

respective chemical-containing medium was replaced with normal medium,

and the cells were infected with 1000 particles per cell of rAAV-LacZ

for 2hr. Transduction efficiency was determined by X-gal staining at

48hr post- infection. The values represent the relative fold-increase

of transduction efficiency campared to that by rAAV itself.

27

EGFR (Epidermal growth factor receptor)에 의해 ssDBP (single-

stranded D-Sequence-binding protein)이 인산화 그리고 활성화 되면, 이

ssDBP 는 rAAV 의 single-stranded D-sequence(ssDS)에 결합하여 ssDNA 가

dsDNA 로 전환되는 것을 억제한다. Tyrphostin-1 은 EGFR 을 저해함으로써,

IB3 세포에서 rAAV 의 형질 전환을 증가시킬 수 있다고 알려져 있다.

Tyrphostin-1 이 본 연구에서도 rAAV 의 형질 전환을 유도하는지를 알아

보았다. 그 결과는 table 1 에서 보듯이 Hela cells 와 MCF-7 cells 에서는

3 배 정도 증가시켰다. HCT116 과 SK-Hep1 세포에는 그 효과가 미비하였다.

rAAV 의 유전자 전달 효율은 ssDNA genome 이 dsDNA genome 으로의 전환

효율에 따라 달라진다고 알려져 있다. 아데노 바이러스는 rAAV 의 복제를

위한 helper 바이러스로써 알려져 있다. 아데노 바이러스 genome 에서

발현되는 초기 유전자인 E1A, E1B, E4, 그리고 E2A 의해 rAAV 의 ss DNA

genome 이 dsDNA 로 전환이 촉진됨으로써 형질 전환이 증가된다고 있다.

이러한 사실이 본 연구에서도 적용되는지를 확인하기 위해 야생형

아데노바이러스와 rAAV 를 동시에 감염시켜보았다. HCT 116 의 경우는

100 배, Hela 와 SK-Hep1 세포의 경우는 40 배, MCF-7 의 경우 50 배까지

형질 전환 효율을 증가시켰다 (Fig. 4, Table 1). U251 세포의 경우에는

chemical 에 의한 효과가 거의 보이지 않았고, 또한 세포에 많은 손상을

주어서 결과를 생략하였다.

28

Histone deacetylase inhibitor 인 trichostatin A 는 rAAV 의 co-

receptor 인 αv integrin 의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다. 본

연구에서는 rAAV 의 co-receptor 의 발현양의 증가가 rAAV 에 의한 형질

전환 효과를 유도할 수 있는지를 알아보기로 하였다. Trichostatin

A 처리에 의해 αv integrin receptor 의 발현이 증가되었는지를 알아보기

위해, RT-PCR 을 통해 mRNA level 을 측정하였다. 그 결과, 각각의 세포는

어느 정도 αv integrin receptor 를 발현시키고 있었고, trichostatin A

처리에 의하여 αv integrin receptor 의 발현양이 증가됨을 확인할 수

있었다 (Fig. 9). 증가된 co-receptor 에 의해 rAAV 의 형질 전환이

증가되는지를 알아보기 위하여, 동일한 조건으로 TSA 를 처리한 후에, X-

gal staining 을 통해 형질 전환 효율을 비교해보았다. 그러나 rAAV

자체를 infection 한 경우와 비교하여 trichostatin A 처리에 의한 형질

전환 효과는 모든 세포에서 거의 변화가 없었다 (Table 1).

4. chemical 조합에 따른 rAAV 의 유전자 형질 도입율의 비교

앞의 결과에서 보듯이, 각각의 chemical 은 세포에 따라 그 효과가

다르기 때문에, 각 단계 (1) rAAV 의 receptor 를 통한 감염, (2) 감염된

rAAV 의 발현을 위한 핵까지의 trafficking, (3) ssDNA 의 dsDNA 로의

29

Fig. 9. RT-PCR analysis αV integrin of RNA in control and trichostatin-treated cells. Cells were incubated with trichostatin A. Total RNA was isolated and RT-PCR was performed as described in “materials and methods” using GAPDH as an internal control. 1. Mock- treated control 2. 30 nM trichostatin treated 3. 90 nM trichostatin treated.

전환에 관여하는 각각의 chemical 의 조합을 통한 결과는 어떻게 되는지를

알아보고자 하였다. Hela cells 에서 chemical combination 에 의한 효과는

분명하게 나타났다 (Fig. 10). Hela cells 에 camptothecin 와 MG-132 를 을

처리하였을 때 rAAV-lacZ 자체의 감염보다 형질 도입율이 각각 1.3 배, 9 배

정도 증가하는 것으로 나타났다. 각각의 chemical 을 combination 시켰을

때는 약 12 배로 추가적인 효과가 나타났다.

