群馬大学・大学院理工学府・准教授

科学研究費助成事業　　研究成果報告書

様　式　Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９ （共通）

機関番号：

研究種目：

課題番号：

研究課題名（和文）

研究代表者

研究課題名（英文）

交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

１２３０１

基盤研究(C)（一般）

2017～2015

バイオルミネッセンスの色決定機構における化学反応ダイナミックス

Study on chemical reaction dynamics in the color determination mechanism in bioluminescence

９０３９９３１１研究者番号：

樋山　みやび（Hiyama, Miyabi）

研究期間：

１５Ｋ０５３７９

平成 年 月 日現在３０ ６ １３

円 3,800,000

研究成果の概要（和文）：従来法によりオキシルシフェリンの吸収・蛍光スペクトルにおける振電相互作用の解析を行い、ケト型のみに特異な水和の影響を見つけた。同時に、この影響は従来法では解析できず、理論計算における水和の扱いは非常に難しいことが明確になった。生物発光のタンパク質酵素は水溶液中で働くことから、まず水和の問題を解決する必要があった。水和問題に対応するため第一原理分子動力学計算を実施し、ケト型のみにみられる特異な水和の影響はその疎水的な水和構造に起因することを突き止めた。この計算に基づく理論吸収スペクトルでは、実験とよく一致し、「化学種の疎水性の影響がスペクトル形状に現れる」という、新しい関係性を見つけた。

研究成果の概要（英文）：We elucidated the vibronic effect on the absorption and fluorescence spectra of the oxyluciferin and its conjugate bases. While the energies of the excited states were calculated with the time-dependent density functional theory, the solvent effect was incorporated using the polarized continuum model. Then, the effects of hydrogen bonding interactions were clarified through a theoretical study on the stability of the oxyluciferin anions with explicit water molecules using the first-principles molecular dynamics (FPMD) simulations. These simulations showed that enol type is more stable than keto type because of the unique features of the static and dynamical hydration structures. The absorption spectra of aqueous oxyluciferin anions were derived using the structures obtained from the FPMD simulations at room temperature for each isomeric form, in order to account for the effects of vibrations of oxyluciferin anions and dynamical fluctuations of their hydration structures.

研究分野： 物理化学

キーワード： ホタル生物発光　オキシルシフェリン　水和　量子化学計算　分子動力学計算

２版

様 式 Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９、ＣＫ－１９（共通）

１．研究開始当初の背景 バイオルミネッセンスは、バクテリア、藻、

キノコ、魚、イカ、エビ、昆虫等で観測されている。昆虫では、ホタル、鉄道虫、ヒカリコメツキムシなどがある。これらは光吸収や電子衝突等のようにあらわに外部からエネルギーが供給されることなく、化学反応により発光する興味深い現象である。この反応は、ルシフェラーゼタンパク質酵素中でアデノシン三リン酸(ATP)・Mg2+・ルシフェリン・02からオキシルシフェリンが生成・発光する。その反応過程は図 1に示すように中間体を経由しておき、「ルシフェリンールシフェラーゼ反応」と呼ばれる。タンパク質酵素の違いにより発光色が異なることから、反応経路はタンパク質酵素から影響をうけており、この点がホタル生物発光における発光色決定機構の本質であると考えられる。

ルシフェリンールシフェラーゼ反応ダイ

ナミックスを調べるためには、その基礎となるデータとして、反応物であるルシフェリンと発光体であるオキシルシフェリンの構造を知る必要がある。これまでルシフェリンの電子状態については理論・実験研究から明らかになった。 一方で、オキシルシフェリンにはケト型と

エノール型が存在することから、生物発光に互変異性が何らかの影響を与える可能性があると考えられている。しかし、オキシルシフェリンは不安定な化合物であるため、水溶液中における吸収・蛍光実験スペクトルの研究は限られていた。 ２．研究の目的 これまでオキシルシフェリンの実験デー

タが少なかったため、計算手法の妥当性を検討することができなかった。平成２７年初頭に水溶液中のオキシルシフェリンとその共役酸・塩基に対する詳細な実験スペクトルが報告された[Ghoseetal.J.Pys.ChemB,2015]。これらの実験スペクトルと理論スペクトルを比べることで、オキシルシフェリン電子状態に対する水和の影響が明らかになると考えられる。 そこで、本研究では、まず十分な水分子の

