בדיקת פיזור רצפי בדיקת פיזור רצפי RNAiRNAi בגנום של בגנום של c-c-

eleganselegansאודי חוזהאודי חוזה

יאיר ארנפרוינדיאיר ארנפרוינדמנחה: ד"ר רון מנחה: ד"ר רון

אונגראונגר

תופעה שבה שרשראות קטנות תופעה שבה שרשראות קטנות siRNA siRNA הנקראות הנקראות RNARNAשל של

(small interfering RNA)(small interfering RNA) מדכאות התבטאות של חלבון מדכאות התבטאות של חלבון

mRNAmRNAמסוים ע"י דגרדציה של מסוים ע"י דגרדציה של מתאיםמתאים

siRNA

RNAiRNAiגילוי ה גילוי ה

Richלפני יותר מעשור, התגלה ע"י החוקר Jorgensen , שכאשר מנסים להזריק לפטוניות

גן לפיגמנט שיוצר צבע סגול תחת פרומוטור חזק, על מנת להגביר את הצבע הסגול, מתקבל במקום צבע סגול חזק, צבעים

מגוונים ואפילו צבע לבן.י כך הסיקו שהחדרת הגן לפיגמנט סגול " ע

שהומולוגי לגן המקורי גורם לחוסר ביטוי של הגן המוזרק + להשתקה של הגן המקורי.

המנגנון כונה המנגנון כונה RNAiRNAi

פריצת הדרך. התגלה ע"י פריצת הדרך. התגלה ע"י : : 19981998 שהזרקת שהזרקת FIRE &MELLOFIRE &MELLOהחוקרים החוקרים

dsRNAdsRNA גורמת ג"כ לסופרסיה בביטוי גורמת ג"כ לסופרסיה בביטויגנים שמכילים רצפים הומולוגים גנים שמכילים רצפים הומולוגים

. . dsRNAdsRNAלאותם לאותם

הסופרסיה הזו יעילה בהרבה הסופרסיה הזו יעילה בהרבה בודד. בודד. strandstrandי י ""מסופרסיה שנעשית עמסופרסיה שנעשית ע

RNAiRNAiגילוי ה גילוי ה

RISC

AAAGUCUAGAGUCGAUGA

UUUCAGAUCUCAGCUACUAC

G

UGC

CGACAAACGAUUUCAGAUCUCAGCUACUUCCGAACAGUGCAUGGCC

CGAUA

20-25nt

mRNA

RNA- stem-loop-stem

degradation

Free to go

מכניזם הפעולה של RNAi

ACG

UGC

Consists of Two RNA binding

proteins and a nuclease

nicknamed as Slicer

RNAiRNAiמאפייני ה מאפייני ה

ספציפיות לרצף מסויים בגנום שהומולוגי •לו.

interference פוטנטי מאד )כדי לגרום ל • בתא(.dsRNAדרושות רק מעט מול' של

קיים רק באיאוקריוטים • שמפרק RNaseIII)בפרוקריוטים יש

dsRNA.)

המשךהמשך - -RNAiRNAiמאפייני ה מאפייני ה

יכול לגרום לאינאקטיבציה של גנים גם •מחוץ לרקמה שבה הוא נמצא.

יכול לחצות קרומי תא. •

יכול לעבור מדור לדור.•

מטרת מנגנון ההשתקה:מטרת מנגנון ההשתקה:

משמש להתגוננות של האורגניזם מפני • זיהומים או וירוסים.

מונע פעילות של טרנספוזונים.•

מנגנון ההשתקה פועל כאשר מוחדרים •לתא טרנסגנים מסויימים, במעבדה.

מחקרים רבים מרמזים על כך שמרכיבים •שונים במנגנון ההשתקה שפועל באמצעות

RNAi מתפקדים ברגולציה על ביטוי גנים שונים בתאים של אורגניזמים.

בגנום בגנוםRNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש

, מורכב מהגן שאותו RNAiמנגנון של • dsRNAמבקשים להשתיק, ומ-

שבעזרתו נשתיק את הגן.

