1

ชอเรอง การพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหยาเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด ดวยโครมาโ ทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง (Development and Analytical Method Validation for the Assay of Cefoperazone and Sulbactam for Injection by High Performance Liquid Chromatography) ชอผเขยน 1. นางสาวภณดา รตนานกล (ผประสานงาน) 2. นางสาวประชาพร ผลสน สถานทท างาน ศนยวทยาศาสตรการแพทยท 10 อบลราชธาน เมอง อบลราชธาน 34000 โทรศพท 045-312230-3 ตอ 207

2

บทคดยอ วธวเคราะหเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉดพฒนาขนโดยวธรเวอรสเฟส โครมาโทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง โดยใชคอลมน BDS Hypersil C18 สารละลายตวพาคอ 0.005 M Tetrabutylammonium hydroxide pH 4.0 และ acetonitrile อตราสวน 72 : 28 อตราการไหล 1.0 มลลลตรตอนาท ตรวจวดทความยาวคลน 230 นาโนเมตร การตรวจสอบความใชไดของวธแสดงถงความจ าเพาะเจาะจง โดยสามารถแยกเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมออกจากสารสลายตว กราฟมความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของเซโฟเพอราโซน 0.0720 ถง 0.2160 มลลกรมตอมลลลตร และซลแบคแทม 0.0750 ถง 0.2250 มลลกรมตอมลลลตร ไดคาสมประสทธสหสมพนธเทากบ 0.9999 และ 1.0000 การทดสอบความแมนของวธมคารอยละของการกลบคนเฉลยเทากบ 99.4 และ 100.4 คาเบยงเบนมาตรฐานเทากบ 0.9 และ 0.4 การทดสอบความทวนซ าไดและความเทยงของการวเคราะหมคารอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพนธอยในชวง 0.0 ถง 1.0 วธวเคราะหมความทนตอการเปลยนแปลงสภาวะตางๆ ททดสอบ ขดจ ากดของการตรวจพบและขดจ ากดของการหาเชงปรมาณของเซโฟเพอราโซนมคา 0.005 และ 0.014 มลลกรมตอมลลลตร และซลแบคแทม 0.0025 และ 0.0075 มลลกรมตอมลลลตร จากผลการตรวจสอบความใชไดของวธแสดงวาวธทพฒนาขนมความเหมาะสมในการน าไปใชเปนวธวเคราะหปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด Abstract The analytical method for Cefoperazone and Sulbactam for injection was developed using a reversed-phase high performance liquid chromatography. The stationary phase was Hypersil BDS C18 Column while the optimum mobile phase was 0.005M Tetrabutylammonium hydroxide pH4.0 and acetonitrile (72:28), with a flow rate of 1.0 ml/min. and the detector wavelength at 230 nm. Method validation data showed a good specificity by separation of Cefoperazone and Sulbactam from the unknown degradation products. The linearity at the concentration was found at the range of 0.0720 to 0.2160 mg/ml for Cefoperazone and 0.0750 to 0.2250 mg/ml for those of Sulbactam, with the correlation coefficient of 0.9999 and 1.0000 respectively. Mean percentage recoveries of Cefoperazone and Sulbactam were 99.4 (%RSD = 0.9) and 100.4 (%RSD = 0.4) respectively. The repeatability and precision varied from 0.0 to 1.0 %RSD. The method was rugged and robust to the variations. The detection limit and the quantitation limit were 0.005 and 0.014 mg/ml for Cefoperazone and for Sulbactam were 0.0025 and 0.0075 mg/ml. The developed method is therefore suitable for assay of Cefoperazone and Sulbactam for injection.

3

Keywords: Cefoperazone and sulbactam for injection, method validation, reversed-phase high performance liquid chromatography

บทน า ยาสตรผสมเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด (Cefoperazone and Sulbactam for

injection) เปนยาสตรผสมระหวาง เซโฟเพอราโซน ซงเปนยาปฏชวนะกลมเซฟาโรสปอรน (cephalosporins) รนทสาม ( third-generation) ออกฤทธฆาเชอแบคทเรยโดยมกลไกการออกฤทธคลายยา กลมเพนซลลน (penicillins) คอสามารถยบย งการสรางผนงเซลลของแบคทเรยในขนตอน traspeptidation ซงเปนขนตอนสดทายในการสรางผนงเซลล ท าใหเชอแบคทเรยมผนงเซลลทผดปกต ซงไมสามารถทนตอแรงดนออสโมซส เซลลจะแตกสลายและแบคทเรยตายในทสด เซโฟเพอราโซน ใชส าหรบรกษาโรคตดเชอแบคทเรยแกรมบวก เชน Staphylococci sp. และ Streptococci sp. และแกรมลบหลายชนด เชน Pseudomonas aeruginosa (1) สวนซลแบคแทม เปนตวยบย งเอนไซมบตา-แลคแทมเมส (β-lactamase) ซงเปนเอนไซมของเชอแบคทเรยทสามารถท าลายยาปฏชวนะ ซงเปนสาเหตใหแบคทเรยดอตอยาปฏชวนะหลายชนด

เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทน ามาเตรยมเปนยาฉดในรปแบบผงยาผสมน ากอนใชนนเปนเกลอโซเดยมทละลายน าไดด มสตรโครงสรางทางเคมดงภาพท 1 และ 2 (2)

ภาพท 1 สตรโครงสรางทางเคมเซโฟเพอราโซน โซเดยม ภาพท 2 สตรโครงสรางทางเคมซลแบคแทม โซเดยม

จากคณสมบตสามารถยบย งการเจรญเตบโตของแบคทเรยหลายชนดท าให เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม เปนยาท มขอบงใชในการรกษาโรคตดเชอของทางเดนหายใจทงสวนบนและสวนลาง โรคตดเชอของทางเดนปสสาวะทงสวนบนและสวนลาง อาการเยอบชองทองอกเสบ ถงน าดอกเสบ ทอทางเดนน าดอกเสบ และโรคตดเชออนๆภายในชองทอง อาการตดเชอในกระแสโลหต โรคตดเชอของผวหนงและเนอเยอออน โรคตดเชอของกระดกและขอ อาการอกเสบภายในองเชงกราน เยอบมดลกอกเสบ โรคหนองใน และโรคตดเชออนๆของระบบสบพนธ (1) จากคณสมบตในการรกษาการตดเชอท

