第三节 分 枝 杆 菌 属 (Mycobacterium)

分枝杆菌属的分类

结核分枝杆菌复合群( 生长慢不产色 )

结核分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌田鼠分枝杆菌

非结核分枝杆菌

Ⅰ 群 ( 光产色菌 )Ⅱ 群 ( 暗产色菌 )III 群 ( 不产色菌 )Ⅳ 群 ( 快速生长菌 )

麻风分枝杆菌 ( 人工培养基不生长 )

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结 核 分 枝 杆 菌结 核 分 枝 杆 菌 (Mycobacterium tuberculosis)

1882 年 3 月 24 日德国细菌学家郭霍发现

一、分 类

结核分枝杆菌复合群 ( 生长慢不产色 )

结核分枝杆菌 (90%)

牛分枝杆菌 (5%)

非洲分枝杆菌 (5%)

田鼠分枝杆菌

二、生 物 学 特 性

结核杆菌抗酸染色结核杆菌抗酸染色 ((×1000×1000))

结核杆菌的扫描电镜照片

结核杆菌菌落

“ 谗、懒、顽、变”

“ 谗、懒”：胞壁含脂质高，营养要求高，

生长缓慢；

罗 - 琴 (L-J 培养基 )

（含蛋黄、甘油、马铃薯、

无机盐、孔雀绿等）

培养需 2-4 周有菌落生成

“ 顽” ：对某些理化因素抵抗力较强

抗干燥抗干燥：在干燥痰中可生存 6-8 个月，

附在尘埃上传染性可保持 8-10d;

抗酸碱抗酸碱：：抗 6%H2SO4 或 4%NaOH 达 30min( 集菌 )

抗染料抗染料：： 1:13000 孔雀绿或 1:75000 结晶紫

“ 变”：形态、菌落、毒力及耐药性均可变异

卡介苗 : 毒力变异株（ Bacille Calmette-Guerin ， BCG ）

耐药变异株 : 药物选择作用 ( 应规范用药 , 药敏试验选敏感药物联合用药 )

R-S 变异 : 菌落变异

L 型变异 : 药物等诱导而成 ,TSA-L 培养基生长

　肺结核患者外周血中的分枝杆菌伴非抗酸颗粒， 培养法　抗酸染色　 ×1000

杀灭结菌的方法：

1 、阳光下暴晒 2h ；

2 、 5%-12% 来苏作用 5min-2h ；

3 、 75% 酒精接触 2min ；

4 、煮沸 1min ；

5 、焚烧—是最简便的灭菌方法

生化反应

热触酶试验

结核分枝杆菌、牛分枝杆菌 (-)

非结核分枝杆菌 (+)

硝酸盐还原试验烟酸试验烟酰胺酶试验

结核分枝杆菌 (+)

牛分枝杆菌 (-)

三、 细 菌 学 检 验

结 核 病 确 诊 的 重 要 依 据

( 一 ) 标本的采集与注意事项

注意事项

标本采集：视病变部位取标本如：痰取晨痰约 5ml

无菌密闭容器及时接种低温送检痰液合格收检

( 二 ) 检 验 程 序

集菌涂片

1 、沉淀集菌法：

2 、漂浮集菌法：生理盐水稀释高压灭菌液化 离心，取沉渣

二甲苯 1ml 振荡 30min

吸取泡沫和油层接界部分

意义 : 阳性可确诊为结核病，有传染性。但检出率低 ; 制定治疗方案和化疗疗效评价的重要指标 .

√37℃ 30min4%NaOH

染 色

抗酸染色

金胺 O 染色

报告方式 镜检结果

- 仔细检查 300 个视野未发现抗酸杆菌

± 300 个视野内发现 1~2 条抗酸菌

＋ 100 个视野内发现 1~9 条抗酸菌

2 ＋ 10 个视野内发现 1~9 条抗酸菌

3 ＋ 每个视野内发现 1~9 条抗酸菌

4 ＋ 每个视野内发现 9 条以上抗酸菌

抗酸染色镜检结果报告方式

痰检至少 2次阳性 !!!

