肿瘤相关基因突变的临床肿瘤相关基因突变的临床

意义及其检测方法意义及其检测方法

中山大学肿瘤防治中心中山大学肿瘤防治中心

分子诊断科分子诊断科 王芳王芳

一、核酸DNA提取

三、肿瘤相关基因突变简介三、肿瘤相关基因突变简介

二、基因突变常规检测手段基因突变常规检测手段

四、核酸扩增技术其他用途

五、新基因介绍五、新基因介绍

基因组DNA提取方法

硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸

磁珠法：独特包埋的磁珠

传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低

第一部分

RNA提取方法

硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸

TRIZON：一步法

样本种类

血液学样本：抗凝血液、血浆、血清、全血、骨髓

组织学样本：新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织

脱落细胞：胸腹水、痰液、宫颈诊刮LCT、TCT

石蜡组织基因组DNA提取流程

加入吸附柱 缓冲液漂洗 DNA洗脱收集样本裂解

硅胶膜吸附法（吸附柱法）

核酸保存• 浓度：100－300ng/ul

• 纯度：避免杂质导致DNA在储存过程中的降解

• 温度：分装-20℃保存

• 溶解DNA Buffer：TB Buffer 或者Tris缓冲液

纯度（ OD260-320 /OD280-320 ）

紫外分光光度计测量

• 选择稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间：

• OD260 /OD280 < 1.7 有蛋白的污染

OD260 /OD280＝1.7～1.9 纯度很好

OD260 /OD280 > 1.9 部分降解或有RNA污染

DNA检测方法－紫外分光光度法

DNA检测方法－内参检测法

石蜡包埋组织GAPDH扩增产物电泳图

基因突变检测方法

显微切割 + 直接测序

直接测序法

荧光定量PCR法

Mutation-riched PCRPCR-SSCP

……

第二部分

激光捕获显微切割（laster capture microdissection, LCM）

切割之前的目的癌巢

切割之后，可见目的癌

巢已取走

工作原理：

利用紫外激光对生物样本进行

切割和分离，通过弹射装置将目

的细胞收集于EP管内。

功 能：

通过从诊断明确的组织中切取

获得的细胞或细胞成份，提取核

酸，可用于PCR、DHPLC等

直接测序法

原理：双脱氧终止法

仪器：PCR仪、电泳仪、测序仪

CEQ8000:工作原理：标记终止物法

直接测序法的特点

直接测出碱基序列，明确突变类型

检测条件要求高：仪器、组织质量、操作、结果分析

耗时长：2~3天

敏感性有限制：10~30% 突变体

病理学评估

琼脂糖凝胶电泳纯化

高质量的 PCR 反应原液

提取肿瘤组织DNA

测序法流程

DNA测序仪上机

PCR反应扩增

测序结果影响因素分析

石蜡包埋组织提取DNA的片段化

直接测序法：肿瘤组织中混杂不同程度非肿瘤细胞，

影响测序敏感性

显微切割+测序：不适于普通实验室开展

传统PCR易于产生污染

产物纯化及DNA测序不可控

500

200

100

2000

测序法检测突变的基因

EGFR:18、19、20、21号外显子

c-kit：9、11、13、17号外显子

PDGFRA:12、18号外显子

荧光定量PCR原理：Taqman探针

仪器：荧光定量PCR仪

基于定量PCR检测工作流程

每个DNA样本均加到几

个独立的试管中并放入实时PCR仪器

12 12 alaala

concon 12 12 argarg

12 12 aspasp

12 12 cyscys

12 12 serser

13 13 aspasp

12 12 valval

PCR反应耗时约90分钟

对突变与对照的反应进行比较以完成分析

提取肿瘤组织DNA

荧光定量PCR特点

针对固定的已知突变

操作简便、耗时短（2h）

结果分析直观

敏感性：

10%以上突变体

条件优化困难

标本类型 例数 成功检出 阳性检出