4

ครอบคลมหลายระบบในรางกาย ท าใหมการใชยาดงกลาวอยางกวางขวาง เปนทางเลอกของผทแพยาปฏชวนะกลมอนๆ และยงจดเปนยาในบญชยาหลกแหงชาต พ.ศ. 2556 บญช ง ซงใชส าหรบการตดเชอในโรงพยาบาล (nosocomial infection) จากแบคทเรยแกรมลบ โดยเฉพาะการตดเชอ Acinetobacter sp. (3)

ปจจบนม เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด ทขนทะเบยนต ารบยาในประเทศไทย 24 ต ารบ จ าแนกเปนผลตในประเทศ 9 ต ารบ และน าเขาจากตางประเทศ 15 ต ารบ เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด 1 กรม ประกอบดวย เซโฟเพอราโซน 500 มลลกรม และซลแบคแทม 500 มลลกรม และขนาดเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด 1.5 กรม ประกอบดวย เซโฟเพอราโซน 1000 มลลกรม และซลแบคแทม 500 มลลกรม (4)

การวเคราะหหาปรมาณ เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ในรปแบบยาฉดยงไมมวธมาตรฐานทใชในการตรวจวเคราะหทงในต ารายาของสหรฐอเมรกา ( USP) ต ารายาของยโรป ( Ph. Eur.) และต ารายาของสหราชอาณาจกร (BP) ซงในต ารายาของสหรฐอเมรกาและต ารายาของสหราชอาณาจกรพบเพยงการตรวจวเคราะหวตถดบของ เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ในการตรวจวเคราะหยา เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉดตามโครงการสรางหลกประกนคณภาพและมาตรฐานบรการดานยาปงบประมาณ 2557 ศนยวทยาศาสตรการแพทยท 10 อบลราชธานท าการตรวจวเคราะหตามทะเบยนต ารบยา ซงใชสารเคม และวธการตรวจวเคราะหทตางกน ท าใหใชเวลาและสนเปลองสารเคมมาก ผวจย จงท าการพฒนาวธวเคราะหโดยใชเทคนค รเวอรสเฟสโครมาโทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง (reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) โดยพฒนาจากงานวจยของ Sreenivasulu และ Rani (5) เรอง Validated RP-HPLC method for simultaneous estimation of sulbactam and cefoperazone in bulk and pharmaceutical dosage form งานวจยดงกลาวใชสภาวะของโครมาโทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง ดงน คอลมน phenomenex C18 ขนาด 4.6 x 150 มลลเมตร บรรจอนภาคขนาด 5 ไมโครเมตร สารละลายตวพาคอบฟเฟอร pH 6.6 กบ acetonitrile ในอตราสวน 70 : 30 อตราการไหล 0.8 มลลลตรตอนาท ตรวจวดทความยาวคลน 230 นาโนเมตร พบพคของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมท retention time เทากบ 9.32 และ 5.33 ตามล าดบ run time เทากบ 20 นาท ซงสภาวะดงกลาวใชเวลานาน และตรวจสอบความถกตองของวธทพฒนาขนตามหลกเกณฑของต ารายา USP (6) และ ICH Guideline (7) โดยศกษาความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ ความจ าเพาะเจาะจงของวธ ความเปนเสนตรงและชวงของการวเคราะห ความแมน ความเทยง ความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง ความทนของวธ ขดจ ากดของการตรวจพบและขดจ ากดเชงปรมาณ เพอลดเวลาในการตรวจวเคราะห และใชเปนวธมาตรฐานของศนยวทยาศาสตรการแพทยท 10 อบลราชธาน ท าการ

5

พฒนาวธวเคราะหโดยใชเทคนค รเวอรสเฟสโครมาโทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง ( reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) เลอกใชคอลมนชนด BDS Hypersil C18 ขนาด 4.6 x 100 มลลเมตร ขนาดอนภาค 3 ไมโครเมตร สารละลายตวพาประกอบดวยสวนผสมของสารละลาย 0.005M Tetrabutylammonium hydroxide pH 4.0 และ acetonitrile ในอตราสวน 72 : 28 โดยปรมาตร อตราการไหลของตวพา 1.0 มลลลตรตอนาท ตรวจวดทความยาวคลน 230 นาโนเมตร ในการตรวจวเคราะหคณภาพยา เซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ในรปแบบยาฉด เพอเปนการคมครองผบรโภค ใหผบรโภคไดใชยาทมประสทธภาพในการบ าบดรกษาโรค

วสดและวธการ เครองมอและอปกรณ

1. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ผลตภณฑของ Agilent สหพนธสาธารณรฐเยอรมน

2. เครองชง : Sartorius ED224S ผลตภณฑของ Sartorius สหพนธสาธารณรฐเยอรมน 3. Ultrasonic bath : 175DAE ผลตภณฑของ Crest Ultrasonics สหรฐอเมรกา 4. คอลมน : Hypersil BDS C18 ขนาด 4.6 x 100 มลลเมตร บรรจอนภาคขนาด 3

ไมโครเมตรผลตภณฑของ Thermo Scientific 5. pH meter : Metrohm 702 SM Titrino ผลตภณฑของ Metrohm Herisae สวตเซอแลนด

สารเคม Acetonitrile, HPLC grade ผลตภณฑของ Merck; Tetrabutylammonium hydroxide 40%, HPLC

gradeผลตภณฑของ Fluka; Phosphoric acid, AR grade ผลตภณฑของ Merck; น า HPLC quality สารมาตรฐาน

1. USP Cefoperazone Dihydrate Reference Standard CAT. No. 1623670 Lot No. IOK056 2. USP Sulbactam Reference Standard CAT. No. 1097705 Lot No. JOJ117

ตวอยาง ตวอยางยาเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ในรปแบบยาฉด ประกอบดวยผงยาเซโฟเพอราโซน 500 มลลกรม และซลแบคแทม 500 มลลกรมตอ 1 ขวดยาฉด

6

การเตรยมสารละลายตวพา (Mobile phase) เตรยมสารละลาย 0.005M tetrabutylammonium hydroxide โดยเจอจางสารละลาย tetrabutylammonium hydroxide (40% ) 3.3 ml ดวยน า 900 ml ปรบ pH เทากบ 4.0 ± 0.1 ดวย phosphoric acid ปรบปรมาตรดวยน าใหครบ 1000 ml จากนนผสม 0.005 M tetrabutylammonium hydroxide pH4.0 กบ acetonitrile ในอตราสวน 72 : 28 โดยปรมาตรและกรองผานแผนกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตร การเตรยมสารละลายมาตรฐาน

ชงสารมาตรฐานเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม 15 มลลกรม ลงใน volumetric flask ขนาด 100 มลลลตร ละลายและปรบปรมาตรดวยสารละลายตวพา กรองผานแผนกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตร การเตรยมสารละลายตวอยาง ละลายผงตวอยางยาในขวดบรรจยาฉดดวยสารละลายตวพา ใสใน volumetric flask ขนาด 100 มลลลตร ปรบปรมาตรจนครบ 100 มลลลตร ดวยสารละลายตวพา จากนนปเปตสารละลายนมา 3 มลลลตร ใสใน volumetric flask ขนาด 100 มลลลตร ปรบปรมาตรจนครบ 100 มลลลตร ดวยสารละลายตวพา จะมความเขมขนของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม เทากบ 0.15 มลลกรมตอมลลลตร กรองผานแผนกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตร (ใชทนท) สภาวะของระบบโครมาโทกราฟ (HPLC)

HPLC column : Hypersil BDS C18 ขนาด 4.6 x 100 บรรจอนภาคขนาด 3 ไมโครเมตรMobile phase : 0.005 M Tetrabutylammonium hydroxide pH4.0 : acetronitrile =72:28 Flow rate : 1.0 ml/minute Detector : UV 230 nm

Injection volume : 10 µl การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (Method validation)

1. การทดสอบความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ (Chromatographic system suitability) เตรยมสารละลายมาตรฐานเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในสารละลายตวพาใหมความ

เขมขน 1.0 มลลกรมตอมลลลตร ปเปตสารละลายมาตรฐานน 1.5 มลลลตรลงใน volumetric flask ขนาด 10 มลลลตร เตม 3 M hydrochloric acid 0.2 มลลลตร ตมในน า 80 องศาเซลเซยส 3 ชวโมง ตงทงไวใหเยน ปรบปรมาตรดวยสารละลายตวพาแลวกรองผานแผนกรอง 0.22 ไมโครเมตร น าไปวเคราะหดวยเครอง HPLC ตรวจสอบพารามเตอรตางๆ เชน %RSD, retention time, theoretical plate, tailing factor

7

และ resolution ซงค านวณตามวธของ USP (6) จากโปรแกรมอตโนมตของเครอง HPLC ฉดซ า 3 ครง เพอแสดงความเหมาะสมของระบบทใช

2. การทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของวธ (Selectivity/Specificity) เตรยมสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในสารละลายตวพาใหมความเขมขน

1.0 มลลกรมตอมลลลตร ปเปตสารละลายตวอยางน 1.5 มลลลตรลงใน volumetric flask ขนาด 10 มลลลตร น ามาท าใหสลายตวในสภาวะตางๆ ปรบปรมาตร ดวยสารละลายตวพาแลวกรองผานแผนกรอง 0.22 ไมโครเมตร สภาวะตางๆ ทท าใหเกดการสลายตว

1. ท าใหรอนท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 2. เตมสารละลาย 35%hydrogen peroxide จ านวน 1 หยด แลวน าไปท าใหรอนท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 3. เตมสารละลาย 3M hydrochloric acid จ านวน 1 หยด แลวน าไปท าใหรอนท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 4. เตมสารละลาย 3M sodium hydroxide จ านวน 1 หยด แลวน าไปท าใหรอนท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 5. น าไปผงแดด นาน 6 ชวโมง

วเคราะหสารละลายตวอยางทท าใหเกดการสลายตวทสภาวะตางๆ ดวยเครอง HPLC เพอศกษาการรบกวนจากสารสลายตว ค านวณรอยละของสารสลายตวโดยเปรยบเทยบคาพนทใตพคของสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทสภาวะปกต

3. การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของการวเคราะห (Linearity and Range) ชงสารมาตรฐานเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม 25.5 และ 25.1 มลลกรม (%purity ของสาร

มาตรฐานเซโฟเพอราโซนเทากบ 94.7 และของสารมาตรฐานซลแบคแทมเทากบ 99.7) ลงใน volumetric flask ขนาด 50 มลลลตร ละลายและปรบปรมาตรดวยสารละลายตวพา จะมความเขมขนของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมเทากบ 0.48 และ 0.50 มลลกรมตอมลลลตร ตามล าดบ จากนนเจอจางสารละลายดงกลาวใหมความเขมขนเปนรอยละ 50, 75, 100, 125 และ 150 ของระดบความเขมขนทใชตรวจวเคราะห จะมความเขมขนของเซโฟเพอราโซนเทากบ 0.0720, 0.1075, 0.1449, 0.1787 และ 0.2160 มลลกรมตอมลลลตร และจะมความเขมขนของซลแบคแทมเทากบ 0.0750, 0.1120, 0.1500, 0.1850 และ 0.2250 มลลกรมตอมลลลตร กรองสารละลายผานแผนกรอง 0.22 ไมโครเมตร น าไปวเคราะหดวยเครอง HPLC โดยฉดความเขมขนละ 6 ซ า ศกษาความสมพนธระหวางความเขมขนและพนทใตพคสรางกราฟมาตรฐาน

8

ระหวางความเขมขนและพนทใตพค ค านวณคาสมประสทธสหสมพนธ ( Correlation coefficient, r) ซงตองมคาไมนอยกวา 0.995 (7)

4. การทดสอบความแมน (Accuracy) ทดสอบความแมนของวธโดยการวเคราะหสารละลายตวอยางทเตมสารละลายมาตรฐานเซโฟ

เพอราโซนและซลแบคแทม ( spiked sample solution) ท 5 ระดบความเขมขน คอ 0.075, 0.1125, 0.150, 0.1875 และ 0.2250 มลลกรมตอมลลลตร คดเปนรอยละ 50, 75, 100, 125 และ 150 ของระดบความเขมขนทใชวเคราะหหาปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในตวอยาง ตามล าดบ โดยทดสอบความเขมขนละ 3 ซ า วเคราะหปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทงหมดทมในสารละลายเพอค านวณคารอยละของการกลบคน (% recovery) ทแตละระดบความเขมขน และคารอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (% Relative standard deviation, %RSD) ของการกลบคนทกความเขมขน โดยทคาเฉลยรอยละของการคนกลบตองอยในชวง 98.0 – 102.0 และคา %RSD ไมเกน 2.0 (7)

สรางกราฟหาความสมพนธระหวางปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทเตม และปรมาณทตรวจพบ ค านวณคาสมประสทธสหสมพนธ (correlation coefficient, r) ก าหนดใหคา r ไมต ากวา 0.995 (7)