בגנום, יש RNAi ע"מ למצוא הבעיה:למצוא רצף מסוים ולוודא שיש לו רצף

משלים בקרבתו ע"מ שיוכלו ליצור . כיצד hairpinביחד את מבנה ה

נעשה זאת?

בגנום בגנוםRNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש

CCGAAAGUCUAGAGUC

ACGGGCUUUCAGAUCUC

AGUGC GCACUGAGAUCUGAAAGC

CUGA…CGA

dsRNA במבנה hairpin

הוא בעצם hairpin הרצף היוצר את ה •פלינדרום ביולוגי

בגנום בגנוםRNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש

…GTCTAGAGTCGATGAACGACT….GCTCGTTCATCGACTCTA

GAC…

אותו המקום ב DNA

…CAGATCTCAGCTACTTGCTGA….CGAGCAAGTAGCTGAGATC

TG…sens

e

antisense

זהה בדיוק antisense ניתן לראות שרצף ה • אך הפוך! senseלרצף ה

כלומר, אם נפתח את הדו-גדיל נקבל •את אותו הרצף פעמיים !!

כעת אם נמצא הופעה נוספת של אחד הרצפים בגן ידוע-נוכל להגיד שמצאנו מועמד פוטנציאלי לשמש

RNAi

RNAiRNAiאיך נחפש איך נחפש בגנום-סיכוםבגנום-סיכום

הופעות 3 נחפש DNAלאחר שנפתח את ה •זהות של אותו הרצף.

לפחות אחד ההופעות חייב להיות בגן •(, והשניים האחרים צריכים targetידוע )

אחד מהשני 5-500bpלהיות במרחק של .hairpinכך שיוכלו ליצור מבנה

אין חשיבות למיקומם בגנום-הם יכולים •להופיע גם במקומות חסרי חשיבות

. UTR, כגון אינטרונים או לכאורה

Suffix Suffix חיפוש בעזרת חיפוש בעזרת arrayarray

SS==AATTCCAACCAATTCCAATTCCAAii112233445566778899101011111212AA121244991166111133885510102277

סיבוכיות:

:quick sort במיון suffix arrayבניית ה •O)nlogn( • מיון אלפבתי של האינדקסים נעשה לפי אורך

.20bpמחרוזת של

אינדקסים של מחרוזות זהות בהכרח יופיעו אחד •השני ליד

suffix arraysuffix arrayחיפוש ב חיפוש ב

, נחלק את suffix arrayלאחר בניית ה •המערך לקבוצות של אינדקסים זהים.

ההתאמות עד אורך ננסה להרחיב את •לגודל המקס' האפשרי, ע"מ שלא לאבד

מידע ולמנוע כפילות מידע.

סינון המידעסינון המידעבכל קבוצת אינדקסים זהים נחפש לפחות

stem-loopזוג אחד שיכול ליצור מבנה של .

כלומר שעבור אחד האינדקסים נמצא התאמה בצד הכרומוזום ההפוך, שתהיה

… …5-500bp. …GGCTTTGA….CGAAAGCCבמרחק GGCTTTCG….TCAAAGCC…

Sense

Antisense

קבוצה שאין בה זוג כזה, אינה רלוונטית עבורנו ותסונן!

עיבוד המידעעיבוד המידעלאחר הסינון, נתייג כל רצף שמצאנו לפי

מיקומו בגנום: 5UTR /3UTR /intergenicאקסון/ אינטרון/

יהיו Targetsלכאורה, היינו מצפים שכל ה יהיו באיזורים שלא stem-loopsבאקסונים, וה –

intergenicמקודדים לחלבון כמו אינטרונים או regions.

שכבר נמצאו, מסתבר RNAi ממקרים של -אבל דוקא נמצאים במקרים רבים ב- Targetsשה-

3UTR !

– Targetעבור כל • מתאימים לו.stemsנבדוק אילו

עיבוד המידע מתבצע בשתי גישות:

עיבוד המידעעיבוד המידע

כעת, בעזרת כלים סטטיסטים ננתח את stems וה Targetsהתפלגות מיקומי ה C.elegansבגנום של

- stemעבור כל • מתאימים לו.Targets נבדוק אילו

The endתודה רבה ל:

ד"ר רון אונגר

יאיר חורש

תרצה דוניגר