利用染色質免疫沉澱定序資料研究 TR4核受體結合位

Uncovering TR4 Binding Motif using Chromatin Immuno-Precipitation Sequencing

Data專題組員 : 呂姿穎、李懿容、林佳穎、柯鈺彤

指導老師 : 董其樺老師

摘要

研究目的

孤核受體 TR4(testicular orphan nuclear receptor 4)，部分參與生物體的代謝調節、胚胎發育、細胞分化和基因表達。本專題研究接續前人的研究，利用 TR4之ChIP-seq資料，定位出 TR4在 DNA上結合的位置並加以擴充長度，再利用 MEME-ChIP軟體，找出可能的 Motif。最後我們探討TR4 binding motif與致病基因之間的關係，推論出當 TR4出現異常時，會導致人類產生何種疾病。 [1-4]

1.利用 TR4之 ChIP-seq資料定位出 TR4在 DNA上結合的位置及調控的基因2.使用 MEME ChIP軟體，找出可能的 Motif3.探討 TR4 binding motif與致病基因

研究動機 為了確定 TR4在體內的結合位置，我們將找出 TR4後端位置和Motif，就能夠更進一步了解 TR4在生物體內扮演多重要的角色。

專題進行方式 前人建立的 TR4資料庫中， TR4結合部位之 DNA序列共約 100多萬筆，其中我們只選擇位於某個基因上游的資料，共 548,514筆。接著利用 blast的快速比對，分別將這些 ChIP-seq之序列找出在人類染色體上對應的位置，之後將其結果分別依照染色體編號寫入至檔案紀錄之。接著，再使用 MEME網站輸入 ChIP-seq序列，建立出 motif。最後我們探討較具意義的 TR4 binding motif、會影響的基因及可能致病的關聯性。 [5.6]專題製作流程步驟如下圖二所示。

3.1 TR4相關資料蒐集(http://140.126.132.67/phpadmin) 根據前人的研究，所建立的 TR4資料庫，挑選所有 ChIP-seq資料中只結合在某特定基因上游的 TR4結合序列，長度皆為 32bp。總數共548,514筆。3.2　撰寫程式A) Run_blast.php:用以執行 blast，比對 TR4 ChIP-seq序列在人類基因體 GRCh37p10[7]中出現在哪個染色體上的位置。將比對結果記錄在得到 result.txt。B)Seperate-dnaseq.php:將人類基因體序列 GRCh37p10檔案透過此程式，將序列依照染色體編號區分成出多個檔案，以利下個程式的執行。C) get_dnaseq.php: 將 ChIP-seq序列 (TR4結合部位 ) 對應在基因體上的序列，延長其範圍，從 32bp擴充至 100bp(如圖三 ) 。序列結果依照染色體編號分別記錄下來。 D) 最後得到儲存在 CHIP-result資料夾裡的各個以染色體區分的檔案chrN。每個檔案裡記錄 TR4結合在該染色體上的位置，以及其長度100bp的 ChIP序列為何。

3.3 MEME網站分析 ChIP序列(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme-chip.cgi) 根據 get_dnaseq.php中所獲得 ChIP序列 (100bp)，經 Excel排序後，每個染色體裡各挑選前三十名 TR4影響最多的基因，每筆基因蒐集TR4結合序列成 FASTA格式，再利用 MEME網頁工具分析，建立成無間隔的序列 motif。 依照 motif的統計數據及出現次數，挑選出合適的結果。挑選的標準為 : 統計數據 E-value小於 10-50 、出現次數大於 10次。最後討論 TR4蛋白質結合 motif和可能影響之下游的致病基因。

圖二、專題步驟流程圖

圖三、 TR4結合部位擴展示意圖

圖一、孤核受體 TR4結合 DNA示意圖

主要成果

3.4 疾病探討我們透過以下兩個網頁搜尋疾病名稱，協助我們了解致病基因及相關知識。A) 衛生福利部國民健康署　 (http://gene.hpa.gov.tw/index.php?mo=DiseasePaper&action=paper1_cate&cate=Set1)

B) 疾病資料庫 --罕見遺傳疾病一點通(http://www.genes-at-taiwan.com.tw/genehelp/dbIndex.asp)

　根據結果觀察，我們發現多個 TR4作用位置之序列呈現高度保留性，可被MEME-ChIP網站偵測出 motif。而這些 motife又與特定的罕見疾病有關。以下我們針對其中統計數據與出現次數較顯著的 motif以及影響下游重要的致病基因作結果討論。

A) LRPPRC: TR4可能調控此基因。此致病基因若發生基因異常，則會導致 Leigh症候群 (Leigh Syndrome,LS)的產生。根據我們的發現，這種 TR4結合位置，可能呈現的 motif型樣有兩種。 AGAGTTCTCGGTATTTTTACTAGTTGGCC以及 C[CT](2)T[CG]C[CG][AC]C[GA] [TA]CCTGGGA（如圖四）。

