荧光定量 pcr 技术讲座

荧光定量荧光定量 PCRPCR 技术讲座技术讲座

------------ 分子生物学实验技术系列讲座分子生物学实验技术系列讲座ⅢⅢ

张志坤张志坤 20102010 、、 0909 、、1010

大纲大纲一、荧光定量一、荧光定量 PCRPCR 技术的基础理论技术的基础理论二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计三、内参基因的选择三、内参基因的选择四、反应体系的优化四、反应体系的优化五、实验方案的选择五、实验方案的选择六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控八、实验结果的分析八、实验结果的分析

PCRPCR技术技术（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）

► PolymerasePolymerase chainchain ReaReactionction以目的基因或以目的基因或 DNADNA片段为片段为模板，在引物介导及模板，在引物介导及 DNADNA聚合酶催化下，在体外用核聚合酶催化下，在体外用核苷酸（苷酸（ dNTPdNTP ）大量合成目）大量合成目的基因或的基因或 DNADNA片段。片段。

► 它能快速、专一地扩增所希它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或望得到的目的基因或 DNADNA片段。片段。

一、荧光定量一、荧光定量 PCRPCR 技术的基础理技术的基础理论论

11 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 技术概论技术概论荧光定量荧光定量 PCRPCR 技术产生并成熟于上世纪技术产生并成熟于上世纪 9090 年代，由于该年代，由于该

技技术实现了术实现了 PCRPCR 从定性到定量的飞跃，能够对从定性到定量的飞跃，能够对 PCRPCR 反应的全过反应的全过

程进程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，，成为成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。


11 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 技术概论技术概论荧光定量荧光定量 PCRPCR 技术是在技术是在 PCRPCR 反应体系中加入荧光基团，反应体系中加入荧光基团，

利用利用荧光信号随着荧光信号随着 PCRPCR 反应的积累来实时监控反应的积累来实时监控 PCRPCR 反应的进程，反应的进程，

并通并通过分析软件对过分析软件对 PCRPCR 的反应进行检测分析的技术。的反应进行检测分析的技术。系统组成：定量系统组成：定量 PCRPCR 仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。


22 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 常用的三个概念常用的三个概念扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、 CTCT 值值（（ 11 ）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式

左图反映的是随着左图反映的是随着 PCRPCR 反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号是指数期很短；右图反映的是荧光信号的的变化量的对数与变化量的对数与 PCRPCR 反应循环数的关系，反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。换。


22 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 常用的三个概念常用的三个概念（（ 22 ）、阈值线）、阈值线在荧光定量在荧光定量 PCRPCR 扩增的指数期，画一条线，在此直线上，扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。


22 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 常用的三个概念常用的三个概念（（ 33 ）、）、 CTCT 值值 PCRPCR 过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过

的的扩增循环数。扩增循环数。


33 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的化学基础的化学基础荧光定量荧光定量 PCRPCR 是随着是随着 PCRPCR 循环的进行，以荧光信号强度的积循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映累来实时反映 PCRPCR 反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点：点：（（ 11 ）、本底低）、本底低（（ 22 ）、荧光强度高）、荧光强度高（（ 33 ）、每轮）、每轮 PCRPCR 反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧光强度的增高和每轮循环后光强度的增高和每轮循环后 PCRPCR 产物的量成线性关系产物的量成线性关系（（ 44 ）、没有）、没有 PCRPCR 产物时，没有荧光产物时，没有荧光（（ 55 ）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种荧光不会产生荧光的交叉干扰荧光不会产生荧光的交叉干扰


33 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的化学基础的化学基础目前常用的几种荧光物质目前常用的几种荧光物质（（ 11 ）、）、 TaqmanTaqman 探针类探针类

55’’端标记荧光基团，端标记荧光基团， 33’’端标记淬灭基团，探针完整时，没有端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着与目的基因互补序列结合，随着 PCRPCR 反应的进行，在反应的进行，在 TaqTaq酶酶 55’’---3---3’’外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。


33 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的化学基础的化学基础TaqmanTaqman 常用的荧光基团和淬灭基团常用的荧光基团和淬灭基团荧光基团：荧光基团： 55’’端常用荧光基团端常用荧光基团 FAMFAM标记，最佳激发光波长：标记，最佳激发光波长： 494-495nm494-495nm ，最，最