手术标本 924

520

1444

917 （99.2%）257（28.0%）

活检或穿

刺标本

493 （94.8%）144（29.2%）

汇总 1410（97.6%）401（28.4%）

荧光定量PCR法检测突变的基因

EGFR：19、21号外显子

KRAS：12、13号密码子

BRAF：15号外显子

肿瘤相关基因

与肿瘤的发生发展密切相关的基因

ras、 braf、PIK3CA、p53 、EGFR、HER-2、kit 、PDGFRA、cMET、PTEN …

从分子水平认识肿瘤

指导肿瘤的诊断、治疗及预后预测

第三部分

肿瘤相关基因致瘤过程改变

致瘤过程：癌基因激活、抑癌基因失活、

相关基因扩增、过表达

基因突变：点突变、缺失、插入

基因过表达

基因扩增

EGFR (epidermal growth factor

receptor)，又称HER – 1

位于人 类Chr7的短臂

含EGFR激活性突变的NSCLC对

TKI敏感

突变多发生于EGFR激酶区

EGFREGFR

血管生成

转移细胞凋亡

侵袭

增生

EGFR-TKIEGFREGFR--TKITKI

配体

EGFR

EGFR-TK

Chiu et al, 2003

中国ASCO会议第一人

1。 治疗组无进展生存期明显

延长（4.8个月：2.6个月）

疾病进展风险下降了58%

2。EGFR突变的亚组：

中位无进展生存期延长（16.6月： 2.7月）

疾病进展风险下降了84%

INFORM研究成果

非小细胞肺癌中EGFR酪氨酸激酶区突变

Nature Review 2007, 7:169

外显子 突变类型 突变位点 对TKI敏感性

18exon 置换 G719A (2156G>A碱基置换突变) 敏感

△E746-A750del2235-2249位点，15bp缺失突变

敏感

△E747-A753del2240-2257位点，18bp缺失突变

敏感

20exon 置换 T790M (2369位点C>T碱基置换突变) 耐药

L858R (2573位点T>G碱基置换突变) 敏感

21exon 置换L861Q (2582位点T>G碱基互换突变) 敏感

19exon 缺失

EGFR主要突变

EGFREGFR基因突变检测方法基因突变检测方法

直接测序

定量PCR

ADx-ARMS

EGFR-exon18测序峰图

野生型

18号外显子G719C突变

测序图测序图

EGFREGFR--exon19 exon19 测序峰图测序峰图

△E746-A751del2240-2254位点，15bp缺失

开始出现套峰

开始出现套峰 19号外显子△L747-S752 InS

EGFREGFR--exon20 exon20 测序峰图测序峰图

20号外显子T790M

20号外显子V769-D770insASV

EGFREGFR--exon21exon21测序峰图测序峰图

L861Q

L858R

2573 T>G

Q-PCR法检测EGFR基因exon19 15bp缺失结果扩增曲线图

Exon19 △E746-A750del15bp缺失

扩增曲线

Q-PCR法检测EGFR基因Exon19 18bp缺失突变结果扩增曲线图

Exon19 △E747-A753del18bp缺失

Q-PCR法检测EGFR基因Exon21 2573位点突变扩增曲线图

Exon21 L858R

2573位T>G

34

基因测序结果

Real-timePCR结果 突变型 野生型

合计

突变型 284 18 302

野生型 11 693 704

合计 295 711 1006

实时荧光定量PCR法与基因测序法符合率：977 /1006=97.1%

Real-time PCR法与基因测序法结果的比较

肺癌EGFR基因突变率 – 东方人群

国家 基因突变发生率 参考文献

26%

(15/58)Science 2004,304:1497-500

40%

(111/277)Cancer Res 2004,64:8919-23

韩国40%

(4/10)Int J Cancer 2005, 113: 510-1

中国

(吴一龙)

19%

(26/135)ASCO meeting 2005, Abstract 7089

中国

(周彩存)

