รายงานการวจย

ชอโครงการวจย : การพฒนาระบบการทดสอบเบองตนส าหรบสารควบคมการท างานของทรานสครปชนแฟคเตอรและคนหาสารออกฤทธจากสมนไพรไทยเพอการรกษาเบตา-ธาลสซเมย Development of screening system for transcription factor regulators and search for active substances from Thai medicinal plants for the therapy of -thalassemia

หนวยงานทรบผดชอบ : - สถาบนชววทยาศาสตรทางการแพทย กรมวทยาศาสตรการแพทย - สถาบนวจยสมนไพร กรมวทยาศาสตรการแพทย

คณะผวจย : สถาบนชววทยาศาสตรทางการแพทย กรมวทยาศาสตรการแพทย

1) นางสาวปฐมาพร ปรกษากร หวหนาโครงการวจยและผวจยหลก 2) นางสาวกญจนรชต เศรษฐศภพนา ผวจยรวม 3) นายภาณพนธ ปญญาใจ ผรวมวจย 4) นางสาวอณชา เลองชยเชวง ผรวมวจย 5) นางสาวปนดดา เทพอคศร ผรวมวจย 6) นายสทธโชค จงตระกลศร ผรวมวจย 7) นายสรคเมธ มหาศรมงคล ผรวมวจย 8) นางสาวนวลจนทร วจกษณจนดา ผรวมวจย 9) นางสาวสกญญา วฒนาโภคยกจ ผรวมวจย 10) นางสาวนสรา สตยเพรศพราย ผรวมวจย

สถาบนวจยสมนไพร กรมวทยาศาสตรการแพทย

11) นางสาวดวงเพญ ปทมดลก ผรวมวจย

การพฒนาระบบการทดสอบเบองตนส าหรบสารควบคมการท างานของทรานสครปชนแฟคเตอรและคนหาสารออกฤทธจากสมนไพรไทยเพอการรกษาเบตา-ธาลสซเมย

ปฐมาพร ปรกษากร* กญจนรชต เศรษฐศภพนา* ภาณพนธ ปญญาใจ* อณชา เลองชยเชวง* ปนดดา เทพอคศร* สทธโชค จงตระกลศร* สรคเมธ มหาศรมงคล* นวลจนทร วจกษณจนดา* สกญญา วฒนาโภคยกจ* นสรา สตยเพรศพราย* และ ดวงเพญ ปทมดลก** * สถาบนชววทยาศาสตรทางการแพทย กรมวทยาศาสตรการแพทย ** สถาบนวจยสมนไพร กรมวทยาศาสตรการแพทย

เบตา-ธาลสซเมยเปนโรคทางพนธกรรมทท าใหเกดความผดปกตในการสรางฮโมโกลบน โดยอาการของโรคจะปรากฏขนภายในสองขวบปแรกเมอการสราง fetal hemoglobin (HbF, α22) ถกแทนทดวย adult hemoglobin (HbA, α22) อยางไรกตามในผปวยทยงคงมระดบของ HbF สงจะมอาการแสดงทางคลนกของโรคทไมรนแรง ซงการเพมขนของระดบ HbF สามารถลดความรนแรงของอาการทางคลนกในผปวยเบตา-ธาลสซเมยไดโดยการไปชดเชยการขาด HbA ดงนนการกระตนใหมการสราง HbF เพมขนอกครงจงเปนเปาหมายส าคญเพอบรรเทาการขาดฮโมโกลบนในผปวยเบตา-ธาลสซเมยได การศกษานมจดประสงคเพอพฒนาระบบการทดสอบฤทธในเซลลส าหรบใชคนหาสารกระตนการสราง HbF จากสมนไพรเพอใชเปนสารตนแบบในการพฒนายาบรรเทาการขาดฮโมโกลบนตอไป โดยผวจยไดออกแบบเซลลโมเดลส าหรบการทดสอบฤทธกระตนการสราง gamma-globin chain ซงเปนโปรตนทเปนสวนประกอบใน HbF และท าการเตรยมเวคเตอร pGL3-HBG pro ทมสวนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma (HBG) ตอกบ reporter gene คอ luciferase (Luc) แลวน าเวคเตอร pGL3-HBG pro และ pSV--galactosidase control มา co-transfect ลงในเซลล K562 (human erythroleukemia cells) จากนนใช transiently transfected cells ทเตรยมไดมาทดสอบฤทธกระตน HBG promoter ของสารสกดสมนไพร โดยจากการทดสอบสารสกดสมนไพรมากกวา 180 ตวอยาง พบวาสารสกดพช 7 ตวอยางมฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma จากพชทมฤทธดอกกระเทยมเถาถกน ามาสกดและแยกบรสทธสารออกฤทธตามหลกการ bioassay guided- separation ซงพบวามสารออกฤทธหลกคอ apigenin-7-O-glucoside (1) การสกดและแยกบรสทธสารออกฤทธจากใบโกสนพบวาสารออกฤทธคอ loliolide (2) ในสวนสมนไพรทเหลอจะแยกบรสทธในล าดบถดไป

Development of screening system for transcription factor regulators and search

for active substances from Thai medicinal plants for the therapy of -thalassemia

Patamaporn Pruksakorn*, Kanjarat Settasupana*, Parnuphan Panyajai*, Anicha Luengchaichawang*, Panadda Dhepakson*, Suttichoke Jongtrakulsiri*, Surakameth mahasirimongkol*, Nuanjun Wichukchinda*, Sukanya Wattanapokayakit*, Nusara Satproedprai*, and Duangpen Pattamadilok** * Medical Life Sciences Institute, Department of Medical Sciences ** Medical Plant Research Institute, Department of Medical Sciences

Beta-thalassemia is a genetic blood disorder that affects hemoglobin. This condition becomes clinically apparent within the first two years of life when production of hemoglobin switches from fetal hemoglobin (HbF, α22) to adult hemoglobin (HbA, α22). However, individuals with persistent expression of HbF showed minder symptoms. Increased levels of HbF can reduce the clinical severity in beta-thalassemia by compensating the lack of HbA. Thus, reactivation of gamma-globin expression to increase HbF level is one of the most effective strategies for treatment of beta-thalassemia. This study, we aimed to develop a cell-based assay system for searching active substances that can activate HbF production from medicinal plants. The cell model was designed for detection of the gamma-globin expression activating activity. The reporter vector, pGL3-HBG pro was constructed by cloning HBG promoter into pGL3 control vector that contained luciferase (Luc) as a reporter gene. The pGL3-HBG pro and the pSV--galactosidase control vectors were co-transfected into K562 (human erythroleukemia cells). Then, the transiently transfected cells were used to test over 180 extracts from medicinal plants. Of these, seven plant extracts exhibited HBG promoter-activating activity. Among them, the flowers of garlic vine were extracted and isolated using bioassay guided- separation to obtain apigenin -7-O-glucoside (1) as major active substance. The extraction and isolation of active substances from the leaves of garden croton found that HBG promoter-activating substance is loliolide (2). The remains of active medicinal plants will be isolated to furnish active substances in further study.

- i -

สารบญ หนา

สารบญตาราง ii สารบญภาพ iii ค ายอ iv บทน า 1 รายละเอยดเกยวกบการด าเนนการวจย 4 ผลการทดลอง 19 สรปผลการทดลอง 24 สรปผลการวจย 26 บรรณานกรม 27

- ii -

สารบญตาราง หนา

ตารางท 1 แสดงการแยกภาวะของโรคเบตา-ธาลสซเมยตามความผดปกตของยนและอาการแสดง 1 ตารางท 2 primers ทใชส าหรบ PCR 5 ตารางท 3 แสดงปรมาณสารสกดหยาบทไดจากสมนไพรทใชศกษา 9 ตารางท 4 แสดงคณภาพและปรมาณของ total RNA 19 ตารางท 5 ผลการทดสอบฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมา 21 ตารางท 6 แสดงฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมาของสาร 23 apigenin-7-O-glucoside (1) และ loliolide (2)

- iii -

สารบญภาพ หนา

ภาพท 1 แสดงการสรางฮโมโกลบนของมนษยในชวงอายตาง ๆ 2 ภาพท 2 โมเดลระบบการทดสอบฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกรมมา 3 ภาพท 3 การเตรยมเซลลเมดเลอดขาวและเซลลเมดเลอดแดง 5 ภาพท 4 ดอกกระเทยมเถา 15 ภาพท 5 การแยกสารออกฤทธจากดอกกระเทยมเถา 16 ภาพท 6 ตนโกสน 17 ภาพท 7 การแยกสารออกฤทธจากใบโกสน 18 ภาพท 8 เซลลทใชในการศกษา 19 ภาพท 9 การวเคราะหคณภาพของ total RNA โดยวธ FA gel electrophoresis 20 ภาพท 10 การศกษาระดบการแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบน 20 ภาพท 11 การวเคราะหโครงสรางทางเคมของสารออกฤทธทแยกไดจากดอกกระเทยมเถา 22 ภาพท 12 การวเคราะหโครงสรางทางเคมของสารออกฤทธทแยกไดจากใบโกสน 22