大大发射光波长：发射光波长： 518-520nm518-520nm 。。淬灭基团：淬灭基团： TAMRATAMRA 、、 BHQBHQ 、、 ECLIPSEECLIPSE等。等。 TAMRATAMRA 本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽， 500500——

560nm560nm ，最佳激发光波长在，最佳激发光波长在 560nm560nm附近，对附近，对 FAMFAM 基团产生的发基团产生的发射光射光

具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽， 560560——650nm650nm ，当做，当做多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已不常用。不常用。 BHQBHQ 和和 ECLIPSEECLIPSE 为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较为常用，尤其在多重荧光定量为常用，尤其在多重荧光定量 PCRPCR 时常常被采用。时常常被采用。


33 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的化学基础的化学基础TaqmanTaqman 探针的特点及应用探针的特点及应用（（ 11 ）、特异性强、准确性高）、特异性强、准确性高本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与 PCRPCR 产物产物的量成正比关系，因此准确性极高。的量成正比关系，因此准确性极高。（（ 22 ）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的用，普通的 TaqTaq酶就能满足实验的要求。酶就能满足实验的要求。（（ 33 ）、常被用作基因含量的精确检测）、常被用作基因含量的精确检测 (( 精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝 )) 及基因表达变化的精确分析（精确度可达及基因表达变化的精确分析（精确度可达 0.10.1倍的变倍的变化）。化）。（（ 44 ）、目前价格也不是太贵，）、目前价格也不是太贵， 2OD 1000.002OD 1000.00 左右左右


33 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的化学基础的化学基础（（ 22 ）、荧光染料类）、荧光染料类目前常用的荧光染料为目前常用的荧光染料为 SYBR GreenSYBR GreenⅠⅠ、、 SYBR GreenSYBR GreenⅡⅡ、、 SYTO9SYTO9 、、 HRMHRM等。其共同性质为：等。其共同性质为：（（ aa ）、结合于双链核酸的小沟处）、结合于双链核酸的小沟处（（ bb ）、与双链）、与双链 DNADNA 结合后受激产生荧光结合后受激产生荧光（（ cc ）、在变性条件下双链分开，荧光消失）、在变性条件下双链分开，荧光消失


33 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的化学基础的化学基础荧光染料的特点及应用荧光染料的特点及应用（（ 11 ）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；（（ 22 ）、可做双链核酸的熔解曲线分析；）、可做双链核酸的熔解曲线分析；（（ 33 ）、）、 SYBR GreenⅠSYBR GreenⅠ 染料本身价格便宜，但是做荧光定量染料本身价格便宜，但是做荧光定量 PCRPCR 时对时对

引物设引物设计的要求很高；对计的要求很高；对 TaqTaq 酶要求较高，最好是酶要求较高，最好是 HotStar TaqHotStar Taq 酶，酶，

或者操或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；（（ 44 ）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；（（ 55 ）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（（ 66 ）、对）、对 PCRPCR 反应的毒性，能抑制反应的毒性，能抑制 PCRPCR 反应，降低反应，降低 PCRPCR 反应的效率。反应的效率。


44 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的数学原理的数学原理对于普通的对于普通的 PCRPCR 反应来说反应来说

nn XXnn=X=X00 （（ 11 ＋＋ EE ））

上式中，上式中， XXnn 为为 nn 轮轮 PCRPCR 循环后，目的基因循环后，目的基因 PCRPCR 产物的量；产物的量；nn 为为 PCRPCR 循环数；循环数； XX0 0 为目的基因的初始模板量，为目的基因的初始模板量， EE 为为 PCRPCR的反应效率，的反应效率， 0≤E≤10≤E≤1 。。


44 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的数学原理的数学原理由于由于 PCRPCR 反应体系中荧光物质的荧光强度与反应体系中荧光物质的荧光强度与 PCRPCR 产物的量成正比，产物的量成正比，