数を考慮した計算により実際的な環境のモデル系を作成し、分子動力学計算および量子化学計算によりオキシルシフェリン電子状態に対する環境の影響を解明することを目的とした。

３．研究の方法 本研究ではタンパク質の働く標準的な pH7を仮定した。これまでの研究から、pH7の水溶液中オキシルシフェリンの吸収・蛍光スペクトルにはN原子にプロトン付加した化学種は現れないことがわかっている[Hiyamaetal.CPL2013]。そこで、図 2に示す6種類のオキシルシフェリンとその共役塩基に着目した。スペクトルの強度を与える遷移双極子モ

ーメントは、近似的に始状態と終状態の間のフランク・コンドン因子(FCF)に比例する。オキシルシフェリンとその共役塩基の基底状態(S0)と第一励起状態(S1)の振動波動関数 を 得 る た め 、 密 度 汎 関 数 法(CAM-B3LYP/AUG-cc-pVTZ)を用いてS0とS1状態それぞれの安定構造の振動解析を行った[主な発表論文等の雑誌論文 4]。溶媒効果は標準的な連続誘電体モデル(PCM)により取り入れた。第一原理分子動力学(FPMD)計算では、水和モデルには、オキシルシフェリンアニオンと 64 個の水分子を取り入れた。この系に対して 1ns(200 日)を超える FPMD 計算を実行した[主な発表論文等の雑誌論文 3]。水和構造は FPMD 計算により得られるスナップショットに現れるため、スナップショットごとのオキシルシフェリンアニオンの励起状態を計算することで、水和構造を取り入れた吸収スペクトルを得ることができる。そこで、FPMD 計算の結果から 1000 個のスナップショットを取り出し、スナップショットごとの水分子に対して、NaturalPopulationAnalysis(NPA)により各原子の電荷を求めた。周囲の水分子を得られた点電荷で近似し、オキシルシフェリンアニオンの励起エネルギーおよび振動子強度を、時間依存 DFT 計算cam-B3LYP/aug-cc-pVTZ計算により求めた。NPA 計算および電子励起状態計算にはGaussian09 を用いた。振動幅に影響を与えない程度に、振動子強度のラインに人為的な線幅をつけて、積算することにより、理論吸収スペクトルを得た[主な発表論文等の雑誌論文 1]。４．研究成果本研究では、６種類のオキシルシフェリン

図１：ルシフェリンールシフェラーゼ反応 conjugate acids and bases co‐exist in aqueous solution at pH 7. How-

ever, it is unclear whether protonated and/or deprotonated interme-

diate chemical species contribute to the luciferin emission process.

In previous studies,[13–19] only one chemical species is assumed for

LH‐AMP, Diox, and oxyluciferin.

Although the pKa values for chemical species can be obtained

using PCM, these theoretical values are overestimated.[23,24] The

reason for the inadequate accuracy of the theoretical pKa values for

luciferin, oxyluciferin, and their conjugate acids/bases is that hydrogen

bonding interactions are not properly incorporated into the calcula-

tions via the PCM method for evaluating a solvent effect.

Our previous theoretical studies on the correction for pKa values

overcame this problem and obtained good agreement with experimen-

tal results.[14,23–25] This correction for pKa values should be useful for

evaluating the relative free energies for the chemical reaction in aque-

ous solution. In this paper we aim to elucidate the emission process at

pH 7–9 with the correction for pKa values by considering not only

LH‐AMP, Diox, and phenolate‐keto types of oxyluciferin (Figure 1),

but also their conjugate bases.

We calculated the equilibrium structures of the chemical species

contributing to the reaction in the emission of luciferin, obtained the

potential energy profile of this reaction, and estimated the relative

free energies of the species at a pH range 7–9. The theoretical

methods and model systems employed in this study are explained

in the Experimental section. As shown in Results and Discussion,

the emission process is identified by comparison of the potential

energy profiles including the energies of intermediate chemical

species and their deprotonated chemical species. We then discuss

the energy profiles based on free‐energy changes. Finally, the main

results and conclusions of the study are summarized in the

Conclusions section.

