TUMOR SUPRESOR GENI

ONKOGENI

ONKOGENEZA Mr sci Nevenka Ili

Procenjeno je da kod odraslog oveka ukupan broj elija iznosi oko 100 biliona (1014) ili u proseku oko milijardu elija po gramu tkiva. Tokom itavog ivota odvija se kontinuirano stvaranje novih elija i uklanjanje ostarelih, a stalnost ukupnog broja rezultat je balansa izmedju elijske proliferacije (mitoze) i elijske smrti (apoptoze). Onkogeneza je proces nastanka elije koja raste, deli se i kree se, nezavisno od utvrdjenih mehanizama kontrole normalnog rasta, deobe i migracije elija.

GENETSKA TEORIJA ONKOGENEZE Sedamdesetih godina prolog veka otkriveni su prvi virusni onkogeni. Bishop i Varmus su 1976. godine demonstrirali da su onkogeni defektni protoonkogeni, koji se nalaze i u humanom genomu. Za ovo otkrie su navedeni autori dobili Nobelovu nagradu za medicinu i fiziologiju 1989. godine. Dve decenije je dominiralo miljenje da pod dejstvom fizikih i hemijskih kancerogenih supstanci dolazi do aktivacije, odnosno mutacije normalnih gena protoonkogena, te oni postaju onkogeni, ijom transkripcijom dolazi do prekomernog ispoljavanja efekata proteina odgovornih za rast i deobu elije. Pri tome je dovoljna mutacija samo jednog alala (dominantno nasledjivanje), a kodirani protein koji i normalno uestvuje u signalnom prenosu izmie kontrolnim mehanizmima regulacije, te izaziva dalju aktivaciju proteina u tom putu i u sluaju izostanka pro-proliferativnih signla. Opisano je oko 100 onkogena. Razvojem molekularne biologije, dolo se do otkrivanja tumor supresor gena, iji produkti imaju potpuno suprotno dejstvo inhibiraju rast i deobu elije, izazivaju programiranu elijsku smrt i odgovorni su za medjuelijsko povezivanje i kretanje elija.

Smatra se da je malignitet bolest gena i nastaje usled poremeaja ravnotee izmedju efekata kodiranih proteina onkogena i tumor supresor gena.

Poetni faktor u onkogenezi predstavlja postojanje mutacije, tj inaktivacija tumor supresor gena. To dovodi do ubrzanog rasta i deljenja elija. Kratak deobni ciklus ne dozvoljava adekvatnu reparaciju eventualnih oteenja DNA, te nastaju mutacije gena odgovornih za ispravljanje oteenja, kao i mutacije protoonkogena uz ili bez prisustva kancerogenih supstanci. Serija deoba elija u kojima se mutacije i druge hromozomske aberacije sustiu u erkama elijama, dovode do formiranja genotipa koji indukuje ispoljavanje malignog fenotipa ije su osnovne karakteristike : 1) ubrzan rast 2) brza deoba elija 3) gubitak kontaktne inhibicije i pojava kretanja elija.

ONKOGENI elijski rast i deoba

Proto-onkogen je normalan gen, koji kodira proteine, znaajne za regulaciju elijskog rasta i diferencijacije. Najee kodira proteine koji su ukljueni u prenosnim signalnim procesima mitogena. Postaje onkogen posle mutacije ili poveane ekspresije. Onkogen je modifikovani gen, koji kodira protein od znaaja za : - pretvaranje normalne elije u tumorsku - poveanje maligniteta tumorske elije. Proto-onkogen moe postati onkogen posle male modifikacije njegove originalne funkcije. Osnovna tri tipa aktivacije onkogena su: 1) Mutacije proto-onkogena dovodi do promena u strukturi kodiranog proteina to za posledicu ima:

- poveane enzimske aktivnosti (mutacija samo u jednoj amino kiselini moe imitirati stanje stalne fosforilacije tj aktivacije)

- povaanja njegove stabilnosti, tj nemogunosti njegove razgradnje to produava njegovo postojanje i vreme njegovog efekta

2) Genske duplikacije dovode do poveanje ekspresije gena sa poveanom koliinom proteina 3) Hromozomske translokacije koje dovode do ekspresije gena u pogrenoj eliji u pogreno vreme ili do stvaranja aktivnih hibridnih proteina. Ekspresija gena fuzionisanog proteina moe biti velika. Deo takvog proteina moe normalno uticati na signalni prenos u malim koliinama. U sluaju njegove poveane produkcije i signali u kojima uestvuje su aktivni. Ne postoji mogunost inhibicije aktivnosti ovakvog proteina. ONKOGENI Postoji nekoliko klasifikacija onkogena, zasnovanih ili na mestu ispoljavanja efekta, ili na hronologiji dogadjaja u elijskog ciklusu, ali za sada ni jedna nije prihvaena kao standard. Onkogeni utiu na rast i deobu elija. Posledica njihove aktivacije je poveana koliina i aktivnost faktora rasta, povean broj receptora za faktore rasta, poveana aktivnost proteina koji ine signalni put ili je poveano stvaranje transkriptornih faktora. PRODUKTI ONKOGENA EFEKTI ONKOGEN FAKTORI RASTA Poveano stvaranje faktora

rasta

c-sis

RECEPTOR TIROZIN KINAZA

Poveana ekspresija receptora za faktore rasta ime elija postaje senzitivnija na EGF, VEGF, FGF, PDGF....

