ניתוח מאפייני מבנה שניוני של מולקולות ה- h/aca-like snorna...

ניתוח מאפייני מבנה שניוני ניתוח מאפייני מבנה שניוני של מולקולות של מולקולות

H/ACA-like snoRNAH/ACA-like snoRNA - -ההבטריפנוזומטידיםבטריפנוזומטידים

::מאתמאת

אינה מיסליוקאינה מיסליוק

אביחי אפטובאביחי אפטוב

בהנחיית:בהנחיית:

פרופסור פרופסור שולמית שולמית מיכאלימיכאלי

הטריפנוזומטידיםהטריפנוזומטידיםהטריפנוזומטידים הינם אאוקריוטים חד תאיים ירודים שהתפלגו מוקדם מהענף

האאוקריוטי.הם מהווים פרזיטים של בעלי חוליות, חסרי חוליות וצמחים.

חלקם פתוגניים וגורמי מחלות באדם.

הטריפנוזומטידיםהטריפנוזומטידיםטריפנוזומה ברוסיי

(Tripanosoma brucei ,)אחד הנחקרים במעבדה, גורם

למחלת השינה באדם ולמחלות נוספות בבקר.

הטפיל מחלק את מחזור חייו אצל חרק )זבוב הצצה( ואצל

יונק.על מנת לשרוד את שינויי

התנאים במעבר מן החרק ליונק התפתחו בטפיל

מנגנונים יחודיים. -Pre-mRNA transתהליך ה-splicing וחלוקה ייחודית של

תת-היחידות בבניית הריבוזום הן דוגמאות לייחודם של

,.Handman et alהטפילים )1995 .)

רקע מולקולרירקע מולקולרי, רק rRNA ו-tRNA בתא מתברר כי רובו הוא RNAכאשר בוחנים את הרכב ה-

. mRNAאחוזים ספורים מהווים את חלקו של ה- קטנות "חדשות". מולקולות RNAבשנים האחרונות מתגלות ונחקרות מולקולות

אלה אינן מקדדות לחלבון, פועלות בשיתוף עם חלבונים בצורת קומפלקסים .RNPsמעורבים -

.H/ACA-like box snoRNAהמולקולות אותן אנו חקרנו בפרויקט הינן

, כלומר מולקולות אשר מהוות חלק Guide snoRNAמולקולות אלה הן מסוג ומכוונות את הקומפלקס למקום הפעילות המדויק שלו.RNPמקומפלקס

ופועל בגרעינון.rRNAהקומפלקס מבצע מודיפיקציות על

From:Liang X-h et al., Trypanosome C/D and H/ACA-like RNAs

תמונה זו מייצגת את אחת של rRNAמיחידות ה-T.brucei.

בצבע, מקומות שעוברים מודיפיקציה.

בירוק, אתרי מודיפיקציה יחודיים לטריפנוזומה.

המספר הגדול של מודיפיקציות דומה לזה שקייםrRNAעל ה-

בצמחים ומשויך לשינויים הקיצוניים בטמפרטורה איתן

האורגניזם מתמודד.

Ψ

פעילות המולקולהפעילות המולקולהיורידין עובר מודיפיקציה לפסאודויורידין ובכך מתאפשרת יצירת קשר מימן נוסף

שתורם לחוזק הריבוזום.

H/ACA-like box H/ACA-like boxמבנה ותפקוד המולקולה מבנה ותפקוד המולקולה snoRNAsnoRNA

Down Stem – loop + pseudouridylation pocket – stem – loop Up

נוקליאוטידים.70 אורך המולקולה כ-•

- הרצף הראשוני היחיד שהוכח כי חשוב לקישור בין החלבונים AGA קופסת ה-• למולקולה והיחיד שנמצא משותף לכלל המולקולות.