所以所以用荧光强度来代替用荧光强度来代替 PCRPCR 产物的量，我们可以得到：产物的量，我们可以得到：

RRnn= R= RBB+ X+ X00(1+ E) R(1+ E) Rssnn

总荧光信号强度总荧光信号强度 == 本底信号本底信号 ++ 分子数量分子数量××单位信号强度单位信号强度

RRnn ：：第第 nn 个循环时的总信号个循环时的总信号RRBB ：：本底本底RRSS ：：单位信号强度单位信号强度XX00 ：：起始起始 DNADNA 数目数目EE ：： PCRPCR效率效率


44 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 的数学原理的数学原理当循环数当循环数 nn 等于等于 CTCT 值时，所有样品荧光信号强度变化量的值时，所有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都达到了阈值。对数全部一致，都达到了阈值。 RRTT= R= RBB+ X+ X00(1+ E) Rs(1+ E) Rs lg(Rlg(RTT -R -RBB) = lgX) = lgX00 + CT lg(1+ E) + lg Rs + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgXCT lg(1+ E) = -lgX00 + lg(R + lg(RTT -R -RBB) ) ––lg Rslg Rs

此时，此时， PCRPCR 反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率 EE 稳定且近似相稳定且近似相等；等； lg(Rlg(RTT -R -RBB)) 、、 RsRs 也都相同，只有也都相同，只有 CTCT 值和值和 -lgX-lgX00 为变量，且这两为变量，且这两

个变个变量之间成一次性方程。量之间成一次性方程。也就是说，所有样品的也就是说，所有样品的 lgXlgX00 与到达阈值时的循环数与到达阈值时的循环数 nn （（ CtCt 值）呈线性值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即关系，根据样品扩增达到域值的循环数即 CtCt 值就可计算出样品中所含的模值就可计算出样品中所含的模板量板量

CT


55 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 线性关系成立的条件分析线性关系成立的条件分析

CT lg(1+ E) = -lgXCT lg(1+ E) = -lgX00 + lg(R + lg(RTT -R -RBB) ) ––lg Rslg Rs（（ 11 ）、）、 PCRPCR效率相等，在效率相等，在 PCRPCR 扩增的指数期，扩增的指数期， EE 稳定且为常数；稳定且为常数；（（ 22 ）、）、 RRTT ––RRB B 要要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧光本底之差要相等；光本底之差要相等；（（ 33 ）、样品的单位信号强度）、样品的单位信号强度 RsRs 要相等，用荧光染料做荧光基团时，要相等，用荧光染料做荧光基团时， Rs Rs 就就是每条是每条 PCRPCR 产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和 PCRPCR 产物的长短有关，产物的长短有关， PCRPCR 产物越长，结合的荧光染料越多，产物越长，结合的荧光染料越多， Rs Rs 值值越大；用探针做荧光基团时，越大；用探针做荧光基团时， Rs Rs 就等于就等于 PCRPCR 反应时，反应时， TaqTaq酶水解掉酶水解掉探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和 PCRPCR 产物的长度没有产物的长度没有直接关系。直接关系。



左图横坐标是左图横坐标是 PCRPCR 循环次数，纵坐标是总的荧光强度循环次数，纵坐标是总的荧光强度 RnRn ，改图反映的是各个样品，改图反映的是各个样品随着每轮随着每轮 PCRPCR 反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是 PCRPCR 循环次数，纵循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值 RT RT ––RBRB即△即△ RnRn 的对数，在右图中确定阈值的对数，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的线，该直线上所有样品的 RT RT ––RBRB 的对数都相同，荧光定量的对数都相同，荧光定量 PCRPCR 的线性关系才会成的线性关系才会成立。立。



LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品 Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。


66 、双链核酸的熔解曲线分析、双链核酸的熔解曲线分析使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着 PCRPCR 反应的反应的

进进行，双链行，双链 PCRPCR 产物呈指数增长，产物呈指数增长， SYBR GreenⅠSYBR GreenⅠ 与双链与双链 PCRPCR 产物结合后产物结合后

荧光越荧光越来越强，当来越强，当 PCRPCR 反应结束时，荧光强度达到最大，此时对反应结束时，荧光强度达到最大，此时对 PCRPCR 产物进行缓产物进行缓慢慢

加热，从加热，从 50℃50℃ 一直加热到一直加热到 99℃99℃ ，在此过程中，在此过程中 PCRPCR 产物按照产物按照 TMTM 值的大小值的大小双链被双链被