HER/neu, c-erb-B2 (Epidermal growth factor receptor

Neurogloiblastoma Erytroblastosis omcogen)

REGULATORNE GTP aze

Smanjenje regulatornih GTPaza (neograniena indukcija GTP od strane kinaza) to dovodi do poveanog signalnog prenosa

Ras (Mendelian Inheritance in Man)

CITOPLAZMATSKE TIROZIN KINAZE

Dezinhibicija aktivirajuih kinaza u signalnom prenosu

c-abl (Abelson)

Bcr (Breakpoint cluster region)

CITOPLAZMATSKE SERIN/TREONIN KINAZE I NJIHOVE SUBJEDINICE

Prekomerno stvaranje kinaza u signalnom prenosu Raf

(Mendelian Inheritance in Man)

TRANSKRIPTORNI FAKTORI

Produkti onkogena se vezuju za transktiptorne faktore u nukleusu i izazivaju ulazak elije u deobni ciklus uz aktivaciju DNA transkripcije

c-myc (Myelocitomatosis)

Poveano stvaranje faktora rasta - c-sis onkogen Na poveano stavaranje faktora rasta utiu mutacije iz grupe c-sis onkogena. Faktori rasta predstavljaju proteine koji stimuliu elijsku proliferaciju i diferencijaciju i deluju kao signalni molekuli izmedju elija vezujui se za receptore na ciljnim elijama. Faktori rasta ili mitogeni predsatavljaju molekule koji daju inicijalni simulus za zapoinjanje elijskog ciklusa. Ukoliko mitogen deluje na receptor na membrani elije, preko niza proteina u elijskog citoplazmi koji ine odredjeni signalni put (pathway) dolazi do prenosa tog signala do jedra. U jedru elije aktiviraju se prvenstvneno transkriptorni faktori neophodni za regulaciju toka deobnog ciklusa.

Faktori rasta mogu delovati autokrino, parakrino ili endokrino.

Opisano je preko 20 grupa faktora rasta: - stimulirajui faktor granulocitnih kolonija (G-

CSF) - Stimulirajui faktor granulocitno monocitnih

kolonija (GM- CSF) - Nervni faktor rasta (NGF) - Neurotrofini - Faktor rasta koji se oslobadja iz trombocita

(PDGF) - Eritropoetin (EPO) - Trombopoetin (TPO) - Miostatin (GDF-8) - Faktor rasta i diferencijacije 9 (GDF9) - Fibroblastni faktori rasta (FGF) - Epidermalni faktor rasta (EGF) - Hepatocitni faktor rasta (HGF)

Poveana ekspresija receptora za faktore rasta HER/neu, c-erb-B2 onkogeni Receptori faktora rasta su proteini iz grupe tirozin kinaza. Do sada je utvrdjeno 58 gena koji kodiraju tirozin kinazne receptore. Svaki transmembranski monomer ovog receptora se sastoji od 25 do 38 aminokiselina. Ekstracelularni N- terminalni kraj je veliki protein za koji se vezuju faktori rasta. Citoplazmatski C- terminalni region odgovoran je za kinaznu aktivnost tj za transfer fosfatnih grupa sa visokoenergetskih molekula (ATP). Kada se faktor rasta vee za receptor dolazi do njegove dimerizacije sa autofosforilacijom tirozinskih ostataka na citoplazmatskoj strani membrane, to uslovljava vezivanje kofaktora i posledino aktiviranje puteva signalnog prenosa. Krajnji efekat je regulacija genske ekspresije i elijskog ciklusa.

Identifikovano je preko 20 klasa razliitih tirozin kinaza receptora: RTK I klase familija EGF receptora RTK II klase familija insulinskih receptora RTK III klase familija PDGF receptora RTK IV klase familija FGF receptora RTK V klase familija VEGF receptora RTK VI klase familija HGF receptora itd