αv integrin GAPDH

31 2 3 1 2

30

Fig. 10. Effect of combination of each chemial on the transduction frequencies of AAV vector. Cells were seeded into a 48-well plate and treated with each chemical as described in “materials and methods”. After optimal treatment of each chemical, the respective chemical-containing medium was replaced with normal medium, and the cells were infected with 1000 particles per cell of rAAV-LacZ for 2 h. Transduction efficiency was determined by X-gal staining 2 days after infection. The values represent the relative fold-increase of transduction efficiency campared to that by rAAV itself.

Hela

0

2

4

6

8

10

12

14

1

drug

rela

tive

tra

nsduction

eff

icie

ncy

AAV only

camp

camp + MG-132

camp + tyr

MG132

tyrphostin-1

HU

HU + tyr

A

MCF-7

0

2

4

6

8

10

12

14

1

drug

rela

tive

tra

nsduction

eff

icie

ncy

AAV

TSA

Camptothecin

HU

HU+Tyr

Tyr

B

31

Camptothecin (1.3 배)과 tyrphostin-1 (3 배)을 combination 시켰을 때에도

9 배 정도로 synergistic effect 가 관찰되었다. Hydroxyurea (1.3 배)와

tyrphostin-1 (3 배)를 처리하였을 때에도 6 배 정도로 그 효과가

증가되었다 (Fig.10,A). MCF-7 cells 에서도 마찬가지로 chemical

combination 에 의한 형질도입율의 증가가 관찰되었다. Hydroxyurea 와

tyrphositin-1 을 처리하였을 때 rAAV-lacZ 자체의 감염보다 형질 도입율이

각각 8 배, 3 배 정도로 증가되었다. 두 chemical combination 시에는 12 배

정도로 additive effects 를 관찰할 수 있었다 (Fig. 10). 다른 세포에서도

같은 실험을 하였었지만, 그 효과가 미비하여 결과를 생략하였다.

32

IV. 고 찰

본 연구에서는 rAAV 의 유전자 전달 효율을 증가시킨다고 알려져 있는

각각의 화학적 첨가제를 서로 조합함으로써 여러 가지 암세포주에 대한

rAAV 의 유전자 형질 도입율을 개선하고자 하였다. 그 결과 Hela

cells 에서는 camptothecin 과 MG-132, camptothecin 과 tyrphostin-

1,그리고 hydroxyurea 와 tyrphostin-1 의 조합이 현저하게 rAAV 에 의한

유전자 형질 도입율을 증가 시킨다는 것을 알 수 있었다 (Fig. 10A). MCF-

7 에서도 hydroxyurea 와 tyrphostin-1 의 조합이 AAV 의 유전자 형질

도입율을 올릴 수 있다는 가능성을 보여 주었다 (Fig. 10B).

rAAV 의 효과적인 유전자 전달을 위해서는 다음과 같은 사항들이

고려되어야 한다.

첫째, 바이러스가 세포내로 uptake 되기 위해서는 자신의 receptor 와

결합을 하여야 한다. Heparan sulfate proteoglycan 는 rAAV 의

receptor 로써 잘 알려져 있고, fibroblast growth factor receptor 와 αv

integrin 는 coreceptor 로 알려져 있다 27,28. 이러한 receptor 들이

부족하거나 세포막에서 그것의 location 이 rAAV 의 결합이 용이하지 않을

때는 유전자 전달 효율이 떨어진다. 이러한 바이러스의 초기 단계에

관여하는 receptor 의 발현을 증가시키기 위하여, trichostatin 의 처리가

rAAV 의 coreceptor 인 αv integrin 발현을 증가시키는지 또한 그 발현

33

증가가 rAAV 의 감염능을 증가시키는지를 알아보았다. RT-PCR 결과에 의하면,

TSA 를 30nM, 90nM 로 증가시켰을 때 αv integrin receptor 발현이 증가함을

알 수 있었다 (Fig. 10). 하지만 HCT 116, Hela, SK-Hep1, 그리고 MCF-7

모두에서 TSA 의 단독 처리는 rAAV 의 유전자 형질 전환을 거의 유도하지

못하였다. 이는 아마도 TSA 에 의해 rAAV 의 coreceptor 의 발현 증가가

이루어졌지만, receptor 가 세포막으로 제대로 trafficking 이 되지 않아서

rAAV 가 결합할 기회가 늘어나지 않았기 때문이거나, rAAV 가 αv integrin

co-receptor 에 의해 충분한 감염이 이루어졌지만, 핵내로 이동된 rAAV 의

ssDNA genome 이 유전자 발현 형태인 dsDNA 로 전환되는 과정이 원할하지

않기 때문에 그 효율이 미미했을 수도 있다. Qing et al.에 의하면 co-

receptor 의 증가는 rAAV 의 receptor 결합을 증가시킨다는 보고는 있지만 21

(Fig. 2), 이 역시 co-receptor 자체만의 효과는 미비하였다.