5. การทดสอบความเทยง (Precision) 5.1 ความทวนซ าได (Repeatability)

5.1.1 ความเทยงของระบบ (System precision) ฉดสารละลายมาตรฐานเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ความเขมขน 0.15 มลลกรมตอ

มลลลตร จ านวน 3 ตวอยาง แตละตวอยางฉดซ า 6 ครง ค านวณ %RSD ของพนทใตพคเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม คา %RSD ไมเกน 2.0 (7)

5.1.2 ความเทยงของวธ (Method precision) ฉด Spiked sample solution ทความเขมขน 0.15 มลลกรมตอมลลลตร จ านวน 3 ตวอยาง

แตละตวอยางฉดซ า 6 ครง ค านวณ %RSD ของพนทใตพคเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม คา %RSD ไมเกน 2.0 (7) 5.2 ความเทยงของการเปลยนสภาวะ (Intermediate Precision)

วเคราะหปรมาณตวยาส าคญในตวอยางยาเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ในรปแบบยาฉด จ านวน 6 ซ า โดยทดสอบตางวน เปนเวลา 2 วน เปลยนนกวเคราะห จ านวน 2 คน และเปลยนเครอง HPLC จ านวน 2 เครอง ค านวณปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม คาเฉลย และ %RSD โดยคา %RSD ไมเกน 2.0 (7)

9

6. ความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง ฉดสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทความเขมขน

0.15 มลลกรมตอมลลลตร ทกๆ 1 ชวโมง เปนเวลา 24 ชวโมงตดตอกน ค านวณปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม เปรยบเทยบกบปรมาณท 0 ชวโมง โดยใหปรมาณท 0 ชวโมง เปน 100% ปรมาณทพบในเวลาตางๆ ควรไมนอยกวา 95% เพอดความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยางในระหวางท าการทดสอบ

7. การทดสอบความทนของวธ (Robustness) 7.1 ความคงสภาพของคอลมน ในระหวางการศกษาทดสอบความถกตองของวธวเคราะหใหตรวจสอบประสทธภาพของคอลมน

โดยท าการบนทกคา theoretical plates ในวนทเรมตน และในระหวางการทดสอบจนจบการทดลอง นบจ านวนครงทฉดสารละลายมาตรฐาน และสารละลายตวอยางในการทดสอบทงหมด คา theoretical plates ควรมคามากกวา 2,000 (ตอความยาวคอลมน) (8)

7.2 ผลกระทบของการเปลยนแปลงสภาวะของระบบ HPLC ศกษาผลกระทบตอการวเคราะหยาจากการเปลยนแปลงสภาวะตางๆ ของระบบโครมาโทกราฟ

คอ คอลมน สดสวนของสารละลายตวพา คาความเปนกรด-เบส ( pH) ของสารละลายบฟเฟอรในสารละลายตวพา และอตราการไหลของสารละลายตวพา (Flow rate) โดยวเคราะหปรมาณตวยาส าคญในตวอยางยาเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม จ านวน 3 ซ า ศกษาพารามเตอรตางๆ ทอาจมผลกระทบตอความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ เชน ลกษณะรปรางพค (คา tailing factor ไมเกน 2.0) retention time และ theoretical plates พรอมทงค านวณปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม เปรยบเทยบผลวเคราะหทไดโดยค านวณคา %RSD ตองไมเกน 2.0

8. ขดจ ากดของการตรวจพบ (Detection Limit) และขดจ ากดของการหาเชงปรมาณ (Quantitation Limit) ของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ค านวณขดจ ากดของการตรวจพบและขดจ ากดของการหาเชงปรมาณของเซโฟเพอราโซนและซล

แบคแทม โดยค านวณจาก slope และ intercept ของกราฟมาตรฐาน (7) ผล

1. การพฒนาวธวเคราะห จากการพฒนาวธวเคราะหโดยใชเทคนค รเวอรสเฟสโครมาโทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง

(reversed phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) โดยเลอกใชคอลมนชนด BDS

10

Hypersil C18 ขนาด 4.6 x 100 มลลเมตร ขนาดอนภาค 3 ไมโครเมตร สารละลายตวพาประกอบดวยสวนผสมของสารละลาย 0.005M Tetrabutylammonium hydroxide pH 4.0 และ acetonitrile ในอตราสวน 72 : 28 โดยปรมาตร อตราการไหลของตวพา 1.0 มลลลตรตอนาท ตรวจวดทความยาวคลน 230 นาโนเมตร พบพคของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมท retention time เทากบ 5.0 และ 2.9 ตามล าดบ run time เทากบ 10 นาท

2. การทดสอบความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ (Chromatographic system suitability)

จากการฉดสารละลายส าหรบตรวจสอบความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ ไดคา retention time ของสารทออกมาเรยงตามล าดบดงน เซโฟเพอราโซนเทากบ 5.0 ซลแบคแทม เทากบ 2.9 สารสลายตวพคท 1 เทากบ 1.0 สารสลายตวพคท 2 เทากบ 1.2 สารสลายตวพคท 3 เทากบ 1.9 สารสลายตวพคท 4 เทากบ 2.1 สารสลายตวพคท 5 เทากบ 2.6 สารสลายตวพคท 6 เทากบ 3.5 และสารสลายตวพคท 7 เทากบ 3.7 (ภาพท 3 และตารางท 1)

ภาพท 3 โครมาโตแกรมของสารละลายมาตรฐานเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในสภาวะกรด

Tailing factor ของทกพคประมาณ 0.9 ถง 1.4 Theoretical plate ของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมเทากบ 10723 และ 9108 ตามล าดบ %RSD ของการฉดซ า 3 ครง ของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมเทากบ 0.2 และ0.1 ตามล าดบ สารสลายตวท Relative retention time เทากบ 0.51 และ 0.75 มคา resolution เทากบ 1.8 และ 7.1 ตามล าดบ

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

พค 1

พค 2

พค 4

พค 5

พค 6

พค 7

พค 3

11

ตารางท 1 คา tailing factor, theoretical plate, resolution ของสารละลายส าหรบตรวจสอบความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ

