电泳Electrophoresis

基本原理及其在生化领域的应用

电泳（ Electrophoresis ）是荷电物质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。电泳分离是利用荷电物质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。

电动电位和电动现象

如果一个生物分子（或胶体）通过某个过程（如选择性吸附、化学反应或电离）得到一个带电表面，这将影响该表面附近的离子分布，其中溶液介质中的反粒子会紧密排列在表面，导致偶电层的形成。偶电层的固定层和可移动层之间可形成电位，叫做电动电位或 Zeta- 电位（ ζ 电位）。

固 - 液或液 - 液界面在外加电场的作用下相对运动而产生的电场现象，统称为电动现象。主要有如下 4种：电渗、流动电位、沉降电位和电泳（表 1 ）。其中电泳方法在生物系统中得到了广泛的运用

电泳迁移率（ u ） 当一个带有效电荷 Q 的质点，在介质中（液体或凝

胶）受到电场 E 的作用而恒速迁移时，质点在受到驱动力 F 的同时还受到一个与其相平衡的阻力 f 。

F = QE (1) f = 6πrηv (2) F = f

QE = 6πrηv (3)电泳迁移率是指在单位电场强度（ 1V/cm ）时的泳动速

度，即电泳迁移率 u = v/E (4)

代入（ 3 ）式得u = Q/6πrη （ 5 ）

在特定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。

影响电泳迁移率的因素 电泳迁移率与移动距离、球形分子大小、介质粘度、

颗粒所带电荷有关。另外还受到一些其他因素的影响，如电场强度、溶液的 PH 、离子强度和温度等。

（ 1 ）    颗粒性质；（ 2 ）    电场强度；（ 3 ）    溶液性质： PH 、离子强度、溶液粘度；（ 4 ）    焦耳效应；（ 5 ）    电渗；（ 6 ）    吸附；（ 7 ）    分子筛分离；（ 8 ）    扩散；（ 9 ）    缓冲液的性质

电泳的分类1 ．按分离的原理：（ 1 ）区带电泳：不同的离子成分在均一的缓冲液系统

中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来。（ 2 ）移界电泳：最前面的成分是纯的，其他相互重叠，

只能起到部分分离的作用。（ 3 ）等速电泳：在电泳达成平衡后，各区带相随但没

有重叠，分成清晰的界面，以等速移动。（ 4 ）等电聚焦：由多种具有不同等电点的载体两性电

解质在电场中自动形成 PH 梯度，被分离物质各自移动到其等电点而聚成很窄的区带。

2 ．按有无固体支持物：自由电泳和支持物电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ） 这是一种利用人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作支持介

质的区带电泳方法，其分离是以物质的物理差别、分子大小和净电荷为基础的，普遍用于分离蛋白质和小分子的核酸。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（ acrylamide ，简称 Acr ）和 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 [N,N-methylenebis(acrylamide) ，简称 Bis 或甲叉双丙烯酰胺 ] 聚合交联而成的。凝胶的聚合过程通常使用能提供游离基（ free radicals ）的一些催化 - 氧化还原体系来完成，如过硫酸铵 -四甲基乙二胺（ TEMED0 ）或核黄素 -TEMED 等。聚合反应得到的孔径大小，取决于反应体系中单位体积的丙烯酰胺用量，以及交联剂 Bis 的用量。一般来说凝胶聚合时形成的孔径是无规则的，具有一定范围的大小分布。

由于凝胶具有粘度和高摩擦阻力，不仅阻止对流使扩散减少到最小程度，而且具有网络结构，直接参与移动颗粒的分离过程，而这种作用依赖于移动颗粒的分子大小。因此，在这种凝胶中，移动颗粒的分离依赖于净电荷的性质和分子大小 2 个因素。

在实际工作中常根据分子量的大小来选择所需要的凝胶。而在分析未知样品时，常采用7.5% 的标准凝胶或用 4%-10% 的凝胶作预试验。可根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果来判断决定下步工作的步骤。

不连续体系聚丙烯酰胺凝胶电泳

所谓不连续就是指凝胶孔径、缓冲溶液成分及 PH值均不一样。在不连续体系电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成，上层凝胶浓度较低，孔径较大，凝胶对样品的泳动无阻滞作用，样品在此层得到浓缩，称为浓缩胶；下层凝胶浓度较高，各个组分根据电荷与迁移率的差别得到分离，称为分离胶。

在不连续体系电泳中，含有三种离子。一种称为前导离子（ leading ion ） , 具有较大的迁移率。再有一种是和前导离子带有相同电荷的，但迁移率较小的离子，称为尾随离子（ trailing ion ）。第三种是和前两种离子带有相反电荷的离子，称为缓冲平衡离子（ buffer-counter ion ）。前导离子只存在于凝胶中，尾随离子只存在于电极缓冲液中，而缓冲平衡离子则在凝胶和电极缓冲液中均有。当电泳开始后，由于前导离子和尾随离子在浓缩胶中的迁移率不同，形成了高低两个电位梯度，样品在电位梯度之间被浓缩成一薄层而达到稳态，也就是说样品在浓缩胶中进行的是等速电泳。随着电泳的继续，样品薄层一旦进入分离胶，由于 pH 的不同，尾随离子的迁移率变为与前导离子大致相同，产生新的电位梯度。被浓缩的样品各个组分从两层不连续的界面开始，在一个固定的电位梯度下，进行电泳迁移，按照各自分子的大小和电荷的不同获得分离。

