第三章 高效液相色谱法 (HPLC)第一节 概述

一．定义 以液体为流动相的色谱法，包括

1 ．经典液相色谱法：普通固定相、流动相常压输送

2 ．高效液相色谱法：高压输送、高效固定相、在线检测、

仪器化

二． HPLC 与 GC 应用范围对比

GC ：有机物的 20%

HPLC ：有机物的 80% （适合挥发性低、热稳定性差、

分子量大的高分子化合物及离子型的化合物）

三． HPLC 的特点：

① 适用范围广 ②分离性能好 ③分析速度快

④ 流动相可选择性范围宽 ⑤灵敏度高

⑥ 色谱柱可反复使用 ⑦流出组分容易收集

⑧ 安全

第二节 高效液相色谱法分类与基本原理 一． HPLC 的分类

HPLC

1. LSC

2. LLCNLLC

RLLC

3. BPC (ÏÁÒå)NBPC

RBPCÒ»°ãRBPCPIC

ISC

4. IEC

Ò»°ãIECICAA

5. SECGPC

GFC

6. AC7. MC8. CC

9. CEC

OTCEC

PCCE

CE (HPLC)CZE

MEKC±Ú́¦ ÀíÖùBPC

SEC

二．基本原理

HPLC 是将经典液相色谱法与气相色谱法的基本原理

和实验方法相结合而产生的，因此气相色谱法的基本概念，

保留值于分配系数的关系，塔板理论及速率理论，都可用

于高效液相色谱法，他们的主要差别在于流动相的不同。

（一） Van Deemter 方程式

1 ．在 GC 中表现形式

H = A + B / u + C u -------- 填充柱

H = B / u + C u -- 毛细管柱 （ A = 0 ）

H

u

uoptuopt

HPLC

GC

2 ．在 HPLC 中

B = 2γDm Dm T / η∝

HPLC 中的 Dm 比 GC 中的 Dg 小 1

05 倍

H = A + C u

u↑, H↑, n↓

第三节 各类高效液相色谱法

一．液 - 固吸附色谱法

（一）分离机制

K =Cs

Cmk = K

SVm

=t'Rto

S----Îü¸½¼ÁµÄ±í Ãæ»ý

k↑, tR↑, t’R ↑

吸附色谱法是被分离的组分分子与流动相分子争夺吸附剂表

面的活性中心，靠溶质分子的吸附系数的差别而分离。

tR = to(1+KVs

Vm) = to(1+k)

（二）固定相

1 ．硅胶 多孔硅胶，表面积大，容量大。如

（ 1 ）无定形多孔硅胶，塔板数 2×104 ～ 5×104 m-1

（ 2 ）球形多孔硅胶，塔板数 8×104 m-1

（ 3 ）堆积硅球，塔板数 8×104 m-1

2 ．高分子多孔微球（有机胶）

分离机制：吸附或吸附、分配及空间排斥兼有

特点：柱效低（ 103m-1 ） , 但选择性好，峰形好

（三）流动相

烷烃（底剂） + 极性调节剂 ---------- 二元、多元溶剂系统

溶剂极性大，洗脱力强， k↓, tR↓

（四）固定相和流动相的选择

1 ．固定相的选择： 5 ～ 10μm, 比表面积大，含水量

小

2 ．流动相的选择： TLC （薄层色谱）为先导

二．液 - 液分配色谱法

（一）分离机制

1 ．正相液 - 液分配色谱法（ NLLC ）

流动相极性小于固定相极性 ------- 正相色谱

正相洗脱 , 极性小的先出色谱柱

流动相极性↑，洗脱能力↑， k↓, tR↓

tR = to(1+KVs

Vm) = to(1+k)

2 ．反相液 - 液分配色谱法（ RLLC ）

流动相极性大于固定相极性 ------- 反相色谱

流动相极性↑，洗脱能力↓， k↑, tR↑

极性大的先出色谱柱

tR = to(1+KVs

Vm) = to(1+k)

三．化学键合相色谱法 (BPC)

（一）反相键合相色谱法（ RBPC ）

固定相：十八烷基键合相（ ODS ）

流动相： MeOH – H2O, CH3CN - H2O

1.  分离机制 ------- 吸附、分配兼而有之

2.  流动相极性与容量因子的关系

流动相极性↑，洗脱能力↓， k↑, tR↑

（主要用于非极性化合物的分离）

（二）正相键合相色谱法（ NBPC ）

固定相：氨基、氰基键合相

氰基与硅胶相似，比硅胶极性小（硅胶可以分离的都可用氰

基分离） 氨基键合相 ------ 适合于分离糖类物质

流动相：烷烃（底剂） + 极性调节剂 ----- 二元、多元溶剂系统

1 ．分离机制 诱导力、色散力、范德华力

2 ．流动相极性与容量因子的关系

流动相极性↑，洗脱能力↑， k↓, tR↓

极性小的先出色谱柱

（三）离子对色谱法（ PIC 或 IPC ）

RPIC---- 反相离子对色谱法 （在极性流动相加入离子对试剂，

被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带

电的中性离子对，增加样品离子在非极性固定相中的溶解度，

分配系数增加，改善分离效果），

1 离子对试剂：分离酸性或带负电荷物质，选择铵盐离子对

分离碱性或带正电荷物质，选择烷基磺酸（硫酸）钠

2 分离机制 离子对模式说

Á÷¶¯Ïà (m)