c-sis

EGFEGF

EGF

EGF

Tirozin kinazne receptore za epidermalni faktor rasta kodira proto-onkogen HER2 Amlifikacija ili prekomerna ekspresija ovog gena dovodi do onkogenog efekta u smislu poveanog stavaranja receptora to eliju ini senzitivnijom na efekte faktora rasta. Ovaj onkogen otkriven je u 25 do 30 % karcinoma dojke, ali se esto nalazi i u tumorima jajnika i eluca. U vreme kada je otkriven u neuroblastomima nazvan je neu, a zbog prisustva u ptiijoj eritroblastozi (avian eritroblastosis oncogen B) nazvan je ErbB. Kasnijim genskim kloniranjem uoeno je da su HER2, neu i ErbB2 isti gen (Chr 17 q11.2-q12). Smanjenje regulatornih GTPaza to dovodi do poveanog signalnog prenosa - Ras onkogen Proteini familije Ras imaju vanu ulogu u aktivaciji i kontroli razliitih signalnih puteva, koji uestvuju u procesima ouvanja citoskeletnog integriteta elije, proliferaciji, elijskoj adheziji, apoptozi i elijskog migraciji. Fosforilacija tirozin kinaza dovodi do aktivacije enzima iz grupe faktora izmene guanina (guanin exchange factors) (Grb2, SOS 1, SOS2, SDC25 i dr.), koji su odgovorni za aktiviranje Ras proteina. Naime Ras protein je neaktivan kada je za njega vezana GDP, a aktivira se fosforilacijom, tj vezivanjem za GTP. Proteini grupe faktora izmene guanina odgovorni su za odvajanje GDP od Ras proteina i njegovu fosforilaciju. Inaktivacija ovih faktora izmene guanina odvija se preko RasGAP, proteina koji aktiviraju GTP-aze, to za posledicu ima hidrolizu GTP-Ras protein aktivnog kompleksa na neorganski fosfor i GDP-Ras protein neaktivni komleks. Aktivnost Ras proteina odredjuje mnoge signalne puteve, a jedan od znaajnih je aktivacija MAP kinaza (mitogenima aktiviran protein), koji prenosi signal do nivoa regulatornih proteina gena.

HER2/neuc-erb B2

EGF

EGFR

Mutacije RAS gena (Chr 1 p 13.2) nadjene su u 20 do 30 % svih karcinoma kod ljudi. Takasta mutacija glicina u valin na 12. mestu ini Ras protein neosetljivim na inaktivaciju RasGAP-om. Mutacija na mestu 61 odgovorna je za gubitak unutranje GTP-Ras hidrolize. Opisane su i mutacije S17N i D119N. Stalno aktivirani Ras protein pojaava singnalni prenos. U tumorima je est nalaz amplifikovanih Ras onkogena. Tumor supresor gen NF1 kodira RasGAP, te je u sluaju postojanja mutacije ovog gena izmenjeni protein manje sposoban da inaktivira GTP-Ras protein aktivni kompleks. Takodje onkogeni p210BCR-ABL ili erbB za posledicu imaju poveanje nivoa aktivnosti Ras proteina i dalji prenos signala. Problem neuspelih pokuaja da se molekularnom terapijom ubiju elije sa nekontrolisanim Ras prenosom, lei u injenici da se mutirani proteini razlikuju od normalnih u jednoj aminokiselini, zbog ega je njihova diskriminacija na nivou elije neuspena, a neeljeni efekti ovakve terapije veoma izraeni.

c-ras

EGF

EGFR

Grb2SOS

GTP

GDP

pRAS

Prekomerno stvaranje kinaza u signalnom prenosu Raf onkogen

Aktivni Ras protein izaziva konformacijske promene raf1 proteina (serin treonin kinaze) koji se iz citoplazme kree ka membrani. U neaktivnom obliku ovaj protein je sa fosforilisanim serinom- 259. Aktivacija raf 1 proteina je dvostruki proces. Sa jedne strane dolazi do fosforilacije aktivirajueg dela uz pomo citoplazmatskih tirozin kinaza iz

grupe Src i PAK (serin -338), dok se na serin-259 ispoljava aktivnost fosforilaze A2 (PPA2) koja otcepljuje fosfatnu grupu i ini ovaj protein prijemivim za proteine koji uestvuju u daljem signalnom prenosu. Raf onkogeni idukuju poveano stvaranje raf 1 proteina koji pripadaju grupi serintreonin kinaza.