2 | EXPERIMENTAL

The most important theoretical protocol for identifying a reaction

pathway is the estimation and comparison of total energies for the

reactant, transition state, and product.[31] In aqueous solutions, lucif-

erin exists as its carboxylate anion (LH−) at pH 7–8 and dianion (L2−)

at pH 9,[11,14,22,24] whereas oxyluciferin exists as phenolate‐keto,

phenolate‐enol, or enolate forms.[23,25] Accordingly, we identify the

emission process by comparison of the potential energy profiles,

including the energies of intermediate chemical species such as

LH‐AMP, Diox, and their deprotonated chemical species. We then

discuss the energy profiles based on free‐energy changes.

2.1 | Model systems

Figure 2 shows the chemical species in the systems at the reactant,

intermediate, and product stages for the firefly luciferin‐luciferase

reaction. A pH range of 7–9, which is a suitable condition for proteins,

is assumed. As discussed below, the chemical species that may exist in

this pH range were taken into consideration. Each system consists of

21 C atoms, 24 H atoms, 20 O atoms, seven N atoms, two S atoms,

three P atoms, and one Mg atom. To maintain as constant the number

and type of atoms, and the total electric charge of the system (−2),

H2O or H3O+ is added in each step.

The first line of Figure 2 shows the reactants in the current

reaction system, including luciferin and O2. Because the pKa value of

luciferin is 8.7,[8] it exists as LH− at pH 7–8 and the luciferin dianion

(L2−) at pH 9. The pKa values of ATP are known to be 4.0 and

6.48,[32] suggesting that no protonation occurs on the triphosphate

group of ATP at pH 7–9. Accordingly, ATP is reasonably assumed to

bind to Mg2+ in the tridentate coordination mode.

Although there are several possible structures in the tridentate

coordination mode, the α,β,γ‐Mg‐ATP anion is selected because, in

the coupling reaction of the luciferin anion with ATP, nucleophilic

addition of the carboxylate group in luciferin is most likely to take place

to the P atom in the α phosphate group (the most electropositive

among the P atoms) to yield LH‐AMP and diphosphoric acid.[2,12]

Compared with ATP itself, the ATP fragment in α,β,γ‐Mg‐ATP is highly

stabilized by electron donation toward Mg2+, such that the triphos-

phate group in ATP‐Mg is not protonated at pH 7–9.

The possible spins of O2 are singlet and triplet. Here, the reactant

system including LH− and the singlet O2 is called RaS, and that including

LH− and triplet O2 is called RaT. The reactant system including L2− and

singlet O2 is called RbS, and that including L2−and triplet O2 is called Ra

T.

As shown in Figure 1, the coupling reaction of the luciferin anion

with ATP is proposed to give luciferyl‐AMP and pyrophosphate. The

second line of Figure 2 shows the first intermediates, including

luciferyl‐AMP. As shown, LH‐AMP and its deprotonated form (pheno-

late form, L−‐AMP) are considered in our calculations because the pKa

value of LH‐AMP has not been determined. Themonoprotonated pyro-

phosphate (PPi) coordinating to Mg2+ (PPi‐MgH) at pH 7–9 is chosen

(rather than dideprotonated PPi) because the pKa values of PPi are 9.4

and 6.6.[33] Here, the first intermediate system including singlet O2

and LH‐AMP is called I1aS, that including tripletO2 and LH‐AMP is called

I1aT, that including singlet O2 and deprotonated LH‐AMP is called I1b

S,

and that including triplet O2 and deprotonated LH‐AMP is called I1bT.

The third line of Figure 2 shows the second intermediates, includ-

ing Diox, AMP, and PPi‐MgH. Because the pKa values of 5′‐AMP are

FIGURE 1 The essential chemical reaction inthe emission of luciferin

2 HIYAMA ET AL.

図２：オキシルシフェリンとその共役塩基

Oxyluciferin

4

the total amount of keto- and enol-form. The Henderson–Has-selbalch equation yields 7.27 ! 0.11 for the calculated pKa forionization of the enolic hydroxyl group.