둘째, 다양한 chemicals 이 rAAV 의 형질 전환을 유도한다. DNA 에 손상을

주는 UV light 나 gamma irradiation 을 주었을 때 double-stranded vector

DNA 의 축적이 증가된다는 보고가 있었다. 이러한 결과는 외부 자극에 의해

DNA 손상 되었을 때, 그것을 극복하기 위해 세포내에 일시적으로 DNA

중합효소 발현이 증가하게 되고, 그 증가된 DNA 중합효소가 rAAV 의 ssDNA

genome 을 dsDNA genome 으로 바꾸는데 기여하는 것으로 보인다. 본

연구에서는 hydroxyurea 를 처리하였을 때 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

Hydroxyurea 는 세포에 활성산소 (Reactive oxygen intermediates,ROI)의

34

발생을 증가시킴으로써 세포내의 DNA 에 손상을 일으킨다고 알려졌다 25,26.

이런 DNA 손상을 극복하기 위해 DNA repair 에 관여하는 DNA 중합효소의

발현이 증가되고, 그 증가가 rAAV 의 유전자 형질 전환을 증가시키는 것으로

보인다. 본 실험에서 hydroxyurea 를 처리하였을 때, MCF-7 과 HCT 116

에서는 rAAV 의 유전자 전달 효율이 증가됨을 알 수 있었다. 그러나,

Hela 와 SK-Hep 1 에서는 그 효과가 거의 관찰되지 않았다 (Table 1).

Topoisomerase 저해제인 camptothecin 과 etoposide 의 경우에도 각각의

처리되는 세포에 따라 그 효과가 다르게 나타났다. Camptothecin 의

경우에는 HCT 116 에서 약 10 배까지 효율을 증가시켰고, etopocide 의

경우에는 SK-Hep 1 에서 약 5 배정도까지 효율을 증가 시켰다. 이는 각각의

chemical 이 세포에 따라 다른 효과를 준다는 것을 알 수 있다. 그리고

Proteasome 활성 억제는 rAAV 벡터를 핵내로 좀더 효율적으로 이동

시킴으로써 그 벡터의 형질전환 효율을 증가시킬 수 있다. 그러나,

proteosome 억제제인 MG-132 를 가지고 여러 번의 시도를 했지만 세포에

너무 많은 손상을 일으켜서 그 효과를 확인하지는 못했다. 다만,

Hela 에서는 세포가 많은 손상을 받았지만 (약 30% 손상) 9 배까지 효율이

증가되었다. MG-132 에 의한 rAAV 형질 전환을 좀 더 연구하기 위하여,

앞으로 MG-132 의 농도와 처리 시간을 변화시킴으로써 좀 더 효율적이고,

세포에 안전한 조건을 찾으려고 시도중이다. 또한 EGFR 은 ssDBP 를 인산화

시키고, 인산화된 ssDBP 는 rAAV 의 terminal repeat (TR)에 있는 D

35

sequence 와 결합하여 dsDNA 로의 전환을 억제한다. EGFR 억제제인

tyrphostin-1 을 처리하면 EGFR 의 downstream 신호전이를 억제함으로써,

ssDBP 를 억제하게 되고, rAAV 의 ssDNA genome 을 dsDNA 로 전환이 용이하게

할 수 있다. 하지만, 이 chemical 도 세포에 약간의 손상을 주는 것으로

보인다. Hela 와 MCF-7 에서 3 배 정도 미비한 효율 증가가 관찰되었다

(Table 1). 이런 미비한 효과는 chemical combination 에 의하여 더욱 증가

시킬수 있었다. Hela cells 에 camptothecin 와 MG-132 를 을 처리하였을 때

rAAV-lacZ 자체의 감염보다 형질 도입율이 각각 1.3 배, 9 배 정도 증가하는

것으로 나타났다. 각각의 chemical 을 combination 시켰을 때는 약 12 배로

추가적인 효과가 나타났다. Camptothecin (1.3 배)과 tyrphostin-1 (3 배)을

combination 시켰을 때에도 9 배 정도로 synergistic effect 가 관찰되었다.

Hydroxyurea (1.3 배)와 tyrphostin-1 (3 배)를 처리하였을 때에도 6 배

정도로 그 효과가 증가되었다 (Fig. 11,A). MCF-7 에서도 마찬가지로

chemical combination 에 의한 형질 도입율의 증가가 관찰되었다.