依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：


66 、双链核酸的熔解曲线分析、双链核酸的熔解曲线分析对于核酸序列相同的对于核酸序列相同的 PCRPCR 产物，其产物，其 TMTM 值也相同，而且其值也相同，而且其 TMTM 值在一值在一

个很小个很小的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：


66 、双链核酸的熔解曲线分析、双链核酸的熔解曲线分析上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的酸双链，在一定的离子强度下的 TMTM 值。核酸双链的值。核酸双链的 TMTM 值由双链值由双链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其 TMTM 值也不值也不同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。能分析出来。电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线是根据双链核酸的是根据双链核酸的 TMTM 值来分析的，这与琼脂糖电泳及值来分析的，这与琼脂糖电泳及 SSCPSSCP 有异有异曲同工之处。曲同工之处。


77 、绝对定量和相对定量、绝对定量和相对定量


77 、、 mRNAmRNA 差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析

研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。

实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同， RNARNA提取提取时得率不同、时得率不同、 RNARNA 反转录为反转录为 cDNAcDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析的的效率不同等客观因素，用于定量分析的初初

始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基的差异。常用的内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有被用作内参照，常用的内参基因有 GAPDHGAPDH 基因、基因、 β-Actinβ-Actin 基因，基因， 18srRNA18srRNA

基基因等。因等。


77 、、 mRNAmRNA 差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析

以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法种相对定量的分析方法：：双标准曲线法和双标准曲线法和 Delta-delta CtDelta-delta Ct 法。法。


77 、、 mRNAmRNA 差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析（（ 11 ）、双标准曲线法）、双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定

量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。量的基本公式来求出目的基因的差异表达。

双标准曲线法的特点双标准曲线法的特点：：（（ aa ）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误差；率，最大限度的避免了误差；（（ bb ）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像 Delta-Delta-

delta CTdelta CT 法那样对实验进行反复的优化；法那样对实验进行反复的优化；（（ cc ）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲）、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；线；（（ dd ）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。


77 、、 mRNAmRNA 差异表达的相对定量分析差异表达的相对定量分析（（ 22 ）、）、 2 -△△CT2 -△△CT 法法

该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为 1 ，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于 0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。

该方法要求严格的重复，因为 CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。

该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。

二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计11 、染料法引物的设计原则、染料法引物的设计原则：：（（ 11 ）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（（ 22 ）、避免引物自身或与引物之间形成）、避免引物自身或与引物之间形成 44 个或个或 44 个以上连续配对，避免引物个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；自身形成环状发卡结构；（（ 33 ）、检测）、检测 mRNAmRNA 时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；子；（（ 44 ）、引物之间的）、引物之间的 TMTM 相差避免超过相差避免超过 2℃2℃ ；；（（ 55 ）、典型的引物）、典型的引物 1818 到到 2424 个核苷长；个核苷长；（（ 66 ）、目的基因和内参基因所扩增的）、目的基因和内参基因所扩增的 PCRPCR 产物长度尽量一致，不大于产物长度尽量一致，不大于 300bp300bp ，这样有利于使两种基因，这样有利于使两种基因 PCRPCR效率相同效率相同（（ 77 ）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做 BLASTBLAST 分析其分析其特异性特异性

二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计22 、、 TaqmanTaqman 探针及引物的设计原则探针及引物的设计原则：：在在 TaqmanTaqman 探针法中，探针法中， TaqTaq酶除了酶除了 55’’-3-3’’聚合酶作用之外，还要聚合酶作用之外，还要 55’’-3-3’’外外切酶切酶

的活性来切断探针链产生荧光，普通的活性来切断探针链产生荧光，普通 PCRPCR 的延伸温度为的延伸温度为 72℃72℃ ，此温度为，此温度为 TaqTaq

酶聚合作用的最佳温度；酶聚合作用的最佳温度； TaqmanTaqman 探针法反应中，在要求探针法反应中，在要求 TaqTaq 酶酶 55’’-3-3’’聚合酶聚合酶活活