พค 1 พค 2 พค 3 พค 4 พค 5 ซลแบค แทม

พค 6 พค 7 เซโฟเพอราโซน

Retention time

1.0 1.2 1.9 2.1 2.6 2.9 3.5 3.7 5.0

Tailing factor

1.3 1.1 1.0 1.1 0.9 1.1 1.0 1.1 1.2

Theoretical plate

1500 2442 6058 9899 4230 9108 11142 9418 10723

Resolution 1.8 7.1

3. การทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของวธ (Selectivity/Specificity) จากการฉดสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทท าใหเกดการสลายตวทสภาวะ

ตางๆ เปรยบเทยบกบสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทสภาวะปกต พบวาสามารถแยกสารสลายตวจากสภาวะตางๆ ออกจากพคของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม (ภาพท 4)

12

ภาพท 4 โครมาโตแกรมของสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม (A) และสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทท าใหเกดการสลายตวทสภาวะตางๆ คอ ท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง (B), สภาวะออกซเดชนท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง (C), สภาวะกรดท 80 องศา

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(F)

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

เซโฟ

เพอราโซน

ซลแบ

คแทม

พค 1 พค 2

พค 4

พค 5

พค 6

พค 7

พค 3

พค 1

พค 2

พค 4

พค 5

พค 6

พค 7

พค 3

พค 8

พค 9

พค 9

พค 1

พค 2

พค 5

พค 6 พค

3

พค 7

พค 4

พค 1 พค 2 พค

3

พค 4

พค 1

พค 2

พค 3

พค 4

13

เซลเซยส นาน 3 ชวโมง (D), สภาวะเบสท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง (E), และสภาวะทถกแสงแดดนาน 6 ชวโมง (F)

เซโฟเพอราโซนเกดการสลายตวจากความรอนท 80 องศาเซลเซยส ในสภาวะออกซเดชน ในสภาวะกรด ในสภาวะดางท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง และเรงดวยแสงแดด โดยมการสลายตวคดเปนรอยละเทากบ 51.1, 86.7, 40.7, 97.2 และ 39.7 ตามล าดบ และตรวจพบสารสลายตวทเวลาตางๆ สวนซลแบคแทมมความทนตอความรอนท 80 องศาเซลเซยส โดยไมพบการสลายตว แตพบการสลายตวจากสภาวะออกซเดชน ในสภาวะกรด ในสภาวะเบสท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง และเรงดวยแสงแดด โดยมการสลายตวคดเปนรอยละเทากบ 57.5, 9.1, 100.0, และ 8.3 ตามล าดบ (ตารางท 2)

ตารางท 2 สภาวะทศกษาการสลายตวของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมและสารสลายตวทพบ

สภาวะทท าใหเกดการสลายตว %การสลายตว

Retention time ของสารสลายตว (นาท) เซโฟเพอราโซน

ซลแบคแทม

80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 51.1 0.0 1.2, 1.9, 2.1, 2.2, 2.7, 3.2, 3.5 ออกซเดชนท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง

86.7 57.5 1.0, 1.2, 1.9, 2.1, 2.4, 2.7, 3.2, 3.3, 3.6, 3.9

กรด ท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 40.7 9.1 1.0, 1.2, 1.9, 2.1, 2.6, 3.5, 3.7 เบส ท 80 องศาเซลเซยส นาน 3 ชวโมง 97.2 100.0 1.0, 1.9, 2.7 แสงแดด นาน 6 ชวโมง 39.7 8.3 2.6, 3.2, 3.5, 4.1

4. การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของการวเคราะห (Linearity and Range)

จากการฉดสารละลายมาตรฐานเซโฟเพอราโซนทความเขมขนตางๆกน 5 ระดบ ตงแต 0.0720 ถง 0.2160 มลลกรมตอมลลลตร และซลแบคแทมทความเขมขนตางๆ กน 5 ระดบ ตงแต 0.0750 ถง 0.2250 พบวาความสมพนธระหวางความเขมขนของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม กบพนทใตพคมลกษณะเปนเสนตรงตลอดชวงความเขมขนททดสอบ โดยมคาสมประสทธสหสมพนธ (r) เทากบ 0.9999 และ 1.0000 ตามล าดบ ภาพท 5, 6

14

ภาพท 5 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ ภาพท 6 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ สารละลายมาตรฐานเซโฟเพอราโซนกบพนทใตพค สารละลายมาตรฐานซลแบคแทม กบพนทใตพค

จาการฉด Spiked sample solution ทความเขมขน 0.075, 0.1125, 0.150, 0.1875 และ 0.2250 มลลกรมตอมลลลตร พบวาความสมพนธระหวางปรมาณเซโฟเพอราโซนทเตม กบปรมาณทตรวจพบมลกษณะเปนเสนตรงตลอดชวงความเขมขนททดสอบ โดยมคาสมประสทธสหสมพนธ (r) เทากบ 1.0000 และความสมพนธระหวางซลแบคแทมทเตมกบปรมาณทตรวจพบ มลกษณะเปนเสนตรงตลอดชวงความเขมขนททดสอบ โดยมคาสมประสทธสหสมพนธ (r) เทากบ 1.0000 ภาพท 7, 8

ภาพท 7 ความสมพนธระหวางปรมาณ ภาพท 8 ความสมพนธระหวางปรมาณ เซโฟเพอราโซนทเตมกบปรมาณทตรวจพบ ซลแบคแทม ทเตมกบปรมาณทตรวจพบ

15

5. การทดสอบความแมน (Accuracy) จากการฉด Spiked sample solution ทความเขมขน 5 ระดบ พบวาคาเฉลยรอยละของการกลบคน

(percent recovery) ของเซโฟเพอราโซนเทากบ 98.2, 99.3, 100.7, 100.2 และ99.7 ตามล าดบ และซลแบคแทม เทากบ 99.8, 100.3, 101.4, 100.9 และ 100.4 ตามล าดบ คารอยละของการกลบคนในทกระดบความเขมขนอยในเกณฑทยอมรบได ในชวงรอยละ 98.0 – 102.0 และ %RSD ไมเกน 2.0 (ตารางท 3 )

ตารางท 3 ผลการทดสอบความแมน (Accuracy)

สารทเตม ปรมาณสาร ทเตม(มก)

(n = 3)

ปรมาณสาร ทตรวจพบ(มก)

(n = 3)

รอยละของการกลบคน

(n = 3)

%RSD

เซโฟเพอราโซน

0.2390 0.2347 98.2 0.9 0.5975 0.5934 99.3 0.9 0.9461 0.9627 100.7* 0.5 1.3146 1.3172 100.2 0.3 1.6731 1.6681 99.7 0.4