- iv -

List of Abbreviation

293F human embryonic kidney cells, adapted to be suspension cells

293T human embryonic kidney cells alpha beta BCL11A B-cell CLL/lymphoma 11A -thal beta-thalassemia BuOH butanol cDNA complementary DNA COSY COrrelation SpectroscopY DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium DNA deoxyribonucleic acid DTT dithiothreitol EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EGTA ethylene glycol tetraacetic acid ELISA enzyme-linked immunosor EtOAc ethyl acetate EtOH ethanol FA gel formaldehyde agarose gel gamma g/dl gram per deciliter GAPDH glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase H2O water Hb hemoglobin HbA adult hemoglobin HBB hemoglobin beta HbE hemoglobin E HbF fetal hemoglobin HBG hemoglobin gamma Hct hematocrit HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

- v -

HPLC High Performance Liquid Chromatography K562 human erythroleukemia cells Klf-1 Kruppel -like factor1 MeOH methanol ONPG o-nitrophenyl--D-galactopyranoside PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction RBC red blood cells and reticulocytes RNA ribonucleic acid SiO2 silica gel µg/mL microgram per milliliter WBC white blood cells

- 1 -

บทน า (Introduction)

เบตา-ธาลสซเมย เปนโรคโลหตจางพนธกรรมอนเนองมาจากความผดปกตของการสรางฮโมโกลบน เกดจากการสรางสายโกลบนชนดเบตาซงเปนองคประกอบในฮโมโกลบนลดลงหรอไมมการสรางเลย มสาเหตสวนใหญมาจาก mutation ของ beta-globin gene บนโครโมโซมท 11 โดยพบความแตกตางกนของ mutation ทเกดขนในผปวยเบตา-ธาลสซเมยมากกวา 200 ต าแหนง(1-3) ความผดปกตของยนทแตกตางกนสงผลใหอาการแสดงของผปวยมความแตกตางกน ในผปวยทมอาการรนแรงมกเรมมอาการซดตงแตขวบปแรก หากไมไดรบการรกษาจะม ตบ มามโต กระดกขยายกวางท าใหรปใบหนาเปลยนแบบ thalassemic facies รางกายเจรญเตบโตชา จ าเปนตองใหเลอด และเมอถงวยรนและผใหญมกมภาวะแทรกซอนจากธาตเหลกเกน ไดแก ตบแขง เบาหวาน และหวใจลมเหลว โดยสามารถแยกความผดปกตของยนตามอาการแสดงทเกดขนไดดงตารางท 1 ตารางท 1 แสดงการแยกภาวะของโรคเบตา-ธาลสซเมยตามความผดปกตของยนและอาการแสดง

ชอโรคหรอภาวะ ความผดปกตของยน genotype

อาการแสดง phenotype

ชนดของฮโมโกลบน Hb typing

Homozygous -thal

(0 / 0), (0 / +) หรอ (+ / +)

โลหตจางมากมกตองใหเลอดเปนประจ า

HbA2F, ไมพบ HbA

-thalassemia/ HbE

(0 / E) หรอ (+ / E)

โลหตจางปานกลางถงมาก บางคนใหเลอดเปนประจ า แตบางคนไมตองให

Hb EF หรอ HbEFA

Homozygous HbE (HbEE)

(E / E) โลหตจางเลกนอย Hb E (E= 80 -100%)

HbE trait (E / ) ระดบฮโมโกลบนปกต เมดเลอดแดงมขนาดเลก (MCV ต า) หรอขนาดปกต

Hb EA (E= 25-35%)

-thalassemia trait

(0 / ) หรอ (+ / )

ระดบฮโมโกลบนปกต หรอโลหตจางเลกนอย เมดเลอดแดงมขนาดเลก (MCV ต า)

Hb A2A (A2> 3.5%)

การรกษาโรคโลหตจางธาลสซเมยขนอยกบความรนแรงของโรค สามารถจดกลมไดดงน 1. ธาลสซเมยชนดรนแรง คอมระดบ base line Hb ต ากวา 7.0 g/dl (Hct <20%) ไดแก -thal/ -thal และ -thal /Hb E disease สวนนอย ผปวยมทางเลอกในการรกษาดงน - การปลกถายไขกระดก (stem cell transplantation) - การใหเลอดมากพอทจะระงบการสรางเลอด (high transfusion) และใหยาขบธาตเหลก (iron chelation) - ใหเลอดแบบประคบประคอง (low transfusion) ใหยาขบธาตเหลก และตดมามเมอจ าเปน

- 2 -

2. ธาลสซเมยชนดรนแรงปานกลาง คอมระดบ base line Hb ระหวาง 7-9 g/dl (Hct 20 – 27 %) ไดแก ผปวย -thal /Hb E disease สวนใหญ และผปวย -thal/ -thal บางราย ผปวยมทางเลอกในการรกษาดงน

- การใหเลอดมากพอทจะระงบการสรางเลอด (high transfusion) และใหยาขบธาตเหลก (iron chelation) - ใหเลอดแบบประคบประคอง (low transfusion) หรอเมอม acute hemolysis และตดมามเมอจ าเปน 3. ธาลสซเมยชนดรนแรงนอย คอมระดบ base line Hb ระหวาง > 9 g/dl (Hct > 27 %) ไดแก ผปวย -thal /Hb E ควรใหการรกษาโดยใหเลอดตอเมอม acute hemolysis 4. ธาสสซเมยชนดไมมอาการ (Asymptomatic) ไดแก homozygous Hb E และ trait ไมจ าเปนตองตรวจรกษาเปนพเศษ ควรไดรบการตรวจสขภาพตามระบบปกต และไดรบค าแนะน าปรกษาดานพนธศาสตร (genetic counseling)(4) อาการแสดงของโรคเบตา-ธาลสซเมยจะเกดขนตงแตอายนอยกวาสองป โดยเรมเมอชนดของฮโมโกลบนทสรางในรางกายเปลยนจาก fetal hemoglobin (HbF, α22) เปน adult hemoglobin (HbA, α22) ภาพท 1(5) อยางไรกตามในผปวยทยงคงมระดบของ HbF สงจะมอาการแสดงทางคลนกของโรคทไมรนแรงเทาผปวยทวไป โดย HbF สามารถชดเชยการขาด HbA ได การกระตนใหมการสราง HbF เพมขนอกครงจงเปนเปาหมายส าคญเพอบรรเทาการขาดฮโมโกลบนในผปวยเบตา-ธาลสซเมย(6-10)

ภาพท 1 แสดงการสรางฮโมโกลบนของมนษยในชวงอายตาง ๆ

- 3 -

ปจจบนยาหลายชนดสามารถเพมการสราง HbF ในผปวยไดเชน 5-azacytidine, hydroxyurea, และอนพนธของ butyrate อยางไรกตามยาเหลานยงมประสทธผลและความจ าเพาะตอการรกษาทต าในขณะทมความเปนพษสง ดวยเหตนการวจยเพอคนหาสารทมฤทธเพมการสราง HbF ทมประสทธผลมากขนและมความเปนพษลดลงจงยงคงเปนทตองการ ในการศกษานผวจยมความประสงคทจะพฒนาวธทดสอบฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมา () ซงเปนโปรตนสวนประกอบใน HbF ส าหรบใชคนหาสารทมฤทธกระตนการสราง HbF โดยไดท าการศกษาการแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบน และออกแบบเซลลโมเดลส าหรบทดสอบฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมา (ภาพท 2) จากนนพฒนาระบบการทดสอบฤทธในเซลล โดยวธการทดสอบทสรางขนนไดถกน ามาใชในการคนหาสารทมฤทธกระตนการสราง HbF จากสมนไพรมากกวา 120 ชนด และคดเลอกสมนไพรทแสดงฤทธมาแยกสารออกฤทธใหบรสทธโดยวธการทางโครมาโตกราฟฟ ซงสารออกฤทธทไดถกน ามาวเคราะหโครงสรางทางเคมเพอระบชนดของสาร และจะน าสารทไดไปศกษาฤทธเพมเตมในระดบ RNA และโปรตนในล าดบถดไป เพอคดเลอกสารทมคณสมบตเหมาะสมส าหรบเปนสารตนแบบในการพฒนายาบรรเทาการขาดฮโมโกลบนตอไปในอนาคต

ภาพท 2 โมเดลระบบการทดสอบฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกรมมา

- 4 -

รายละเอยดเกยวกบการด าเนนการวจย (Materials & Method)

1. การแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบนในเซลลเมดเลอดและเซลลเพาะเลยงดวยวธ real-time PCR เครองมอและอปกรณ

ตปลอดเชอชนด Biological Safety Cabinet Class II (NUAIR); CO2 Incubator (BINDER); กลองจลทรรศน (Nikon ECLIPSE TE 2000-U); ตบมเพาะเลยงเชอควบคมอณหภม (Amerex Instrument, GYROMAXTM737); เครองเพมปรมาณสารพนธกรรม (AB Applied Biosystems, GeneAmp 2400 PCR system); เครองขยายจ านวนสารพนธกรรมแบบเวลาจรง (Roche, LightCycler); เครองหมนเหวยงความเรวสง (BECKMAN COULTER, AllegraTM X-12R centrifuge); เครองหมนเหวยงความเรวสง (MIKRO 200R Hettich zentrifugen); อเลกโตรโฟรซส (MupidR – Exu); เครองถายภาพและวเคราะหสารพนธกรรม (SYNGENE, Bio Imaging System)