חיפוש גנומי של המולקולותחיפוש גנומי של המולקולות H/ACA-like מולקולות 100קיימת הערכה כי צריכים להימצא בטריפנוזומטידים כ-

שונות. C/D מולקולות לזנים מרכזיים. מרביתן נמצאו בסמיכות לגן אחר מסוג 30בידינו כיום כ-

Guide snoRNA.אשר קל יחסית לחפשו בגנום ,

בטריפנוזומטידים –H/ACA-likeלא קיימת כיום תוכנה שמסוגלת לאתר את מולקולות הבשל החלוקה לשניים של רצף ההכרה, היותו קצר מלכתחילה ואי קיומו של רצף קונצנזוס

די ארוך.ניסיונות חיפוש של מולקולות אלה על גנום שלם נעשים במעבדה של פרופסור אונגר, עד

כה ללא הצלחה מזהירה. . H/ACA-likeבפרויקט שלנו התמקדנו בניסיון למצוא חוקיות במבנם השניוני של רצפי ה- Falseתוספת חוקי חיפוש בסיסיים יכולה למקד את התוכנה ולסנן החוצה תוצאות

Positive.

שלבי הפרויקטשלבי הפרויקט

איסוף מולקולות והכנת מאגר של מספר זנים:•T.BruceiT.CruziT.VivaxT.CongolenseL.MajorL.Infantum

חיפוש חוקים חדשים.•

שלבי איסוף והכנת שלבי איסוף והכנת המולקולות למחקרהמולקולות למחקר

Homology DB Vienna files

mfold

Blast

Canvas

ClustalW + needle

+

Primary DB

Graphic 2° structure

files

שימוש בתוצאות ללימודשימוש בתוצאות ללימוד

Graphic 2° structure

files

ClustalW + needle

לימוד יחסי הומולוגיה בין מולקולות.• ניחוש רצפי הכרה של המולקולות.•

, הופעת stems ביצוע סטטיסטיקות על המבנה השניוני )גודל • ועוד(.K-turn נוקליאוטידים שונים במיקומי מפתח, חיפוש

+שילוב התוצאות

זיהוי האזורים השמורים במבנה השניוני לפי השוואה בין• הומולוגים על גבי תמונות המבנה השניוני.

BlastBlast

http://www.genedb.org/ http://www.sanger.ac.uk/Projects/

כמה שיותר מולקולות בזנים מספיק רחוקים. מה מחפשים?•

מתי מחפשים? תלוי בהתקדמות פרויקט הריצוף של הזן.•

T.Congolense - initially to a 1x coverage.T.Vivax - The current coverage is 5x.

L.Major - sequencing complete, 2 small gaps remaining.L.Infantum - ~5x coverage in progress.

T.Brucei progress:

BlastBlast

התהליך (.T.brucei, T.cruzi, L.major חיפוש בעזרת רצף ידוע ) •.E value סינון התוצאות לפי התאמה מירבית ו- •TCT בסוף אלא AGA במידה והרצף המתקבל הינו על הגדיל המשלים )אין •בהתחלה( הפכנו את הרצף בעזרת כלי שכתבנו. קביעת שם לרצף ושמירה במאגר הנתונים. •

התוצאות

T.congolense 25 חדשים, T.vivax 22 חדשים, L.major 0תוצאות החיפוש: • חדשים.L.infantum 32חדשים ו- 32 ו-T.cruzi מולקולות T.brucei, 32 מולקולות של 34 יחד עם עוד •

עליו עבדנו. Primary DB, מהוות תוצאות החיפוש את ה-L.major מולקולות

ClustalWClustalW

NeedleNeedle (Needleman-Wunsch global alignment) (Needleman-Wunsch global alignment)

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/

Or directly:http://www.agri.huji.ac.il/emboss-bin/emboss.pl?_action=

input&_app=needle

Under:http://www.agri.huji.ac.il/EMBOSS/

ClustalWClustalW

.Blast השימוש הראשון שעשינו בתוכנה היה לצורך ניקוי תוצאות ה-•

חסר חשיבות בפני עצמו ולכןH/ACA-likeמולקולות ה-הרצף הראשוני של • השונות, בין מולקולות שאינן הומולוגיות, רבה.