PP2A

Raf 1 protein neaktivan

Raf 1 proteinaktivan

Inhibitor ERK , MEK-a

c-raf

EGF

EGFR

Grb2SOS

pRAS

GTP

GDP

Raf 1

PP2A

Kinaze - Src, PAK

MEK

ERK

c-abl

EGF

EGFR

Grb2SOS

pRAS

GTP

GDP

Raf 1

Kinaze - Src, PAK

PP2A

Dezinhibicija aktivirajuih, citoplazmatskih tirozin kinazau signalnom prenosu

Posle defosforilacije serin-259 raf 1 protein se vezuje za kinazu koja inhibira ERK (extracelular signal regulated kinase) i MARK (mitogen activated protein kinase), te je inaktivie. Sa druge strane kinaznom aktivnou dovodi do fosforilacije, tj aktivacije ERK / MARK kinaza. Aktivirane MARK kinaze reguliu aktivnost nekoliko transkriptornih faktora (myc, MNK, CREB, Fos i dr) koji imaju znaaja u elijskom ciklusu Dezinhibicija aktivirajuih kinaza u signalnom prenosu - c-abl, Bcr onkogeni Citoplazmatske tirozin kinaze ine Src familija, Syk-ZAP-70 familija i BTK familija tirozin kinaza. Primer gena koji ih kodira je ABL gen. Filadelfija hromozom (Ph t(9:22)(q34:q11)) je hromozomska abracija koja podrazumeva postojanje translokacije izmedju 9 i 22 hramozoma. Prisutna je u 95 % obolelih od hronine mijeloidne leukemije, u 25 do 30% akutne limfoblastne leukemije odraslih i 2 do 10% akutne limfatine leukemije kod dece. Na hromozomu 22 (q11) nalazi se BCR gen (breakpoint cluster region) koji se fuzionie sa ABL genom na hromozomu 9 (q34). ABL gen kodira monomer tirozin kinaze. U sluaju dejstva citokina dolazi do dimerizacije proteina to je neophodno za autofisforilaciju, tj aktivaciju ove kinaze. BCR protein nema kinaznu aktivnost, ali je odgovoran za dimerizaciju. U sluaju ove translokacije nastaju hibridni proteini p250 i p185 koji stalno prave dimere to uslovljava aktivaciju i bez prisustva citokina, a po efektu su citoplazmatske tirozin kinaze. Usled ispoljavanja njihovi efekata dolazi do ubrzanja elijske deobe uz smanjenje DNA reparacije, to za posledicu ima gensku nestabilnost.

Glivec (Imatinib) inhibira proliferaciju bcr-abl pozitivnih elija, a pojava rezistencije na ovaj lek tumai se estim takastim mutacijama u kinazama bcr-abl gena.

Produkti onkogena koji se vezuju za transktiptorne faktore u nukleusu i izazivaju ulazak elije u deobni ciklus uz aktivaciju DNA transkripcije - c-myc onkogeni

Deoba elije je veoma organizovan i sloen proces, koji obezbedjuje kompletnu i preciznu replikaciju DNK i elijskih komponenti pre deobe. U toku ovog procesa uestvuje niz molekula, enzima ukljuenih u proizvodnju novih elijskih komponenti (DNK, membrane organela i sl). Takodje paralelno procesu stvaranja komponenti koje ine eliju, svoje efekte ispoljavaju i molekuli i jedinjenja koji uestvuju u kontroli elijskog ciklusa. Ovaj sistem obezbedjuje pravilnost u toku elijskog ciklusa, zaustavljajui ga ukoliko se u odredjenoj fazi nisu stekli odgovarjui uslovi za prelazak u sledeu fazu. Za otkrie kljunih molekula za odvijanje i kontrolu elijskog cuklusa, Leland Hartwell, Timoty Hunt i Paul Nurse dobili su Nobelovu nagradu za medicinu i fiziologiju 2001. godine. (Bumbasirevi V. elijski ciklus). Danas se zna da su za odvijanje elijskog ciklusa najvanije tri grupe proteina: 1) ciklini 2) ciklin zavisne kinaze 3) inhibitori ciklin zavisnih kinaza.

Ciklini predstvalju grupu proteina mase 35 90 kD, ija se koncentracija znaajno menja u toku elijskog ciklusa, po emu su i dobili naziv. Do sada je indentifikovano 16 ciklina (obeleavaju se slovima od A do J). U pojedinim fazama elijskog ciklusa poveava se sinteza odredjene vrste ciklina koji je neophodan za tok tog dela ciklusa, dok se koncentarcija drugih ciklina smanjuje zbog proteolitike razgradnje. To obezbedjuje jednosmerni tok elijskog ciklusa. Osnovna funkcija ciklina je da se veu za ciklin zavisne kinaze (Cdk), ime dolazi do konformacijonih promena to uz fosforilaciju dovodi do aktivacije. Fosforilacija treonina dovodi do poveanja enzimske aktivnosti ovog proteina i do 300 puta. Identifikovano je 9 ciklin zavisnih kinaza. Postoje dve grupe inhibitora ciklin zavisnih kinaza:

- CKI p21, p27, p57 inhibiraju sve Cdk - INK4 - p15, p16, p18, p19 prevashodno inhibiraju Cdk4 i Cdk6.

Myc geni imaju znaajnu ulogu u poveanju sineteze ciklina D (aktivatora ciklin zavisne kinaze 4) i E2F transkriptornog faktora uz poveanje degradacije inhibitora ciklin

zavisnih kinaza p 27. Regulisani su razliitim singnalnim putevima, od kojih su najei ERK / MARK i Wnt put. Aktivacija Myc gena dovodi do poveanja elijske proliferacije (stvaranje ciklina, smanjenje p21), regulaciji elijskog rasta (ribozomalna RNA i proteini), apoptoze (aktivacija Bcl2, diferencijacije i preivljavanja stem elija). Familija Myc transkriptornih faktora sadri bazine Helix-Loop-Helix Leucin Zipper delove kojim se ovi proteini sa jedne strane vezuju za DNA, a sa druge strane prave dimere izmedju sebe. Proteini familije Myc (N-Myc, L Myc) su transkriptorni faktori koji reguliu ekspresiju velikog broja gena vezivanjem za E sekvence i stvaranjem histon acetiltransferaza.