วสดและสารเคม RPMI1640 (GIBCO); fetal bovine serum (GIBCO); phosphate buffer saline (Nissui);

TRIZOL ® reagent (Invitrogen); isopropyl alcohol (Merck); Lymphoprep TM Tube (AXIS-SHIELD); Agarose (Vivantis Inc.); diethylpyrocarbonate DEPC (Merck); formaldehyde (Merck); Super Script III (Invitrogen); pGEM ® T Easy Vector (Promega); LightCycler ® FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I (Roche); LightCycer® Capillaries 20 µL (Roche)

เซลลเพาะเลยง K562 (human erythroleukemia cells) 293T (human embryonic kidney cells) และ

293F (human embryonic kidney cells, adapted to be suspension cells) ถกเพาะเลยงในอาหาร RPMI1640 ทเตมดวย 10% fetal bovine serum และบมทอณหภม 37oC โดยมปรมาณคารบอนไดออกไซด 5% ส าหรบเซลล K562 และ 293T และคารบอนไดออกไซด 8% ส าหรบเซลล 293F

การแยกเซลลเมดเลอดขาวและเซลลเมดเลอดแดง การเตรยมเซลลเมดเลอดขาวและเซลลเมดเลอดแดงท าไดโดยน าเลอดคนปกต (peripheral blood) 25 มลลลตรซงผสมสารกนการแขงตวของเลอด EDTA ไปปนท 420 xg 10 นาท จากนนดดสวนของซรมและเซลลเมดเลอดทปนตก (packed cells) สวนบนปรมาตร 2 มลลลตร มาใชส าหรบแยกเซลลเมดเลอดขาวและเซลลเมดเลอดแดงโดยปนแยกดวย Lymphoprep TM Tube ท 800 xg 20 นาท แยกสวน buffy coat ซงมเซลลเมดเลอดขาวออกจากเมดเลอดแดง (ภาพท 3) จากนนปนลางสวนของเซลลเมดเลอดขาวและเซลลเมดเลอดแดงดวย PBS (phosphate buffer saline) เพอเตรยมเซลลส าหรบใชในการสกด RNA

- 5 -

ภาพท 3 การเตรยมเซลลเมดเลอดขาวและเซลลเมดเลอดแดง

การเตรยม RNA Total RNA เตรยมโดยการสกดดวย TRIZOL reagent จากนนวเคราะหคณภาพและปรมาณ

ของ RNA ทไดโดยการวดคาการดดกลนแสง และการวเคราะหคณภาพ RNA โดยวธ formaldehyde agarose (FA) gel electrophoresis

การเตรยมพลาสมดส าหรบใชเปน DNA มาตรฐาน น า total RNA 4 ไมโครกรม มาเปน template ส าหรบการสงเคราะห cDNA โดยใช Super Script III (invitrogen) ด าเนนการตามวธการของบรษทผผลต จากนนใช RNA ทเปลยนเปน cDNA แลวเปน template และใช primers ตามตารางท 1 ส าหรบท า PCR เพอเตรยม DNA มาตรฐานของยนทตองการศกษา โดยสภาวะส าหรบ amplification คอ 95oC 2 ตามดวย 95oC 15 ว 56oC 15 ว และ 72oC 30 ว จ านวน 30 รอบ น า PCR products ทไดโคลนลงใน pGEM® T Easy Vector และตรวจสอบโคลนทไดโดยการ sequence จากนนวเคราะหความเขมขนของพลาสมดทได และค านวณความเขมขนของ DNA มาตรฐาน เปนหนวย copy / ปรมาตร

ตารางท 2 primers ทใชส าหรบ PCR

Gene Direction Primer Product size, bp

Klf-1 F GCC CCA AAC AGG AAC ACA TA 204 R TTG CAA GAG AAA CCA TGC AC

BCL11A F GGT TGC GGC AAG AGC TAC A 200 R GTC AGA GCG CGA AAA AGC AC

HBB F ACA ACT GTG TTC ACT AGC AAC C 209 R GTT GCC CAT AAC AGC ATC AGG

HBG F AGG TGC TGA CTT CCT TGG G 174 R GGG TGA ATT CTT TGC CGA A

GAPDH F TGT TGC CAT CAA TGA CCC CTT 202 R CTC CAC GAC GTA CTC AGC G

- 6 -

การวเคราะหการแสดงออกของยนโดยวธ real-time quantitative PCR น า total RNA 4 ไมโครกรม มาเปน template ส าหรบการสงเคราะห cDNA โดยใช Super Script III (invitrogen) ด าเนนการตามวธการของบรษทผผลต จากนนน า RNA ทเปลยนเปน cDNA แลว 600 นาโนกรม มาเปน template ส าหรบศกษาการแสดงออกของยนโดยวธ real-time quantitative PCR ใช LightCycler® FastStart DNA Master PLUS SYBR Green I (Roche) ส าหรบ amplify ยนทตองการศกษาโดยใช primers ตามตารางท 2 และใชสภาวะส าหรบ amplification คอ 95oC 10 ตามดวย 95oC 10 ว 62oC 45 ว และ 72oC 10 ว จ านวน 45 รอบ วเคราะหระดบการแสดงออกของยนตางๆ โดยเทยบกบ DNA มาตรฐาน และวเคราะหการแสดงออกของยนตางๆ เปรยบเทยบกบเซลลแตละชนดทตองการศกษาโดยใชระดบการแสดงออกของยน GAPDH (glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase) เพอ normalization 2. การพฒนาระบบทดสอบเบองตนในเซลลเพอคนหาสารกระตนการสราง fetal hemoglobin (HbF) ผานทางการกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma

เครองมอและอปกรณ ตปลอดเชอชนด Biological Safety Cabinet Class II (NUAIR); CO2 Incubator (BINDER);

กลองจลทรรศน (Nikon ECLIPSE TE 2000-U); ตบมเพาะเลยงเชอควบคมอณหภม (Amerex Instrument, GYROMAXTM737); เครองหมนเหวยงความเรวสง (BECKMAN COULTER, AllegraTM X-12R centrifuge); เครองหมนเหวยงความเรวสง (MIKRO 200R Hettich zentrifugen); อเลกโตรโฟรซส (MupidR – Exu); เครองถายภาพและวเคราะหสารพนธกรรม (SYNGENE, Bio Imaging System); ELISA plate reader (ELx808 Ultra Microplate Reader, Bio-TEK Instruments. Inc.); Luminometer (Berthold)

วสดและสารเคม DMEM (GIBCO); fetal bovine serum (GIBCO); gBlock® Gene Fragments

(Integrated DNA Technologies); pGL3 control vector (Promega); SV-β-galactosidase control (Promega); Lipofectamine ® 2000 Transfection Reagent (Invitrogen); Opti-MEM® (GIBCO); cell culture dish (Corning); 96-well culture plate, U-shape wells (Nunc); white plate (Greiner bio-one); potassium phosphate (Merck); Triton X-100 (Usb); DTT (Merck); glycylglycine (Merck); MgSO4 (Merck); EGTA (CalBioChem); ATP (CalBioChem); D-luciferin

(Sigma); MgCl2 (Merck); -mercaptoethanol (Amersham); ONPG (Sigma); Na2CO3 (Merck)

- 7 -

เซลลเพาะเลยง

เซลล K562 (human erythroleukemia cells) ถกจดซอจาก ATCC® และเพาะเลยงในอาหาร DMEM ทเสรมดวย 10% Fetal Bovine serum บมทอณหภม 37oC 5% คารบอนไดออกไซด

เวคเตอร การสรางเวคเตอร pGL3-HBG pro ท าโดย cloning สวนโปรโมเตอรของยน hemoglobin

gamma (HBG2) ล าดบนวคลโอไทดท –439 ถง +49 จากต าแหนงเรมตนของการถอดรหสพนธกรรมลงใน pGL3 control vector

วธทดสอบฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma เตรยมเซลล K562 ความหนาแนน 2 x 105 เซลลตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตรในถาดเพาะเลยงเสนผาศนยกลาง 10 เซนตเมตร จากนน co-transfect เวคเตอร pGL3-HBG pro และ pSV--galactosidase control อยางละ 12 ไมโครกรมลงในเซลลทเตรยมไวโดยใช Lipofectamine 2000 แลวบมเลยงทอณหภม 37oC เปนเวลา 24 ชวโมง น า transiently transfected cells ทเตรยมไดใสใน 96-well culture plate ชนด U-shape wells ปรมาตรหลมละ 100 ไมโครลตร แลวเตมตวอยางสารสกดสมนไพรทละลายในเอทานอลปรมาตร 1 ไมโครลตร ใหมความเขมขนของสารสกด 3 – 100 ไมโครกรมตอมลลลตรโดยท าการทดสอบเปนสองซ าในตวอยางแตละชนด ใช butyric acid ส าหรบ positive control และใชเอทานอลส าหรบ vehicle control บมเลยงทอณหภม 37oC เปนเวลา 3 วน เมอครบก าหนดการบมเลยงวเคราะหผลการทดสอบโดยวดระดบการกระตนโปรโมเตอรโดยตรวจวดการท างานของเอนไซม luciferase และ -galactosidase แลวน าผลการทดสอบทไดมาค านวณฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมาทเพมขนตามสมการท (1) ตวอยางทแสดงฤทธตดสนจากการกระตนทมากกวา 2 folds