26%

(21/80)ASCO meeting 2005, Abstract 7101

中国台湾39%

(39/101)Clin Cancer Res 2004, 10:8195-203

日本

标本类型 例数 成功检出 阳性检出

手术标本 924

520

1444

917 （99.2%） 257（28.0%）

活检或穿

刺标本

493 （94.8%） 144（29.2%）

汇总 1410（97.6%） 401（28.4%）

我中心完成的1444例NSCLC组织EGFR基因突变基本资料

我中心完成的1410例NSCLC组织EGFR基因突变与临床病理特征的关系

factors EGFR statuswild（n=1009） mutation （n=401）

P value

Average year 57.79±11.36 58.04±11.52GenderMaleFemale

713（80.2%）

296（56.8%）

176（19.8%）

225（43.2%）

0.000

Histological subtypeAdenosquamousAdenosquamousothers *

727（66.5%）

238（89.5%）

17（77.3%）

27（96.4%）

367（33.5%）

28（10.5%）

5（22.7%）

1（3.6%）

0.000

Smoking statusNeversmoker

532（62.4%）

477（85.6%）

321（37.6%）

80（14.4%）

0.000

EGFR突变状况与性别、组织学亚型及吸烟状况显著相关

Smoking status EGFR statuswild（n=1009） mutation （n=401）

P value

never 532（62.4%） 321（37.6%）

Pack × year<20 125（77.6%） 36（22.4%）

20~50 239（86.3%） 38（13.7%）

>50 113（95.0%） 6（5.0%）

0.000

吸烟状态与EGFR基因突变状况

37.6

22.413.7

50

10

20

30

40

0 <20 20~50 >50EGFR

mut

atio

n

（%

）

ARMS方法

原理：等位基因特异性PCR + Taqman探针

补充补充

ARMS反应 实时定量PCR

ARMS检测流程

数据分析

突变： 阳性 阴性

内参： 有扩增 有扩增

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

control std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

T790M std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

Deletion std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

L858R std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

L861Q std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

G719X std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

S768I std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

insertion std NTC 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

以10人次检测为例96孔板布局

KRAS

KK--rasras• 哺乳动物ras基因家族：H-ras，K-ras，N-ras

• K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb

• Ras蛋白（P21）——膜结合型GTP/GDP结合蛋

白，位于细胞膜内侧，在传递细胞生长分化信号

方面起重要作用。

K-ras突变作用

K-ras突变是结直肠发生的早期事件

K-ras突变可促进肿瘤的恶性进展

EGFR抑制剂活性的预测性标记物

Cetuximab和K-ras基因的关系

• 当K-ras基因突变时，无

论EGFR是否激活，K-

ras蛋白都处于活化状态

Cetuximab阻断EGFR

及其下游胞内的信号传导

通路

• K-ras突变可见于40-45

% 的CRC患者，发生在

CRC早期

客观应答n (%)

参考文献 治疗方案患者数

（野生型 : 突变）Wild-type Mutant

Lièvre A, et al. J Clin Oncol 2008 爱必妥® ± CT 114 (78:36) 34 (44) 0 (0)

Benvenuti S, et al. Cancer Res 2007

帕尼单抗或爱必妥®

或爱必妥® + CT48 (32:16) 10 (31) 1 (6)

DeRoock W, et al. Ann Oncol 2008 爱必妥® 或爱必妥®

+ 依立替康113 (67:46) 27 (41) 0 (0)

Capuzzo F, et al. Br J Cancer 2008 爱必妥® ± CT 81 (49:32) 13 (26) 2 (6)

Di Fiore F, et al. Br J Cancer 2007 爱必妥® + CT 59 (43:16) 12 (28) 0 (0)

Khambata-Ford S, et al. J ClinOncol 2007

爱必妥® 80 (50:30) 5 (10) 0 (0)

Amado RG, et al. J Clin Oncol 2008 帕尼单抗 208 (124:84) 21 (17) 0 (0)