ซลแบคแทม

0.2500 0.2495 99.8 0.7 0.6250 0.6269 100.3 1.1 1.0000 1.0140 101.4* 0.6 1.3750 1.3874 100.9 0.3 1.7500 1.7570 100.4 0.5

*ระดบความเขมขนทใชในการตรวจวเคราะห

6. การทดสอบความเทยง (Precision)

6.1 ความทวนซ าได (Repeatability) 6.1.1 ความเทยงของระบบ (System precision)

จากการฉดสารละลายมาตรฐานเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ซงมความเขนขน 0.15 มลลกรมตอมลลลตร จ านวน 3 ตวอยาง แตละตวอยางฉดซ า 6 ครง ค านวณคาเฉลยของพนทใตพค และคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธได %RSD แสดงดงตารางท 4

16

ตารางท 4 ผลการทดสอบความเทยงของระบบ (System precision)

ครงท พนทใตพค เซโฟเพอราโซน ซลแบคแทม ตวอยางท 1 ตวอยางท 2 ตวอยางท 3 ตวอยางท 1 ตวอยางท 2 ตวอยางท 3

1 3560145 3572567 3552636 405334 409373 407873 2 3560379 3573202 3554431 406854 408824 407820 3 3555056 3572290 3551340 406510 408936 406359 4 3554835 3571747 3549946 406250 409221 407431 5 3551937 3572791 3550651 406777 409310 407714 6 3546660 3571554 3547075 405933 409097 407336

Mean 3554835 3572359 3551013 406276 409127 407422 %RSD 0.1 0.02 0.1 0.1 0.1 0.1

6.1.2 ความเทยงของวธ (Method precision)

จากการฉดสารละลาย Spiked sample solution ทระดบความเขมขน 0.15 มลลกรมตอมลลลตร ใน 3 ตวอยาง แตละตวอยางฉดซ า 6 ครง ค านวณคาเฉลยของพนทใตพค และคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธได %RSD แสดงดงตารางท 5

ตารางท 5 ผลการทดสอบความเทยงของวธ (Method precision)

ครงท พนทใตพค เซโฟเพอราโซน ซลแบคแทม

ตวอยางท 1 ตวอยางท 2 ตวอยางท 3 ตวอยางท 1 ตวอยางท 2 ตวอยางท 3 1 3669233 3672520 3684478 419434 419446 421709 2 3673481 3667040 3693652 419656 418725 423134 3 3668017 3672994 3687643 419342 420459 421989 4 3662478 3666379 3681380 418401 417921 421948 5 3662794 3668423 3682648 418571 419291 421178 6 3664838 3664734 3679548 418829 418939 421283

Mean 3666807 3668682 3684892 419039 419130 421874 %RSD 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2

17

6.2 ความเทยงของการเปลยนสภาวะ (Intermediate Precision) จากการวเคราะหสารละลายตวอยาง วนละ 6 ตวอยาง ท าการทดสอบ 2 วน โดยใช

นกวเคราะห 2 คน และเครองมอ 2 เครอง ค านวณรอยละของปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมเทยบกบสารมาตรฐาน และ%RSD ของแตละวน พบวา %RSD ของการทดสอบภายในวนเทากบ 0.4 และ 0.2 และ %RSD ของการทดสอบระหวางวนเทากบ 0.3 ซงไมเกน 2.0 ดงตารางท 6 และ 7 ตารางท 6 ผลการทดสอบความเทยงของการเปลยนสภาวะ Intermediate Precision ของเซโฟเพอราโซน

รายการททดสอบ ปรมาณของ Cefoperazone (% labeled amount)

Intermediate Precision

1 2 3 4 5 6 เฉลย %RSD เฉลย %RSD

ระหวางวน วนท 1 95.6 94.8 95.4 95.2 94.6 94.7 95.1 0.4

94.7 0.5 วนท 2 94.3 94.1 94.4 94.6 94.3 94.0 94.3 0.2

ระหวางนกวเคราะห

คนท 1 95.6 94.8 95.4 95.2 94.6 94.7 95.1 0.4 95.9 1.0

คนท 2 96.7 96.8 97.3 96.9 96.4 96.4 96.8 0.4 ระหวางเครองมอ

HPLC1 95.6 94.8 95.4 95.2 94.6 94.7 95.1 0.4 94.9 0.4

HPLC2 94.3 94.6 94.8 94.9 94.8 94.7 94.7 0.2

ตารางท 7 ผลการทดสอบความเทยงของการเปลยนสภาวะ Intermediate Precision ของซลแบคแทม

รายการททดสอบ ปรมาณของ Sulbactam (% labeled amount)

Intermediate Precision

1 2 3 4 5 6 เฉลย %RSD เฉลย %RSD

ระหวางวน วนท 1 101.9 101.4 102.1 101.9 100.9 101.6 101.6 0.4

101.1 0.7 วนท 2 100.5 100.2 100.6 101.0 100.6 100.3 100.5 0.3

ระหวางนกวเคราะห

คนท 1 101.9 101.4 102.1 101.9 100.9 101.6 101.6 0.4 101.7 0.4

คนท 2 101.6 101.8 102.4 102.0 101.4 101.3 101.8 0.4 ระหวางเครองมอ

HPLC1 101.9 101.4 102.1 101.9 100.9 101.6 101.6 0.4 101.5 0.5

HPLC2 100.4 101.0 101.8 101.8 101.4 101.3 101.3 0.5

7. การทดสอบความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง จากการฉดสารละลายมาตรฐานสารละลายตวอยางเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทความ

เขมขน 0.15 มลลกรมตอมลลลตร ทกๆ 1 ชวโมง เปนเวลา 24 ชวโมงตดตอกน พบวาสารละลายมความคงสภาพในระหวางทดสอบได 24 ชวโมง โดยสารละลายมาตรฐานมปรมาณเซโฟเพอราโซนและซล

18

แบคแทม รอยละ 97.5 และ 99.7 ตามล าดบ และสารละลายตวอยางมปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม รอยละ 96.8 และ 100.0 ตามล าดบ เมอเทยบกบปรมาณทจดเรมตน

8. การทดสอบความทนของวธวเคราะห (Robustness) 8.1 ความคงสภาพของคอลมน จากการตรวจสอบประสทธภาพของคอลมน Hypersil BDS C18 ทใชในการศกษาครงนโดย

บนทกคา theoretical plates ของพคเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม เมอเรมตนใชเทากบ 11644 และ 9936 ตามล าดบ หลงจากจบการทดสอบ พบวาฉดสารละลายตางๆ ประมาณ 500 ครง คา theoretical plates เทากบ 10810 และ 9138 ตามล าดบ