HBG promoter-activating activity = average of (Luciferase activity / -Galactosidase activity) in sample (1) (folds) average of (Luciferase activity / -Galactosidase activity) in control

วธวเคราะหการท างานของเอนไซม luciferase เตรยม cell lysates ส าหรบการวเคราะหการท างานของเอนไซม โดยปนตกเซลลท 1,500 rpm เปนระยะเวลา 10 นาท จากนนดดอาหารเลยงเซลลทง แลวท าใหเซลลแตกโดยใช 100 ไมโครลตรของ Triton-lysis solution (0.2% v/v Triton X-100, 100 mM potassium phosphate pH7.8 and 1 mM DTT) บมทอณหภมหองเปนเวลา 20 นาท วเคราะหการท างานของเอนไซม luciferase โดยดด 20 ไมโครลตร ของ cell lysates ใสลงในแตละหลมของ white plate แลวเตม 70 ไมโครลตรของ luciferase assay buffer (25 mM glycylgylcine pH 7.8, 15 mM potassium phosphate pH7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP and 1 mM DTT) ลงในแตละหลม จากนนเตม 50 ไมโครลตรของ Luciferin solution (0.2 mM D-luciferin, 25 mM glycylglycine pH7.8 และ 2 mM DTT) ลงในแตละหลม แลวอานผลโดยใชเครอง luminometer

- 8 -

วธวเคราะหการท างานของเอนไซม -galactosidase ใช 40 ไมโครลตรของ cell lysates ทเตรยมไดจากวธขางตนใสลงใน plate ใหม จากนน

เตม 50 ไมโครลตรของ 2X buffer solution (for -gal analysis : 200 mM sodium phosphate pH7.3, 2 mM MgCl2, 100 mM –mecaptoethanol และ1.33 mg/mL ONPG) บมทอณหภม 37oC จนกระทงเปลยนเปนสเหลอง หยดปฏกรยาโดยการเตม 150 ไมโครลตรของ 1 M Na2CO3 แลวอานผลดวย ELISA plate reader ท 420 nm 3. การทดสอบฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma ของสารสกดสมนไพร และแยกสารออกฤทธใหบรสทธดวยวธทางโครมาโตกราฟฟ

เครองมอและอปกรณ เครองกลนระเหยสารแบบหมน (Rotary evaporator, BÜCHI); เครองชงดจตอล ความ

ละเอยดทศนยม 4 ต าแหนง (METTLER TOLEDO); เครองชงดจตอล ความละเอยดทศนยม 2 ต าแหนง (METTLER TOLEDO); UV cabinet (SPECTROLINE); High Performance Liquid Chromatography (DIONEX); Multichannel Pipette ขนาด 30-300 ไมโครลตร (Finn); Autopipette ขนาด10, 200 และ 1,000 ไมโครลตร (Finn)

วสดและสารเคม Ethanol (MERCK); chloroform (RCI Labscan); methanol (Fisher Scientific);

hexane (RCI Labscan); ethyl acetate (RCI Labscan); Silica gel 60 (0.063-0.200 mm) (Merck); Silica gel 60 G (Merck)

ตวอยางพช สมนไพรทน ามาทดลองเกบรวบรวมจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร ระหวางป 2553 - 2556 และไดเกบสารสกดตวอยางพรอมขอมลพนฐานและก าหนดหมายเลขตวอยางไวทหองปฏบตการของสถาบนชววทยาศาสตทางการแพทย กรมวทยาศาสตรการแพทย

การเตรยมสารสกดเอทานอลจากสมนไพร ตดชนสวนของพชสดทน ามาทดลองใหมขนาดเลกและท าแหงทอณหภมหอง น าชนสวนพชแหงทไดมาสกดดวยเอทานอล โดยหมกเปนระยะเวลาอยางนอย 1 คน จากนนน าสารสกดเอทานอลมาระเหยแหงภายใตสญญากาศจนกระทงแหงด น าสารสกดหยาบทไดมาเตรยมใหอยในรปแบบทเหมาะสมกบการทดสอบฤทธ โดยละลายสารสกดหยาบดวยเอทานอลใหไดความเขมขน 30, 10, 3, 1 และ 0.3 มลลกรมตอมลลลตรของสารสกดตวอยางแตละชนด และเกบรกษาทอณหภม 4oC จนกวาน ามาทดสอบ (ตารางท 3)

- 9 -

ตารางท 3 แสดงปรมาณสารสกดหยาบทไดจากสมนไพรทใชศกษา

ชอทองถน สวนทใช น าหนก (กรม) % Yield พชแหง สารสกด

กนจ า ตน 9.3 0.73 7.85 กระเจยบแดง ตน 12.7 2.86 22.52 กระเจยบแดง กลบเลยง 5.5 2.46 44.73 กระเจยบแดง ผลดบ 10.1 0.45 4.46 กระเทยมเถา ตน 10.5 1.31 16.93 กระเทยมเถา ดอก 6.0 2.37 39.50 กระเพรา ตน 3.5 0.52 14.86 กระชาย ตน 3.1 0.19 6.13 กระชาย เหงา 18.3 0.91 4.97 กระชายด า ตน 2.2 0.23 10.45 กระชายด า เหงา 4.7 0.13 2.77 กระดมไพลน ตน 5.9 0.83 14.07 กระดกไกด า ตน 15.1 1.06 7.02 กระถน ตน 6.1 0.44 7.21 กระถน ฝก 14.6 0.57 3.90 กระถนปา ใบ 3.9 0.56 14.36 กระถนปา ดอก 6.0 0.82 13.67 กระถนปา ฝก 9.1 2.25 24.73 กระพงโหม ตน ดอก 5.7 0.82 14.39 กระสง ตน 3.0 0.40 13.33 กระเมง ตน 5.7 0.33 5.79 กลวย ใบ 6.7 1.00 14.93 กลวย กลบเลยง 2.3 0.36 15.65 กลวย ผลดบ 23.0 0.14 0.61 กลวย เปลอกผลดบ 4.0 0.23 5.75 กะทกรก เถา 16.0 1.89 11.81 กระทอ เหงา 13.1 1.91 14.58 กาหลง ใบ 9.0 2.07 23.00 กาหลง ดอก 12.5 2.64 21.12 กาฝาก ใบ 16.1 0.50 3.11 แกว ใบ 13.9 2.52 18.13 แกว ดอก 8.9 1.24 13.93 โกสน ตน 14.1 1.03 7.30

- 10 -

ชอทองถน สวนทใช น าหนก (กรม) % Yield พชแหง สารสกด

ขมนขาว เหงา 41.62 0.71 1.71 ขมนขาวปา เหงา 8.8 0.38 4.35 ขมนชน เหงา 16.3 1.02 6.31 ขมนออย เหงา 19.9 0.86 4.31 ขล ตน 9.9 0.59 5.96 ขง เหงา 30.5 1.24 4.06 ขกาแดง เถา 9.5 0.87 9.16 ขกาแดง ผล 4.1 0.49 11.95 ขดมอญ ตน 13.3 0.53 3.98 ขา ตน 4.3 0.30 6.98 ขา เหงา 13.3 1.47 11.05 ขอย ตน 5.9 0.56 9.49 ครอบจกรวาฬ ตน 33.5 2.31 6.90 เงนไหล ตน 2.4 0.18 7.50 เงนไหล ดอก 9.2 0.40 4.35 จนทรกระจางฟา ใบ 6.9 0.75 10.87 ชะพล ตน 2.6 0.24 9.23 ช ามะเลยง ใบ 6.9 0.33 4.78 ช ามะเลยง ผล 17.8 6.52 36.63 ช ามะเลยง เมลด 13.2 0.70 5.30 ชมเหดไทย ตน 26.5 1.17 4.42 ชองนาง ใบ 7.9 0.75 9.49 ชองนาง ดอก 2.6 0.13 5.00 ดาวเรอง ตน 1.7 0.26 15.29 ตอยตง ตน 36.0 1.61 2.78 ตอยตง ราก 20.2 0.46 2.28 ตะไคร ตน 3.1 0.30 9.68 ต าแยแมว ตน 20.3 1.95 9.61 ต าแยแมว ราก 3.7 0.24 6.49 เตยหอม ใบ 7.8 0.93 11.92 เตยหอม ตน 11.0 1.71 15.55 ทองพนชง ตน 11.2 1.17 10.45 ทองหลาง ใบ 10.7 1.84 17.20

