CAPILLARY ZONE

ELECTROPHORESISKelompok 1:

Mochamad Fathurohman (20714035)

Nadia Nanda Kalista (20714501)

Triyadi Hendra Wijaya (20714007)

Yeni (20714032)

Elektroforesis?????

Elektroforesis: teknik pemisahan komponen bermuatanberdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah

medan listrik (yang dialirkan pada suatu medium yang

mengandung sampel yang akan dipisahkan).

Elektrokinetik: pergerakan komponen bermuatan positif (+) ke kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) ke

kutub positif (+).

Hasil: elektroforegram yang memberikan informasi mengenai kecepatan migrasi.

Simple Electrophoresis

Electropherogram

Y-axis = detector response (Abs)

X-axis = waktu migrasi

Puncak electropherogram menyerupai kromatogram akan tetapi puncaknya lebih

sempit.

Data kualitatif: lokasi puncak dan resolusi puncak.

Data kuantitatif: tinggi puncak dan area di bawah puncak.

Jenis Elektroforesis

Planar Kapiler (CE)

Hal yang mempengaruhi

kecepatan migrasi......

Hidrofobisitas

Massa

Muatan

CE

Capillary Zone Electrophoresis (CZE)

Capillary Gel Electrophoresis (CGE)

Capillary Isoelectric Focusing (cIEF)

Capillary Isotachophoresis (cITP)

Micellar Electrophoresis

Chiral Electrophoresis

Nonaqueous Electrophoresis

Capillary Electrochromatography

Elektroforesis zona

kapiler (CZE) ????

Mekanisme separasinya berdasarkan pada perbedaan rasiomuatan-massa.

Dasar-dasar CZE adalah keseragaman larutan buffer danbesarnya medan listrik yang tetap pada sepanjang kolom

(pipa) kapiler. CZE menggunakan kapiler terbuka.

Komponen-komponen sampel terpisah menjadi zona-zonakhusus.

Mobilitas elektroforesis ditentukan dengan menggunakan persamaan dari teori Debeye-Huckel-Henry (q=muatan netto,

R=jari-jari Stokes, =viskositas).

Komponen-komponen sampel terpisah

menjadi zona-zona khusus.

Aplikasi CZE

Sodium ions

Drugs Protein

Instrumentasi

Alat-alat yang digunakan

Kolom kapiler (Capillaries are normally made of silica with a length of 20100 cm, an outer

diameter of 300400 m, and an inner diameter

of 20200 m).

Dua buah elektroda (Anode + dan katode -)

Power supply (bisa diatur untuk bertegangantinggi)

Detector (sinar UV)

Larutan buffer beserta dua buah tempatpenyimpanannya.

Kolom kapiler Biasanya digunakan fused silika. Permukaan bermuatan negatif (Si2O

- atau silanol)

Pada CE diameter kolom kecil, luas area kecil, sehinggaresistensi listrik tinggi. Pada kondisi ini pelebaran kurvakarena termal minimum.

Na NaNa

Na Na Na Na

OSi

OH

OSi

OSi

OH O

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

OSi

OH

OSi

O

OSi

OH

O

ClCl

Na

Na

ClNa

ElektrodaPlatinum foil

PotensialDC supply 20-30 kV (high voltage)

Detektor: Pada dasarnya detektor yang semua detektor yang digunakan padaHPLC dapat juga diaplikasikan pada CE.Detektor tersebut meliputi: UV, diodaarray, fluorescence, refraktif indeks, elektrokimia dan lainnya.

Sistem injeksi sampel

Digunakanbantuantekanan saatmenginjeksikansampel padakolom kapiler.

Injeksihidrodinamik

Digunakanbantuan aruslistrik saatsampeldiinjeksikanpada kolomkapiler.

Injeksielektrokinetik

Volume sampel yang diinjeksikan pada sistem injeksi

hidrodinamik dihitung dengan persamaan

P adalah perbedaan tekanan (Pa)

d adalah diameter kapiler bagian dalam (m)

t adalah waktu menggunakan (det)

adalah viskositas buffer (kg m1s1),

L panjang tabung kapiler. The fact (m)

103 merupakan faktor konfersi m3 ke liter.

Mol solut yang diinjeksikan pada sistem injeksi elektrokinetik

dihitung dengan persamaan

C adalah konsentrasi solut

t adalah waktu medan listrik diaplikasikan

r adalah jari-jari kapiler

ep adalah mobilitas elektroforetik solut eof adalah mobilitas

elektroosmotik

E adalah medan listrk yang digunakan

Kbuf adalah konduktivitas buffer

.

Migration time & MIGRATION RATE

Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktuyang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolom

kapiler menuju jendela detektor.