8.2 ผลกระทบของการเปลยนแปลงสภาวะของระบบ HPLC จากการทดลองเปลยนสภาวะตางๆของระบบโครมาโทกราฟ เพอศกษาคาพารามเตอรตางๆ เชน

retention time, tailing factor และ theoretical plates รวมทงวเคราะหหาปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในตวอยางยาฉด เพอเปรยบเทยบผลวเคราะห จากผลการทดสอบพบวา สภาวะตางๆ ของระบบโครมาโทกราฟทมการเบยงเบนไป ยงคงใหผลการวเคราะหปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมทมคา %RSD ไมเกน 2.0 และคา theoretical plates มคามากกวา 2,000 tailing factor ไมเกน 1.3 ดง ตารางท 8 และ 9 ตารางท 8 ผลการทดสอบความทนของวธวเคราะห (Robustness) ของเซโฟเพอราโซน

สภาวะของระบบ โครมาโทกราฟ

Retention Theoretical Tailing ปรมาณของ Cefoperazone (% labeled amount) time plates factor 1 2 3 เฉลย %RSD

HPLC column

No. 1 5.1 8869 0.9 96.3 96.8 97.1 96.7 0.4 No. 2* 5.0 11181 1.2 96.2 96.7 96.9 96.6 0.4 No. 3 4.9 11735 1.2 96.1 96.8 97.0 96.6 0.5

สดสวนของตวพา

70/30 4.0 10774 1.2 97.7 97.2 97.0 97.3 0.4 72/28* 5.0 11233 1.2 97.6 96.9 96.5 97.0 0.6 75/25 8.1 11886 1.2 97.7 97.2 97 97.3 0.4

pH ของ buffer

3.9 5.0 11382 1.1 97.4 97.1 96.9 97.1 0.3 4.0* 5.0 11233 1.2 97.6 96.9 96.5 97.0 0.6 4.1 5 11288 1.2 97.4 96.9 96.7 97.0 0.4

Flow rate 0.9 5.6 11908 1.2 97.8 97.0 97.1 97.3 0.4 1.0* 5.0 11233 1.2 97.6 96.9 96.5 97.0 0.6 1.1 4.6 10815 1.2 97.6 97.3 97.1 97.3 0.3

*สภาวะของระบบโครมาโทกราฟทท าการตรวจสอบความถกตอง

19

ตารางท 9 ผลการทดสอบความทนของวธวเคราะห (Robustness) ของซลแบคแทม สภาวะของระบบ โครมาโทกราฟ

Retention Theoretical Tailing ปรมาณของ Sulbactam (% labeled amount) time plates factor 1 2 3 เฉลย %RSD

HPLC column

No. 1 2.9 7292 0.9 101.1 101.3 101.3 101.2 0.1 No. 2* 2.9 9918 1.1 100.6 101.3 101.5 101.1 0.5 No. 3 2.8 9682 1.2 101.1 102.1 102.2 101.8 0.6

สดสวนของตวพา

70/30 2.6 9579 1.1 98.1 97.8 97.7 97.9 0.2 72/28* 2.9 9921 1.1 99.3 99.4 99.3 99.3 0.1 75/25 3.6 10724 1.3 99.5 99.2 99.1 99.3 0.2

pH ของ buffer

3.9 2.9 9893 1.1 99.1 99.0 99.0 99.0 0.1 4.0* 2.9 9921 1.1 99.3 99.4 99.3 99.3 0.1 4.1 2.9 9963 1.2 99.8 99.3 99.1 99.4 0.4

Flow rate 0.9 3.2 10620 1.2 100.0 99.1 99.4 99.5 0.5 1.0* 2.9 9921 1.1 99.3 99.4 99.3 99.3 0.1 1.1 2.6 9200 1.2 99.9 99.7 99.8 99.8 0.1

*สภาวะของระบบโครมาโทกราฟทท าการตรวจสอบความถกตอง

9. ขดจ ากดของการตรวจพบ (Detection Limit) และขดจ ากดของการหาเชงปรมาณ (Quantitation

Limit) ของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม เมอค านวณขดจ ากดของการตรวจพบและขดจ ากดของการหาเชงปรมาณของเซโฟเพอราโซน

พบวามคา 0.005 และ 0.014 มลลกรมตอมลลลตรตามล าดบ และขดจ ากดของการตรวจพบและขดจ ากดของการหาเชงปรมาณของซลแบคแทม พบวามคา 0.0025 และ 0.0075 มลลกรมตอมลลลตร ตามล าดบ ค านวณไดจากคา slope และ Y-intercept ของสมการเสนตรงจากผลในขอ 3

วจารณ

การตรวจวเคราะหปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด ( Cefoperazone and Sulbactam for injection) เปนยาทยงไมมวธมาตรฐานในต ารายาเลมใด ในการตรวจวเคราะหคณภาพยาตองท าการตรวจวเคราะหตามทะเบยนต ารบยา ซงแตละทะเบยนมการใชคอลมน สารเคม และวธในการตรวจวเคราะหทแตกตางกนท าใหตองเตรยมอปกรณและสารเคมหลากหลายชนด และใชตองเวลาในการตรวจวเคราะหนาน จากงานวจยของ Sreenivasulu E and Rani GT เรอง Validated RP-HPLC method for

20

simultaneous estimation of sulbactam and cefoperazone in bulk and pharmaceutical dosage form งานวจยดงกลาวใชสภาวะของโครมาโทกราฟแบบของเหลวสมรรถนะสง ดงน คอลมน phenomenex C18 ขนาด 4.6 x 150 mm บรรจอนภาคขนาด 5 ไมโครเมตร สารละลายตวพาคอบฟเฟอร pH 6.6 กบ acetonitrile ในอตราสวน 70 : 30 อตราการไหล 0.8 มลลลตรตอนาท ตรวจวดทความยาวคลน 230 นาโนเมตร พบพคของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมท retention time เทากบ 9.32 และ 5.33 ตามล าดบ run time เทากบ 20 นาท ( 10) ซงสภาวะดงกลาวใชเวลานาน วธทพฒนาขนโดยใชวธรเวอรสเฟสไฮเพอรฟอรมานซลควดโครมาโทกราฟ ใชคอลมนชนด BDS Hypersil C18 ขนาด 4.6 x 100 มลลเมตร ขนาดอนภาค 3 ไมโครเมตร สารละลายตวพาประกอบดวยสวนผสมของสารละลาย 0.005M Tetrabutylammonium hydroxide pH 4.0 และ acetonitrile ในอตราสวน 72 : 28 โดยปรมาตร อตราการไหลของตวพา 1.0 มลลลตรตอนาท ตรวจวดทความยาวคลน 230 นาโนเมตร พบพคของเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมท retention time เทากบ 5.0 และ 2.9 ตามล าดบ run time เทากบ 10 นาท ซงใชเวลานอยกวา