制备凝胶电泳：

制备凝胶电泳有两种方法：  电泳在常规方法下操作，带凝胶尚需分离组

分分开后，分段切开并萃取物质；  被分离物质在整个凝胶柱上移动使分离区带从凝胶管下端流出，同时用连续的冲洗缓冲液从外侧将各分离区带洗脱到分布收集器中。

制备电泳在生化方面的应用包括如下几个方面：

   从少量组分的混合物中分离一种或一种以上物质；

    从复杂的混合物中分离提取一种组分；    净化早已纯化过的物质，除去微量杂

质。

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠（ SDS ）是一种阴离子去污剂，能以一定比例与蛋白质结合并能够破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有构象，特别是在强还原剂（如巯基乙醇）存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与 SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物。

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 洗脱峰 2 ＃ Mark 冻干后粗酶液

Mark

97,400

66,200

43,000

31,000

20,100

14,400

凝胶电泳测定亚基分子量：第一条带分子量 66,000Da

第二条带分子量 31,000Da

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。

蛋白质的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于蛋白质分子量大下这一因素，即蛋白质迁移率是相对分子量的函数。

LgM = -b*Rm + K

由于蛋白质结合 SDS 的量与蛋白质的种类有关，并受溶液 pH值、离子强度和缓冲液组分的影响，这些因素使相对分子质量的测定产生偏差，所以一般都用已知分子质量的蛋白质作为标准蛋白与被测样品在同一条件下进行电泳，然后绘出 lgM-Rm图，在计算出样品的分子量。

等电聚焦 等电聚焦（ Isoelectric Focusing ）就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，即形成一个由阳极到阴极逐步增加的 PH值梯度。当把两性电解质放入此体系时，不同的大分子及移动并聚焦于相当其等电点 PH 的位置，从而就可以达到以下两个目的：

以等电点的不同将两性大分子彼此分离，从而可以高分辨率的用于分析和制备

    测定等电点，以鉴定蛋白质

等点聚焦的主要特点是在电泳槽中加入很多具有不同等电点的小分子载体两性电解质，构成一个从正极到负极 PH逐渐增加的自然 PH 梯度。一个好的自然 PH 梯度，必须有足够的缓冲能力，不致于由于蛋白质或其他两性分子的存在而改变 PH 梯度。同时，载体两性电解质必须易溶于水，才能使其达到足够的缓冲能力，它还必须有足够的电导性，以容许一定的电流通过，而且要求整个梯度要有较均匀的电导性。常用的载体两性电解质有：

        Ampholine(LKB)        Biolyte(Biorad)        Pharmalyte(Pharmacia)

等电聚焦的缺点是： 要求无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质

可能发生沉淀 样品中的组分必须停留在其等电点处，

不适合用于在等电点不溶或发生变形的蛋白质

IEF/SDS- 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

这一技术将等电聚焦和 SDS 凝胶电泳结合在一起，先后按照等电点和分子大小进行分离，分辨率极高。采用 IEF/SDS- 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳来分离蛋白质，第一向 IEF-PAGE 所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向 SDS—PAGE 所用的为板状。

IEF/SDS- 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳是当前分子生物学领域常用的实验技术，特别是对蛋白质的分离和分析极为精细和有效。

琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳法（ agarose gel electrophoresis ），

主要用于分离、鉴定和纯化 DNA片段。用溴化乙锭（ ethidium bromide ，简称 EB ）染色，在紫外灯下，凝胶中 1ng 的 DNA 即能直接观察到。 DNA 、 RNA结构分析的巨大进展，也主要依赖琼脂糖凝胶电泳的高度分辨能力。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的分子量及分子构型。

琼脂糖是琼脂经处理后制成的，加入缓冲液后加热、冷却即成琼脂糖凝胶。 DNA 分子通过琼脂糖凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。在实际操作中，以低琼脂糖浓度、低电压分离效果较好。同时不同构型的 DNA 的电泳速度也不同。实验装置分为垂直型和水平型。

琼脂免疫电泳

琼脂免疫电泳是利用琼脂作为支持介质的区带电泳，结合免疫扩散，以提高对免疫组分的分辨率的一种免疫化学方法。基本步骤是：

   用电泳方法将样品进行分离，使各组分完全或部分地分离成点状或现状图谱

  沿分离组分的一侧开一条槽，用以盛放相应的抗体

    将琼脂板放在适当条件下进行扩散