Karapetis C, et al. WCGIC 2008 爱必妥® + BSC 或BSC

394 (230:164)

13 (13) 1 (1.2)

NCIC CTG CO.17 Karapetis C, et al. WCGIC 2008, June 28, 10:45 Session XVII

耐药性CRC中K-ras野生型与

EGFR抑制剂疗效相关的证据：有效性

PFS and OS in PFS and OS in mCRCmCRC patients treated with patients treated with cetuximabcetuximabaccording to KRAS mutation (n = 17) versus KRAS wildaccording to KRAS mutation (n = 17) versus KRAS wild--

type (n = 41).type (n = 41).

Fig 2. PFS and OS in mCRC patients treated with cetuximab according to KRAS mutation (n = 17) versus KRAS

wild-type (n = 41).

Time (months) Time (months)

Time (months) Time (months)

为什么检测KRAS：重要的mCRC生物标记物

KRAS基因状态— EGFR抑制剂活性的预测性标记物

65%的mCRC KRAS为野生型

KRAS野生型状态可预测mCRC对TKI治疗的有效性

– KRAS与生存受益相关

– KRAS与治疗有效性相关

KRAS基因检测可以做为结直肠癌个体化靶向治疗的突破

后续的研究将会有更多的生物标记物做为疗效预测指标

2008年7月，欧洲药品评审局（EMEA）批准

爱必妥®用于KRAS野生型mCRC患者的治疗

通用名：西妥昔单抗

英文商品名：Erbitux英文通用名：cetuximab针对EGFR的IgG1单克隆抗体

第一个获准上市的靶向单克隆抗体第一个获准上市的靶向单克隆抗体,,治疗转移性结直肠癌！治疗转移性结直肠癌！

爱必妥

突变概况：97%的突变位于12–13密码子

野生型与突变型的比较

突变 百分比

GGT -> GTT G12V 21,58%

GGT -> GAT G12D 35,07%

GGC -> GAC G13D 20,62%

GGT -> TGT G12C 9,63%

GGT -> GCT G12A 5,39%

GGT -> AGT G12S 5,59%

GGT -> CGT G12R 0,96%

GGC -> TGC G13C 0,39%

GGT -> GGA G12G 0,19%

GGC- > GCC G13A 0,19%

GGT -> GGG G12G 0,19%

GGC -> GTC G13V 0,19%

罕见的突变：<2%

7种最常见的突变：>98%

K-ras突变情况

转移灶与原发灶突变状况一致

病理号 原发部位 QPCR 转移灶（肝） QPCR

380897 w w w w

378813 w w w W

377316 w w w w

382366 m GAT m GAT

380543 w w w W

302981 m GAT m GAT

379533 w w w w

345495 w w w w

391549 w GAT w GAT

335419 w w w w

378109 w w m w

378192 m w m w

356560 w GAT w GAT

349182 w w w w

405507 w w w w

400363 w w w w

395828 w w w w

334947 m GAT m GAT

339345 w w m w

393270 m 12M m 12M

400073 m w m w

K-ras基因突变检测方法

显微切割+ 直接测序

直接测序

定量PCR

Riched-mutant PCR

K-ras基因测序结果分析

测序原始图谱

野生型

Condon12 突变型

荧光定量PCR法

引物：

探针（针对突变方式设计的8种特异序列探针）

野生型 GTTGGACCTGGTGGCGTAGG

34G>T GTTGGACCTTGTGGCGTAGG

34G>A GTTGGACCTAGTGGCGTAGG

34G>C GTTGGACCTCGTGGCGTAGG

35G>T GTTGGACCTGTTGGCGTAGG

35G>A GTTGGACCTGATGGCGTAGG

35G>C GTTGGACCTGCTGGCGTAGG

38G>A GTTGGACCTGGTGACGTAGG

37G>C GTTGGACCTGGTCGCGTAGG

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

35G>A NTC 对照1 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