- 11 -

ชอทองถน สวนทใช น าหนก (กรม) % Yield พชแหง สารสกด

ทบทม ตน 10.1 1.28 12.67 ทบทม เมลด 14.4 1.10 7.64 ทบทม เปลอกผล 16.1 3.52 21.86 ทบทม น าทบทม 100 mL 19.4 19.40 เทยนหยด ตน 5.0 0.72 14.40 เทยนหยด ผล 76.5 9.53 12.46 ธรณสาร ตน 7.8 1.59 20.38 น านมราชสห ตน 14.3 0.86 6.01 บวฉตร ใบ 7.0 1.04 14.86 บวฉตร กลบดอก 3.5 0.37 10.57 บวบก ตน 1.5 0.23 15.33 บานไมรโรย ตน 8.1 0.50 6.17 บานไมรโรยปา ตน 6.7 0.41 6.12 ใบเงน ตน 8.4 1.12 13.33 ใบทอง ตน 4.3 0.60 13.95 ใบนาค ตน 4.4 0.56 12.73 เปราะหอม เหงา 23.0 0.83 3.61 ผกเปดแดง ตน 15.0 0.77 6.67 ผกเสยน ตน 11.9 1.09 9.16 ผกเสยนขน ตน 4.7 0.34 7.23 ผกเสยนผ ตน 5.5 0.60 10.91 ผกแครต ตน 3.1 0.21 6.77 ผกโขมหน ตน 32.1 1.30 4.05 ผกขม ตน 4.9 0.31 6.33 ผกชฝรง ใบ 2.6 0.52 20.00 ผกชฝรง ดอก 5.3 0.66 12.45 ผกชฝรง ราก 2.4 0.32 13.33 ผกบงไทย ตน 6.1 0.87 14.26 ผกบงไทย ผล 8.6 0.58 6.74 ผกปราบ ตน 2.6 0.42 16.15 ผกหวานบาน ตน 6.6 0.84 12.72 ผกหวานบาน ผล 7.0 0.81 11.57 ไผจน ตน 8.1 0.86 10.62 ไผหวาน ใบ 7.9 0.62 7.85

- 12 -

ชอทองถน สวนทใช น าหนก (กรม) % Yield พชแหง สารสกด

พญากาสก ใบ 8.0 0.81 10.13 พญากาสก ดอก 7.8 0.36 4.62 พญากาสก ผลดบ 17.6 2.76 15.68 พญายอ ตน 13.9 0.90 6.47 พญายอ ดอก 3.1 1.28 41.29 พรก ตน 4.8 0.32 6.67 พรก ผล 6.6 0.55 8.33 พล ตน 4.7 1.09 23.19 พวงคราม ใบ 12.3 0.54 4.39 พวงคราม ดอก 8.5 0.63 7.41 พวงทอง ตน ดอก 8.6 0.86 10.00 พนง ตน 14.6 0.71 4.86 พทธรกษา ตน 6.8 0.73 10.74 พทธรกษา เหงา 4.2 0.89 21.19 ไพล เหงา 22.6 0.65 2.88 ไพลด า ตน 8.0 0.93 11.63 ไพลด า ดอก 2.5 0.37 40.00 ไพลด า เหงา 9.0 1.52 16.89 ฟาทะลายโจร ตน 8.4 1.07 12.74 มะเดอ ตน 4.3 0.34 7.91 มะเดอ เปลอกตน 3.2 0.24 7.50 มะแวงเครอ ตน ดอก ผล 6.7 1.14 15.06 มะกรด ตน 10.0 0.57 5.70 มะกรด เปลอกผล 33.1 3.51 10.60 มะกรด เมลด 5.4 0.78 14.44 มะกรด น ามะกรด 100 mL 14.07 14.07 มะกา ใบ 7.4 1.40 18.92 มะดน ตน 8.7 1.60 28.07 มะดน ผล 8.3 3.78 45.54 มะตม ใบ 7.1 0.90 12.68 มะตม เปลอกผล 22.2 1.21 5.41 มะตม เนอผล 100 g (fresh) 22.15 22.15 มะพด ใบ 13.5 0.95 7.04 มะพด เนอผลสก 8.0 6.96 87.00

- 13 -

ชอทองถน สวนทใช น าหนก (กรม) % Yield พชแหง สารสกด

มะพด เมลด 22.5 3.84 17.07 มะมวง ใบ 18.5 2.74 14.81 มะมวง ดอก 38.6 9.69 25.10 มะมวงหาวมะนาวโห ใบ 5.8 0.88 15.17 มะรม ใบ 11.9 0.42 3.53 มะรม ฝก 10.5 1.38 13.14 มะรม เปลอกตน 9.6 0.40 4.17 มะละกอ ใบ 5.4 0.62 11.48 มะละกอ ล าตน 11.3 1.00 8.85 มหาเมฆ เหงา 17.7 0.62 3.51 มาเหลอง เหงา 16.8 1.43 8.53 แมงลก ตน 5.3 0.33 6.23 แมงลก ดอก 5.8 0.34 5.86 โมกบาน ตน 10.6 0.89 8.40 ไมยราพ ตน 7.7 0.37 4.81 มนส าปะหลง ตน 7.1 0.90 12.86 มนส าปะหลง เนอหวใตดน 20.2 0.89 4.41 มนส าปะหลง เปลอกหว 12.2 0.62 5.08 ยอ ใบ 12.1 1.85 15.29 ยอ ผล 81.3 5.08 6.25 ยานาง ใบ 9.3 1.36 14.62 ยหรา ตน 7.4 0.73 9.86 ยหรา ดอก 16.4 0.54 3.29 รก ตน 7.2 0.83 11.53 รก ดอก 7.1 0.82 11.55 รางจด ใบ 3.4 0.42 12.35 ราชพฤกษ ใบ 3.3 0.40 12.12 ราชพฤกษ ดอก 4.7 0.50 10.64 ราชพฤกษ ฝกออน 22.7 1.24 5.46 ราชพฤกษ ฝกแก 10.5 0.95 9.05 ร าเพย ใบ 12.5 1.94 15.52 ลกใตใบ ตน 5.3 0.81 15.28 เลบมอนาง ใบ 7.8 1.09 13.97 เลบมอนาง ดอก 12.0 1.35 11.25

- 14 -

ชอทองถน สวนทใช น าหนก (กรม) % Yield พชแหง สารสกด

วานกวนอม ตน 2.6 0.25 9.62 วานชกมดลก เหงา 41.1 3.97 9.65 วานนางค า เหงา 11.6 0.95 8.20 วานหอมแดง ตน 2.2 0.24 10.91 วานหอมแดง ดอก 16.2 0.95 5.86 วานหอมแดง หว 51.0 2.79 5.47 วาสนา ใบ 11.4 1.43 12.54 วาสนา ดอก 12.4 1.64 13.23 สรอยทอง ตน 4.0 0.42 10.50 สะเดา ใบ 13.7 1.58 11.53 สะเดา ผล 7.1 0.82 11.55 สะเดาดน ตน 20.3 1.98 9.75 สะแก ตน 14.7 2.09 14.22 สะแก ผล 8.2 1.37 16.71 สาบเสอ ตน 10.4 1.24 11.92 สาบเสอ ดอก 9.6 0.82 8.54 สาบแรงสาบกา ตน 2.5 0.31 12.40 โสมไทย ตน 8.0 0.49 6.13 โสมไทย ราก 4.4 0.35 7.95 หญาแหวหม ตน 7.7 0.94 12.21 หญาแหวหม หว 22.0 0.91 4.14 หญางวงชาง ตน 12.5 0.62 4.96 หญางวงชาง ราก 1.7 0.24 14.12 หญาหนวดแมว ตน 10.7 1.18 11.03 หญาดอกขาว ตน 4.3 0.42 9.77 หมอน ใบ 2.7 0.57 21.11 หนามแดง ใบ 3.8 0.41 10.79 หนามแดง ผลดบ 14.4 1.14 7.92 หนมานประสานกาย ใบ 13.3 0.80 6.02 อญชน เถา 6.2 0.80 12.90 อญชน ดอก 3.4 0.20 5.88 เอนเหลอง เหงา 19.5 0.76 3.90

- 15 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma จากสารสกดดอกกระเทยมเถา ดอกกระเทยมเถา (ภาพท 4) ถกเกบจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร เดอนมนาคม 2558 จากนนน ามาท าใหแหงทอณหภมหอง และตดใหมขนาดเลกลง

ภาพท 4 ดอกกระเทยมเถา การแยกสารบรสทธด าเนนการตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยน าดอกกระเถยมเถาแหง (295 กรม) มาสกดโดยการหมกดวยเอทานอล ไดสารสกดหยาบ 61 กรม จากนนสกดแยกดวยตวท าละลาย 2 ชนด คอ เอทลอะซเตทและน า ระเหยสารละลายในชนเอทลอะซเตทไดสารสกด 8.8 กรม แลวน าไปสกดแยกตอดวยตวท าละลายเฮกเซนและ 90% เมทานอล น าสารสกดในชน 90% เมทานอล (4.2 กรม) ซงแสดงฤทธมาแยกบรสทธตอโดยใชคอลมนชนดซลกาเจล (SiO2 G60, 70-230 mesh) และใชวฏภาคเคลอนทเปนคลอโรฟอรมและเมทานอล น าสวนทมฤทธดสดมาแยกบรสทธตอโดยใชคอลมนชนดซลกาเจล (SiO2 G60, < 60 mesh) แลวน ามาท าใหบรสทธในขนตอนสดทายโดยใชวธ recrystallization ไดสารบรสทธ (1) น าหนก 20 มลลกรม (ภาพท 5)

- 16 -

ภาพท 5 การแยกสารออกฤทธจากดอกกระเทยมเถา

- 17 -

การแยกบรสทธสารทมฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma จากสารสกดใบโกสน ใบโกสน (ภาพท 6) ถกเกบจากอ าเภอบางแพ จงหวดราชบร เดอนเมษายน 2558 จากนนตดใหมขนาดเลกลง ท าใหแหงทอณหภมหอง และบดละเอยด