הרצנו קבוצת מולקולות מאותו זן בתוכנה והשתמשנו בטבלת הציונים•

שהתוכנה מספקת. בטבלה זו מוצגות כל ההשוואות בין כל זוגות הרצפים האפשריים מתוך הקלט. קבוצה "נקייה" של מולקולות נותנת ציוני דמיון בין

אחוז בין הזוגות השונים.50 ל-10

90% ניתן היה למצוא גם זוגות רצפים בעלי Blast ברצפים שקיבלנו מה- • מוטציות וסוננו 2-3 דמיון בינם לבין עצמם. זוגות כאלה נבדלים ב-

.Blast מתוצאות ה-

ClustalWClustalW

.L.major ו- T.vivax בשלב הבא יצרנו טבלאות הומולוגיות לרצפי •

כנגד כל רצפי L.major על מנת ליצור טבלה הרצנו, למשל, את כל רצפי • T.brucei.וקבענו מי הומולוג למי במידת האפשר .

וכך הלאה.T.cruzi כנגד L.major בשלב הבא הרצנו את כל רצפי

זנים ובוצעה 4כל טבלת הומולוגים שהתקבלה בסופו של דבר הכילה • בדוגמא(.L.major סביב זן אחד מרכזי )

בהכוונתה של פרופ' T.vivax וב- L.major* החל מנקודה זו התמקדנו ב- . שולמית

ClustalWClustalW

.ClustalW כל רביעיית הומולוגים שזיהינו בשלב הקודם הרצנו שוב ב- • דוגמא לפלט התוכנה:

Homology DBHomology DB

4265315.c000538791.Contig1_324 GCCATCCCCTTTAATAGCGAGCAG-CCCTACGTGCATCACCGCGAGCGGCTC10C1H1 --CATCCCCTTTAATAGCGAGCGGACCCTCAGTGCGTCACCGCGAGCCGCTB10C1H1 -TCATCCCCTTTAATAGCGAGTGGTCTTTGTGTGCATCTCCGCAAACCACTviv_chr10_1509417_1509487 ---ATCCCCTTAGACAGCGAGCAGCACGCCTGTGCGTTCCCGCAAGCCGC ******** * ****** * **** * **** * * *

4265315.c000538791.Contig1_324 TCGTCTACACCGGGGGAGAGAT-—TC10C1H1 TCGTCTACACCGGGGGAGA-----TB10C1H1 TCGTCTACACCGGGGGAAAGATAATviv_chr10_1509417_1509487 TCGTCTACACCGGGGGAGAGAGAA ***************** *

כבר בשלב זה ניתן לראות, פחות או יותר, שאגפי המולקולה יותר שמורים ממרכזה. • ואת הלולאה הראשונה בה נמצא רצף ההכרה.stems אזורים אלה מכילים את ה-

needleneedle

בין זוג רצפים.Global Alignment מבצעת needle תוכנת • טוב בין Alignment השתמשנו בתוכנה זו במקרים בהם לא הצלחנו לבצע

בתור תוכנה המבצעת התאמהClustalW הומולוגים, בשל האילוצים החלים על בין רצפים רבים.

• needleמאפשרת שליטה רבה יותר בפרמטרים וכוונון משופר של ההתאמה בין זוג רצפים. פלט לדוגמא:

Homology DBHomology DB

LM35C1H1 1 GTGCGGCCCACATTGGAGTTGTGTCCTGGCCCCA----GCAGTGGCCCTG ||.||.|||.|. |..|.|||.|||||||||||||||||||||.. TB9C2H1 1 AAGGCCCACATTGGAGTTGTGTCTTGGGCTAACATTTCTGTGTCCTTG LM35C1H1 47 TCTGCACACTCGCGTGGGCCAAGAGAT 73|..|||.||.|||||.|||||||||.| TB9C2H1 49 TTTGCACACTCACGTGGTCCGAGAATT 75

mfoldmfold

http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi

למבנה שניוני. T.vivaxורצפי L.major קיפול רצפי •base pairing מלבצע mfold הקיפול מותנה ביכולת שלנו להגביל את התוכנה •

כרצונה. בדרך כלל פלט התוכנית אינו מתאים למבנה המצופה של המולקולה. )מיד יודגם(.