2.8 The chemical equilibria of oxyluciferin

Analysis of the spectra of 60-MeOxyLH shows that even a three-component system can be challenging if only a single datamatrix from one experiment is analyzed. To overcome thedifficulties encountered with OxyLH2 which may exist as one ofthe six components, simultaneous analysis of 4-MeOxyLH, 5,5-DMeOxyLH, 60-MeOxyLH and OxyLH2 was performed

(Fig. 3 and 6). As mentioned above, HOxyLH was excluded fromthe analysis because both the experimental data and the single-set analysis revealed that its phenol-enol spectrum is blue-shied several nanometres relative to its counterpart in othermodel compounds. The species that were taken into account arethe phenol-enol and phenolate-enol in 4-MeOxyLH, phenol-ketoand phenolate-keto in 5,5-DMeOxyLH, phenol-enol, phenol-keto and phenol-enolate in 60-MeOxyLH, and ve out of the sixpossible species of OxyLH2. Only the phenolate-enol form of thelatter was excluded because this monoionic form should benegligible in oxyluciferin solution in view of the signicantlylower acidity of the phenol compared to the enol hydroxylgroup. This assumption is in agreement with the analysis ofOxyLH2 data which point to the existence of ve species. Thespectra and concentration proles extracted for the individualspecies are presented in Fig. 6 and Table 3. The spectra of allcomponents are broad, structureless and positioned on thewavelength scale in the following order: phenol-enol (367 nm) <phenol-keto (389 nm) < phenolate-enol (405 nm) < phenol-enolate (414 nm) < phenolate-enolate (425 nm) < phenolate-keto(486 nm). The pK values calculated from the respectiveconcentration proles of the chemical species ofOxyLH2 and itsanalogues are listed in Table 4.

3 Conclusions

In this work, we applied multivariate curve resolution simulta-neously on a set of purposefully synthesized model compoundsto disentangle the individual spectra of the chemical forms ofoxyluciferin, the emitter in rey bioluminescence, in modelbuffered aqueous solutions. For the rst time, the UV/Visspectra of the six forms of oxyluciferin in aqueous solution wereextracted from an extensive set of pH-dependent spectral

Fig. 5 Left: spectra of the three forms obtained by multi-set MCR-ALS analysis(Fig. 3) of 60-MeOxyLH, 4-MeOxyLH and 5,5-DMeOxyLH. Right: concentrationprofiles (triangles) of 60-MeOxyLH and fit to the Henderson–Hasselbalch equa-tion (solid line). The concentration profiles of 4-MeOxyLH and 5,5-DMeOxyLH(not shown) are similar to those in Fig. 4, and are given in the ESI (Fig. S4, ESI).†

Fig. 6 (A) Multi-set MCR-ALS analysis of OxyLH2 and three derivatives (4-MeOxyLH, 60-MeOxyLH and 5,5-DMeOxyLH). (B) Spectra and concentrationprofiles of the six forms of OxyLH2 obtained by multi-set MCR-ALS analysis(triangles) and fit to the Henderson–Hasselbalch equation (continuous line).

Table 3 Absorption spectroscopic characteristics of the different chemical formsof oxyluciferin obtained using multi-set MCR-ALS analysis

Oxyluciferin form lmaxabs/nm 3/(M"1 cm"1)

Phenol-enol 367 26 880Phenol-keto 389 22 800Phenolate-enol 405 21 670Phenol-enolate 414 18 440Phenolate-enolate 425 25 860Phenolate-keto 486 22 030

Table 4 pKa values of the phenol–phenolate and enol–enolate equilibria andpKE42 for oxyluciferin and oxyluciferin derivatives based on the multi-set MCR-ALSanalysis and fitting concentration profile to the Henderson–Hasselbalch equation

CompoundpKa

(phenol–phenolate)pKa

(enol–enolate)pKE

(keto–enol)

4-MeOxyLH 8.90 ! 0.10 —5,5-DMeOxyLH 7.83 ! 0.06 —60-MeOxyLH — 7.27 ! 0.11 "0.43 ! 0.12HOxyLH — 7.19 ! 0.05OxyLH2 9.10 ! 0.12 7.40 ! 0.15 "0.39 ! 0.08

3808 | Chem. Sci., 2013, 4, 3803–3809 This journal is ª The Royal Society of Chemistry 2013

Chemical Science Edge Article

Publ

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2014

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phenolate-keto OxyL2- phenolate-enol

enol enolate keto

に対して、それらの基底状態と励起状態の間の振動の FCF を見積もることにより、水溶液におけるオキシルシフェリンの振電相互作用を調べた。その結果、水溶液中におけるケト型とエノール型のオキシルシフェリンおよびその共役塩基の吸収・蛍光スペクトルにおけるスペクトルの形状・幅・それらの起源を解明することができた。例えば図 3に示す蛍光スペクトルでは、phenolate-keto のみスペクトル幅が小さくなるという特徴が、Ghose らによる実験結果（図3(a)）と本研究の理論結果(図 3(b))とで一致している。