Hydroxyurea 와 tyrphositin-1 을 처리하였을 때 rAAV-lacZ 자체의 감염보다

형질 도입율이 각각 8 배, 3 배 정도로 증가되었다. 두 chemical

combination 시에는 12 배 정도로 additive effects 를 관찰할 수 있었다

(Fig. 10). 하지만, tyrphostin-1 은 EGFR 뿐아니라 세포내 스트레스 반응

(stress response)에도 영향을 주는 것 같다. 이 시약의 처리에 의해 많은

세포가 손상을 받았다. 그러므로 처리 가능한 적절한 시약 농도를 결정하고,

36

rAAV 의 유전자 형질 효율을 증가시킬 수 있는 조건을 찾는 일이 시급한

과제라고 할 수 있다. 또한 각각의 chemical 이 작용하는 기전과 그것에

반응하는 세포들에 관한 좀 더 많은 연구가 선행되어져야 할 것이다.

37

IV. 결 론

본 연구는 재조합 아데노 부속 바이러스의 낮은 유전자 형질 도입율을

개선하기 위하여 각종 화학물의 첨가에 따른 유전자 형질 도입율을 향상

시킬 수 있는 방안들을 찾고자 계획되었다.

재조합 아데노 부속 바이러스에 의한 유전자 전달 효율이 Hela, SK-Hep1,

MCF-7 등의 각종 인체 암세포주를 대상으로 하였을 때 약 0.02% 정도로

매우 낮았지만, hydroxyurea, camptothecin, tyrphostin-1, MG-132 등과

같은 chemical 을 처리하였을 때 그 형질 전환 효율이 크게 증대됨을 확인할

수 있었다. 또한 이러한 chemicals 을 동시 처리 (chemical combination)

하였을 때에는 Hela 와 MCF-7 에서 additive effect 를 관찰할 수 있었다.

또한 이러한 조건에서 바이러스 및 화학물의 처리에 따른 부작용은

발견되지 않았다. 따라서 본 연구 결과는 재조합 아데노 부속 바이러스의

유전자 전달 효율이 인체 암 세포주의 종류와 chemical 에 따라 차이가

있을 수 있지만, 성질이 다른 화학물의 단독 처리, 특히 화학물의 동시

첨가에 의하여 개선되어 질 수 있음을 보여주었다.

이는 향후 재조합 아데노 부속 바이러스를 이용한 유전자 전달의

유용성에 또 다른 가능성을 제시한다.

38

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Abstract

Enhancement of gene expression by recombinant adeno-associated

virus by various chemical treatments

Sung Jin Kim

Department of Medical Science

The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor Jin Woo Chang)

Recombinant adeno-associated virus (rAAV) has been recently drawn an

attention as a gene delivery system with the advantage of long-term

and efficient gene expression in various cell types, especially

neuronal and muscle cells. However, transduction efficiency by rAAV is

still low, which may explain its limited application, even in neuronal

cells in vitro. To overcome this drawback of rAAV system, I have tried

to enhance the transduction efficacy using many different kinds of

chemicals which can have an effect on DNA synthesis, cell cycle or

rAAV receptor expression.

To elucidate the enhanced transduction efficacy, I investigated the

45

enhanced transduction efficacy of rAAV expression by treatment or

combination of seven chemicals (Trichostatin A as an inducer of rAAV

receptor expression, Aphidicolin and Hydroxyurea as a DNA damaging

agent, Etopocide and Camptothecin as a DNA synthesis blocker, MG-132

as a proteosome inhibitor, and Tyrphostin-1 as a EGFR inhibitor) in

five different human cancer cell lines (cervical Hela, colon HCT 116,

breast MCF-7, hepatocellular carcinoma SK-Hep 1, and glioma U 251).

Hydorxyurea increased the transduction efficiency by 25- or 5-fold in

Hela or HCT 116 cells, respectively. MG-132 increased the transduction

efficiency by 8.5-fold in SK-Hep 1 cells. Co-treatment of MG-132 and

camptothecin enhanced the transduction efficiency by 12-fold in Hela

cells. The combined treatment of hydroxyurea and tyrphostin-1 also

enhanced the transduction efficiency by 12-fold in Hela cells.

Finally, MTT assay data consistently showed that cytotoxicity was not

observed in any concentrations of each chemical used in this study.

In conclusion, the transduction efficiency of rAAV mediated

transgene expression could be significantly enhanced in human cancer

cells by chemical combinations. This may be of wide application to

other cells, such as primary neuronal cells, neural progenitor cells

46

as an optimized gene delivery condition with highly improved

transduction efficiency.

Key Words : recombinant adeno-associated virus(rAAV),

transduction efficiency, chemical combination, camptothecin,

hydroxyurea, tyrphostin-1, MG-132