אינן מיצגות קיפול "אמיתי" ודורשותmfoldתמונות הקיפול המתקבלות ב- • תיקונים.

. בקובץ זה השתמשנו Viennaאת תוצאות הקיפול שמרנו הן כתמונה והן כקובץ •. Canvasיותר לבניית מבנה שניוני חדש למולקולה בתוכנה מאוחר

:Vienna דוגמא לקובץ •TV10C1H3GCAGGAACGUGGCAGGCCAAUGAGUGCGCACUCGUCUCUCAUGUGGUUCAACAACAUGGUCCGAGACUUG

...(((.((((....(((((((((.(((....)))..))))).)))).......)))).)))........

בלי מגבלות: בלי מגבלות:mfoldmfoldהרצת הרצת

קלט:LM35C4H1 UUGCGGUGAAGCGGCUUUAGCCUUGGCGCGGCUUUCACACCCCUGUGCCGUGUGCCAUCUUGGUGCGCCUCGAGAUCG

:2פלט :1פלט

אוי ווי

mfoldmfoldמגבלות על מגבלות על לזווג זוג נוקליאוטידים או לאסור על זיווגם.mfold ניתן להכריח את • מגבלות יצרנו בעזרת:•

( שקיבלנו מהמעבדה:rRNAא. רצפי הכרה )אלה שמזהים את ה-

ב. רצפי הכרה שניחשנו על סמך הומולוגיה בין רצפים:LM36C3H4LM36C3H4 --------AGCAGTGTCGCTATGCGTCTCCGTCTCACCTCGATGCGGAGCLInfant_CntGDB3661_1120_1184 --------AGCAGTGTCGCTATGCGTCTCCGTCTCACCTCGGTGCGGAGCTB10C3H1 --------AGCAGTGTCGCTATGCGTTCCCGTC----AGTAATACGGGCTTC10C3H1 GCCGAGGCAGCGGTGTCGCTATGCGTCCCCGCA----GACAGTGCGGTGC

*** ************** *** * *** LM36C3H4 AACGGTACGAAACACGTGCGAGATGCLInfant_CntGDB3661_1120_1184 AACGGTACGAAACACGTGCGAGA---TB10C3H1 AACGGTACGAAGCACGTGCGAGAGGTTC10C3H1 GACGGTACGAAGCACGCGCGAGAGCC ********** **** ******

, ולפי ההומולוגיהT.bruceiבדוגמא הנ"ל ידענו מהו אתר הפעילות של ניחשנו את רצף ההכרה וקיפלנו לפיו.L.majorהחזקה עם

עם מגבלות: עם מגבלות:mfoldmfoldהרצת הרצת

קלט:LM35C4H1 UUGCGGUGAAGCGGCUUUAGCCUUGGCGCGGCUUUCACACCCCUGUGCCGUGUGCCAUCUUGGUGCGCCUCGAGAUCG

P 20 0 3P 59 0 8P 73 0 3

פלט:

הצלוחע

האומנם?

ובכן...

טוב mfoldלא כל מה שטוב ל- למולקולה:

בולג'ים שקולים.•.stem הסטה של צד אחד מה-• בולג' כנגד פתיחה מוקדמת•

של לולאה. ועוד...•

לכן, על מנת לקבל תמונה נכונהשל המולקולה בטרם המחקר,השתמשנו בתוכנת הגרפיקה

Canvas כדי ליצור תמונות של המולקולות באופן ידני.

Tviv_chr9_2334096_2334166 CTTCTGGTAGTCGCGGAGATGCTC9C1H2 CTTCTGGTAGTCCCGGAGATGATB9C1H2 CTTCTGGTGGCTCCGGAGAAGC4265315.c000214879.Contig1_197 CTTCTGGTAGTTCCGGAGATG- ******** * ****** *

ACACGUGACAAUCCGAGGUGCGUGCGCGUCUUCCAUGCCACGUGAUUUCCUUCUGGUAGUCGCGGAGAUGC...((((((......(((((((((.((((.....))))))))))....))).......)))))).......