しかしながら、ケト型アニオンは 0-0’バンドが強いため鋭いスペクトル形状になり、また、ケト型は吸収・蛍光エネルギーが他の化学種に比べて過大評価された。ここで用いた計算方法では、ケト型のみが実験結果と異なる結果となった。これらの結果から、理論計算における水和

の扱いは非常に難しいことが明確になった。生物発光でのタンパク質酵素は水溶液中で働くことから、まず水和の問題を解決する必要がある。水和の問題に対応するため、さらに高精度

な計算方法を検討した。上記の原因は、ケト型アニオンの場合は他の化学種に比べて特異な溶媒効果があり、溶媒環境の記述が従来の連続誘電体モデルでは不十分であるためと考えられる。水分子をあらわに扱う分子動力学計算が必要であるが、これまで想定していた古典分子動力学計算では計算精度が不明である。そこで、第一原理分子動力学計算を実施すれば、これまでよりも水素結合相互作用を高精度に取り入れることができると

考えた。本研究ではオキシルシフェリンアニオンと 64個の水分子の系に対する FPMD計算を実施した。図 4に、FPMD 計算から得られるオキシルシフェリンアニオンの周囲に生成した水分子鎖のスナップショットを示す。図 4に示すように、オキシルシフェリンアニオンのエノール(enol)型やエノレート(enolate)型は、周囲の水分子によりベンゾチアゾール環とチアゾリン環からなる面の左右に水分子鎖が生成する。この水分子鎖の影響により、エノール型やエノレート型は水溶液中でエネルギー的に安定化することがわかった。

一方、図 4に示すようにオキシルシフェ

リンアニオンのケト(keto)型の場合は、一部にしか水分子鎖が生成されないという疎水的な水和構造になるため、水溶液中ではエネルギー的に不安定化することがわかった。すなわち、「水和によりケト型がエノール型に比べて不安定化する原因は、ケト型アニオンの疎水的な水和構造にある」と言える。このような特殊な水和構造は、吸収スペクトルに反映されていると考えられる。そこで、水分子をあらわに含むケト型とエノール型のオキシルシフェリンの分子動力学計算から得られる構造データから吸収スペクトルの形状を見積もることで、溶媒効果を調べた。図 5に Ghose らによる実験スペクトル（図5(a)）・平成２７年度に行った FCF 計算による吸収スペクトル（図 5(b)）・今回の理論吸収スペクトル(図 5(c))を示す。図 5から明らかなように、水分子をあらわに取り入れた今回の理論吸収スペクトルでは、エノール型とエノレート型だけでなく、ケト型の吸収スペクトルの幅も実験値と理論でよく一致した。連続誘電体モデルによるFCF計算の結果では、エノール型とエノレート型の吸収スペクトルの幅は実験値に近い値になるが、ケト型の場合は明らかに実験値よりも小さくなった。このことを考慮すると、今回水分子をあらわに取り入れた構造を用いることで、ケト型の水和構造が再現されたため、このような一致

図 3：蛍光スペクトル(a)実験(b)理論[主な発表論文等の雑誌論文 4]

ISBC2016� ���

1.5 2.0 2.5 3.0Energy /eV

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Norm

alize

d in

tens

ity/ a

rb. u

ni.

Phenolate-keto

Enol

Keto

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Enolate

2-

1.5 2.0 2.5 3.0Energy /eV

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1.0

Nor

mal

ized

Inte

nsity

emission with gamma=4.05 cm-1

Phenolate-enol

DatafromGhoseetal.

(2015)

J.Phys.Chem.B119,2638

Hiyamaetal.(2015)

Photochem.Photobiol.