35G>T NTC 对照2 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

38G>A NTC 对照3 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

35G>C NTC 对照4 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

34G>T NTC 对照5 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

34G>A NTC 对照6 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

37G>C NTC 对照7 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

34G>C NTC 对照8 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10

以10人次检测为例96孔板布局

K-ras 12GAT

K-ras 13GAC

350例大肠癌k-ras基因codon12突变概况

33%

67%

0%

20%

40%

60%

80%

mutant wild

22.5% 24.5%28.10%

33.30%

0%

10%

20%

30%

40%

A B C D

检测总突变率33%

各分期突变率分布图

引物：A：5’-ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3’B：5’-TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3’C：5’-GCATATTAAAACAAGATTTAC-3’

限制性内切酶： BstN1识别序列: 5’ …GGWCC … 33’’

3’ …CCWGG …5’

产生片段大小：野生型135bp，突变型106bp

敏感性：10％以上突变体

耗时：2天

▲▲

▼▼

富集突变法PCR - - -检测codon12

K-ras 突变检测流程（富集突变法PCR）

提取肿瘤组织DNA

第一轮PCR 反应

第二轮PCR 反应

BstN 1

BstN 1

富集的突变PCR产物

mutant 143bp 14bpA C

第2轮

135bpmutant

A B

第1轮

mutant

157bpBstN1 BstN1

29bp 114bp 14bp

143bp 14bp

wild

mutant135bp

BstN1

106bp29bpwild

PCR产物鉴定

琼脂糖凝胶电泳：2％琼脂糖凝胶

电压：100V

时间：50min

106bp

Marker 1 2 3 4 5 6

100bp150bp 135bp

标本1、2、3、4为野生型；标本5为突变型；

标本6为阴性对照

双重PCR反应影响因素分析

双重PCR反应+酶切易造成污染

检测费时，专人操作需要2天时间完成

对codon13突变检测较局限

部分结果判读较困难（无法预测酶切反应效率）

检测方法 优点 缺点

显微切割+测序 准确、可靠 成本高，需特殊仪器，

不适于临床开展

直接测序 相对准确 敏感性低，耗时长、过

程不易控制

富集突变PCR 敏感性高、可得富

集产物

耗时长、易污染

荧光定量PCR 敏感性较高、快速 条件优化较困难

常用检测方法比较

测序、荧光定量PCR 、富集PCR检测k-ras突变 (n=89)

site Direct sequencing

Enriched PCR

Q-PCR

exon12

exon13

12 31 20

4 4

total 16 (17.98%) 31(34.84%) 24(27.0%)

3种常见方法数据比较

K-ras基因突变的其他检测方法

------ASO Hybridization步骤

PCR反应或PCR-RFLP

斑点原位杂交

特点

敏感性高

可检测突变类型

缺点

步骤复杂

耗时

K-ras基因突变的其他检测方法

------PNA PCRPNA：peptide nucleic acid具有类多肽骨架的DNA类似物，通过watson-crick碱基配对

结合DNA

杂交稳定性及特异序列识别能力强

总 结

爱必妥用于治疗KRAS为野生型的肿瘤患者

时， 疗效更加明显;

应尽早推荐所有mCRC患者进行KRAS基因状

态判定，以便选择最适当的个体化治疗策略;

根据实验室的仪器配置等状况选择具体的检测

方式。

案例分析

Ct=40

Ct=34

Ct=30

重新上机

重新提取组织D

NA

Ct=42

Ct=43

Ct=34

重新上机

重新提取组织D

NA

开始出现套峰开始出现套峰

开始出现套峰

ng/μl 260/280465767-SLA-5-8 310.9 1.76465767-9A-5-15 185.1 1.92465767-SLA-5-22 131.8 1.91465767-9A-5-22 89.2 1.87