Myc onkogen otkriven je prvi put u pacijenata sa Burkitovim limfomom koji pokazuje este translokacije hromozoma 8. Mutiran ili poveano transkribovan

c-Myc protoonkogen (Chr 8 q24) postaje onkogen koji poveava elijsku proliferaciju. Mnogi autori ukazuju da amplifikacija Myc familije nije primarni dogadjaj u karcinogenezi, ve se ispoljava kod ve transformisanih elija, najee kao posledica efekata citostatske terapije.

TUMOR SUPRESOR GENI Tumor supresor geni kodiraju proteine koji koji imaju represivni efekat na elijski ciklus ili dovode do apoptoze elije. Funkcije tumor supresor gena su :

- represija gena koji su esencijalni za nastavak elijskog ciklusa, koji ukoliko nisu eksprimovani dolazi do zastoja u elijskom ciklusu.

- otkrivanje i ispravljanje DNA oteenja. Dok god u eliji postoje oteenja DNA ona se normalno nee deliti. Tek kada se oteenja otklone, dolazi do nastavka elijskog ciklusa.

- Iniciranje apoptoze tj. programirane elijske smrti ukoliko ne dodje do otklanjanja oteenja DNA

- Odranje elijske adhezije, blokiranje gubitka kontaktne inhibicije, tj inhibicija nastanka metastaza.

Tumor supresor geni se nasledjuju recesivno, te je neophodno oteenje oba alela da bi se ispoljila njihova disfunkcija. Naime ukoliko je mutiran samo jedan alel, drugi e proizvoditi normalan protein, to odrava krajnji efekat. Ipak postoje izuzetci kod kojih se poremeaji u funkcionisanju elije dogadjaju i u sluaju mutacije samo jednog alela tumor supresor gena. Interesantan je podatak da postojanje delecije oba alela tumor

c-myc

EGF

EGFR

Grb2SOS

pRAS

GTP

GDP

Raf 1

PP2A

Kinaze - Src, PAK

MEK

ERK

ERK

ERK

Transkriptorni faktori

Produkti onkogena se vezuju za transktiptorne faktore u nukleusui izazivaju ulazak elije u deobni ciklus uz aktivaciju DNA transkripcije

supresor gena dovodi do rane smrti u embrionalnom periodu, to ukazuje na esencijalnu ulogu ovih gena i embrionalnom razvoju.

FUNKCIJA EFEKTI usled disfunkcije GENA

Zaustavljanje elijskog ciklusa

Gubitak regulacije ulaska u elijski ciklus zbog odvajanja transkriptornih faktora

Rb

Gubitak regulacije elijskog ciklusa usled nedostatka inhibicije elijske proliferacije u sluajevima potrebe za DNA reparacijom

TP53

Aktivacija apoptoze Smanjenje pro-

apoptotikih proteina Bcl 2 familija (Bax, Noxe)

Ouvanje elijske adhezije Gubitak regulacije elijske adhezije sa gubitkom kontrole u trenutku medjuelijske interreakcije

APC

Zaustavljanje elijskog ciklusa Gubitak regulacije elijskog ciklusa usled nedostatka inhibicije elijske proliferacije u sluajevima potrebe za DNA reparacijom - P53 tumor supresor gen Gen TP53 (Chr 17 p13.1) kodira tumor protein p53, transkriptorni faktor koji regulie elijski ciklus. Naziva se i elijskim asovnikom i uvarom genoma, zato to ima znaajnu ulogu u ouvanju stabilnosti genoma i prevenciji genomskih mutacija.

Okriven je 1979. godine (Levin A.,Lan D) kao onkogen, target gen za SV40 virus. God 1989. svrstan je u grupu tumor supresor gena.

1-42 Aktivacija transkriptornih faktora

80-94 apoptoza (prolin)

100-300 Vezivanje za DNA (Zn+arginin)

N

356-393 Smanjenje vezivanja za DNA

C 393 am. kis

U normalnoj eliji p53 nalazi se u malim koliinama u neaktivnom obliku, vezan za negativni regulator mdm2 (mievi) tj HDM2 (ljudi). HDM2 transportuje p53 iz jedra u citoplazmu gde se razgradjuje u proteazomima. U sluaju poveanja p53 unutar jedra, dolazi do poveane transkripcije HDM2, te se p53 u normalnoj eliji uvek nalazi u vrlo niskim koncetracijama. Aktivacija p 53 podrazmeva njegovu fosforilaciju koja onemoguava vezivanje HDM2 ime se produava srednje vreme preivljavanja ovog proteina i njegovo nagomilavanje u eliji, kao i konformacione promene koje su neophodne za vezivanje p 53 za DNA i ispoljavanja njegove transkriptorne funkcije. Aktivacija p53 deava se u sluaju:

- kada je elija u stresu (oteenje membrane, oksidativni stres, osmolarni ili toplotni ok, i sl) to prepoznaju kinaze MAPK familije (JNK1-3, ERK1-2, p38 MAPK)

- kada postoji oteenje unutar jedra usled efekata genotoksinih faktora (UV zraenje (sunanje), radijacija, pri ekspresiji onkogena, u prisustvu lekova koji oteuju DNA) kada checkpoint faktori (ATM ataxia teleang., CHK1 i 2- chekpoint homolog, i dr) fosforiliu p53 i dolazi do disocijacije p53-HDM2 kompleksa.