91,819�

EnergyposiJonTheoreJcalenergiesof

Phenolate-keto&Ketoarehigherthanexperimentalones

Spectrumwidth

FWHM~0.4-0.5eV

→Goodagreementwithexperimentalones

Spectrumshapephenolate-keto:0-0bandis

mainband→FWHMissmallothers:FWHMsarelargerthan

thatofphenolate-keto

→Goodagreementwithexperimentalones

SpecialsolventeffectwouldworkonspectraofKetotypes

Emissionspectra�(a)�

(b)�

図 4 オキシルシフェリンアニオンの水溶液におけるスナップショット [主な発表論文等の雑誌論文 3]

keto, indicating that keto is closer to charge-neutral than theother isomers. This suggests that keto has intrinsically strongerhydrophobicity.Stabilities in Aqueous Solution. Now, we discuss the

result of the FPMD simulations performed for oxyluciferin and64 surrounding water molecules by applying the periodicboundary condition. For accurate and reliable discussion, wehave run FPMD up to 1 ns, corresponding to over 2 millionMD steps; this took around 200 days when using 128 IntelXeon processors for each isomer. In the simulation, the internalenergy showed convergence in around 0.7 ns with a 0.1 eVerror according to our block average analysis; a subsequentsimulation of 0.3 ns duration was used to take an average. Forfurther details, see the Supporting Information.The cumulative average of the internal energy (Figure 4)

shows that enol is the most stable, whereas others are less stableby 0.20−0.25 eV. The result is qualitatively different from thoseobtained by PCM (see Figure 1), indicating that the hydrationeffect not described by the dielectric continuum model plays asignificant role. By comparing the internal energy with the totalenergy of oxyluciferin isolated in vacuum (shown in Figure 1),we found that the energy gained by hydration is smaller forketo than that for others by 0.7−0.8 eV, which is a remarkablylarge difference.Distribution of Water Molecules. Now, we analyze the

simulation in more detail to find a reason for the loss in stabilityfor keto. By carefully monitoring the trajectory of the FPMDsimulations, we find that the distribution of water molecules isdifferent among the isomers; in addition, the distribution isqualitatively different from the optimized geometry obtained bythe cluster model calculation, as shown in Figure 2. Typicalsnapshots of the FPMD, shown in Figure 5, indicate thatoxyluciferin is hydrogen bonded to nearby water molecules thatform hydrogen bond networks surrounding oxyluciferin. Thissituation corresponds to a formation hydration shell or,possibly, the formation of a water wire.44−48 For keto, the

hydration shell is not formed at the bottom side, which has ahydrophobic nature; instead, a cavity is formed where no watermolecules exist, as indicated in green in Figure 5. (See theSupporting Information for details; the remarkably poor waterpopulation in the cavity can be confirmed from the movies forketo, enol, and enolate.) In contrast, for enol, the hydrationshell completely surrounds oxyluciferin; furthermore, in themolecular plane of oxyluciferin, 20 water molecules areinvolved with the shell.We assume that the cavity is formed owing to the

hydrophobic nature that pushes water molecules away from

Figure 4. Time evolution of the cumulative average internal energy.

Figure 5. Snapshot of the FPMD simulation. Only those watermolecules in contact with oxyluciferin are shown. For keto, there is aregion where water is not populated, which is indicated in green.

The Journal of Physical Chemistry B Article

DOI: 10.1021/acs.jpcb.6b04963J. Phys. Chem. B 2016, 120, 8776−8783

8778

が得られたと考えられる。これらの結果からスペクトル形状の元となる要因について分解して考えることができる。スペクトルのピークシフトには「疎水性が互変異性体で異なること」が反映されており、スペクトル幅には「水和の動的揺らぎは互変異性体で差があること」がわかった。

今回の結果は、ホタル生物発光の発光体で

あるオキシルシフェリンアニオン異性体という特定の化学種の水和問題に着目した結果となっている。しかし、このオキシルシフェリンアニオン異性体がベンゼン環・ヒドロキシ基・ケト基など、有機分子の典型的な置換基を持つ化学種であることを考慮すれば、本研究で用いた計算方法と分析方法は他の有機分子に対してもその水和効果の解析に有効であると言える。今回の研究では、特に「化学種の疎水性の

影響がスペクトル形状に現れる」という、これまで着目されていなかった新しい関係が明らかになった。これらの研究成果について投稿論文６件、図書１件、招待講演 5件を含む 21件の学会発表を行うことができた。５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線） 〔雑誌論文〕（計 6 件） ① Miyabi Hiyama, Motoyuki Shiga,

Nobuaki Koga, Osamu Sugino, Hidefumi Akiyama, Yoshifumi Noguchi, The effect of dynamical fluctuations of hydration structures on the absorption spectra of oxyluciferin anions in an aqueous solution. Phys. Chem. Chem. Phys., 査読有 , Vol.19, Issue 15, 2017, 10028-10035, DOI: 10.1039/c7cp01067b.