1. DNA质量检测

2. DNA模板抑制剂的存在

B、CA

B、C

A

A：DNA提取原液

B：稀释5倍

C：稀释10倍

3. 标本不同石蜡组织分别进行检测（病理学评估+ 检测结果）

组织学图片 刮取范围 病理学评估 Q-PCR扩增图 Ct值

中至低分化腺癌

37

肿瘤成分少，刮取部分为高分 华 腺 癌 伴BAC

31

中低分化腺癌，伴BAC

30

高至中分化腺癌，伴BAC

28

Exon21 R585Q

Exon19 del E746-A750

不同量突变体测序

工作流程和质量控制

CC--kitkit及及PDGFRAPDGFRA同属酪氨酸蛋白激酶家族，结构相似

C-kit：肥大细胞因子/干细胞因子

定位于4q11-12，由21个外显子组成编码蛋白CD117

常见突变位点

exon11：复杂

GIST中C-kit exon11突变规律

c-kit 基因可出现缺失、重复和点突变等多种方式，

可纯合性，亦可杂合性，常见方式为杂合性片段缺

失，同一病例可有不同的突变方式

突变位点不固定，但有集中性，点突变和缺失集中

在第550～570 位点，而重复集中在570～585 位点

缺失或重复的片段是3 的倍数，不影响c-kit 基因

的阅读框架

J Lasota & M Miettinen, Histopathology 2008, 53.

CC--kitkit及及PDGFRAPDGFRA同属酪氨酸蛋白激酶家族，结构相似

C-kit：肥大细胞因子/干细胞因子

定位于4q11-12，由21个外显子组成编码蛋白CD117

常见突变位点

exon11：复杂

exon 9 ：Ala502_Tyr503dupexon13：Lys642Gluexon17：Asn822Lys

Kit作用示意图

• PDGFRA：血小板衍生生长因子受体

定位于4q12-13，由22个外显子组成

• 与C-kit突变很少同时发生

• 30~40% C-kit阴性病例

• 多发生于胃及十二指肠

• 多发生exon18、exon12：碱基置换突变 常见

exon 18：D842V（A>T）exon 12：V561A（T>A）

SeminSemin DiagnDiagn PatholPathol. 2006 May;23(2). 2006 May;23(2)

PDGFRA

C-kit exon11

11号外显子W557R点突变

11号外显子缺失△W557-K558

测序图测序图

C-kit exon11

571 I后插入DPTQLPYE8个氨基酸

W557-K559del（insF）

13号外显子K642E

17号外显子D820G

C-kit exon13、17

PDGFRA exon12

A>G(A>G(无义突变无义突变))

格列卫(Glivec)