ภาพท 6 ตนโกสน การแยกสารบรสทธด าเนนการตามหลกการ Bioassay-guided separation โดยน าใบโกสนแหง (180 กรม) มาสกดโดยการหมกดวยเอทานอล ไดสารสกดหยาบ 22 กรม จากนนสกดแยกดวยตวท าละลาย 2 ชนด คอ เอทลอะซเตทและน า ระเหยสารละลายในชนเอทลอะซเตทไดสารสกด 12.2 กรม แลวน าไปสกดแยกตอดวยตวท าละลายเฮกเซนและ 90% เมทานอล น าสารสกดในชน 90% เมทานอล (1.2 กรม) ซงแสดงฤทธมาแยกบรสทธตอโดยใชคอลมนชนดซลกาเจล (SiO2 G60, 70-230 mesh) และใชวฏภาคเคลอนทเปนคลอโรฟอรมและเมทานอล น าสวนทมฤทธดสดมาแยกบรสทธตอโดยใช preparative HPLC (GROM-SIL 100 Si NP-1, 20 mm i.d. × 250 mm, 10 µm particle size) ไดสารบรสทธ (2) น าหนก 9 มลลกรม (ภาพท 7)

- 18 -

ภาพท 7 การแยกสารออกฤทธจากใบโกสน

- 19 -

ผลการทดลอง (Results)

1. การแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบนในเซลลเมดเลอดและเซลลเพาะเลยงดวยวธ real-time PCR

การศกษาการแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบนในเซลลเมดเลอดและเซลลเพาะเลยง ด าเนนการโดยเตรยมเซลลทตองการศกษาซงประกอบดวย K562 (human erythro leukemia cells), 293F (human embryonic kidney cells; adapted to be suspension cells), 293T (human embryonic kidney cells), RBC (red blood cells and reticulocytes) และ WBC (white blood cells) ดงภาพท 4 โดยเซลล K562 เปนเซลลมะเรงเมดเลอด สวน 293F และ 293T (HEK cells) เปนเซลลทมตนก าเนดมาจากเซลลไตของตวออนซงถก transform ดวย adenovirus สามารถเจรญเตบโตไดงายและเหมาะส าหรบ transfection ในสวนของเซลลเมดเลอดแดงทเตรยมไดประกอบดวยเซลลเมดเลอดแดงทเจรญเตมท (ไมมนวคลโอไทดเหลออย) และเซลลเมดเลอดแดงทยงไมเจรญเตมท (immature red blood cells) ทเรยกวา reticulocytes ซงยงมสวนของ นวคลโอไทดเหลออย ท าใหสามารถน ามาสกด RNA ได

ภาพท 8 เซลลทใชในการศกษา (A) K562, (B) 293F, (C) 293T, (D) RBC และ (E) WBC

จากนนน าเซลลทเตรยมไดแตละชนดมาสกด RNA โดยใชวธ TRIZOL แลววเคราะหคณภาพและปรมาณของ RNA ทเตรยมไดโดยวดการดดกลนแสง (ตารางท 4) และวเคราะหโดยใชวธ FA gel electrophoresis (ภาพท 5) ซงพบวา RNA ทเตรยมไดมคณภาพด (260/280 ratio : >1.8 – 2 ) เหมาะสมส าหรบน าไปใชในการศกษาการแสดงออกของยนตอไป

ตารางท 4 แสดงคณภาพและปรมาณของ total RNA

Cells Concentration (ng/µL) 260/280 ratio 293F 2,192.9 1.95 RBC 614.6 2.14 WBC 784.8 2.04 293T 3,933.9 1.83 K562 1,326.7 1.85

A B C D E

- 20 -

1 : 293F 2 : RBC 3 : WBC 4 : 293T 5 : K562

ภาพท 9 การวเคราะหคณภาพของ total RNA โดยวธ FA gel electrophoresis

จากการศกษาระดบการแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบน Klf-1 (Kruppel -like factor1), Bcl11a (B-cell CLL/lymphoma 11A), HBB (hemoglobin beta) และ HBG (hemoglobin gamma) ในเซลลชนดตางๆ พบวา 293F และ 293T มระดบการแสดงออกของยนทท าการศกษาใกลเคยงกน และมการแสดงออกของ globin genes ทง 2 ชนดในระดบต ากวาเมอเปรยบเทยบกบเซลลเมดเลอด ในสวนของเซลลเมดเลอดพบวามระดบการแสดงออกของ globin

genes ในระดบสง โดย K562 มระดบของ -globin สงกวา - globin ในทางตรงขามระดบการ

แสดงออกของ - globin ในเมดเลอดแดงสงกวาระดบ -globin เนองจากในผใหญปกตมฮโมโกลบนชนด Adult hemoglobin (HbA) เปนสวนประกอบหลก (ภาพท 6) A B ภาพท 10 การศกษาระดบการแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบน A) qPCR analysis

แสดงระดบการแสดงออกของยน Klf-1, Bcl11a, HBB และ HBG B) สดสวนของระดบ -globin

และ - globin ใน K562 และ RBC

1 2 3 4 5

- 21 -

2. การพฒนาระบบทดสอบเบองตนในเซลลเพอคนหาสารกระตนการสราง fetal hemoglobin (HbF) ผานทางการกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma

การพฒนาระบบทดสอบเพอคนหาสารกระตนการสราง HbF เรมตนโดยออกแบบเซลลโมเดลส าหรบการทดสอบฤทธ จากนนเตรยมเวคเตอรทใชส าหรบการวเคราะห (pGL3-HBG pro vector) โดยการ clone สวนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma (HBG2) ล าดบนวคลโอไทดท –439 ถง +49 จากต าแหนงเรมตนของการถอดรหสพนธกรรมลงใน pGL3 control vector ซงม luciferase เปน reporter gene และท าการตรวจสอบล าดบเบสในสวนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma ใหถกตอง น าพลาสมดทเตรยมไดมาใชส าหรบพฒนาวธทดสอบโดยพบวาเมอใชเซลล K562 ความหนาแนน 2 x 105 เซลลตอมลลลตร ปรมาตร 10 มลลลตร มา co-transfect ดวยเวคเตอร pGL3-HBG pro และ pSV--galactosidase control อยางละ 12 ไมโครกรมลงในเซลลโดยใช Lipofectamine 2000 เปนเวลา 24 ชวโมง แลวน า transiently transfected cells ทไดไปใชทดสอบฤทธกบ 1 mM butyric acid ซงเปนสารทมรายงานฤทธกระตนการสราง HbF พบวาสารดงกลาวสามารถกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma ได โดยใหผลในการเพม enzyme activity ของ luciferase ไดสงขน 4 – 7 เทาเมอเทยบกบกลม control ซงจากผลการศกษานจงไดเลอกใชสภาวะดงกลาวมาพฒนาระบบการทดสอบเบองตนในเซลลและใช 1 mM butyric acid เปน positive control 3. การทดสอบฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma ของสารสกดสมนไพร และแยกสารออกฤทธใหบรสทธดวยวธทางโครมาโตกราฟฟ

วธการทดสอบทพฒนาขนถกน ามาใชในการคนหาสารกระตนการสราง HbF จากสารสกดสมนไพรไทย ในการทดสอบสารสกดสมนไพรและพชพนบานมากกวา 180 ตวอยาง จากพชกวา 125 ชนด พบวาสารสกดพช 7 ชนด คอ ดอกแกว ตนโมกบาน ตนวานหอมแดง ใบโกสน ดอกกระเทยมเถา เหงากระชายด า และตนสาบแรงสาบกา แสดงฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma ดงตารางท 5 โดยสามารถกระตนไดเพมขนมากกวา 2 folds เมอเปรยบเทยบกบเซลลทดสอบทไมมสารสกด

ตารางท 5 ผลการทดสอบฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมา

พชและสวนทใช ความเขมขนของสารสกดทมฤทธกระตนการสราง gamma-globin (folds) 300 100 30 10 3 (µg/mL)

ดอกแกว 0.28 4.48 2.92 1.40 1.17 ตนโมกบาน 0.27 5.28 4.73 2.82 1.00 ตนวานหอมแดง 1.54 4.11 2.28 1.26 1.49 ใบโกสน 2.17 7.99 7.52 3.47 1.24 ดอกกระเทยมเถา 8.44 5.82 1.51 1.13 1.03 เหงากระชายด า – 0.03 3.81 6.09 5.34 ตนสาบแรงสาบกา – 1.02 7.97 5.82 5.13

- : ไมไดท าการทดสอบ

- 22 -

เบองตนคดเลอกสมนไพรทมฤทธ 2 ชนดคอดอกกระเทยมเถาและใบโกสน น าไปแยกสารออกฤทธใหบรสทธโดยวธการทางโครมาโตกราฟฟ แลววเคราะหโครงสรางทางเคมโดยใชขอมลผล NMR spectrum ซงพบวาสารออกฤทธในดอกกระเทยมเถา คอ apigenin-7-O-glucoside (1) (ภาพท 11) และสารออกฤทธในใบโกสนคอ loliolide (2) (ภาพท 12) โดยสารทงสองชนดแสดงฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมา ดงตารางท 6 A) B) ภาพท 11 การวเคราะหโครงสรางทางเคมของสารออกฤทธทแยกไดจากดอกกระเทยมเถา A) การวเคราะหโครงสรางเคมโดยใชขอมล COrrelation SpectroscopY (COSY) และ Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) และ B) 1H และ 13C NMR chemical shift data A) B)