性的同时，还需要性的同时，还需要 TaqTaq 酶酶 55’’-3-3’’外切酶的活性来切断探针链产生荧光，外切酶的活性来切断探针链产生荧光， TaqTaq酶酶55’’-3-3’’外切酶活性的最佳温度为外切酶活性的最佳温度为 60℃60℃ ，所以，所以 Taqman PCRTaqman PCR 反应的一般采用两步反应的一般采用两步法，即法，即 95℃95℃ 变性，变性， 60℃60℃复性延伸。复性延伸。在在 TaqmanTaqman 探针及引物的设计过程中，引物的探针及引物的设计过程中，引物的 TMTM 值已经确定为值已经确定为 60℃60℃ 左左右，在每轮右，在每轮 PCRPCR 循环的复性过程中（循环的复性过程中（ 95→60℃95→60℃ ），为了确保探针先于引物与），为了确保探针先于引物与模板结合，这就要求探针的模板结合，这就要求探针的 TMTM 值高于引物值高于引物 10℃10℃ 左右，所以左右，所以 TaqmanTaqman 探针及引探针及引物一般都是引物物一般都是引物 TMTM 值为值为 60℃60℃ 左右，探针的左右，探针的 TMTM 值为值为 70℃70℃ 左右。左右。

二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计22 、、 TaqmanTaqman 探针及引物的设计原则探针及引物的设计原则：：（（ 11 ）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（（ 22 ）、检测）、检测 mRNAmRNA 时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；子；（（ 33 ）、引物）、引物 TMTM 值为值为 60℃60℃ 左右，探针的左右，探针的 TMTM 值为值为 70℃70℃ 左右；左右；（（ 44 ）、探针的）、探针的 55’’端应避免使用鸟嘌呤端应避免使用鸟嘌呤 GG ，因为，因为 55’’GG 会有淬灭作用，而且即使会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；是被切割下来还会存在淬灭作用；（（ 55 ）、整条探针中，碱基）、整条探针中，碱基 CC 的含量要明显高于的含量要明显高于 GG 的含量的含量 GG 含量高会降低反含量高会降低反

应应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；（（ 66 ）、引物之间的）、引物之间的 TMTM 相差避免超过相差避免超过 2℃2℃ ；；（（ 77 ）、典型的引物长度为）、典型的引物长度为 18-24bp18-24bp ，探针长度为，探针长度为 15-45bp15-45bp ；；（（ 88 ）、）、 PCRPCR 产物长度在产物长度在 50-150bp50-150bp之间，这样有利于使之间，这样有利于使 PCRPCR效率相同；效率相同；（（ 99 ）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做 BLASTBLAST 分析其分析其特异性特异性

二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计22 、、 TaqmanTaqman 探针及引物的设计原则探针及引物的设计原则：：

探针中 GC含量的差异对定量 PCR反应效率的影响

二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计33 、、 TaqmanTaqman探针及引物的设计举例探针及引物的设计举例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC

经经 OligoOligo 软件验证，探针软件验证，探针 TMTM 值值 7070℃℃ 左右，左右，上下游引物的上下游引物的 TMTM 值都为值都为 60 ℃60 ℃ 左右，二级结构左右，二级结构分析，引物和探针比较理想，再经分析，引物和探针比较理想，再经 BLASTBLAST 分析，引物和探针特异性较好。分析，引物和探针特异性较好。

二、引物及二、引物及 TaqmanTaqman 探针的设计探针的设计44 、、 TaqmanTaqman 探针及引物合成时注意事项探针及引物合成时注意事项（（ 11 ）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；（（ 22 ）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCRPCR ，电泳检测，电泳检测 PCRPCR 产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异异

性扩增情况，必要时进行性扩增情况，必要时进行 PCRPCR 产物的测序验证；产物的测序验证；（（ 33 ）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以外的损失；外的损失；（（ 44 ）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，）、探针合成好后，先检测一下探针的质量， 250nm250nm 的探针终浓度，的探针终浓度， 25ul25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量 PCRPCR 仪上检测，仪上检测， 95℃95℃ ，， 2min; 95℃2min; 95℃ ，， 20s20s ，， 60℃60℃ ，， 20s20s ，， 4040 个个 cyclescycles ；看；看

荧光本底和荧光本底和荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着 PCRPCR 反应，荧反应，荧光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量较差，建议重新合成。较差，建议重新合成。