圖四、 Leigh Syndrome,LS MEME-ChIP Motif Overview。可能的 motif共兩種。B) PALB2:TR4的調控在該基因上游

若產生異常，將可能導致胰臟癌的發生(Fanconi anemia, complementation group N)。胰臟癌是一種「高度惡性的疾病」 , 有90%的病人無法以手術根除治療。死亡率極高，此疾病是在美國是排名第四大癌症。在我們的研究結果中顯示，其可能的 motif為 A[GC]TC[TA]T[TC][CG]A[GC]AG [AC][TG][TC][CG][CG][GC][GT]CT[AC]CTT[CT][CA]GGC、 CTCCTCCACTTCCGC TCCAGGTGGCCCACT(如圖五 ) 。

圖五、 Fanconi anemia, complementation group N MEME-ChIP Motif Overview。可能的 motif型樣共兩種。 C) SRP72: 此基因也可能受到 TR4

結合異常時而致病，其基因會導致骨髓造血缺陷 (Bone marrow failure, familial)。此遺傳疾病又稱「再生障礙貧血症」，其中一個引起的因素是先天性體質。根據我們的推測， TR4與此基因的上游位置結合，可能會調控此基因。若 TR4有先天性的異常，亦可能導致此疾病的發生。結果發現，此 TR4結合部位共有兩種可能的 motif:( 如圖六 ) GGCTGAAGACACTCCCAACTCGGCGACGCT 、 TAGCAATCATCGACTTCCTCCTCCTCTTGG

圖六、 Bone marrow failure, familial MEME-ChIP Motif Overview。可能的 motif型樣共兩種

評估與展望　 除了前文所舉的例子之外，我們找出五個以上的致病基因，皆有 TR4在其

上游結合。根據我們的推測，這些致病基因產生異常後，會導致罕見疾病，有部分原因可能正是 TR4的調控出現。我們認為人類致病基因與 TR4調控變異是有相關的，並且找出 TR4結合部位的 motif。未來可以利用這些 motif進一步去搜尋基因體是否有其他位置符合這些 motif，進而深入了解這些遺傳疾病的發生原因，也了解 TR4的重要性。結語

　根據前人建立的 TR4資料庫，我們將 ChIP-seq資料中只結合在某特定基因上游的 TR4序列 32bp長度擴充至 100bp。本專題透過 PHP程式撰寫，定位出 TR4在 DNA上結合的位置及調控的基因，再進一步的探討 TR4異常時導致人類產生何種疾病，在這 548,514筆序列裡，我們找到五個以上罕見疾病可能與 TR4調控有關。銘謝

　製作專題期間，在董老師耐心指導下，使我們學會了 MEME-ChIP的使用。在製作過程中，有問題也有耐心的考驗，組員之間的互相互助，董老師總是耐心的教導著我們每一個步驟的重要，且指導我們如何學會使用軟體的方便與功能性。因為大家的高度互動，提升了彼此之間的感情，使我們在專題期間，有問題共同解決且不拖延任何一點能夠利用的時間，在專題裡不僅僅學到了本科系專業知識，也學到了團體之間的相處及互助。參考文獻

1. Du, L., et al., Evidence for orphan nuclear receptor TR4 in the etiology of Cushing disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(21): p. 8555-60.2. Hwang, S.B., J.P. Burbach, and C. Chang, TR4 orphan receptor crosstalks to chicken ovalbumin upstream protein-transcription factor and thyroid hormone receptor to induce the transcriptional activity of the human immunodeficiency virus type 1 long-terminal repeat. Endocrine, 1998. 8(2): p. 169-75.3. Lee, Y.F., et al., Identification of direct repeat 4 as a positive regulatory element for the human TR4 orphan receptor. A modulator for the thyroid hormone target genes. J Biol Chem, 1997. 272(18): p. 12215-20.4. O'Geen, H., et al., Genome-wide binding of the orphan nuclear receptor TR4 suggests its general role in fundamental biological processes. BMC Genomics, 2010. 11: p. 689.5. Viens, A., et al., Use of protein biotinylation in vivo for chromatin immunoprecipitation. Anal Biochem, 2004. 325(1): p. 68-76.6. 紀郁祥 , 曾景宏 , 陳敬凱 , Discovering TR4 Nuclear Receptor Binding Information from ChIP-seq Data. 2012年第七屆專題成果報告 , 2012: p. 1-6.7. Genome Reference Consortium Human Build 37 patch release 10 (GRCh37.p10). 2012/08/31]; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.22/.

中華大學生物資訊學系系統開發專題報告專題編號： PROJ2013-BIOINFO-9907