ภาพท 12 การวเคราะหโครงสรางทางเคมของสารออกฤทธทแยกไดจากใบโกสน A) การวเคราะหโครงสรางเคมโดยใชขอมล COrrelation SpectroscopY (COSY) และ Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) และ B) 1H และ 13C NMR chemical shift data

- 23 -

ตารางท 6 แสดงฤทธกระตนการสรางสายโกลบนชนดแกมมาของสาร apigenin-7-O-glucoside (1) และ loliolide (2)

Substances (resources)

HBG promoter activating activity (folds) 100

µg/mL 30

µg/mL 10

µg/mL 3

µg/mL 1

µg/mL 0.3

µg/mL 0.1

µg/mL 0.03

µg/mL apigenin-7-O-glucoside (1)

(flowers of garlic vine) 15.82 14.34 14.40 10.78 5.39 2.69 2.46 0.79

loliolide (2) (leaves of garden croton)

0.74 13.14 16.65 16.57 9.20 4.43 3.37 0.80

- 24 -

วจารณผลการทดลอง (Discussion) การวจยนเรมตนโดยท าการศกษาระดบการแสดงออกของยนทเกยวของกบการสรางฮโมโกลบน เชน Klf-1, Bcl11a, HBB และ HBG ในเซลลเพาะเลยงคอ K562, 293F, และ 293T เปรยบเทยบกบเซลลเมดเลอด เพอเปนขอมลประกอบการพจารณาคดเลอกเซลลส าหรบน ามาใชพฒนาวธการทดสอบ ซงจากผลการศกษาพบวา 293F และ 293T ทมตนก าเนดมาจากเซลลไตของตวออนม

การแสดงของ globin gene ในระดบต าเมอเปรยบเทยบกบเซลลเมดเลอด K562 มระดบของ -globin

สงกวา -globin ตรงขามกบเซลลเมดเลอดแดงทมระดบ -globin สงกวา จากผลการศกษาทไดในเบองตนคณะผวจยไดเลอกเซลล 293T และ K562 มาใชในการพฒนาเซลลโมเดลส าหรบการทดสอบฤทธ เนองจาก 293T เปนเซลลทถก transfect ไดงายและเปน adherent cell จงสะดวกตอการสราง stably transfected clones อยางไรกตามเซลลนมการแสดงออกของ globin genes ในระดบต าซงอาจเปนขอจ ากดของเซลล ในสวนของ K562 เปนเซลลทม cell lineage มาจากเซลลเมดเลอดจงมการแสดงออกของ globin genes เชนเดยวกบเซลลเมดเลอด แตเนองจากเปน suspension cell จงอาจยากตอคดเลอก stably transfected clones ในการพฒนาเซลลโมเดลส าหรบการทดสอบฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma คณะผวจยไดออกแบบเซลลโมเดลส าหรบการทดสอบและสรางพลาสมดเพอใชส าหรบพฒนาระบบการทดสอบฤทธในเซลล โดยล าดบนวคลโอไทดในสวนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma (HBG2) ทเลอกใชคลอบคลมสวนต าแหนงจบของ regulatory elements ตาง ๆ ทมผลตอการกระตนหรอกดการแสดงออกของยน HBG และเลอกใชสารซงมรายงานฤทธกระตนการสราง HbF คอ butyric acid เปน positive control(11-13) จากนนด าเนนการสราง stably transfected clones ของทง 293T และ K562 ไปพรอมกนแบบคขนาน และสามารถสราง stably transfected clones ของ 293T ทม HBG promoter กบ reporter gene (luciferase gene) อยในเซลลอยางถาวรได แตยงไมสามารถสราง stably transfected clones ของ K562 ได อยางไรกตามเมอน า stably transfected-293T cell มาทดสอบกบ butyric acid พบวาเซลลโมเดลทสรางไดไมสามารถใชทดสอบฤทธดงกลาวได ซงอาจมสาเหตมาจาก 293T มการแสดงออกของ globin genes ในระดบต า และไมไดม cell lineage มาจากเซลลเมดเลอด จงอาจไมเหมาะสมตอการใชพฒนาวธทดสอบฤทธน แตเมอใช transiently transfected cells ของ K562 มาทดสอบฤทธของ butyric acid พบวาสามารถกระตนโปรโมเตอรไดโดยเพม enzyme activity ของ reporter gene สงขน 4 - 7 เทา ดวยเหตนคณะผวจยจงพฒนาระบบทดสอบโดยใช transiently transfected cells ของ K562 มาทดสอบฤทธของสารสกดสมนไพรทละลายในเอทานอล (เอทานอลไมมผลกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma; ไมไดแสดงขอมลผลการทดสอบ)

ปจจบนการศกษาฤทธกระตนการสราง HbF เพอคนหาสารตนแบบทางยาไดรบความสนใจจากนกวจยเปนอยางมาก โดยมงานวจยทพฒนาวธการทดสอบฤทธส าหรบคนหาสารออกฤทธดงกลาว

- 25 -

อยหลายวธดวยกน(14-16) และมรายงานการศกษาฤทธนทงกบสารสงเคราะห(16) และสารสกดจากผลตภณฑธรรมชาต(17-20) อยางไรกตามยงไมเคยมการศกษาฤทธนกบตวอยางทเปนสารสกดสมนไพรไทยมากอน ในการศกษานพบวาสารสกดดอกแกว ตนโมกบาน ตนวานหอมแดง ใบโกสน ดอกกระเทยมเถา เหงากระชายด า และตนสาบแรงสาบกา แสดงฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma และเมอเปรยบเทยบความแรงและชวงความเขมขนของสารสกดทแสดงฤทธพบวาสารสกดเหลานแสดงฤทธไดดในชวงความเขมขนทกวาง ยกเวนสารสกด 2 ชนดคอ ดอกแกว และตนวานหอมแดงทมความแรงนอยกวาและมชวงความเขมขนของการแสดงฤทธทแคบกวา ดงนนในการคดเลอกชนดของพชเพอท าการแยกบรสทธสารออกฤทธในการศกษาถดไปจงควรเลอก ตนโมกบาน ใบโกสน ดอกกระเทยมเถา เหงากระชายด า และตนสาบแรงสาบกา มาใชส าหรบการศกษา

การศกษานเบองตนไดคดเลอกสมนไพรทมฤทธ 2 ชนดคอดอกกระเทยมเถาและใบโกสน มาศกษาเพอแยกสารออกฤทธใหบรสทธตามหลกการ bioassay guided-separation ซงจากการแยกบรสทธสารกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma พบวาสารออกฤทธหลกคอ apigenin -7-O-glucoside (1) โดยมคณสมบตทางกายภาพและขอมลสเปคตรมเหมอนกบทเคยตพมพในงานวจยของ Ersoz T. และคณะ(21) สารนอยในกลม flavone glucoside ซงมรายงานฤทธทางเภสชวทยาทหลากหลายเชน immunomodulating activity(22), antioxidant activity, cytoprotective activity(23) และ antibacterial activity(24) ซงสาร apigenin-7-O-glucoside (1) สามารถพบไดในพชหลายชนดดวยกนเชน Scutellaria pontica(21), Mentha longifolia(25) และ Chamomilla recutita(26) และสารนมการรายงานฤทธทางเภสชวทยาอนๆ อกดวยเชน antimutagenic activity(25), antioxidant activity และ antibacterial activity(27) แตยงไมเคยมรายงานฤทธกระตนการสราง HbF มากอน

การแยกบรสทธสารกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma ในตนโกสนพบวาม loliolide เปนหนงในสารออกฤทธ โดยมคณสมบตทางกายภาพและขอมลสเปคตรมเหมอนกบทเคยตพมพในงานวจยของ Rejon GE. และคณะ(28) loliolide เปนสารในกลม terpene พบไดในพชหลายชนด(28-30) ทากทะเล(31) และสาหรายสน าตาล(32) โดยมการรายงานฤทธทางเภสชวทยาทหลากหลาย เชน ant-repellent activity(30), antioxidant activity(31) และ cellular senescence inhibiting activity(33) อยางไรกตามยงไมเคยมรายงานฤทธกระตนการสราง HbF ของสารนมากอนเชนกน

- 26 -

สรปผลการวจย (Conclusion) การศกษานไดพฒนาระบบการทดสอบฤทธเบองตนเพอน ามาใชในการคนหาสารกระตนการ