三、内参基因的选择三、内参基因的选择11 、理想的内参基因具有的特点、理想的内参基因具有的特点（（ 11 ）、不存在假基因；）、不存在假基因；（（ 22 ）、高度或中度表达，排除太高或低表达）、高度或中度表达，排除太高或低表达（（ 33 ）、稳定表达于不同类型的细胞和组织）、稳定表达于不同类型的细胞和组织 (( 如正常细胞和癌细胞如正常细胞和癌细胞 )) ，而且，而且

其其表达量是近似的，无显著性差别；表达量是近似的，无显著性差别；（（ 44 ）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；（（ 55 ）、其稳定的表达水平与目标基因相似；）、其稳定的表达水平与目标基因相似；（（ 66 ）、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的）、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。影响。理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都会有所差异，会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论。一方面可能引致错误甚至相反的结论。

三、内参基因的选择三、内参基因的选择22 、常用内参基因的表达情况、常用内参基因的表达情况（（ 11 ）、）、 GAPDHGAPDH

GAPDH mRNAGAPDH mRNA 在不同癌组织在不同癌组织 (( 包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等 )) 中中的表达的表达

升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变化。在各种因素化。在各种因素 (( 例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子

等等 ))

刺激下，培养细胞刺激下，培养细胞 GAPDH mRNAGAPDH mRNA 的表达水平也不同。的表达水平也不同。

（（ 22 ）、）、 β-actinβ-actin 当细胞向恶性转化时，当细胞向恶性转化时， β-actin mRNAβ-actin mRNA 的表达水平增加。的表达水平增加。（（ 33 ）、）、 18srRNA18srRNA

当细胞有丝分裂时，当细胞有丝分裂时， 18srRNA18srRNA 表达量显著上调。表达量显著上调。

三、内参基因的选择三、内参基因的选择33 、内参基因的选择策略、内参基因的选择策略根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量荧光定量 PCRPCR ，先以，先以 CTCT 值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因

与其与其相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。表达稳定，适合作为理想的内参。也可用也可用 geNormgeNorm 内参分析软件来选择合适的内参基因。内参分析软件来选择合适的内参基因。对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。

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四、反应体系的优化四、反应体系的优化11 、为什么要优化反应体系、为什么要优化反应体系与普通与普通 PCRPCR 反应相比，荧光定量反应相比，荧光定量 PCRPCR 在反应中加入了荧光物质，用以在反应中加入了荧光物质，用以

实实时显示反应的进程，时显示反应的进程， TaqmanTaqman 探针法在普通探针法在普通 PCRPCR 反应体系中加入了与扩增反应体系中加入了与扩增片段片段

互补的一段带荧光标记的核酸序列，互补的一段带荧光标记的核酸序列， TaqTaq 酶除了酶除了 55’’-3-3’’聚合酶作用之外，聚合酶作用之外，还要还要

发挥发挥 5′-3′5′-3′ 外切酶的活性来水解探针链来产生荧光；外切酶的活性来水解探针链来产生荧光； SybrGreenSybrGreen 法加入法加入了了

能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响 TaqTaq 酶的活性进而酶的活性进而影影

响响 PCRPCR 的反应效率。的反应效率。

普通普通 PCRPCR 反应体系反应体系模板模板引物引物 TaqTaq酶酶 BufferBuffer Mg2Mg2＋＋水水

定量 PCR反应体系模板模板引物引物荧光基团荧光基团 TaqTaq酶酶 BufferBuffer Mg2Mg2＋＋水水

四、反应体系的优化四、反应体系的优化11 、为什么要优化反应体系、为什么要优化反应体系

普通 PCR结果电泳图添加荧光基团后 PCR结果电泳图

四、反应体系的优化四、反应体系的优化22 、如何优化、如何优化由上图可知，添加荧光基团后，由上图可知，添加荧光基团后， PCRPCR 的反应效率几乎为的反应效率几乎为 00 ，所以必须，所以必须

对对荧光定量荧光定量 PCRPCR 反应体系进行优化，对体系中各个反应成分的浓度进行调整。反应体系进行优化，对体系中各个反应成分的浓度进行调整。其中最关键的因素其中最关键的因素：： Mg2Mg2 ＋＋浓度浓度、、荧光基团浓度、引物浓度荧光基团浓度、引物浓度