ผลการตรวจสอบความถกตองของวธ พบวาวธวเคราะหมความจ าเพาะเจาะจงตอเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทม ไมพบการรบกวนของสารสลายตวทเกดขนจากสภาวะตางๆ ทท าใหเกดการสลายตว

การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงของการทดสอบ โดยศกษาสารละลายมาตรฐานท 5 ระดบความเขมขน พบวาชวงของความเปนเสนตรงของเซโฟเพอราโซนอยระหวางความเขมขนในชวง 0.0720 ถง 0.2160 และชวงของความเปนเสนตรงของซลแบคแทมอยระหวางความเขมขนในชวง 0.0750 ถง 0.2250 มลลกรมตอมลลลตร โดยมคาสมประสทธสหสมพนธ (r) เทากบ 0.9999 และ 1.0000 ตามล าดบ

การทดสอบความแมนของวธ ท าการทดสอบท 5 ระดบความเขมขน คอ 0.075, 0.1125, 0.150, 0.1875 และ 0.2250 มลลกรมตอมลลลตร พบวาคารอยละของการกลบคนของเซโฟเพอราโซนอยในชวง 98.2 – 100.7 และคารอยละของการกลบคนของซลแบคแทมอยในชวง 99.8 – 101.4 ซงอยในชวงทยอมรบไดคอ รอยละ 98.0 – 102.0 และคา %RSD ไมมากกวา 2.0 แสดงถงวธทพฒนาขนนมความแมน

การทดสอบความเทยง พบวามการทวนซ าได มความเทยงจากการเปลยนวนวเคราะห เครองมอและนกวเคราะห ผลการทดสอบไดคา %RSD อยในเกณฑทยอมรบไดคอไมมากกวา 2.0 แสดงวาวธทพฒนาขนสามารถทวนซ าไดและมความเทยง

การทดสอบความคงสภาพของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง พบวามความคงสภาพนาน 24 ชวโมง การทดสอบความคงทนของวธพบวาการเปลยนคอลมน สดสวน ความเปนกรด-ดางและอตราการไหลของสารละลายตวพา ไมมผลกระทบตอระบบ ซงพจารณาจากประสทธภาพของ

21

การแยก (theoretical plates) และรปรางของพค ( tailing factor มคาไมเกน 2.0) และจากผลการวเคราะหปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉดในสภาวะทมการเปลยนแปลงดงกลาว ไดผลการทดสอบทมคา %RSD ไมเกน 2.0 เปนการยนยนวาเมอสภาวะของระบบโครมาโทกราฟมการเปลยนแปลงไปเลกนอยจะไมกระทบตอผลวเคราะห แสดงวาวธทพฒนาขนมความทนตอสภาวะทเปลยนแปลง

การตรวจสอบขดจ ากดของการตรวจพบและขดจ ากดของการหาเชงปรมาณของเซโฟเพอราโซน มคาเทากบ 0.005 และ 0.014 มลลกรมตอมลลลตร ตามล าดบ และซลแบคแทม พบวามคาเทากบ 0.0025 และ 0.0075 มลลกรมตอมลลลตร ตามล าดบ

สรป วธวเคราะหเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉด ดวย HPLC ทพฒนาขนน สามารถ

ใชวเคราะหปรมาณเซโฟเพอราโซนและซลแบคแทมในรปแบบยาฉดไดอยางถกตอง แมนย า มความจ าเพาะเจาะจงตอตวยาส าคญ และใชเวลาในการตรวจวเคราะหนอย สามารถน าไปใชเปนวธมาตรฐานของศนยวทยาศาสตรการแพทยท 10 อบลราชธาน ในการตรวจวเคราะหคณภาพยาเพอเปนการคมครองผบรโภคใหไดบรโภคยาทมประสทธภาพในการรกษาและปลอดภย

กตตกรรมประกาศ ขอขอบคณนางศภวรรณ เกตอนทร และนางสาวจรยา สขผล ทกรณาใหค าปรกษา และเจาหนาทศนยวทยาศาสตรการแพทยท 10 อบลราชธาน ทกทาน ทใหการด าเนนงานส าเรจไดดวยด

เอกสารอางอง 1. ยพน สงวรนทะ , สภนนท อญเชญ , พยงค วณเกยรต , นพมาศ วงศวทยเดชา , บรรณาธการ. เภสช

วทยา. พมพครงท 5. กรงเทพฯ: คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยมหดล; 2543. หนา 459-469. 2. Trivedi HK, Kshtri N, Patel MC. A Rapid, validated RP-HPLC method for the simultaneous

determination of cleaning validation and cross-contamination of 12 beta-lactam compounds. Sci Pharm 2013; 81: 151-65.

3. ประกาศคณะกรรมการพฒนาระบบยาแหงชาต เรอง บญชยาหลกแหงชาต พ.ศ. 2556. ราชกจจานเบกษา เลมท 130 ตอนพเศษ 126 ง (ลงวนท 30 กนยายน 2556).

22

4. งานบรการขอมลผลตภณฑสขภาพผานอนเตอรเนต. ผลตภณฑยา. [ออนไลน]. 2557 [สบคน 29 ธ.ค.2557]; [5 หนา]. เขาถงไดจาก: URL: http://fdaolap.fda.moph.go.th/logistics/drgdrug/Dserch.asp

5. Sreenivasulu E and Rani GT. Validated RP-HPLC method for simultaneous estimation of sulbactam and cefoperazone in bulk and pharmaceutical dosage form. [online]. 2014 [cited 2016 May 18]. Available from: URL: http://www.ijcrcps.com/pdfcopy/dec2014/ijcrcps7.pdf

6. United States Pharmacopeia National Formulary (USP/NF). 36thed. Validation of compendial procedures <1225>. Rockville, MD: The United States Pharmacopeia Convention; 2013. p. 983.

7. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). ICH Steering Committee; Nov 2005.

8. Center for Drug Evaluation and Research, Reviewer Guidance : Validation of Chromatographic Methods, Nov 1994.