Aktivni p53 zaustavlja elijski ciklus dok traje reparacija DNA, ili ukoliko je ispravljanje oteenja nemogue uvodi eliju u proces apoptoze. Aktivirani p 53 aktivira ekspresiju nekoliko gena i to : - gena za p 21 (vezivanje p21 za ciklin zavisne kinaze (Cdk) onemoguava njihovu funkciju aktivacije ciklina to za posledicu ima zastoj elije u G1 fazi) - zapoinjanje transkripcije reparatornih enzima (BRCA1 i BRCA 2) - u sluaju neefikasnog ispravljanja DNA oteenja, aktivacija ekspresije Bax i Nox gena, to dovodi do apoptoze elije

G1 faza

Ciklin D Ciklin D

Cdk6Cdk4

Reparacija DNAu G1 fazi

BRCA1BRCA2 p21

p53

baxapoptozapRb

E2F

Ras/Raf/ERK

Pojednostavljeni prikaz procesa reparacije oteenja DNA odvija se uz prisustvo dva proteina u kojima jedan prepoznaje rasporedu nukleinskih baza, a drugi prekide u lancu DNA.

U preko 50% malignih tumora u ljudi otkriveno je prisustvo mutacija ili delecija p53. takaste mutacije nadjene su u 95% mikrocelularnog i 40-60% nemikrocelularnog karcinoma bronha. Do ovih oteenja najee dovode hemikalije, zraenje ili virusi. Takodje proteini koje lue elije zaraene humanim papilomavirusima, kao to je E6 protein vazuje se za p53 i inaktivira ga.

Usled postojanja mutacije p53 nema sinteze p21, usled ega su Cdk stalno aktivne, ime stalno fosforiliu pRB to uslovljava aktivaciju transkriptornih faktora E2F i skraivanje G1 faze deobnog ciklusa. I pored prisutnih oteenja DNA umesto nastanka procesa apoptoze, elija nastavlja da se deli i poveava se mogunost maligne transformacije.

G1 faza

Ciklin D Ciklin D

Cdk4

Nema zadravanja u G1 faziuz skraenje vremena potrebnogza reparaciju DNA

p53

pRb

E2F

Cdk6

pRb

Poveana aktivnostbez inhibicije

Brza aktivacija

PROTEIN HISTONA

DNA

Acetil grupe ( histon acetil transferaze)

pRb

E2F

Histon deacetilaze

Kompleks pRb-E2F

Gubitak regulacije ulaska u elijski ciklus zbog odvajanja transkriptornih faktora Rb tumor supresor gen Rb gen kodira pRb protein ija je osnovna regulacija procesa deobe elije. Rb protein prevenira deljenje elije sa oteenim DNA tako to spreava nastavak cikusa kroz G1 fazu (faza prvog zastoja) i ulazak u fazu sinteze (S fazu). Defosforilisan pRb je aktivni oblik i tada je vezan za transkriptorne faktore E2F familije, ime ih ini neaktivnim. Kompleks pRb-E2F omoguava nastavak deobnog ciklusa kroz G1 fazu, obzirom da nema sinteze ciklina E. Osim toga pRb-E2F kompleks se vezuje za deacetilaze histona usled ega je onemoguena sinteza DNA.

Defosforilacija pRb deava se od kraja mitoze, kroz G1 fazu do trenutka ulaska elije u fazu sinteze. Tada se pod dejstvom ciklin zavisnih kinaza (Cdk) i ciklina, pRb fosforilie i postaje neaktivan, te oslobadja faktore transkripcije E2F koji imaju sledeu funkciju:

- zapoinju transkripciju ciklina E, proteina neophodnog za prelazak elije u S fazu, kao i ciklina A znaajnog u G2 fazi,

- poveavaju aktivnost histon acetil transferaze, koja omoguava odvajanje proteina histona od lanca DNA,

- aktivira antigen nuklearne elijske proliferacije (PCNA) koji ubrzava replikaciju DNA i pomae u njenoj reparaciji time to vezuje polimerazu za DNA

- omoguava transkripciju dihidrofolat reduktaze i timidin kinaze koje su neophodne za sintezu DNA

U nukleozomima DNK je vezana za histonske oktamere elektorstatskim intereakcijama izmedju negativnog naboja DNA i pozitivnih aminokiselina u histonu. Da bi transkripcija zapoela, neophodno je popuanje ove veze to se postie aktivnou histon acetil transferaze koja vezuje acetil grupe za histon i smanjuje njegovu pozitivnost ime slabi i elektrostatska interreakcija sa negativnom DNA.