สราง HbF จากสารสกดสมนไพรและพชพนบาน โดยท าการทดสอบผานทางการศกษาฤทธกระตนโปรโมเตอรของยน hemoglobin gamma จากผลการทดสอบพบวาสารสกดพช 7 ชนดคอ ดอกแกว ตนโมกบาน ตนวานหอมแดง ใบโกสน ดอกกระเทยมเถา เหงากระชายด า และตนสาบแรงสาบกา แสดงฤทธดงกลาว เบองตนดอกกระเทยมเถาและใบโกสนถกน ามาสกดและแยกบรสทธสารออกฤทธ โดยพบวา apigenin-7-O-glucoside (1) และ loliolide (2) เปนหนงในสารออกฤทธทมอยในสารสกดพชทงสองชนดตามล าดบ สารออกฤทธทงสองชนดแสดงฤทธดและใหชวงความเขมขนของการแสดงฤทธทกวางจงเปนสารทนาสนใจส าหรบน าไปศกษาตอยอดเพอเปนสารตนแบบในการพฒนายาตอไป นอกจากนยงมสมนไพรอกหลายชนดทยงไมไดมการแยกบรสทธสารออกฤทธจงควรสนบสนนใหท าการศกษาสารออกฤทธในสมนไพรดงกลาวดวยในล าดบถดไป

- 27 -

บรรณานกรม (References) (1) Patrinos GP, Kollia P, Papadakis MN. Molecular diagnosis of inherited disorders: lessons from hemoglobinopathies. Hum Mutat 2005; 26: 399-412. (2) Thein SL, Genetic insights into the clinical diversity of beta thalassemia. Br J Heamatol 2004; 124: 264-74. (3) Thein SL. Beta-thalassemia prototype of a single gene disorder with multiple phenotypes. Int J Hematol 2002; 76: 83-9. (4) คณะท างานมลนธโรคโลหตจางธาลสซเมยแหงประเทศไทย. แนวทางการวนจฉยโลหตจางธาล สซเมยแหง พ.ศ. 2549. [Internet]. 2006 [cited 2015 Aug 5] Available from http http://www.thalassemia.or.th/thal-cpg.pdf (5) Wilber A, Nienhuis AW, Persons DA. Transcriptional regulation of fetal to adult hemoglobin switching: new therapeutic opportunities. Blood [Internet]. 2011 Feb [cited 2014 Dec 22]; 117: 3945-53. Available from blood journal with Full Text: http://www.bloodjournal.org/content/bloodjournal/117/15/3945.full.pdf (6) Olivieri NF. Reactivation of fetal hemoglobin in patients with beta-thalassemia. Semin Hematol 1996; 33: 24-42. (7) Blau CA, Stamatoyannopoulos G, Hemoglobin switching and its clinical implications. Curr Opin Heatol 1994; 1: 136-42. (8) Forget BG. Molecular basis of herediaty persistence of fetal hemoglobin . Ann N Y Acad Sci 1998; 850: 38-44. (9) Lal A, Vichinsky E. The role of fetal hemoglobin-enhancing agents in thalassemia. Semin Hematol 2004; 41: 263-8. (10) Rodgers GP, Rachmilewitz EA. Novel treatment options in the severe beta-globin disorders. Br J Haematol 1995; 91: 263-8. (11) Perrine SP, Ginder GD, Faller DV, DoverGH, Ikuta T, Witkowska HE, Cai SP, Vichinsky EP, Olivieri NF. A short-term trial of butyrate to stimulate fetal-globin-gene expression in the beta-globin disorders. N Engl J Med 1993; 328: 81-86. (12) Blau CA, Constantoulakis P, Shaw CM, Stamatoyannopoulos G. Fetal hemoglobin induction with butyric acid: efficacy and toxicity. Blood. 1993; 81: 529-37. (13) Dover GJ, Brusilow S, Charache S. Induction of fetal hemoglobin production in subjects with sickle cell anemia by oral sodium phenylbutyrate. Blood. 1994; 84: 339-43.

- 28 -

(14) Vadolas J, Wardan H, Orford M, Voullaire L, Zaibak F, Williamson R, Loannou PA. Development of sensitive fluorescent assay for embryonic and fetal hemoglobin inducers using the human β-globin locus in erythropoietic cells. Blood [Internet]. 2002 Aug [cited 2014 Dec 22]; 100: 4209-16. Available from blood journal with Full Text: http://www.bloodjournal.org/content/bloodjournal/100/12/4209.full.pdf (15) Vadolas J, Wardan H, Orford M, Williamson R, Loannou PA. Cellular genomic reporter assay for screening and evaluation of inducer of fetal hemoglobin. Human Molecular Genetics [Internet]. 2004 [cited 2015 Aug 20]; 13; 223-33. Available from OXFORD Journals with Full Text: http://hmg.oxfordjournals.org/content/13/2/223. full.pdf+html (16) Peterson KR, Costa FC, Fedosyuk H, Neades RY, Chazelle AM, Zelenchuk L, Fonteles AH, Dalal P, Roy A, Chagutura R, Li B, Pace BS. A cell-based high-throughput screen for novel chemical inducers of fetal hemoglobin for treatment of hemoglobinopathies PLOS [Internet]. 2014 [cited 2015 Aug 20]; 9; e107006. Available from PLOSONE with Full Text: http://www.plosone.org/article/fetchObject.action? uri=info:doi/10.1371/ journal.pone.0107006&representation=PDF (17) Fibach E, Bianchi N, Borgatti M, Prus E, Gambari R. Mithramycin induces fetal hemoglobin production in normal and thalassemic human erythroid precursor cells. Blood. 2003; 102: 1276–81. (18) Lampronti I, Bianchi N, Borgatti M, Fibach E, Prus E, Gambari R. Accumulation of gamma-globin mRNA in human erythroid cells treated with angelicin. Eur J Haematol. 2003; 71: 189–95. (19) Fibach E, Bianchi N, Borgatti M, Zuccato C, Finotti A, Lampronti I, et al. Effects of rapamycin on accumulation of -,- and -globin mRNAs in erythroid precursor cells from -thalassaemia patients. Eur J Haematol. 2006; 77: 437–41. (20) Bianchi N, Zuccato C, Lampronti I, Borgatti M, Ga,baro R. Fetal Hemoglobin Inducers from the Natural World: A Novel Approach for Identification of Drugs for the Treatment of -Thalassemia and Sickle-Cell Anemia. eCAM [Internet]. 2009 [cited 2015 Jul 20]; 6; 141-51. Available from NCBI PMC with Full Text: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC2686630/pdf/nem139.pdf (21) Ersoz T, Harput US Saracoglu I Calıs I Ogihara Y. Phenolic compounds from Scutellaria pontica. Turk J Chem 2002; 26: 581–88. (22) Akbay P, Basaran AA, Undeger U, Basaran N. In vitro immunomodulatory activity of flavonoid glycoside from Urtica dioica L. Phytother Res 2003; 17: 34-7. (23) Zhong K, Li XJ, Gou AN, Huang YN, Bu Q. Gao H. Antioxidant and cytoprotective activities of flavonoid glycosides-rich extract from the leaves of Zanthoxylum bungeanum J Food & Nutritom Res [Internet]. 2014 [cited 2015 Aug 20]; 2; 349-56.

- 29 -

Available from Science and Education Publishing with Full Text: http://pubs.sciepub. com/jfnr/2/7/4/index.html (24) Rashid F, Ahmed R, Mahmood A, Ahmed Z, Bili N, Kazmi SU. Flavonoid glycoside from Prunus armeniaca and the antibacterial activity of a crude extract. Arch Pharm Res 2007; 30: 932-37. (25) Gulluce M, Orhan F, Yanmis D, Arasoglu T, Guvenalp Z, Demirezer LO. Isolation of a flavonoid, apigenin 7-O-glucoside, from Mentha longifolia (L.) Hudson subspecies longifolia and its genotoxic potency. Toxicol Ind Health [Internet] 2013 Feb [cited 2015 Aug 20]; Available from SAGE journals with Full Text: http://tih.sagepub.com/content/ early/2013/02/04/0748233713475511.long (26) Vanda Sˇvehlı´kova´ V Bennett RN Mellon FA Needs PW Piacente S Kroon PA Bao Y. Isolation, identification and stability of acylated derivatives of apigenin 7-O-glucoside from chamomile (Chamomilla recutita [L.] Rauschert) Phytochem 2004; 65: 2323-32. (27) Akroum S, Bendijeddou D, Satta D, Lalaoui K. Antibacterial, antioxidant and acute toxicity test on flavonoids extracted from some medicinal plants. Int J Green Pharm 2010; 4: 165-69. (28) Erosa-Rejón G, Peña-Rodríguez LM, Sterner1O. Secondary Metabolites from Heliotropium angiospermum J Mex Chem Soc 2009; 53: 44-47. (29) Hodges R. The structure of loliolide: A terpene from lolium perenne. Tetrahedron 1964; 20: 1463-67. (30) Okunade AL, Wiemer DF. (-)-Lioliolide, an ant-repellent compound from Xanthoxyllum setulosum. J Nat Prod 1985; 48: 472-73. (31) Pettit GR, Herald CL, Ode RH, Brown P, Gust DJ, Michel C. The isolation of loliolide from an Indian ocean Opisthobranch mollusk. J Nat Prod 1980; 43: 752-55. (32) Yang, X, Kang MC, Lee KW, Kang SM, Lee WW, Jeon YJ. Antioxidant activity and cell protective effect of loliolide isolated from Sargassum ringgoldianum subsp. Coreanum. ALGAE 2011; 26: .201-08. (33) Kim JR, Son JK, Yang HH, Hwangbo K. Composition for inhibiting cellular senescence comprising loliolide. Patent application no. WO 2014038872 A1.