对于对于 SYBR GreenSYBR GreenⅠⅠ荧光染料定量荧光染料定量 PCRPCR 反应体系来说，反应体系来说， Mg2Mg2 ＋＋的的最佳浓度最佳浓度

为为 3.0-4.0mM3.0-4.0mM ；；

对于对于 TaqmanTaqman 探针反应体系来说，探针反应体系来说， Mg2Mg2 ＋＋的最佳浓度为的最佳浓度为 5.0mM5.0mM 左左右，引物右，引物

最佳浓度为最佳浓度为 500nM500nM ，探针的最佳浓度为，探针的最佳浓度为 250nM250nM 。。

四、反应体系的优化四、反应体系的优化22 、如何优化、如何优化

SYBR GreenⅠSYBR GreenⅠ 反应体系中反应体系中 Mg2Mg2＋浓度梯度优化＋浓度梯度优化 PCRPCR 电泳结果电泳结果

四、反应体系的优化四、反应体系的优化22 、如何优化、如何优化

优化后的 Taqman探针体系实验结果， Mg2Mg2＋浓度为＋浓度为5.0mM5.0mM 左右，引物浓度为左右，引物浓度为 500nM500nM ，探针浓度为，探针浓度为 250nM250nM 。。

四、反应体系的优化四、反应体系的优化33 、自行配制荧光定量、自行配制荧光定量 PCRPCR 试剂试剂

（（ 11 ）、常用的）、常用的 SYBR GreenSYBR GreenⅠⅠ预混酶预混酶（（ 2X2X ）） HotStar TaqE HotStar TaqE ＋＋ Buffer Buffer ＋＋ Mg2Mg2

其中其中 Mg2Mg2 ＋浓度为＋浓度为 66 ～～ 7mM7mM

（（ 22 ）、常用的）、常用的 TaqmanTaqman 预混酶（预混酶（ 2X2X ）） TaqE TaqE ＋＋ Buffer Buffer ＋＋ Mg2Mg2

其中其中 Mg2Mg2 ＋浓度为＋浓度为 10mM10mM

五、实验方案的选择五、实验方案的选择定量 PCR实验方案

定量 PCR实验方案

荧光染料法

Taqman探针法双标准曲线法

2 -△△CT2 -△△CT 法法

双标准曲线法

2 -△△CT2 -△△CT 法法

五、实验方案的选择五、实验方案的选择定量 PCR实验方案

（（ 11 ）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（（ 22 ）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测 (( 精确度可达几十个拷精确度可达几十个拷

贝贝 ))

及基因表达变化的精确分析（精确度可达及基因表达变化的精确分析（精确度可达 0.10.1倍的变化）。倍的变化）。（（ 33 ）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求较高的实验。较高的实验。（（ 44 ）、）、 2 -△△CT2 -△△CT法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基因种类相对较多的实验。因种类相对较多的实验。根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、经费情况等来选择合适的实验方案。经费情况等来选择合适的实验方案。

六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范11 、误差分析、误差分析（（ 11 ）、实验方案本身的误差）、实验方案本身的误差荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差； 2 -△△CT2 -△△CT 法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起误差；误差； TaqmanTaqman 探针法误差相对较小；探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小。双标准曲线法误差相对较小。（（ 22 ）、仪器设备引起的误差）、仪器设备引起的误差测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的浓度）；浓度）；定量定量 PCRPCR 仪的误差仪的误差耗材引起的误差，耗材引起的误差， 9696 空板封口膜透光性的差异等空板封口膜透光性的差异等

六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范11 、误差分析、误差分析（（ 33 ）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差（（ 44 ）、操作引起的误差）、操作引起的误差样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误差。差。

22 、操作规范、操作规范荧光定量荧光定量 PCRPCR 是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一

项项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。（（ 11 ）、样品的处理及选取）、样品的处理及选取处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完全被小白鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。

六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范22 、操作规范、操作规范（（ 22 ）、核酸提取）、核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量， RNA OD260/280RNA OD260/280 ＝＝ 2.02.0 左右，左右， DNA OD260/280DNA OD260/280 ＝＝ 1.81.8 左右，最好再做电泳检测；同一样左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取品要提取 22 到到 33 个个 RNARNA ，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（（ 33 ）、得到的）、得到的 RNARNA立即反转录为立即反转录为 cDNAcDNA ，， RNARNA 样品最好不要存放，反转录样品最好不要存放，反转录