Kompleks pRb + E2F se vezuje za histon deacetilaze to obezbedjuje vrstu povezanost DNA i histona, tj onemoguava transkripciju DNA

Ciklin E se fosforilie Cdk2, postaje aktivan i procesi sinteze se odvijaju kroz S fazu. pRb ostaje fosforilisan i neaktivan kroz S, G2 i fazu mitoze. Usled mutacija Rb dolazi do nesmetane deobe elija to vodi u proliferaciju. Mutacije oba alela Rb gena nadjene su u mnogim tumorima, ali je prvi put otkriven u retinoblastomima, te je po tome i dobio naziv. elije inficirane humanim papilomavirusima mogu sekretovati proteine koji se vezuju za pRb i inaktiviu ga. Inhibitori ciklin zavisnih kinaza Ukoliko u G1 fazi elija ne dobije odgovarajue mitogene signale ili dobije signale za prestanak deobnog ciklusa, zapoinje sinteza inhibitornih proteina koji zaustavljaju eliju u G1 fazi. Ekstraelijski faktor transformacije rasta TGF-a poveava sintezu p15 (INK4 inhibitora Cdk4 i 6) ime izaziva dugu inhibiciju deobe elije u G1 fazi, kontrolisanu diferencijaciju sa posledinim gubitkom mogunosti deobe. TGF aktivira Smad (mothers against decapentaplegic homolog 4) promotore od 4 - 5 nukleinskih baza na DNA. Mutacije ili inaktivacije receptora TGF ili Smad dovode do gubitka inhibicije elijskog rasta i deobe, te je disfunkcija ovih signalnih puteva takodje znaajan nalaz u carcinomima debelog creva. Usled efekata stresnih faktora takodje dolazi do poveane produkcije p16 (INK4). Mutacije ili delecije gena za p16 nadjene su u mnogim tumorima. U tumorskim elijama gde nije uoena mutacija ovog gena, est nalaz je neaktivirani gen usled metilacije DNA. Kod epitelnih elija postoji pojava kontaktneinhibicije, koja spreava prekomernu deobu elija putem poveanja koncentracije p27 proteina (CKI).

G1 faza

Ciklin D Ciklin D

Cdk4

p53

HDM2

pRb

E2F

Cdk6

S fazaCiklin E

Poetak transkripcije za dihidrofolat reduktazui timidin kinazu koje su neophodne za sintezu DNA

Aktivnost histon acetil transferaze

Gubitak regulacije elijske adhezije APC tumor supresor gen APC gen (Chr 5q21-22) kodira protein koji pomae u kontroli uestalosti deobe,

elijskog kontakta i pokretljivosti. Znaajan efekat APC proteina je regulacija beta catenina koji prevenira elijsku deobu i prekomerni rast. elije sluzokoe creva se stalno obnavljaju. Beta katenin je protein koji uestvuje u izgradnji medjuelijskih veza vezujui se za kaderin. U sluaju disocijacije medjuelijske veze dolazi do nakupljanja katenina u citoplazmi elije, koji se kree put jedra, gde deluje kao transkroptorni faktor za deobu elija sluzokoe creva.

APC protein ima ulogu u regulaciji koncentracije katenina u eliji tako to u kompleksu APC+Axin+kinaza glikogensintaze 3 beta (GSK) vezuje beta katenin u citoplazmi i ubrzava njegovu proteolizu. Na taj nain prevenira njegov prelazak u jedro i aktivaciju transkripcije proliferativnih gena. Opisano je preko 800 mutacija APC gena. Veina ovih mutacija za posledicu ima kratak ili nefunkcionalan APC protein. Usled nemogunosti supresije rasta elije ove mutacije vode u formiranje polipa. Deaktivacija ACP proteina takodje nastaje usled ispoljavanja efekata Wnt signalnog puta. Wnt signalni put predstavlja kompleksnu mreu medjuproteinske interreakcije koja ima znaaja u embriogenezi i onkogenezi.

WNT geni predstavljaju znaajne morfoloke vodie sa velikim znaajem u utvrdjivanju obrasca razvoja tela u svim prouavanim vrstama. Tako je u vrsti muica Drosophila melanogaster Wnt gen odgovoran za formiranje krila, a u ljudskoj vrsti smatra se znaajnim faktorom orjentacije polova centralnog nervnog sistema i formiranja ekstremiteta. Postoji vie lanova Wnt familije gena sa razliitom lokalizacijom na hromozomina (member 1 Chr 12q13; member 2 Chr 7q31; member 6 Chr 2q35).

Wnt protein vezuje se za elijski povrinski receptor iz grupe Frizzled familije (FRZ) to uslovljava aktivaciju Dishevelled proteina (DSH). Aktivirani DSH vezuje aksin i dovodi do inhibicije komplesa APC+Axin+GSK to za posledicu ima nakupljanje beta katenina i ispoljavanje njegovog efekta preko TCF/LEF familje transkriptornih faktora na specifine gene, prvenstveno aktivacijom RNA polimeraza za onkogene. Utvreno je da su mnogi onkogeni i tumor supresor geni homologi genima za koje se ve zna da imaju znaajnu ulogu u embrionalnom razvoju.Primeri ukljuuju komponente praktino svih velikih signalnih puteva u toku razvoja: Wnt, Hedgehog,TGFbeta,Notch, Ras/Raf/ERK i sl. Isti signalni putevi u elijama odrasle osobe kontroliu elijiski ivot i odravanje homeostaze. Apoptoza je esencijalni proces u odravanju normalnog balansa izmedju elijskog radjanja i umiranja.