② Miyabi Hiyama, Hidefumi Akiyama,

Nobuaki Koga, Theoretical insights

into the effect of pH values on oxidation processes in the emission of firefly luciferin in aqueous solution. Luminescence: The Journal of Biological and Chemical Luminescence, 査読有, Vol.32, Issue 6, 2017, 1100-1108, DOI: 10.1002/ bio.3308.

③ Yoshifumi Noguchi, Miyabi Hiyama,

Motoyuki Shiga, Osamu Sugino, Hidefumi Akiyama, Reverse Stability of Oxyluciferin Isomers in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B, 査読有, Vol.120, Issue 34, 2016, 8776-8783, DOI: 10.1021/acs.jpcb.6B04963.

④ Miyabi Hiyama, Yoshifumi Noguchi,

Hidefumi Akiyama, Kenta Yamada, Nobuaki Koga, Vibronic structures in absorption and fluorescence spectra of firefly oxyluciferin in aqueous solutions, Photochem. Photobiol. 査読有, Vol.91, issue 4, 2015, 819-827, DOI: 10.1111/php.12463.

⑤ Miyabi Hiyama, Hidefumi Akiyama,

Toshimitsu Mochizuki, Nobuaki Koga, Analysis of Oxyluciferin Photoluminescence Pathways in Aqueous Solutions. Photochem. Photobiol., 査読有 , Vol.91, Issue 1, 2015, 74-83, DOI: doi.org/10.1111/php.12370

⑥ Yoshifumi Noguchi, Miyabi Hiyama,

Hidefumi Akiyama, Yoshihisa Harada, and Nobuaki Koga, First-Principles Investigation of Strong Excitation Effects in Oxygen 1s X-Ray Absorption Spectra, J. Chem.Theo.Comp., 査読有, Vol.11, No. 4, 2015, 1668-1673, DOI: 10.1021/acs.jctc.5b00082.

〔学会発表〕（計 21件） ① Miyabi Hiyama, Hidefumi Akiyama,

Nobuaki Koga, pH dependence of oxidation reaction pathway of firefly luciferin., The 55th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2017.

② 薄倉淳子, 樋山みやび, 倉田麻貴, 挾間優治, Xingping Qiu, Francoise Winnik, 古賀伸明, 秋山英文, クマリン・ケージドルシフェリンの電子励起状態の理論的研究. 第 11回分子科学討論会, 2017.

③ 樋山みやび, 野口良史, 志賀基之, 杉野修, 秋山英文, 古賀伸明, ホタルオキシルシフェリン吸収スペクトルにおける水分子鎖の構造ゆらぎの影響. 第 11 回

図5:吸収スペクトル(a)実験(b)FCF近似による理論吸収スペクトル(c)FPMD 計算結果を用いた理論吸収スペクトル[主な発表論文等の雑誌論文 1]

2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.00.51.01.52.02.5

/10

M

cm

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

arb.

uni

t

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0Energy/ eV

arb.

uni

tε

4-1

-1 (a) Exp.

(b) FCA

(c) tQM/MM

Experimental and Theoretical absorption spectra

22

←previous

←This study

←Experimental

Hiyama et al. PCCP (2017) 19, 10028

Data from Rebarz et al.(2013) Chem. Sci. 4, 3803 phenolate-keto

phenolate-enolenolate

分子科学討論, 2017 ④ 薄倉淳子, 樋山みやび, 倉田麻貴, 挾間

優治, Xingping Qiu, Francoise Winnik, 古賀伸明, 秋山英文, GRRM 法による水溶液中ケージドルシフェリンの構造探索. シンポジウム「化学反応経路探索のニューフロンティア」2017.

⑤ Miyabi Hiyama, Yoshifumi Noguchi, Motoyuki Shiga, Osamu Sugino, Hidefumi Akiyama, Nobuaki Koga, Instantaneous absorption spectra of firefly oxyluciferin using the first principle molecular dynamics simulations. 11th Triennial Congress of the World Association of Theoretical and Computational Chemists, 2017.

⑥ Nobuaki Koga, Miyabi Hiyama, Yoshifumi Noguchi, Motoyuki Shiga, Osamu Sugino, Hidefumi Akiyama, Effects of water solvation on absorption spectra of firefly oxyluciferin, The 28th International Conference on Photochemistry, 2017.

