新的里程碑： talen 靶向基因敲除
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新的里程碑： TALEN 靶向基因敲除. 北京康为世纪生物技术有限公司. 北京康为世纪生物科技有限公司. 王春香 博士 执行董事兼总经理 北京大学生物系学士和硕士学位 美国加州大学洛杉矶分校（ UCLA ）病理系博士学位。 1999 年回国 2002 年创办北京天为时代科技有限公司 2005 年被 QIAGEN 收购 - 天根 2007 年底创建康为世纪 目标：成为中国的 Invitrogen. 北京康为世纪生物科技有限公司. 完善的产品线. 一站式服务平台. 实验设计平台 分子生物学平台 蛋白表达与纯化 平台 抗体制备纯化平台 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
新的里程碑：TALEN靶向基因敲除
北京康为世纪生物技术有限公司
王春香 博士 执行董事兼总经理
• 北京大学生物系学士和硕士学位• 美国加州大学洛杉矶分校（ UCLA ）病理系博士学位。
• 1999年回国 • 2002年创办北京天为时代科技有限公司
• 2005年被 QIAGEN收购 - 天根• 2007年底创建康为世纪• 目标：成为中国的 Invitrogen
北京康为世纪生物科技有限公司
康为世纪生物科技有限公司
完善的产品线
分子生物学 全系列产品
蛋白生物学产品
免疫学相关产品
一站式服务平台
实验设计平台
分子生物学平台
蛋白表达与纯化 平台
抗体制备纯化平台
免疫学检测平台
北京康为世纪生物科技有限公司
我们的客户我们的合作伙伴
北京大学、清华大学、 复旦大学中国科学院、军事医学 科学院301 医院、协和医院、 上海瑞金医院华大基因、诺华制药
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崭新的技术 - TALEN
经典的挑战 - 基因敲除（ Knockout ）
什么是基因敲除 - 通过某种方法将一个特定的目标基因破坏，使其失去原有的功能。
为什么要做基因敲除 - 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一。
寻找、证明一个基因的功能都需要哪些步骤？
崭新的技术解决经典的挑战
科研论证基本法则
科霍法则 （ Koch‘s postulates ）
如何证明某种微生物导致了某种疾病？
• 该种微生物存在与患病个体而不存在于健康个体。
• 该种微生物可从患病个体上分离出来并体外培养。
• 当把该种微生物接种入健康个体体内时可使健康个体患病。
• 从人为接种的患病个体中又可分离得到该种微生物。
Robert Koch
1843 – 1910
科研论证基本法则
Falkow的分子科霍法则（ Falkow’s molecular Koch‘s postulates）
如何证明一个基因编码一种毒力因子？
• 该基因存在于毒力菌株，而不存在于无毒菌株。• 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。• 当该基因被补回（敲除）突变菌株时毒力得到恢复。
Reverse genetics
• 基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节
• 基因敲除是基因工程和基因治疗的重要手段
为什么要做基因敲除？
怎样做基因敲除？
• 经典方法 ：自杀质粒，同源重组 – 几率低 (~1 HR event per 106 cells），难！
• 革命性的进步： RNAi – 临时性，不完全敲除 – Knockdown
• 饱含希望与失望的技术： ZFN
• 新的里程碑： TALEN
TALEN技术原理
基于 TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，其本质是一个转录调控因子，主要有两个重要的结构域：特异性识别靶核酸序列的靶点识别域，切断 DNA序列的核酸酶功能结构域。
靶点识别结构域的组成•17 -18 个 34aa重复序列•34aa中的第 12 和 13个氨基酸（ Repeat Variant Di-residue, RVD)
对应识别一个目标碱基
靶向敲除靶向敲除
TALEN发展过程
• 1989年，植物病原体黄单胞菌属 （ Xanthomonas spp. ） avrBs3 基 因被克隆。
• 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 - TA
• 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
2011 年 8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用 TALEN 技术进行基因敲除的 4篇研究文章，另加一篇综述。• 一篇人类干细胞
《 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 》
• 一篇大鼠
《 Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 》
• 两篇斑马鱼
《 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