操作及报告结果标准化 《中国结核病防治规划实施工作指南》（ 2

008 新版）

《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》

结核病诊断细菌学检验规程（ 1995 年）

生物安全！！

请注意：废弃标本和污染物的处理 痰盒和废弃标本等污染物，均需经高压蒸汽灭菌

后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。 痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内

彻底焚化。焚烧不彻底或暴露焚烧是有害的。 痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，

在操作橱内进行痰涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以 3 ％石炭酸或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯（距离≤ 1 米）照射 30min 。

生物安全！！

分离培养与鉴定

固体培养基 L-J （选择）、 PNB和 TCH （鉴别）

液体培养基（ Middle brook7H9/12和 Sauton 培养基）

L 型培养基（ TSA-L 培养基、 92-3TBL ）

全自动快速培养鉴定药敏系统： Bactec 全自动系统等

标本前处理后培养 !!!

Middle brook7H10/11

意义 :金标准，阳性可确诊为结核病，有传染性。 并可进一步做生化反应、药敏试验，但需时长。

、小川培养基

标本培养前处理1 、痰： 酸 / √ 碱处理　　碱 / 酸性 L-J 培养基

胰蛋白酶 - 新洁尔灭法

NaOH-NALC 法

2 、脑脊液、胸腹水：离心、沉淀（有污染碱处理）

3 、尿液：离心、沉淀（碱处理）

4 、脓液：酸 / 碱处理

报告方式 培养结果

＋ 斜面 20 个菌落以上，占斜面 1/4 以下

2 ＋ 斜面上菌落生长面积占 1/4 以上， 1/2 以下

3 ＋ 斜面上菌落面积占斜面 1/2 以上， 3/4 以下

4 ＋ 斜面上菌落生长密集，成菌苔

培养结果记录与报告方法

分离培养与鉴定

固体培养基 L-J 、 PNB 、 TCH

液体培养基（ Middle brook7H9/12和 Sauton 培养基）

L 型培养基（ TSA-L 培养基、 92-3TBL ）

全自动快速培养鉴定药敏系统： Bactec 960系统等

标本前处理后培养

Middle brook7H10/11

意义 :金标准，阳性可确诊为结核病，有传染性。 并可进一步做生化反应、药敏试验，但需时长

、小川培养基

L 菌 检 测 注意！

细胞壁染色 P51

分离培养与鉴定（ TSA-L 培养基、 92-3TBL ）

意义 :多次检出 L 型是活动性结核的诊断依据之一， 痰菌阴性指标为细菌型与 L 型均阴性

基 因 检 测

免疫学检测

动物试验

结核菌素实验结果

结核分枝杆菌－－结核菌素试验 原理：用结核菌素进行皮肤试验，以检测受试

者对结核杆菌是否有细胞免疫及迟发型超敏反应的试验。

结果：注射部位是否出现红肿硬结判断结果 ＜ 5mm为阴性 ≥5mm为阳性 ＞ 15mm为强阳性 应用：选择卡介苗接种对象；判断卡介苗接种效果；辅助诊断婴幼儿结核病；测定肿瘤患者细胞免疫状态

标本

集菌涂片染色镜检

前处理 基因检查

荧光染色

抗酸染色

报告分枝杆菌

报告抗酸杆菌

动物试验

分离培养

L 型培养

观察生长情况

抗酸染色

生化反应

药敏试验

报告（种别）

PCRDNA探针杂交

报告

报告

鉴定

直接涂片

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* 缺乏快速早期准确的诊断方法

* 合并 HIV 感染者诊断

* 无症状感染者与患者的鉴别

* 耐药性的快速鉴定

实验室诊断存在的主要问题实验室诊断存在的主要问题

四、 流 行 病 学 与 防 治 原 则 （一）流 行 病 学

传染源：患者（开放性肺结核患者）传染途径：呼吸道、消化道、皮肤黏膜破损处临床类型：儿童（原发感染）；成人（原发后感染）疾病特点：人群普遍易感； 以结核结节和干酪样坏死为主要病理特征； 细胞免疫为主，同时获得对结菌的迟发型超敏反应

（二）防治原则

早诊断、早治疗（及时、敏感、足量、联用、全程）

BCG 、 DNA疫苗

思 考 题 痰标本为何要做集菌前处理 ?

怎样集菌 ?

痰检抗酸杆菌的意义？

痰检需注意的生物安全问题？查资料了解一下

查资料了解国内外结核疫情 ?