Najznaajniji je mehanizam elijske smrti u sluajevima oteenja ili poremeaja u funkcionisanju elije. Karakteristika malignih elija je visoka rezistencija na apoptozu. Nadjene su mnoge mutacije koje inhibiraju apoptozu u elijama kancera, kao to je ve opisana mutacija p 53. Mutirani p 53 ne moe da aktivira bax gene ukoliko su oteenja DNA velika te nema procesa apoptoze, elija nastavlja da ivi i da se deli.

Sumirani prikaz nastanka maligniteta debelog creva

Telomera i telomeraze kao kontrolor deobe elije Telomeraza je enzim-rubonukleoprotein koji dodaje DNK sekvence (TTAGGG) na kraju DNK lanca u regionu telomere. Ovaj region sadri nekodiranu DNK, pri emu se pri svakom kopiranju hromozoma prilikom deobe elije gubi oko 100-200 nukleotida.

Telomeraza je reverzna transkriptaza koja nosi sopstveni RNK molekul, koga koristi kao uzorak prilikom produavanja telomere, koja se skrauje posle svake replikacije. Postojanje kompenzatornog mehanizma za skraivanje telomere pretpostavio je ruski biolog Aleksej Olovnikov 1974. godine, koji je ukazivao na znaaj telomere u starenju i kancerogenezi. Telomerazu su otkrili Carol Greider i Elizabeth Blackburn 1984. god, koji su za to otkrie dobili nobelovu nagradu 2009. god. elije koje imaju dovoljnu telomeraznu aktivnost smatraju se besmrtnim. Obzirom da se telomera skrauje pri

svakoj deobi usled, smanjene aktivnosti telomeraze dolazi do aktivacije tumorsupresor gena i elijski rast se zaustavlja. Meutim u sluaju izostanka zaustavljanja elijskog ciklusa, elija nastavlja da se deli to dovodi do niza hromozomskih aberacija i nakulpanja mutacija to moe uzrokovati reaktiviranje telomeraze, a usled mutacije onkogena i tumorsupresor gena nastaje maligna elija. Utvreno je da je telomeraza aktivna u 90% elija malignih tumora, ali i u stem elijama.

TEORIJA MATINE ELIJE TUMORA

Hipotetika regulacija matinih tumorskih elija zasnovana je na utvrenoj unutarelijskoj interreakciji aktivnih signalnih puteva od znaaja u genetskoj teoriji onkogeneze i to:

Hedgehog - cyclin D, cyclin E, Myc, epidermal growth factor pathway, PDGF i VEGF,

Notch - Ras , Wnt - , Bmi-1 - .

Prema ovoj teoriji opisano je nekoliko mehanizama nastanka matine elije tumora i to:

1) mutacije unutar normalnog progenitora uslovljavaju nekontrolisano samoobnavljanje novonastale tumorske matine elije

2) iz normalne pluri/multipotente elije koja se nalazi u kotanoj sri ili loi tkiva

pod dejstvom faktora transdiferencijacije usled hroninog zapaljenja ili kancerogenog dejstva hormona (npr. estrogena)

3) Fuzijom diferentovane i normalne pluri/multipotente elije

Ova teorija zasnovana je i na zajednikim svojstvima normalnih i malignih pluri/multi potentnih elija (Liu S, 2005) kao to su :

, , , , ( ), ,

+ = = +

, .

Mnoga istraivanja humanih (i) i miijih (ii) markera su pokazala zajednine tumorske markere i markere normalnih i malignih pluri/multi potentnih elija (Li 2007) Organ elijski markeri normalne stem elije elijski markeri kancerske stem

elije Hematopoetske elije

(i) CD34+ CD38- Thy1- Lin- 130, 131, 132, 133

(i) CD34+ CD38- Thy1- Lin- 32, 47

(ii) c-Kit+ Thy1low Sca1+ Lin- 134, 135

Dojka (ii) CD24med CD49fhi 6 (i) CD44+ CD24-/low ESA+ Lin- 33 (ii) CD29hi CD24+ Lin- 7 Mozak (i) CD133+ Lin- 41 (i) CD133+ 34, 35, 36 Plua (ii) Sca-1+ CD34+ Lin- 5 (ii) Sca-1+ CD34+ Lin- 5 Koa (ii) CD34+ CD71low 6-integrinhigh

136 (i) CD20+ 137

Prostata (i) CD133+ 21hi 138 (i) CD44+ 21hi CD133+ 139 U svetskim istraivakim centrima intenzivno se izuavaju faktori koji dovode do aktivacije tihe stem elije, njenog kretanja u organizmu i/ili tkivu, kao i zapoinjanja njene proliferacije a to je objanjenje reparacije i/ili fizioloke regeneracije tkiva. Poremeaji na nivou ovih faktora mogli bi uslovljavati i nastanak maligne matine elije tumora.