《 Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 》
• 一篇综述《 Move over ZFN 》
TALEN的最前沿
TALEN基因敲除基本流程
1. 确定靶点：选择目标基因外显子中相隔 17-18bp的两段 14-18bp序列作为靶点
2. TAL靶点识别域的克隆构建
3. 将 TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体以表达重组核酸酶
4. 将重组真核表达质粒转入（卵）细胞
5. 筛选突变体
• TAL的核酸识别单元为 34aa模块中的双连氨基酸（ RVD）
• RVD 与A 、 G 、 C 、 T有恒定的对应关系，即 NI识别 A ， NG识别 T，HD识别 C ， NN识别 G ，非常简单明确
• 欲使 TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应 TAL单元（ 14 -18个）串联克隆即可。
构建 TAL靶点识别域
具专利保护的克隆构建系统
具专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
步骤二： TALEN表达质粒构建
具专利保护的克隆构建系统
FokITAL 靶点识别模块 FokIFokITAL 靶点识别模块
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到 Talen 质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有 TAL的其它必需结构域并在 C端融合有 FokI序列。
目前， TALEN系统利用 FokI的内切酶活性打断目标基因。因 FokI需形成 2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔 17碱基）的靶序列（ 14 - 18个碱基）分别进行 TAL识别模块构建。
X 2
真核表达 TALEN质粒对
步骤三 . 将 TALEN 质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除
TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其 DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个 TALEN融合蛋白中的 FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。
FOKI 内切酶打断靶点区
内切酶的切割诱发 DNA损伤修复机制（ nonhomologous end-joining ， NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。
突变体形成
突变体筛选
MutMut
利用实验设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，可进行 PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用 CEL-I核酸酶检测
TALEN介导的同源重组
同源重组发生率升高几个数量级 Donor plasmid
HR
锌指蛋白核酸酶（ ZFN） 基因敲除
• 约 30aa模块，在锌离子帮助下形成“ ββα”结构。其中构成 alpha螺旋的 6aa可特异识别 3连碱基
• 不是任意三连碱基组合都有对应模块 – 靶点选择受限
• ‘上下文效应’（ context effect ） - 模块单元对 3连碱基的识别特异性受相邻模块影响 - 模块串联构建方法基本不实用
• 通常用 3 – 4个模块构成靶点识别域
• Off-targeting现象严重
ZFN
off-targeting
原因
基本工具质粒
14 – 18bp靶点序列
怎样做 TALEN
• 1单元模块质粒： A ， G ， C, T 共 4种• 2单元模块质粒： 4X4=16种• TALEN表达载体： 2种
怎样做 TALEN
TALEN定制质粒产品
1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择2单元模块质粒 共 16种选择pCS2 TALEN真核表达载体
TALEN空载体 2 种 /套
1+2单元模块质粒套装
4+16+2 共 22种质粒 /套
多单元模块质粒 20以下任意单元数目pCS2 TALEN真核表达质粒
将指定 TALEN模块插入 pCS2 TALEN真核表达载体
怎样做 TALEN
TALEN技术服务
TALEN质粒构建
提供两个测序证明的 14碱基 TALEN识别域真核表达克隆 (pCS2)。且以 293T细胞系转染， PCR酶切鉴定，灰度扫描定量证实突变效率高于 10%
TALEN靶向敲除细胞系构建
提供经克隆测序证明的（至少单等位基因）移码突变细胞系
TALEN靶向敲除斑马鱼构建
提供（至少）单等位基因移码突变 F1斑马鱼
TALE技术应用展望• 靶向基因表达调控
• 靶向基因敲除 - NHEJ
• 靶向基因敲入 -HR– 基因治疗
例如： chemokine receptor 5 （ CCR5 ）基因
谢谢！北京康为世纪生物技术有限公司
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