⑦ 野口良史, 樋山みやび, 志賀基之, 杉野修, 秋山英文, 水溶液中のオキシルシフェリン異性体の安定性, 第 30 回分子シミュレーション討論会, 2016.

⑧ 樋山みやび, 秋山英文, 古賀伸明, ホタルルシフェリン酸化反応経路の理論的研究, 第 10回分子科学討論会, 2016.

⑨ Miyabi Hiyama, Yoshifumi Noguchi, Hidefumi Akiyama Kenta Yamada, Nobuaki Koga, Hydration effects on absorption and fluorescence spectra of firefly oxyluciferin, The 54rd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2016.

⑩ Yoshifumi Noguchi, Miyabi Hiyama, Motoyuki Shiga, Osamu Sugino, Hidefumi Akiyama, Stability of keto-, enol-, enolate-type oxyluciferin anions in aqueous solutions" 19th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, 2016.

⑪ Miyabi Hiyama, Yoshifumi Noguchi, Kenta Yamada, Hidefumi Akiyama, Nobuaki Koga, Effects of vibronic transitions and water solvation on absorption and fluorescence spectra of firefly oxyluciferin, 19th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence 2016（招待講演）.

⑫ Miyabi Hiyama, Yoshifumi Noguchi, Toshimitsu Michizuki, Kenta Yamada, Hidefumi Akiyama, Nobuaki Koga, Theoretical study for photoluminescence of firefly-bioluminescence-related molecules, THE INTERNATIONAL

CHEMICAL CONGRESS OF PACIFIC BASIN SOCIETIES,2015,（招待講演）.

⑬ Yoshifumi Noguchi, Miyabi Hiyama, Hidefumi Akiyama, Yoshihisa Harada, and Nobuaki Koga, All-electron first-principles X-ray adsorption spectra calculations for acetone and acetic acid. Physical, THE INTERNATIONAL CHEMICAL CONGRESS OF PACIFIC BASIN SOCIETIES, 2015.

⑭ 樋山みやび, ホタル生物発光の量子化学計算と反応機構」量子化学探索研究所講演会 2015,（招待講演）.

⑮ 樋山みやび, 生物発光における量子化学計算」第３回津田沼 RBK フォーラム, 2015（招待講演）.

⑯ 樋山みやび「生物発光における分子科学」原子衝突学会第 40回年会 2015,（招待講演）.

⑰ 倉田麻貴, 樋山みやび, 挟間優治, 東暉舜, 吉田正裕, 望月敏光, 秋山英文, "生物発光の光制御に向けたケージド・ルシフェリンの分光評価" 第９回分子科学討論会, 2015.

⑱ 樋山みやび, 野口良史, 秋山英文, 山田健太, 古賀伸明, 水溶液中オキシルシフェリンの吸収・蛍光スペクトルにおける振電構造の解析 ,第９回分子科学討論会,2015.

⑲ 挾間優治, 東暉舜, 倉田麻貴, 樋山みやび, 吉田正裕, 久保田英博, 井上敏, 秋山英文, イクオリン生物発光の量子収率測定 , 日本物理学会 2015 年秋季大会,2015.

⑳ Miyabi Hiyama, Toshimitsu Mochizuki, Hidefumi Akiyama, Nobuaki Koga "Analysis of Photoluminescence Pathways of Firefly Oxyluciferin in Aqueous Solution" The 53rd Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2015.

21 樋山みやび,野口良史,望月敏光,秋山英文,古賀伸明,オキシルシフェリン光ルミネッセンスにおける発光反応経路と振動構造,物性研究所短期研究会機能物性融合科学研究会シリーズ（３）「反応と輸送」,2015.

〔図書〕（計 0件）〔産業財産権〕 ○出願状況（計 0件）名称：発明者：権利者：

種類：番号：出願年月日：国内外の別：○取得状況（計 0件）名称：発明者：権利者：種類：番号：取得年月日：国内外の別：〔その他〕ホームページ等６．研究組織(1)研究代表者 樋山 みやび （HIYAMA,Miyabi）群馬大学・大学院理工学府・准教授

研究者番号：90399311(2)研究分担者 （ ）

研究者番号：

(3)連携研究者

（ ）

研究者番号：

(4)研究協力者

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