Kecepatan merupakan hasil kalkulasi dari membagiperpindahan waktu dengan jarak pipa kapiler dari

detektor. ep= mobilitas elektroforesis

vep= kecepatan elektroforesis

E= medan listrik

Ld= panjang kapiler menuju detektor

Lt= panjang kapiler total

V= tegangan listrik

tm= waktu migrasi

Jika kapiler pada elektroforesis

diberi tegangan

Electroosmotic flow (EOF)

Terjadi perpindahan muatan ke arah kutub negatif (-)/

katode

Elektroforetik Flow (EMF)

Pergerakan elektrolit yang

tidak dipengaruhi oleh EOF

(Berdasarkan gaya gerak

listrik)

Terjadi pemisahan anatara muatan positif dengan muatannegatif akibat adanya lapis rangkap listrik.

Lapis rangkap listrik terjadi akibat pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler.

eof : mobilitas Elektroosmotik (EOF) yang bertambahsecara vektorial

ep: mobilitas analat atau mobilitas elektroforetik (EMF)

eap: mobilitas aktual = ep + eof

Spesi bermuatan (+) mencapai katoda paling cepat karenaEOF & EMF arahnya sama

Spesi netral bergerak ke katoda dengan kecepatanditentukan oleh aliran elektroosmotik

Spesi bermuatan (-) bergerak paling lambat karena EOF & EMF berbeda arah

CONTOH APLIKASI CZE DALAM

JURNAL

Abstrak

Elektrolit : Hydroxyisobutyric acid (HIBA) , NaOH

Standar Internal : imidazole.

Pemisahan dilakukan dalam fused uncoated silica capillary

Metoda :Sample dan standar diinjeksikan secara hidrodinamik(50mbar,3s) dari ujung outlet kapiler

Sistem elektroforesis dioperasikan dalam polaritas normal dan kondisi tegangan konstan 30kV

validasi dari sample tuna yang berbeda

Hasil kadar penentuan histamin dalam sampel melalui CZE dibandingkan dengan metoda LCMS/MS

Pendahuluan

Histamin

senyawa amino biogenik yang terdapat dalam berbagai tingkatan makanan, seperti keju, sayuran, ikan, dan lain-lain.

Terbentuk dalam makanan melalui dekarboksilasi dari asam amino histidinyang dikatalisis oleh L-histidin dekarboksilase

Keracunan

FDA, tingkat histamin di atas 200mg/kg penyakit tipe scombroid.

Gejala penyakit : kesemutan atau terbakar dalam atau di sekitar mulut atautenggorokan, ruam atau gatal-gatal pada tubuh bagian atas, tekanan darah, sakitkepala, pusing, gatal pada kulit, mual, muntah, diare, penyempitan saluranpernapasan seperti asma, palpitasi jantung, dan gangguan pernapasan

KonsentrasiHistamin

Amerika Serikat, FDA : batas maksimum 50mg/kg (histamin untuk ikan segardan kaleng

Brazil :batas maksimal 100mg/kg histamin pada otot ikan beku & segar, danikan kaleng

konsentrasi histamin : kondisi kebersihan, metoda pengolahan suhupenyimpanan dan waktu penyimpanan,

Beberapa metoda penentuan

Histamin

HPLC dengan fluoresensi atau UV dan penggunaan derivatisasi ,

kromatografi gas dengan detektor api pengion,

Deteksi UPLC dengan UV,

kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi fluoresensimenggunakan prosedur pra-kolom derivatisasi

HPLC dengan fluoresensi atau UV ,

kromatografi pertukaran ion dengan deteksi konduktivitas,

elektroforesis kapiler dan HPLC dengan fluoresensi atau UV

kromatografi cair- spektrometri massa menggunakan prosedurekstraksi fase padat

Tujuan Penelitian

Mengembangkan Metode cepat danselektif untuk penentuan histamin

menggunakan elektroforesis zona kapiler

(CZE) dengan deteksi UV. Metode

diterapkan dalam analisis sampel ikan tuna

dan hasilnya dibandingkan dengan metode

LC-MS / MS.

Sampel

Enam sampel tuna yang dibeli dari pasar lokal:

-15oC

Kondisi sampel :

Sampel ikan kalengan, ikan segar dianalisis segera setelah ikan dibuka .

Sampel sushi dibeli dan dianalisis segera.

Sampel ikan (fish tuna beku) dianalisis setelah penyimpanan selama tiga bulan

dalam freezer pada 15oC. (semua sampel

dihaluskan)

background elektrolit (BGE) : 60mmol/L hydroxyisobutyricacid and 10mmol/L

NaOH pada pH3.3.

Standar internal (IS) : Larutan stok standar histamin (600mg/L) dlm EtOH, Imidazole

(30mg/L) disiapkan dalam air deionisasi.