B + H+ BH+

RSO3Na RSO3- + Na+

+

RSO3-RH+

ÖÐÐÔÀë×Ó¶Ô

RSO3-RH+

¹Ì ¶¨ Ïà (s)

流动相 pH 值： pH2 ～ 8

有机溶剂的选择：甲醇、乙腈

（四）离子抑制色谱法 (ISC)

反相色谱法中，通过调节流动相的 pH 值，抑制样品组分

的解离，增加它在固定相中的溶解度，达到分离有机弱酸、

弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。

1 ．适用范围： 3.0≤pKa≤7.0 的弱酸， 7.0≤pKa≤8.0 的弱

碱

2 ．容量因子及其影响因素

对于弱酸： pH＜ pKa, 以分子形式存在， k↑, tR↑

pH＞ pKa, 以离子形式存在， k↓, tR↓

对于弱碱，情况相反

3. 离子抑制色谱（反相）

流动相中加入弱酸（ HAc ）或弱碱（ NH3·H2O ）或缓冲液

（磷酸盐）

流动相 pH2 ～ 8

四．对流动相的要求和洗脱方式

（一）要求：

（ 1 ）不与固定相发生化学反应

（ 2 ）对样品有良好的溶解度 k 1 ～ 10 可用范围， k 2 ～ 5

最佳范围

（ 3 ）与检测器相适应 溶剂的截止波长，如水 190nm, 甲

醇 205 nm ，测定波长大于溶剂的截止波长

（ 4 ）纯度高，粘度小

（二）洗脱方式：

（ 1 ）恒组成溶剂洗脱

（ 2 ）梯度洗脱（梯度淋洗或程序洗提） 在一个分析周

期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。用于极性

差别较大的混合物的分离。

薄层色谱法

一．分类和原理

1 ．定义：固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑

料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称

为薄层色谱法

2 分类

(1)°´ ·ÖÀë»úÖÆ·Ö

Îü¸½É«Æ×·¨

·ÖÅäÉ«Æ×·¨

·Ö×ÓÅÅ×èÉ«Æ×·¨

½ºÊøÉ«Æ×·¨ £¨ ÔÚÁ÷¶¯ÏàÖмÓÈë»î ÐÔ¼Á£©

(2)°´ ·ÖÀëЧÄÜ·Ö

¾ µä±¡ ²ã É«Æ×·¨

¸ßЧ±¡ ²ã É«Æ×·¨

A

c

a

b

ÈܼÁÇ°ÑØ

Rf(A) =ac

Rf(B) =bc

B

3 原理（吸附色谱法）

吸附剂对物质 A 、 B具有不同的吸

附能力，展开剂对 A 、 B 有不同的

溶解、解吸能力，

KA≠KB 。 K↑ ，移动速度慢。

二．薄层色谱 (TLC) 参数

（一）定性参数

1. 比移值（ Rf ） Rf =l-----------×é·ÖǨÒƵľàÀëlo---------- Á÷¶¯ÏàǨÒƵľàÀë

组分的 Rf 值主要受展开剂

（柱色谱中的流动相）的组

成、比例影响

A

c

a

b

ÈܼÁÇ°ÑØ

Rf(A) =ac

Rf(B) =bc

B

定时展开： Rf = u / uo

① 在 TLC 中定时展开， t 相等

② 在柱色谱中定距展开， l = l

o

Rf 可用范围为 0.2 ～ 0.8, 最佳范围 0.3 ～ 0.5

Rf =l / tlo / t

=llo

Rf =l / tR

l / to=

to

tR

2. 相对比移值（ Rr ）

Rr =Rf(a)

Rf(s)=

lals

Rf(a) ， Rf(s) 分别为组分 a 和参考物质s

在同一薄层板上、同一展开条件下

测得的 Rf 值 , la ， ls 分别为原点至组分

a 和参考物质 s 的斑点中心的距离。优点：可消除系统误差，重现性好

（二）相平衡常数

1 ．分配系数与比移值之间的关系

R’ = u / uo , R’------ 组分在展开剂中出现的几率

Rf = l / lo = u / uo, 所以 R’ = Rf

Vs------- 薄层板上固定相的体积， Vm------ 薄层板上展开剂的体

积，组分 K↑, Rf↓

(K =Cs

Cm

1 / R' = 1 + KVs / Vm

Rf =1

1 + KVs / Vm

=Vm

Vm + KVs

)

2 ．容量因子 (k)

k = Ws / Wm = CsVs / CmVm = KVs / Vm

Rf = 1 / (1+k) Ws------ 组分在固定相中的质量

Wm----- 组分在展开剂中的质量

3 ．流动相（展开剂）及其选择被分离物质极

性吸附剂活度数（吸附能

力） 流动相极性

小 大 小

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