所得所得 cDNAcDNA 要用看家基因检测。要用看家基因检测。（（ 44 ）、对于精度要求较高的定量）、对于精度要求较高的定量 PCRPCR ，最好先在样品的所有组织类型内做，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（（ 55 ）、做定量）、做定量 PCRPCR 时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到 PCRPCR管管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。（（ 66 ）、体系中最好掺入）、体系中最好掺入 ROXROX 参比荧光，消除光程差和加样的偏差。参比荧光，消除光程差和加样的偏差。

六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范22 、操作规范、操作规范（（ 77 ）、重复操作）、重复操作让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品 RNARNA 时时就重复，同一个样品，分别提取就重复，同一个样品，分别提取 33 份份 RNARNA ，， 33 份份 RNARNA 都做反转录，所都做反转录，所得的得的 33 份份 cDNAcDNA 都做定量都做定量 PCRPCR 检测，这样的重复之所以最有意义是因检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把为我们是把 RNARNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一的平均值要比只在上机检测时对同一 cDNAcDNA 样品做三个重复要有意义样品做三个重复要有意义的多。的多。同一个同一个 cDNAcDNA 样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时

的的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。检测出来。

六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范22 、操作规范、操作规范

同一 cDNA样品的三个重复

六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范

模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的在扩增曲线上的 CTCT 值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品 CTCT 值明显提值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。

七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控11 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 实验中污染源的分析实验中污染源的分析（（ 11 ）、）、 PCRPCR 产物引起的污染产物引起的污染在检测过程中，荧光定量在检测过程中，荧光定量 PCRPCR 产物都是封闭在产物都是封闭在 PCRPCR管中的，不存在开管中的，不存在开管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量 PCRPCR

产物时引起的污染，只要将电泳室与产物时引起的污染，只要将电泳室与 PCRPCR 加样室隔离开，就能有效加样室隔离开，就能有效的避免的避免 PCRPCR 产物的污染。产物的污染。（（ 22 ）、标准品引起的污染）、标准品引起的污染常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的 PCRPCR 产物等，由于产物等，由于标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，有可能引起污染。有可能引起污染。（（ 33 ）、高浓度的样品引起的污染）、高浓度的样品引起的污染高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。

七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控22 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 实验中污染的防控实验中污染的防控（（ 11 ）、对于）、对于 PCRPCR 产物引起的污染产物引起的污染最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用 dUdU 代替代替 dTdT配合配合 UNGUNG酶酶，，是解决是解决 PCRPCR 产物污染的有效办法，但是成本较高。产物污染的有效办法，但是成本较高。（（ 22 ）、对于标准品引起的污染）、对于标准品引起的污染目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操作台隔离开。作台隔离开。（（ 33 ）、对于样品间的检查污染）、对于样品间的检查污染样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶胶，因为样品的胶，因为样品的 cDNAcDNA链较长，经常开紫外灯，把长链链较长，经常开紫外灯，把长链 cDNAcDNA打断，打断，

能能有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止此类污染。此类污染。

七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控22 、荧光定量、荧光定量 PCRPCR 实验中污染的防控实验中污染的防控（（ 44 ）、对于未知污染源的顽固的污染的防控）、对于未知污染源的顽固的污染的防控这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。

七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控

图中最后一个样品为阴性对照，本来应该图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号


电泳结果显示，该阴性对照确实有电泳结果显示，该阴性对照确实有 PCRPCR 产物出现产物出现


通过定量 PCR检测，测得该阴性样品中含有 227个初始模板。假如这个污染属于是顽固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去 227，来避免污染引起的误差

八、实验结果的分析八、实验结果的分析实验结束后将得到的结果进行分析，现在很多软件都带有结果的自动实验结束后将得到的结果进行分析，现在很多软件都带有结果的自动

分分析功能，可以将结果直接转化为各种图表及柱状图。对于和实验预期偏离析功能，可以将结果直接转化为各种图表及柱状图。对于和实验预期偏离比较大的样品，需重复实验。比较大的样品，需重复实验。

谢谢！

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荧光定量 pcr 技术讲座

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