METODE PENELITIAN

10g sampel dlm labu (volume 150 mL) + 25

mL EtOH

emulsi

Sentrifugasi pada 10,000rpm 3 menit

diencerkan 1: 1 dengan larutan IS

injeksi

Sample dan standar yang disuntikkan secara

hidrodinamis (50mbar, 3s)

kapiler dibilas selama 30 detik dengan BGE. (HIBA

60mmol/L & NaOH10mmol/L pada pH 3,3 dlm

air deionisasi diencerkan dengan

larutan asamtrifluoroacetat

(Konsentrasi akhir 10mmol/L) dan air

deionisasi.

botol berisi 0.25mL campuran chloroform +

1.0mL sampel. Kemudian disentrifugasi

run

fase gerak : 95% pelarut A (H2O 0,1% formicacid) dan 5% pelarut B (95: 5 asetonitril /

H2O). Aliran air =200 mL/min. Volume injeksi adalah 5.0 mL,

30oC

Pretreat

ment !

Pretreat

ment !

Pretreat

ment 2

HASIL & DISKUSI

Hasil Pemilihan komponen BGE dan standar

Cincin amida- mampu menyerap radiasiUV, yang memungkinkan deteksi

langsung dari analit dalam instrumen CE

dengan detektor UV.

Histamine yang terdisosiasi asam basamemiliki nilai Pka 6,0 dan 9,8 muatan positif tergantung pHmedium.

Komponen yang dipilih untuk komposisiBGE adalah natrium sebagai co-ion dan

HIBA sebagai counter-ion Keduanyatidak memiliki kelompok kromofor

dalam struktur kimianya tidakmemberikan kontribusi terhadap

penyerapan background di UV

HIBA terpilih BGE max 60 mmol L^-1 Peakmaster Software

Kapasitas buffer 21,5 mmol^-1 jumlahnya cukup untuk metode yang

digunakan

pH sekitar 3,3 histamine memilikimuatan positif max

Hasil Karakteristik metode optimasi dalam sampel ikan tuna

Matriks sampel puncak kreatinin (0,65 menit) dan histidin (0,75 menit) Kelompok senyawa nitrogen dari ikan tuna (Kationik pd pH BGE) terdeteksi

absorptivitas pada panjang gelombang deteksi histamin

CZE cepat dan selektif untuk pemisahan dan penentuan analit. Karena tingginya mobilitas histamine dan sebagai metode deteksi langsung dimana

kelompok kromoforik tidak bisa ikut tercampur dalam deteksi analit.

Hasil Validasi Metode

metode validasi FDA system suit-ability, repeatability, linearity, limit of

detection, limit of quanti- fication, and

selectivity.

Resolusi antara histidine dan imidazoledapat dipisahkan dengan baik

Instrumental precision and intra-dayprecision pada larutan standar dari histamine

dan sample menunjukan nilai RSD 72,000 linieritas baik

Limits of detection (LOD) = 3 (S/N), Limitsof quantification (LOQ) = 10 (S/N) dengan signal untuk mengetahui noise

ratios.

Slope dari kurva standar adisi(0.036270.0016; R2 0.996) dan kurva

kalibrasi eksternal (0.033270.0015; R2

0.999) T-test menunjukan secara statisticslope yang dihasilkan sama (99%)

Hasil penentuan histamin

dalam sampel

Perbedaan besar antara beberapa nilai-nilai

konsentrasi histamin yang

diberikan pada sampel

menunjukkan bahwa selain

jenis pengolahan ikan,

kondisi waktu dan

penyimpanan juga

mempengaruhi.

Kesimpulan

Strategi pemilihan kondisi yang sesuai untukpengembangan metode pemisahan yang cepat dan bebasgangguan mungkin dapat digunakan dalampengembangan metode baru untuk determinasi molekullain dalam matriks yang kompleks, seperti ikan.

Peakmasters software menentukan komponen BGEtanpa eksperimen.

Sebuah metode sederhana dan cepat dikembangkan dandapat digunakan dalam penentuan histamin dari sampelikan tuna dan juga jenis-jenis ikan lainnya.

TERIMA KASIH

Referensi

Camilleri, Petrick. 1997. Capillary Electrophoresis Theory andPractice, 2and edition. London: CRC Press.

Cay, Jianyi dan Jack Henion. 1995. Capillary Electrophoresis MassSpectro, Journal of Chromatograpy A, 173 (1995) 667-692.

Klug, W. S. and M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4thed. Prentice Hall, Englewood cliffs.

Kuhn, R., dan Kuhn Hoffstetter S. 1993. Capillary ElectrophoresisTheory and Practice. Jerman: Spinger-Verlag.

Li, S.F.Y. 1996. Capillary Electrophoresis Principles, Practice, andApplications. Netherlands: Elsevier.

Smith, Martin. 2004. Understanding Mass Spectro. Kanada: John Wileyand Sons, Inc.

Vitali, Luciano at all. 2013. Development of a fast and selectiveseparation method to determine histamine in tuna fish samples usingcapillary zone electrophoresis. Brazil: Department of Science andFood Technology and Department of Chemistry. Federal Universityof Santa Catarina. Florianopolis, SC.