通用名：甲磺酸伊马替尼（Imatinib）商品名：格列卫

原理：选择性抑制BCR-ABl、CKIT、PDGFRA酪氨酸激酶活性

用途：治疗Ph+CML治疗不能切除或发生转移的恶性GIST

总有效率（CR+PR+SD）：75%

对胃肠道间质瘤基因检测的重要性

(1) 从基因水平上，协助明确诊断，特别是IHC结果不能

确立，或明确CD117阴性的病例

(2) 发生突变的位点不同，抑制剂治疗反应和预后不同

原发性耐药：野生型，PDGFRA exon18 D841V

继发性耐药：CKIT exon13、17

(3) 起始用药剂量选择：exon9突变要加大起始药量

BRAFBRAF

BRAFBRAF丝/苏氨酸特异性激酶

转导因子：RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK

位于7q34

突变类型：90% exon15 T1799A V600E

10% exon11 甘氨酸环

突变发生肿瘤：结直肠癌：5%~10%恶性黑色素瘤：66%甲状腺乳头状癌：30%

RASRAS--RAFRAF--MAPKMAPK通路通路

B-raf基因突变与结直肠癌

• B-raf突变型结直肠癌患者无法从EGFR单抗中获益

• KRAS、B-raf、PIK3CA基因突变与mCRC疗效不

佳及患者生存差相关

• 西妥昔单抗独立影响因素

Q-PCR 法检测B-raf基因exon15突变

Exon15 V600E1799位T>A

核酸扩增技术用途

血浆EBV-DNA定量分析在鼻咽癌临床工作中的应用

• 诊断

• 预测NPC复发和转移

• 生存预后预测

97%

20% 12%

0%20%40%60%80%

100%

首诊NPC 放疗后 正常人

血浆EBV-DNA拷贝数

复发转移 无复发转移

8

7

6

5

4

3

2

1

0

20

6650115

无复发转移组 复发转移组

2.3×105/ml

1.6×106/ml

无事件生存（月）

3020100

Cum Survival

1.1

1.0

.9

.8

.7

.6

.5

.4

.3

.2

.1

.0

EBV

EBV≥40000拷贝/ml

1.00-censored

EBV〈40000拷贝/ml

.00-censored

92.9%

46.1%

1

血浆EBV-DNA定量检测在鼻咽癌临床应用总结

血浆EBV-DNA测定对NPC的诊断敏感性高（>90%），

特异性强（>85%）

TNM分期与血浆EBV-DNA浓度呈显著正相关能较好

反映肿瘤TNM分期的进展

NPC治疗后持续缓解的病人，如果血浆EBV-DNA浓度

突然升高，预示肿瘤复发和转移可能性大。

NPC经治疗后血浆EBV-DNA快速转阴（约80%）

血浆EBV-DNA水平能协助评价治疗效果：治疗前血浆

EBV-DNA水平高的病人较水平低的病人预后生存差。

病原体检测

定量检测肝炎病毒DNA的应用

-- 判断肝病的病情、预后和传染性

--预测抗病毒治疗的效果

--临床药物基因组学应用

结核杆菌的检测

--肿瘤的鉴别诊断：组织、胸腹水、痰液

2

EML4-ALKEchinoderm microtubule-associated protein like-4

anaplastic lymphoma kinase

分子结构

新1

在chr2方向相反，融合时须反向相接。

相接的位置是识别不同融合类型的依据

variant 1

variant 2

EML4-ALK的不同突变体

EML4-ALKEchinoderm microtubule-associated protein like-4

Activation mechanisms for anaplastic lymphoma kinase

分子结构

信号转导ERK通路

STAT3通路

PI3K-AKT通路

新1

EML4-ALKEchinoderm microtubule-associated protein like-4

Activation mechanisms for anaplastic lymphoma kinase

分子结构

信号转导

临床病理腺癌

不吸烟

EGFR/KRAS野生型

新1

EML4-ALKEchinoderm microtubule-associated protein like-4

Activation mechanisms for anaplastic lymphoma kinase

分子结构

信号转导

临床病理特征

阳性率：2.5%~11.6%临床意义

新1

① 独立的肺癌亚型-融合基因阳性肺癌

② 手术患者：临床病程较长、预后较好

③ TKI：EGFR+ > EML4-ALK+ > WT/WT

④ ALK抑制剂的临床试验

EML4-ALKEchinoderm microtubule-associated protein like-4

Activation mechanisms for anaplastic lymphoma kinase

分子结构

信号转导

临床病理特征

阳性率：2.5%~11.6%临床意义

检测手段

新1

RT-PCR FISH IHC

EML4-ALK融合基因检出率

IHC , 2.00%

FISH, 2.70%

RT-PCR, 4.40%

race-coupled PCRsequencing, 11.60%

0.00% 2.00% 4.00% 6.00% 8.00% 10.00% 12.00% 14.00%

IHC

FISH

RT-PCR

race-coupled PCRsequencing

EML4-ALK融合基因检出率

各检测方法对非选择性NSCLC的EML4-ALK融合基因发生率的影响

IHC FISH

Massarray分子量阵列基因分析系统

oncoCarta致癌基因突变谱检测试剂盒

涵盖的基因和突变位点

新2

我们的梦想、我们的目标

谢谢