שיצרנו משלבות את Canvasתמונות ה- יחד עם Homology DBהמידע הקיים ב-

שמייצגים את תמונות Viennaקבצי ה-.mfoldה-

מספר המולקולות בפורמט הסופי קטןבגלל הומולוגיה חלשה או אי הצלחה

בקיפול המולקולות.

בצבע - ההומולוגים ומקום המוטציה. נוקליאוטידים שלא הושוו עם -Italicבפונט

ההומולוגים. נמצאים באזורים בהם קיימות מוטציות רבות מאוד.

השוואת המולקולות ההומולוגיות על גבי התמונה מאפשרות בראש ובראשונה להבחין בחשיבות המבנים השניוניים

השונים במולקולה.

Compensatory mutations -ב stem התחתון תומכות בחשיבותו לתפקוד

המולקולה.

הלולאה האמצעית שמורה בחלקה,רצף ההכרה שמור, שאר הלולאה לא.

השני שמור בחלקו, החלק stemה-שקרוב לכיס הפסאודויורידילציה שמור

ככל שעולים מתחיל הבלגאן.

הלולאה האחרונה אינה שמורה כלל וגודלה משתנה מאוד.

חיפוש חוקיםחיפוש חוקים

החוקים הידועים

של המולקולה.’3 בצד AGA קופסת •• stem.ראשון עם אפשרות לבליטה יחידה . stem ל-AGA מרווח של נוקליאוטיד אחד בין •.Ψ לכיס ה-AGA נוקליאוטידים בין 14-16 מרחק •• stem 3 נוסף באורך מינימלי של bp. נוקליאוטידים.75 ל-55 אורך כללי של המולקולה בין •

בעזרת חוקים אלה נמצאות מאות של "מולקולות".•

rRNA עבור כל אזור מודיפיקציה על גבי ה- • מולקולות עם סבירות נמוכה למצוא5-6 מוצעות

אחת נכונה.

חיפוש חוקים על ידי בדיקות חיפוש חוקים על ידי בדיקות סטטיסטיקותסטטיסטיקות

בירור מעמיק של אורכי חלקי המולקולה.•

חיפוש נוקליאוטידים משמעותיים בזנבות המולקולה )מצדדי • התחתון(. stem ה-

הראשון.stem בדיקה מעמיקה של הבליטות ב- •

נפוצות וסוג המוטציות.•

אורך רצפי ההכרה.•

אורכי חלקי המולקולהאורכי חלקי המולקולה שני stemאורך ראשוןstemאורך אורך כולל

מספר נוקליאוטידים בלולאה האמצעית

אורך עד ללולאה אמצעית )כולל(

64-87טווח – 71.5ממוצע –

5.22סטיית תקן –

4-7טווח – 6.2ממוצע –






21-29טווח – 25.5ממוצע –


אורך החלק מעל הלולאה האמצעית

29-52טווח – 35.75ממוצע –

5סטיית תקן –

AGAמרחק בין הראשוןstemל-

בלבד1

לכיסAGAמרחק בין הפסאודויורידילציה

13-16טווח – 14.8ממוצע –


מסקנותמסקנות אורך המולקולה הוא לא פרמטר טוב, רק אורך חציה •

התחתון.

H/ACA-like למעט מקרה יחיד של מולקולת • Spliced-Leader snRNA המכוונת מודיפיקציה על

1, תמיד קיים רווח של נוקליאוטיד rRNA ולא על הראשון. stem ל-AGA בלבד בין

לגבי שאר התכונות הנמדדות - לא רק שלא מיקדנו • את התוכנה על חוקים ברורים אף הגדלנו את טווח

החיפוש שלה...

כנ"ל לגבי אורך רצפי ההכרה, שלא הוצג • בשקף הקודם

מוטציות מוטציות ובליטותובליטות

stem ב- compensatory mutationsמוטציות שאינן ו- T.brucei עם L.majorהראשון הן נדירות. מהשוואת

T.cruzi סיכוי שתהיה מוטציה בין הזנים, 85% עולה כי יש סיכוי שמוטציה זו תהיה מוטציה לא מפצה.25%אך רק

הראשון יכולות לגרום להיווצרות בליטות stemמוטציות ב- )בולג'ים(. המולקולה יכולה לסבול בולג' אחד בלבד ב-

stem.

הבליטות עוברות מוטציות רבות שאינן מפצות, מכאן שהן חסרות חשיבות.

הן bp 1-3 השני שמופיעות בגובה stemמוטציות ב- בהכרח מפצות.

תוצאות ומסקנותתוצאות ומסקנות

אחוזי המוטציות לא תורמים לתוכנת החיפוש אך •.stems מדגימים את חשיבות ה-

הראשון יכולות להמצא בכל מקום stem בליטות ב- • ולהכיל לכל היותר נוקליאוטיד אחדstem על ה-

מכל צד.

השני stem בליטות או מוטציות שאינן מפצות ב- • מעידות על סיומו. בליטות כאלה מכילות בדרך כלל

יותר מנוקליאוטיד אחד. צמדי 3 הן הבליטות והן המוטציות מופיעות רק לאחר

.stem בסיסים של ה-

חיפוש נוקליאוטידים משמעותיים חיפוש נוקליאוטידים משמעותיים בזנבות המולקולהבזנבות המולקולה

T.cruzi ו- L.major, T.brucei מולקולות מהזנים 79הפעם ניתחנו

Logo’s website: http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi

אוAGA ליד משמאל ל-Uחוק ראשון – נדיר ביותר למצוא .stemבשני המקומות משמאל ל-

.stem לא מופיע אף פעם מיד משמאל ל- Gחוק שני –

משמאלAרק

משמאלCרק

T.brucei 6%נדיר ב- L.major - 30%נפוץ ב

?Gלאן נעלם ה-

לעולםAGAחוק שלישי – הנוקליאוטיד שסמוך ל-.stemלא יעבור זיווג עם הנוקליאוטיד שצמוד ל-

AGA ליד Gתת חוק של חוק שלישי – אם מופיע לא מקובל.G-Uאזי גם זיווג

במקום זהU במולקולה אחת. הופעת G מול U קיימת חריגה של הופעת • היא ענין נדיר בפני עצמו, ולא הצלחנו לשלול את נכונות המולקולה החריגה.

בשאר המיקומים שנבדקו יש פיזור די אחיד של הנוקליאוטידים.•

מסקנותמסקנות

ליד משמאל Uחוק ראשון – נדיר ביותר למצוא .stem או בשני המקומות משמאל ל- AGAל-

לא מופיע אף פעם מיד משמאל ל- Gחוק שני – stem.

לעולם לא AGAחוק שלישי – הנוקליאוטיד שסמוך ל-.stemיעבור זיווג עם הנוקליאוטיד שצמוד ל-

stem ליד ה- A גורר AGA ליד Gחוק רביעי –

Kink-turnKink-turnבקצרה בקצרה RNA מוטיב שהתגלה ממש לאחרונה המופיע במולקולות •

. H/ACA snoRNAקטנות כולל

לא אותר במולקולות של טריפנוזומטידים עד כה. גם לא •על ידינו.

על הלולאה GAG אותר בארכיאה כשסמוך לו מופיע רצף •העליונה.

בכוונתנו לחפש את רצף זה או רצף דומה בעזרת כלי • בשפת סקריפט.

מה עושים עם זה?מה עושים עם זה?

החוקים והתופעות הסטטיסטיות שמצאנו יכולים •כבר עכשיו להשתלב בתוכנת החיפוש כפי שהיא.

רשת נוירונים יכולה לסייע במתן משקל לתכונות •השונות.

יכול לסייע במציאת קשר בין clustering אלגוריתם •תכונות ויצירת קבוצות של מולקולות שתאפשרנה חיפוש

ממוקד יותר.

ניתוח מאפייני מבנה שניוני של מולקולות ה- h/aca-like snorna...

Documents